Capsules entériques à cinq saveurs de Sophora flavescens soulagent les changements liés à la colite expérimentale et à la ferroptose

Résumé

Dans un modèle murin de colite ulcéreuse, les capsules entériques à cinq saveurs de Sophora flavescens ont atténué les lésions du côlon et amélioré le stress oxydatif, le déséquilibre inflammatoire des cytokines, la signalisation JAK2/STAT3 et les modifications des marqueurs liés à la ferroptose.

Résumé

La colite ulcéreuse reste difficile à gérer car les options thérapeutiques efficaces et ciblées sont limitées, et le stress oxydatif, la signalisation inflammatoire et la régulation des voies de mort cellulaire peuvent contribuer à des lésions muqueuses. Cette étude a évalué si les capsules entériques à cinq saveurs de Sophora flavescens (FSEC) soulagent la colite expérimentale et a exploré les changements associés dans le stress oxydatif, l’inflammation et les marqueurs de la ferroptose. Un modèle murin de colite ulcéreuse a été établi par exposition cyclique à 2,5 % de dextran sulfate de sodium, combiné à un défi alpha du facteur de nécrose tumorale. Les souris ont été traitées avec des FSEC à faible dose, moyenne ou élevée ou avec l’antagoniste TLR4 CRX-526 en tant qu’intervention à contrôle positif. L’histopathologie du côlon a été évaluée par coloration par hématoxyline et éosine. Les niveaux de superoxyde sérique dismutase, catalase, glutathione, myélooperoxydase et Fe²⁺ ont été mesurés à l’aide d’essais biochimiques. Les cytokines du tissu du côlon ont été quantifiées par test immunosorbent lié aux enzymes, l’expression de JAK2 et STAT3 a été évaluée par immunohistochimie, et l’expression de GPX4, FTH1 et ACSL4 a été analysée par western blotting. Le traitement par FSEC a réduit les lésions muqueuses du côlon et l’infiltration des cellules inflammatoires, augmenté les indices antioxydants et diminué les niveaux de myéloperoxydase. La FSEC a également réduit les niveaux de TNF-α et d’IL-1α, a partiellement rétabli les niveaux d’IL-13, et a été associée à une immunocoloration plus faible de JAK2 et STAT3. Parallèlement, le FSEC a amélioré les changements de marqueurs liés à la ferroptose, notamment une réduction des niveaux de Fe²⁺ et ACSL4 ainsi qu’une augmentation de l’expression de GPX4 et FTH1. Ces résultats suggèrent que la FSEC soulage la colite ulcéreuse expérimentale chez la souris, au moins en partie en améliorant le statut de stress oxydatif, en modérant la signalisation inflammatoire et en rétablissant les profils de marqueurs liés à la ferroptose.

Introduction

La colite ulcéreuse (CU) est un trouble inflammatoire chronique qui touche principalement la muqueuse du côlon et du rectum, caractérisée par des épisodes récurrents d’inflammation muqueuse, d’ulcération et d’altération de la fonction de la^{barrière 1,2,3}. Bien que la susceptibilité génétique, les facteurs environnementaux, la dysfonction de la barrière épithéliale et la dysrégulation immunitaire aient été impliqués dans la pathogenèse de la CU, les mécanismes sous-jacents à la lésion muqueuse persistante restent incomplètement compris. Les traitements pharmacologiques actuels, incluant les aminosalicylates, corticostéroïdes, immunosuppresseurs et agents biologiques, peuvent réduire l’activité de la maladie chez de nombreux patients ; Cependant, leur utilisation clinique peut être limitée par une rechute après l’arrêt du traitement, des effets indésirables, un coût élevé et des réponses thérapeutiques^{incomplètes 3}.

La ferroptose, une forme de mort cellulaire régulée dépendante du fer caractérisée par la peroxydation lipidique et un métabolisme altéré du fer, est de plus en plus impliquée dans l’inflammation intestinale et les lésions épithéliales associées ^{à la CU} 4,5,6,7,8. Parallèlement, les formulations de la médecine traditionnelle chinoise ont attiré une attention croissante en tant qu’approches complémentaires pour le traitement de la CU en raison de leur potentiel thérapeutique^{multi-cibles 9}.

