Un protocole standardisé de métabolomique pour analyser les changements métaboliques induits par l’exercice chez les boxeurs d’élite par chromatographie liquide - spectrométrie de masse

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail standardisé en métabolomique sérique basé sur la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse tandem quadrupolaire à temps de vol (LC-QTOF-MS/MS) et à l’analyse multivariée des données pour profiler les changements métaboliques aigus et à court terme liés à la récupération chez les boxeurs masculins d’élite.

Résumé

La boxe d’élite induit des changements métaboliques rapides qui ne sont pas entièrement capturés par les mesures physiologiques conventionnelles. Un flux de travail standardisé de métabolomique sérique non ciblée, basé sur la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse en tandem quadrupolaire (LC-QTOF-MS/MS), a été appliqué à des échantillons prélevés avant le sparring, immédiatement après le sparring, et 24 heures après l’entraînement chez sept boxeurs masculins d’élite. Le flux de travail comprenait la collecte standardisée des échantillons, la surveillance du contrôle qualité groupée, le profilage des métabolites, l’analyse statistique multivariée et l’interprétation des voies. Le combat aigu était associé à des modifications des métabolites liées à la glycolyse et à la gluconéogenèse, tandis que le point de 24 heures était associé au métabolisme du soufre.

Le phosphatidylinositol PI (16:0/18:2(9Z,12Z)) a montré une forte distinction de l’état immédiatement post-sparring, et le thiosulfate était associé à l’état de récupération de 24 heures. Ces résultats soutiennent l’utilisation de ce flux de travail pour le profilage reproductible des changements métaboliques liés à l’exercice dans cette cohorte de sept boxeurs masculins d’élite. Le protocole est destiné aux études contrôlées en petites cohortes d’exercices aigus et de récupération à court terme, et met l’accent sur la manipulation reproductible des échantillons, la surveillance de contrôle qualité groupée et l’analyse en aval interprétable.

Introduction

La boxe d’élite, caractérisée par trois rounds de 2 minutes de combats d’entraînement intenses, repose sur une combinaison de métabolisme anaérobie et aérobie et déclenche des déplacements rapides des substrats énergétiques, des médiateurs de stress oxydatif et des métabolites liés à la réparation tissulaire. Les évaluations traditionnelles (lactate sanguin et fréquence cardiaque) ne prennent en compte que des critères physiologiques isolés, sans parvenir à résoudre les changements métaboliques systémiques et interconnectés qui couvrent « la base pré-sparring → le stress aigu post-sparring → la récupération en 24 heures. »

La métabolomique non ciblée, rendue possible par la chromatographie liquide-quadrupole-spectrométrie de masse tandem à temps de vol, répond à cette limitation en profilant de manière exhaustive les métabolites de petites molécules dans des échantillons biologiques. Il détecte généralement des milliers de pics métaboliques et annote des centaines voire des milliers de métabolites grâce à l’intégration avec des bases de données^{sélectionnées 1,2,3}. Cette approche peut révéler des dynamiques métaboliques nuancées que les méthodes traditionnelles manquent, mais les études métabolomiques existantes axées sur la boxe manquent de standardisation : elles omettent souvent des protocoles de sparring contrôlés, des étapes rigoureuses de contrôle qualité (QC) ou des délais de récupération à long terme, conduisant à des résultats irreproductibles et à une traduction limitée en stratégies d’entraînement ou de^{récupération 4,5}.

Un flux de travail métabolomique standardisé, basé sur la chromatographie liquide-la spectrométrie de masse en tandem à temps de vol quadrupole, optimisé pour les boxeurs d’élite, est présenté pour capturer à la fois les réponses aiguës à l’exercice et la récupération retardée. Le protocole comprend trois points temporels clés (pré-sparring [T0], immédiatement post-sparring [T1], 24 heures post-sparring [T2]) pour distinguer la contrainte transitoire de l’adaptation^{soutenue 6,7,8}. Les caractéristiques techniques essentielles incluent : (1) un combat contrôlé (fréquence cardiaque maximale de 80 à 85 %) pour assurer une intensité d’exercice^{constante 7,9} ; (2) LC-QTOF haute résolution pour la détection sensible de métabolites sériques^{à faible abondance 2,3,10} ; (3) analyses multivariées et univariées, incluant l’analyse en composantes principales (PCA), l’analyse orthogonale partielle par moindres carrés discriminants (OPLS-DA), et les tests statistiques par paires, afin d’identifier les métabolites réactifs à^{l’exercice 6,8,11} ; et (4) un échantillon sérique unique en pool (mélange à volume égal des échantillons étudiés) avec plusieurs injections pour évaluer la stabilité de l’instrument face à la dérive du signal¹².