Les capsules entériques (FSEC) à cinq saveurs de Sophora flavescens sont utilisées cliniquement pour le traitement de la CU active légère à modérée dans la médecine traditionnelle chinoise. Des études antérieures suggèrent que la FSEC pourrait améliorer les symptômes de la colite ultérieuse grâce à des mécanismes multi-composants et^{multi-cibles 10}. Cependant, les effets de la FSEC sur le stress oxydatif, la signalisation inflammatoire, l’activité JAK2/STAT3 et les modifications liées à la ferroptose dans l’UC expérimentale restent insuffisamment caractérisés.

Le stress oxydatif et la signalisation inflammatoire sont des facteurs importants contribuant aux lésions muqueuses intestinales dans la CU. Une production excessive d’espèces réactives d’oxygène peut perturber l’intégrité épithéliale, favoriser l’infiltration des cellules inflammatoires et altuer les systèmes de défense antioxydants. Les voies médiées par les cytokines telles que la signalisation JAK2/STAT3 contribuent à l’amplification inflammatoire et à la lésion^tissulaire 11,12,13,14,15. De plus, le stress oxydatif et la ferroptose sont étroitement liés par des altérations des défenses antioxydantes, du métabolisme du fer et la peroxydation^lipidique 16,17,18,19,20. Par conséquent, une évaluation simultanée des indices de stress oxydatif, des cytokines inflammatoires, de la signalisation JAK2/STAT3 et des marqueurs liés à la ferroptose pourrait fournir une compréhension plus complète des lésions muqueuses et des réponses thérapeutiques dans la CU expérimentale.

Dans la présente étude, un modèle murin alpha-challengeant avec le facteur alpha-défié par le sulfate de dextrane sodique cyclique et le facteur de nécrose tumorale a été utilisé pour évaluer les effets du FSAC à faibles, moyens et hauts doses. Une force méthodologique clé de ce design est l’intégration de l’évaluation histopathologique avec les mesures des indices de stress oxydatif sérique, des cytokines du tissu du côlon, de l’immunohistochimie JAK2/STAT3 et de l’analyse western blot des protéines liées à la ferroptose au sein d’un seul cadre expérimental. Cette approche a été utilisée pour déterminer si la FSEC atténue la CU expérimentale et pour caractériser les changements associés du stress oxydatif, de la signalisation inflammatoire et des profils de marqueurs liés à la ferroptose. La conception expérimentale globale et le flux de travail analytique sont résumés à la Figure 1.

Figure 1 : Flux de travail expérimental du modèle murin et des analyses en aval. La colite ulcéreuse expérimentale chronique a été induite par une exposition cyclique à 2,5 % de dextran sulfate de sodium (DSS) combinée au défi du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) durant la dernière semaine du protocole expérimental. Les souris ont été assignées aux groupes témoins normal, modèle, FSAC à faible dose, FSAC à dose moyenne, FSAC à dose élevée et CRX-526 témoins positifs. La FSEC a été administrée par gavage intragastrique à des doses de 108, 216 ou 432 mg/kg de poids corporel. CRX-526 a été utilisé comme intervention à contrôle positif. Après le traitement final, des échantillons ont été prélevés pour une évaluation histopathologique, des tests biochimiques liés au stress oxydatif, l’analyse des cytokines par ELISA, l’immunohistochimie et l’analyse par western blot. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été examinées et approuvées par le Comité de bien-être animal et d’éthique du Collège médical de Nanchang (n° d’approbation NY2SC 20250407). Toutes les expériences ont été menées conformément aux directives institutionnelles concernant le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les produits chimiques, réactifs et équipements sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Animaux et traitement

Des souris mâles C57BL/6J (de type sauvage, 8 semaines) ont été utilisés dans cette étude. Les animaux étaient hébergés dans des conditions de laboratoire standard avec température et humidité contrôlées et disposaient d’un accès libre à la nourriture et à l’eau. Après acclimatation, une colite chronique a été induite par l’administration de trois cycles de dextran sulfate de sodium (DSS) à 2,5 % dans l’eau potable. Chaque cycle durait une semaine et était séparé par une période de récupération de 2 semaines avec une consommation régulière d’eau. Au cours de la dernière semaine du protocole expérimental, les souris des groupes modèle et de traitement ont reçu le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α ; 10 μg/100 g de poids corporel, deux fois par jour) par gavage intragastrique afin d’aggraver davantage la lésion du côlon. Les souris témoins normales ont reçu uniquement le véhicule et n’ont pas été exposées au DSS ou au TNF-α.