Ce protocole peut être adaptable à d’autres sports à haute intensité et de courte durée (par exemple, le sprint et la lutte), mais une telle transférabilité nécessite une validation dans des cohortes spécifiques à chaque sport. Dans la présente étude, le flux de travail fournit un cadre préliminaire pour identifier les marqueurs métaboliques du stress et de la récupération chez les boxeurs masculins d’élite. Ce flux de travail est le plus adapté aux études contrôlées sur l’exercice aigu et la récupération à court terme dans de petites cohortes athlétiques bien caractérisées, utilisant la métabolomique non ciblée à base de sérum. Il peut être moins adapté à une extrapolation directe vers d’autres sports, des athlètes féminines, des populations hétérogènes plus larges ou des études d’adaptation à long terme sans validation supplémentaire.

L’étude visait à caractériser les changements métaboliques sériques induits par le combat d’élite en boxe et à distinguer les réponses aiguës post-sparring des changements liés à la récupération en 24 heures. Il a été émis l’hypothèse que le combat aigu affecterait principalement le métabolisme énergétique, tandis que la récupération en 24 heures serait associée à des métabolites liés à l’équilibre redox et à la réparation tissulaire. Le flux de travail global est montré à la Figure 1.

Protocole

Effectuer toutes les procédures conformément à l’approbation du Comité d’éthique institutionnelle pour la recherche humaine de l’Université d’éducation physique et du sport de la Capital (n° 2025A005).

ATTENTION : Considérez tous les échantillons de sang humain comme potentiellement infectieux. Portez des gants, une blouse de laboratoire et une protection oculaire. Effectuer la collecte de sang veineux, la manipulation sérique et l’élimination des déchets conformément aux procédures de biosécurité institutionnelles. Décontaminez les surfaces de travail après la manipulation de l’échantillon.

ATTENTION : Le méthanol, l’acétonitrule et l’acide formique sont des substances dangereuses. Gérez les étapes de préparation, d’extraction et de reconstitution du solvant dans une hotte chimique certifiée. Évitez le contact cutané et l’inhalation. Collectez les déchets de solvants dans des contenants approuvés.

1. Recrutement et préparation des participants à l’étude

1. Recrutez sept boxeurs masculins d’élite âgés de 20 à 28 ans et concourent dans les catégories de poids 60 à 75 kg.
2. Confirmez que chaque participant possède au moins 5 ans d’expérience professionnelle et aucun antécédent de maladies métaboliques.
3. Excluez les participants ayant des lésions musculosquelettiques au cours des 6 mois précédents.
4. Demandez aux participants de suivre un régime standardisé contenant 55 % de glucides, 25 % de protéines et 20 % de matières grasses pendant 3 jours avant le test.
5. Instruire les participants à éviter les exercices intenses à 60 % ou plus de la fréquence cardiaque maximale pendant 48 heures avant le test.
6. Demandez aux participants de jeûner pendant 12 heures avant la prise de sang. Autorisez l’apport d’eau pendant la période de jeûne.
7. Déterminez la fréquence cardiaque maximale par des tests d’exercice gradués une semaine avant le sparring.
8. Augmentez la vitesse du tapis de course de 1 km/h toutes les 3 minutes jusqu’à épuisement. Utilisez la fréquence cardiaque maximale mesurée pour définir l’intensité cible du sparring.