Les capsules entériques (FSEC) de Sophora flavescens à cinq saveurs étaient utilisées comme médicament breveté chinois commercialement et approuvé. La formulation contenait Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., et Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. Le contenu des capsules du même lot de production était pesé et suspendu dans de l’eau distillée stérile pour préparer des suspensions de dosage fraîches avant l’administration. Les suspensions étaient soigneusement mélangées avant chaque manche pour assurer une dispersion uniforme. La source du produit, le numéro d’approbation, les spécifications pharmaceutiques et les informations sur le contrôle qualité sont fournies dans le Tableau des matériaux. La qualité du produit a été décrite conformément aux spécifications pharmaceutiques approuvées et aux informations fournies par le fabricant, incluant les spécifications des capsules, l’apparence, les exigences de libération et de désintégration entérique, les exigences de limite microbienne et les normes de contrôle qualité.

Les souris traitées par FSC ont reçu une FSEC à faible dose (108 mg/kg de poids corporel), une FSEC à dose moyenne (216 mg/kg de poids corporel) ou une FSEC à dose élevée (432 mg/kg de poids corporel) par gavage intragastrique deux fois par jour durant la dernière semaine de modélisation. Les niveaux de dose ont été sélectionnés en fonction de la dose clinique approuvée, de la conversion surface-corps et des considérations préliminaires de la gamme de doses. Les souris traitées par véhicule ont reçu le même volume d’eau distillée stérile par gavage intragastrique.

Le groupe témoin positif a reçu l’antagoniste TLR4 CRX-526 à 1 mg/kg par injection dans la veine caudale durant la dernière semaine de modélisation. CRX-526 a été utilisé comme intervention anti-inflammatoire de référence. L’étude comprenait six groupes (n = 6 par groupe) : groupe témoin normal, modèle, FSAC à faible dose, FSAC à dose moyenne, FSAC à dose élevée et groupe témoin positif CRX-526. Les souris ont été sacrifiées 24 heures après le dernier traitement d’étude. L’euthanasie a été réalisée par une luxation cervicale sous anesthésie isoflurane, conformément aux directives institutionnelles pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire.

2. Évaluation histologique par coloration par hématoxyline et éosine

Les tissus du côlon ont été prélevés dans la région la plus touchée macroscopiquement entre l’anus et la zone iléocécale. Pour chaque souris, un segment représentatif du côlon de cette région était fixé dans du formol tampon neutre à 10 %, intégré dans la paraffine, sectionné et coloré à l’hématoxyline et à l’éosine. Pour l’évaluation histologique, au moins trois sections ont été préparées pour chaque animal, et cinq champs de haute puissance non chevauchants ont été examinés par section. Les champs ont été sélectionnés de manière systématique et aléatoire en balayant la section d’un bord à l’autre, évitant les zones déchirées, pliées ou mal tachées. Les modifications histopathologiques, incluant ulcération muqueuse, destruction glandulaire, congestion et infiltration des cellules inflammatoires, ont été évaluées à la microscopie optique.

3. Mesure des indicateurs biochimiques liés au stress oxydatif

Des échantillons sanguins (0,5 mL) ont été prélevés dans des tubes contenant un anticoagulant et centrifugés à environ 1160 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Le surnageant a été collecté et utilisé pour mesurer les niveaux de fer sérique, de dismutase superoxydique (SOD), de glutathion (GSH), de catalase (CAT) et de myélooperoxydase (MPO) à l’aide des kits de test correspondants listés dans le Tableau des matériaux selon les instructions du fabricant.

4. Analyse immunohistochimique de JAK2 et STAT3

Des sections de tissu du côlon incrustées dans la paraffine (5 μm) ont été déparaffinées dans le xylène, réhydratées par une série d’éthanol gradué, puis rincées avec du sérum physiologique tamponné phosphate. La récupération d’antigènes a été réalisée dans un tampon de citrate (pH 6,0) à l’aide de chauffage micro-ondes. Après refroidissement à température ambiante, l’activité endogène de la peroxydase a été bloquée avec 3 % de H₂O₂ pendant 10 minutes. Les sections ont été bloquées avec 5 % de sérum normal de chèvre pendant 30 minutes à température ambiante et incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre JAK2 et STAT3 à des dilutions de 1:50 et 1:80, respectivement. Après des lavages salins tamponnés phosphate, des sections ont été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort selon les instructions du fabricant. Les signaux immunoréactifs ont été visualisés à l’aide de la 3,3′-diaminobenzidine, et les noyaux ont été contre-colorés par de l’hématoxyline. Les coupes ont été déshydratées, montées et examinées au microscope optique.

5. Quantification des cytokines par dosage immunosorbent lié aux enzymes

Les tissus du côlon ont été découpés en^morceaux de 2 à 3 mm, homogénéisés sur de la glace dans du sérum tamponné phosphate, puis centrifugés à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Le surnageant a été prélevé, et les concentrations de TNF-α, IL-1α et IL-13 ont été mesurées à l’aide des kits ELISA correspondants selon les instructions du fabricant. Les valeurs d’absorbance ont été mesurées à l’aide d’un lecteur de microplaques, et les concentrations de cytokines ont été calculées à partir de courbes standard générées pour chaque essai.

6. Analyse par Western blot des protéines liées à la ferroptose

Les protéines totales ont été extraites des tissus du côlon, et les concentrations de protéines ont été déterminées à l’aide d’un test à base d’acide bicinchoninique. Des quantités égales de protéines provenant de chaque échantillon ont été séparées par SDS-PAGE et transférées sur les membranes. Après un blocage avec 5 % de lait écrémé ou un tampon de blocage équivalent pendant 2 heures à température ambiante, les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre GPX4, FTH1, ACSL4 et la protéine de contrôle de charge β-actine, comme indiqué dans le tableau des matériaux. Le lendemain, les membranes ont été lavées et incubées avec l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort pendant 2 heures à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un substrat chimiluminescent et imagées à l’aide d’un système d’imagerie chimiluminescente. Les intensités de bande ont été quantifiées à l’aide d’un logiciel de densitométrie. Les niveaux d’expression de GPX4, FTH1 et ACSL4 ont été normalisés en β-actine, et l’expression relative des protéines a été calculée pour une analyse statistique.

7. Analyse statistique

Les données sont présentées en moyenne ± écart-type (DS). Des comparaisons entre plusieurs groupes ont été réalisées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance, suivies du test post hoc de Bonferroni lorsque les hypothèses de normalité et d’homogénéité de la variance étaient remplies. Une valeur de P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Résultats

La FSEC soulage les lésions histopathologiques et améliore les indices liés au stress oxydoatif chez les souris atteintes de colite ulcéreuse
Comme montré à la Figure 2, le groupe témoin normal présentait une architecture muqueuse du côlon intacte, avec des glandes bien organisées et une infiltration minimale des cellules inflammatoires. En revanche, le groupe modèle présentait une lésion muqueuse sévère caractérisée par une perturbation ...