2. Protocole d’entraînement et collecte d’échantillons sérumiques

1. Préparez un ring de boxe standard de 6 × 6 m, des gants de 16 oz et un moniteur de fréquence cardiaque avec une sangle de poitrine.
2. Effectuez un échauffement standardisé de 10 minutes comprenant 5 minutes de jogging à 8 km/h, 3 minutes d’étirements dynamiques et 2 minutes de boxe à l’ombre.
3. Exécutez le protocole de combat comme suit.
   1. Effectuez trois rounds d’entraînement de 2 minutes chacun.
   2. Affrontez les adversaires par catégorie de poids et niveau technique.
   3. Prévoyez un intervalle de repos d’une minute entre les rounds.
   4. Surveillez votre fréquence cardiaque tous les 30 secondes pendant la séance.
   5. Ajustez l’intensité du combat pour maintenir la fréquence cardiaque à 80 % à 85 % de la santé mentale.
   6. Interrompez le combat si la fréquence cardiaque dépasse 90 % de la santé mentale. Reprenez le combat seulement après que la fréquence cardiaque soit revenue dans la plage cible.
4. Prélever des échantillons de sérum à trois moments comme suit.
   1. Prélever 5 mL de sang veineux dans la veine antécubitale 30 minutes après l’échauffement pour T0 en utilisant un tube de séparation sérique (SST) de 8 mL.
   2. Prélève 5 mL de sang veineux dans les 5 minutes suivant la dernière vague pour le T1 en utilisant un nouveau SST.
   3. Prélève 5 mL de sang veineux à la même heure de la journée que T0 pour T2 en utilisant un nouveau SST. Veillez à ce que les participants respectent les mêmes restrictions de jeûne et d’activité que celles pour le T0.
5. Prélevez les échantillons sanguins comme suit.
   1. Centrifugez chaque SST à 11000 × g pendant 15 minutes à 4 °C dans la 1 heure suivant la collecte.
   2. Transférez 2 à 3 mL de la couche sérique supérieure dans 1,5 mL de cryoviaux.
   3. Conservez immédiatement les cryovials à -80 °C.
   4. Limitez chaque échantillon à au maximum deux cycles de congélation-dégel.
6. Préparez un échantillon QC regroupé.
   1. Décongelez les 21 échantillons de sérum d’étude (T0, T1 et T2 de sept participants) sur la glace avant la préparation de la QC en pool.
   2. Transférez une aliquote égale de chaque échantillon d’étude dans un tube de 1,5 mL.
   3. Transférer 20 μL de chaque échantillon pour obtenir un volume QC final de 420 μL.
   4. Vortex l’échantillon QC regroupé pendant 10 s.
   5. Utilisez l’échantillon QC regroupé pour des injections répétées lors de l’analyse LC-QTOF-MS afin de surveiller la stabilité instrumentale et la dérive du signal.

3. Extraction de métabolites à partir d’échantillons sérumiques

1. Retirez les échantillons de sérum congelé (T0, T1, T2 et QC) à -80 °C. Décongelez les échantillons sur glace pendant 30 minutes et faites passer chaque échantillon en vortex pendant 10 secondes.
2. Pipeter 100 μL de sérum dans un tube microcentrifuge à faible liaison aux protéines de 1,5 mL. Ajoutez 500 μL de solvant d’extraction glacé composé de méthanol : acétonitrile (1:1, v/v). Vortex pendant 30 s.
   1. N’ajoutez pas de standard interne lors de l’extraction. N’appliquez pas de correction d’extraction basée sur des standards internes ni de normalisation en aval dans le flux de travail finalisé.
3. Sonicez le tube dans un bain d’eau glacée à 4 °C pendant 10 minutes à 300 W et 40 kHz. Incubez le tube à -20 °C pendant 1 h pour précipiter la protéine.
4. Centrifugez le tube à 13200 × g pendant 20 minutes à 4 °C. Transférer environ 450 μL de surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge et jeter la pellete comme déchets biologiques dangereux.
5. Séchez le surnageant dans un concentrateur sous vide à 37 °C et -0,09 MPa pendant 45 minutes ou jusqu’à obtenir une sécheresse complète.
6. Reconstituez l’extrait séché dans 100 μL d’acétonitrile :eau (1:1, v/v). Vortex pendant 30 s.
   Note : L’acétonitrile :eau (1:1, v/v) a été utilisé car il était compatible avec la colonne de chromatographie en phase inversée utilisée dans ce flux de travail et ne produisait pas de précipitations visibles lors des tests préliminaires.
7. Centrifugez la solution reconstituée à 13200 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Transférez environ 90 μL de surnageant dans un flacon en verre LC-MS équipé d’un insert de 200 μL et scellez le flacon.

4. Chromatographie liquide - détection par spectrométrie de masse

1. Installer une colonne de chromatographie en phase inversée adaptée à la métabolomique sérique (voir Tableau des matériaux) dans le système de chromatographie liquide. Réglez le four à colonne à 40 °C.
2. Préparez la phase mobile A sous forme d’acide formique à 0,1 % (v/v) dans de l’eau ultrapure. Préparez la phase B mobile sous forme d’acide formique à 0,1 % (v/v) dans l’acétonitrile.
3. Filtrez les deux phases mobiles à travers une membrane de 0,22 μm.
4. Réglez le débit à 400 μL/min et le volume d’injection à 5 μL.
5. Appliquez le gradient suivant : 0,0–0,5 min, 95 % A et 5 % B ; 0,5–5,5 min, gradient linéaire à 50 % A et 50 % B ; 5,5–9,0 min, gradient linéaire à 5 % A et 95 % B ; 9,0–10,5 min, 5 % A et 95 % B ; 10,5–12,0 min, retour à 95 % A et 5 % B et rééquilibrez
6. Couplez le système de chromatographie liquide à un spectromètre de masse haute résolution équipé d’une source d’ionisation par électropulvérisation.
7. Acquérir des données en modes ions positifs et négatifs lors de passages séparés.
8. En mode ion positif, réglez la tension capillaire à 2500 V et la tension cône à 30 V.
9. En mode ion négatif, réglez la tension capillaire à -2000 V et la tension cône à 25 V.
10. Réglez la température des gaz de désolvation à 500 °C, le débit des gaz de désolvation à 800 L/h, et le débit des gaz cônes à 50 L/h.
11. Acquérir des données au-dessus de m/z 50–1200 avec un temps de balayage de 0,2 s.
12. Acquérir des données de spectrométrie de masse en tandem en utilisant une faible énergie de collision à 0 V et une énergie de collision élevée à 10–40 V.
13. Analyser les échantillons dans l’ordre suivant : une injection à blanc de solvant de reconstitution ; Trois injections consécutives de l’échantillon QC regroupé ; Tous les échantillons de l’étude avec une injection à blanc et une injection de QC tous les cinq échantillons d’étude ; Une dernière injection de contrôle qualité ; et Une dernière injection à blanc
14. Évaluer la qualité des données et la stabilité analytique dans les deux modes ioniques par analyse de corrélation QC groupée et par regroupement par analyse des composantes principales (PCA).
15. Interpréter les coefficients de corrélation QC groupée supérieurs à 0,8 comme indiquant une stabilité analytique acceptable à travers la séquence analytique.