Discussion

Cette étude a étudié les effets des capsules entériques (FSEC) à cinq saveurs de Sophora flavescens dans un modèle murin de colite ulcéreuse expérimentale (UC) et a évalué les modifications associées des indices liés au stress oxydatif, des cytokines inflammatoires, de la signalisation JAK2/STAT3 et des marqueurs liés à la ferroptose. Les principales conclusions étaient que le traitement FSEC atténuait les lésions histopathologiques du côlon, améliorait les indices biochimiques ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018	Substrate chromogène pour l'immunohistochimie basée sur la HRP.
ACSL4 antibody (F-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	Anticorps primaire monoclonal de souris pour le western blot; utilisé à 1:500; RRID: AB_10842002.
Antigen retrieval solution, citrate buffer, pH 6.0	Beyotime Biotechnology	P0081	Tampon de récupération d'épitope induite par la chaleur pour l'immunohistochimie sur coupes paraffinées.
BCA protein assay kit	Beyotime Biotechnology	P0012	Quantification des protéines avant le western blotting.
C57BL/6J mice	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Souris SPF mâles, âgés de 8 semaines; source animale conforme aux documents d'approbation éthique soumis.
Catalase (CAT) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	Kit colorimétrique pour la mesure de l'activité de la CAT dans le sérum.
ChemiDoc XRS+ imaging system	Bio-Rad Laboratories	1708265	Système d'imagerie par chimiluminescence pour la détection du western blot.
CRX-526	TargetMol	T27090	Antagoniste du TLR4 utilisé comme intervention de contrôle positif; numéro CAS 245515-64-4.
Dextran sulfate sodium salt (DSS), colitis grade	MP Biomedicals	160110	DSS, grade colite, poids moléculaire 36 000–50 000 Da; utilisé à 2,5 % dans l'eau potable.
ECL chemiluminescent substrate	Bio-Rad Laboratories	1705061	Substrat ECL Clarity Western pour la détection des signaux de western blot basés sur la HRP.
ELISA kit, mouse IL-13	Abcam	ab219634	Kit ELISA sandwich colorimétrique pour la quantification de l'IL-13 de souris; lecture à 450 nm.
ELISA kit, mouse IL-1α	Abcam	ab199076	Kit ELISA sandwich colorimétrique pour la quantification de l'IL-1α de souris; lecture à 450 nm.
ELISA kit, mouse TNF-α	Abcam	ab208348	Kit ELISA sandwich colorimétrique pour la quantification du TNF-α de souris; lecture à 450 nm.
Ethanol, absolute	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Utilisé pour le traitement des tissus, la déshydratation et la préparation des réactifs.
Ferrous iron (Fe2+) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	Kit colorimétrique pour la mesure du Fe2+ dans les échantillons de sérum ou de tissus.
Five-flavor Sophora flavescens enteric-coated capsules	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	NMPA approval no. Z20150002	Médicament breveté chinois; 0,4 g/gélule; formulation comprenant Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f., et Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC.; spécification pharmaceutique YBZ00152015
Glutathione (GSH) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	Kit d'analyse du glutathion réduit pour la mesure du GSH dans le sérum.
GPX4 antibody (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	Anticorps primaire monoclonal de souris pour le western blot; utilisé à 1:500; RRID: non répertorié dans la fiche technique du fournisseur.
Hematoxylin and eosin staining kit	Solarbio	G1120	Coloration H&E des coupes de tissus de côlon enrobées de paraffine.
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	Anticorps secondaire pour le western blot; utilisé à 1:50 000; RRID: AB_631736.
ImageJ software	National Institutes of Health	Version 1.54	Logiciel d'analyse d'image et de densitométrie utilisé pour la quantification des bandes du western blot.
Immunohistochemistry detection kit	ZSGB-BIO	PV-9000	Kit de détection HRP basé sur les polymères pour l'immunohistochimie sur coupes paraffinées.
JAK2 antibody (D2E12)	Cell Signaling Technology	3230	Anticorps primaire monoclonal de lapin pour l'immunohistochimie de JAK2 sur coupes paraffinées; RRID: AB_2128522.
Microplate reader	BioTek Instruments	Synergy H1	Lecteur de plaques pour la mesure de l'absorbance ELISA à 450 nm.
Myeloperoxidase (MPO) activity assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A044-1-1	Kit colorimétrique pour la mesure de l'activité de la MPO dans le sérum.
Neutral buffered formalin, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Fixation du tissu du côlon avant l'enrobage en paraffine.
Normal goat serum	Solarbio	SL038	Réactif de blocage pour l'immunohistochimie.
Paraffin	Leica Biosystems	39601006	Médium d'enrobage pour le traitement des tissus de côlon.
Phosphate-buffered saline (PBS)	Solarbio	P1020	Tampon pour les procédures d'homogénéisation des tissus, de lavage et d'immunostaining.
PVDF membrane	MilliporeSigma	IPVH00010	Membrane de transfert de protéines pour le western blotting.
Recombinant mouse TNF-α protein	R&D Systems	410-MT	TNF-α recombinant de souris utilisé pour le défi inflammatoire de la dernière semaine.
SDS-PAGE and transfer system	Bio-Rad Laboratories	1658004	Système Mini-PROTEAN Tetra pour le workflow de SDS-PAGE et de transfert de western blot.
SPSS Statistics software	IBM	Version 24.0	Logiciel d'analyse statistique pour l'ANOVA à un facteur et les tests post-hoc de Bonferroni.
STAT3 antibody (124H6)	Cell Signaling Technology	9139	Anticorps primaire monoclonal de souris pour l'immunohistochimie de STAT3; RRID: AB_331757.
Superoxide dismutase (SOD) assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-3-2	Kit de la méthode WST-1 pour la mesure de l'activité de la SOD dans le sérum.
Xylene	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10023418