5. Prétraitement des données et analyse statistique

1. Importez des fichiers bruts de chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans un logiciel de traitement de données pour l’alignement temporel de rétention, la déconvolution, l’alignement des pics et l’extraction des caractéristiques (voir Tableau des matériaux).
   1. Sélectionnez la première injection QC poolée comme référence d’alignement.
   2. Effectuez l’alignement du temps de rétention, la déconvolution et l’alignement des pics en utilisant le flux de travail par défaut du logiciel sélectionné. Utilisez une tolérance de rétention de ± 0,1 min et une tolérance de masse de ± 5 ppm.
   3. Effectuer le pic de picking et conserver des caractéristiques d’intensité supérieure à 1000 comptages, présentes dans au moins 80 % des échantillons d’au moins un groupe.
   4. N’appliquez pas de normalisation supplémentaire après prétraitement dans aucun des modes ioniques.
   5. Exportez la table des caractéristiques traitées contenant m/z, le temps de rétention et les valeurs de la zone de pic.
   6. La transformée Log2 conservait toutes les intensités de pic.
   7. Imputez les valeurs manquantes avec un cinquième de la valeur positive minimale pour chaque caractéristique.
   8. Centrer chaque caractéristique en moyenne et diviser par son écart-type avant analyse multivariée.
   9. Utilisez la matrice transformée et mise à l’échelle pour l’analyse en composantes principales (PCA), l’analyse discriminante par moindres carrés partiels (PLS-DA), l’analyse orthogonale par les moindres carrés par discriminant (OPLS-DA), le regroupement et l’analyse corrélation. Utilisez les intensités des caractéristiques traitées d’origine pour les graphiques d’abondance.
2. Annoter les métabolites en comparant des caractéristiques avec des bases de données publiques de métabolomique, notamment la Human Metabolome Database (HMDB), la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), et LIPID MAPS lorsque cela est applicable.
   1. Notez chaque annotation par erreur de masse d’ion précurseur, distribution isotopique et correspondance de fragments par spectrométrie de masse en tandem. Attribuez un maximum de 20 points à chaque critère.
   2. Appliquez une fenêtre d’erreur de masse ionique précurseur de 100 ppm et une fenêtre d’erreur de masse ion fragment de 50 ppm. N’appliquez pas de fenêtre de temps de rétention fixe.
   3. Conservez les annotations avec un score total d’au moins 40 sur 60. Excluez les annotations de moins bonne note.
3. Définissez explicitement les groupes de comparaison comme suit : A = T0 (avant le sparring), B = T1 (immédiatement après le sparring), et C = T2 (24 h après le sparring).
4. Effectuer des analyses statistiques en aval à l’aide de logiciels de calcul statistique et de logiciels d’analyse associés (voir Tableau des matériaux).
   1. Effectuez une analyse en composantes principales (ACP) après une échelle par variance unitaire et visualisez les graphiques de score.
   2. Construire des modèles partiels d’analyse des moindres carrés discriminants (PLS-DA) et d’analyse orthogonale des moindres carrés partiels discriminants (OPLS-DA) pour A contre B, B contre C et A contre C.
   3. Utilisez la validation croisée à 7 fois lorsque le nombre d’échantillon est au moins 7. Si le nombre d’échantillons est inférieur à 7, on égale le nombre de plis au nombre d’échantillons.
   4. Effectuer 200 tests de permutation pour évaluer la validité du modèle.
   5. Examinez les métabolites différentiels en appliquant les seuils suivants : changement de pli (FC) ≥ 2 ou FC ≤ 0,5, importance variable en projection (VIP) ≥ 1, et test t P. < 0,05.
   6. Générez des graphiques volcaniques et des graphiques statistiques associés pour des comparaisons par paires.
   7. Générez des cartes thermiques en utilisant la matrice transformée en log2 et à l’échelle de variance unitaire.
   8. Générez des cartes thermiques de corrélation avec un seuil de signification de P ≤ 0,05 et affichez jusqu’à 20 métabolites.
   9. Déterminez le nombre optimal de clusters avant le regroupement k-means. Effectuer un regroupement k-means après l’échelle de variance unitaire.
   10. Générez des graphiques en barres d’abondance à partir des intensités de caractéristiques traitées d’origine.
   11. Générez des diagrammes de Venn pour résumer le chevauchement entre comparaisons par paires.
   12. Effectuer une analyse des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) pour certains métabolites. Évaluer la performance diagnostique selon la zone sous la courbe (AUC).
5. Cartographiez les métabolites différentiels aux voies KEGG en utilisant une fonction d’enrichissement des voies dans un paquet bioinformatique approprié (voir Tableau des matériaux).
   1. Interpréter les voies avec P. < 0,05. Aucune correction par tests multiples n’a été rapportée dans le dossier d’analyse finalisé.

Résultats

Contrôle qualité (QC) Validation des données LC-QTOF-MS/MS

Pour évaluer la stabilité et la reproductibilité du signal, des injections répétées de l’échantillon QC regroupé ont été analysées dans les deux modes ioniques. Les coefficients de corrélation de Spearman parmi les injections de QC regroupées dépassaient 0,8 dans les deux modes ioniques, ce qui indiquait une performance stable de l’instrument sur toute la séquence analytique. L’ACP de ...

Discussion

Ce flux de travail standardisé caractérisait les changements métabolitiques associés au combat d’élite en boxe et à la récupération à court terme dans une petite cohorte contrôlée. Les injections de QC groupées, l’analyse de corrélation basée sur la QC, le clustering PCA et les analyses multivariées ont conjointement soutenu une stabilité analytique acceptable. Le succès du protocole dépendait principalement de quatre facteurs : maintenir l’intensité du combat dans 80 % à 85 % de la fréq...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs	Acétonitrile	Merck	Grade LC-MS, CAS 75-05-8
Réactifs	Méthanol	Merck	Grade LC-MS, CAS 67-56-1
Réactifs	Acide formique	TCI	Grade LC-MS, CAS 64-18-6
Consommables	TUBE VACUETTE CAT Activateur de caillots sérums	Greiner Bio-One	Tube activateur de caillots sérumiques de 8 mL
Consommables	Flacon cryogénique Nalgene	Thermo Fisher Scientific	1,5 mL, filetage externe
Consommables	Tube de liaison protéique	Eppendorf	Cat. N° 0030108442, 1,5 mL
Verrerie	Fiole en verre à bouchon vissé avec insert	Agilent	Fiole de 2 mL avec 200 et mu ; Insert en verre en L ; Insérer Cat. N° 5183-2090
Consommables	Filtre Millex-GP	Merck	Cat. Non. SLGP033RS, 0,22 & mu ; Membrane m
Instruments	Ring de boxe personnalisé 6x6 m	Muay Thai Sport	6 et fois ; Anneau d’entraînement de 6 m
Consommables	Gants de boxe Pro Style 2	Everlast	16 oz
Instruments	Polar H10	Polaire	Capteur de fréquence cardiaque à ceinture thoracique
Instruments	Quasar	H/P/Cosmos	Tapis roulant motorisé
Instruments	Centrifugeuse 5425 R	Eppendorf	Microcentrifugeuse réfrigérée
Instruments	Bransonic CPX2800	Emerson / Branson	Bain ultrasonore numérique 40 kHz
Instruments	Savant SpeedVac SPD1030	Thermo Fisher Scientific	Concentrateur à vide intégré
Instruments	Mélangeur VWR Mini Vortex	Avantor / VWR	Cat. N° 10153-688
Instruments	Congélateur TSX ULT	Thermo Fisher Scientific	Modèle TSX50086A
Instruments	ACQUITY UPLC I-Class PLUS	Eaux	Système UHPLC
Instruments	Xevo G2-XS QTof	Eaux	Spectromètre de masse QTOF
Instruments	Colonne T3 ACQUITY UPLC HSS	Eaux	P/N 176001132, 1,8 & mu ; m, 2.1 et multipliés ; 100 mm
Logiciels	MassLynx	Eaux	Version 4.2
Logiciels	Progenesis QI	Eaux	Version 2.3
Logiciels	R	Fondation R pour l’informatique statistique	Version 3.6.1
Logiciels	PRCOMP	R de base	Fonction de base R
Logiciels	ROPLS	Bioconducteur	Paquet R
Logiciels	Pheatmap	CRAN	Paquet R
Logiciels	Corrplot	CRAN	Paquet R
Logiciels	Kmeans	R de base	Fonction de base R
Logiciels	NbClust	CRAN	Paquet R
Logiciels	venn	CRAN	Paquet R
Logiciels	MetaboAnalystR	CRAN / Laboratoire Xia	Version 1.0
Logiciels	pROC	CRAN	Version 1.15.0
Logiciels	clusterProfiler	Bioconducteur	Package Bioconductor
Bases de données	Base de données du métabolome humain (HMDB)	HMDB	Base de données en ligne
Bases de données	Encyclopédie Kyoto des gènes et génomes (KEGG)	KEGG	Base de données en ligne
Bases de données	CARTES DE LIPIDES	CARTES DE LIPIDES	Base de données en ligne