Synthèse verte de nanoparticules d’or et d’argent à l’aide d’extraits végétaux, de filtrats fongiques et de cultures bactériennes

Résumé

Ce protocole décrit des méthodes de synthèse verte reproductibles pour la fabrication de nanoparticules d’or et d’argent à l’aide d’extraits de plantes, de filtrats fongiques et de cultures bactériennes, suivies d’une confirmation par nanoparticules par spectroscopie ultraviolet-visible et microscopie électronique en transmission.

Résumé

La synthèse verte de nanoparticules métalliques (NP) utilisant des systèmes biologiques offre une alternative durable aux méthodes de fabrication chimique conventionnelles. Ce protocole présente des procédures expérimentales et analytiques reproductibles pour la synthèse des NP d’or (Au) et d’argent (Ag) en utilisant des cultures bactériennes, des filtrats fongiques et des extraits de feuilles végétales comme agents réducteurs et stabilisateurs. Les AgNP ont été synthétisés à partir d’extraits de Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicifera et Earliella sp., présentant des bandes d’absorption caractéristiques ultraviolet–visible (UV–Vis) entre 405 et 425 nm qui ont confirmé la formation de NP. Une approche de conception d’expériences a été mise en œuvre pour évaluer l’influence des facteurs environnementaux, notamment les conditions d’oxygène, le pH, la concentration d’AAu, la concentration cellulaire, le type de donneur d’électrons et la température, sur la synthèse des AuNPs par Shewanella oneidensis et Cupriavidus metallidurans. Dans des conditions idéales (0,2 mM Au et pH 5), S. oneidensis produisait principalement des AuNPs sphériques d’une taille moyenne de 43,6 ± 11,0 nm et d’un pic d’absorption caractéristique à 520 nm. La formation et la morphologie NP ont été confirmées par spectroscopie UV–Vis et microscopie électronique en transmission. Ce flux de travail fournit une plateforme reproductible pour la synthèse de NP biogénique et soutient les applications en biodétection, bioremédiation et technologies antimicrobiennes.

Introduction

Les nanoparticules métalliques (NP) possèdent des propriétés physicochimiques uniques associées à leur grande surface, notamment des comportements électroniques, magnétiques et catalytiques distinctifs, ainsi qu’une forte réactivité. Ces caractéristiques ont favorisé leur application dans de nombreux domaines, notamment la médecine pour le diagnostic des maladies et la délivrance de médicaments 1,2,3,4,5,6, les cosmétiques pour les formulations de crème solaire 7, l’électronique pour transistors et cellules^{solaires 8}, l’ingénierie environnementale pour le traitement de^{l’eau 2,9,10}, et l’agriculture pour les engrais et pesticides^11,12. L’expansion continue des applications des NP à travers les disciplines se reflète dans le nombre croissant de publications connexes rapportées ces^{dernières années 13,14}.

Les méthodes synthétiques pour les NP métalliques permettent un contrôle précis de caractéristiques importantes telles que la taille des particules, la morphologie et la stabilité, faisant du processus de synthèse un déterminant critique de la performance des NP. Les méthodes conventionnelles de synthèse chimique ont été largement optimisées ; cependant, ils impliquent fréquemment des réactifs toxiques, une forte consommation d’énergie et des coûts de production^{élevés 14,15}. Ces limitations ont motivé le développement d’alternatives plus vertes et plus durables. Les approches de synthèse verte utilisent des systèmes biologiques tels que les extraits de plantes ^16,17, des micro-organismes tels que les champignons et^{bactéries 18}, et les^{algues 19} comme agents naturels de réduction et de stabilisation. Au cours de ces procédés, les sels métalliques sont réduits à des formes zéro-valentes, générant des NP via des voies écologiques et rentables. De plus, les NP synthétisés biologiquement sont souvent biocompatibles, facilitant leur utilisation dans des applications médicales, agricoles et^{environnementales 8,14}.

Le choix d’une voie biologique appropriée pour la synthèse des NP dépend de l’application prévue, ainsi que des infrastructures et des exigences opérationnelles disponibles. La synthèse à base de plantes est généralement préférée pour une production rapide et peu coûteuse de NP car elle nécessite une manipulation stérile minimale ; cependant, la variabilité de la composition de l’extrait peut affecter la^{reproductibilité 20,21}. La synthèse médiée par les champignons peut fournir des rendements NP élevés et des enzymes extracellulaires qui améliorent la stabilisation du NP et le traitement en aval, bien que cette approche nécessite des périodes de culture plus longues et des conditions de croissance^{contrôlées 22}. En revanche, les systèmes bactériens permettent une synthèse accordable dans des conditions métaboliques définies et une production rapide de biomasse, ce qui les rend adaptés aux études mécanistiques et aux applications associées^{aux NP 22}. Cependant, la synthèse bactérienne nécessite souvent une manipulation stricte de l’aseptique, des conditions contrôlées du bioréacteur et un traitement supplémentaire en aval lorsque les NP intracellulaires sont^{récupérés 21,22.}

Malgré les avantages mentionnés, les méthodes de synthèse verte continuent de rencontrer des défis liés à la reproductibilité et à la standardisation. De plus, les protocoles visuels détaillés étape par étape pour la synthèse verte des NP métalliques restent^{limités à 23}, limitant la capacité des chercheurs à reproduire et à mettre en œuvre avec succès les méthodologies existantes. L’objectif de ce travail est de présenter des protocoles de synthèse verte reproductible pour les NP d’or (Au) et d’argent (Ag) à l’aide d’extraits de plantes, de filtrats fongiques et de cultures bactériennes. Plus précisément, des extraits aqueux de Psidium guayaquilensis et Acanthophora spicifera, des filtrats fongiques extracellulaires d’Earliella sp., ainsi que des systèmes bactériens impliquant Shewanella oneidensis et Cupriavidus metallidurans ont été utilisés pour la synthèse NP. Les protocoles présentés mettent l’accent sur les étapes critiques de la préparation de l’extrait biologique, de la synthèse des NP et de la caractérisation préliminaire des NP. De plus, le flux de travail intègre la conception d’expériences, des procédures de préparation standardisées et la caractérisation en ligne pour soutenir la synthèse de NP biogénique reproductible et optimisable.

Protocole

La recherche a été menée conformément aux directives institutionnelles de l’Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL, Équateur). La biomasse végétale, algal et fongique utilisée dans cette étude a été prélevée dans des environnements accessibles et n’a pas concerné d’espèces protégées ni de zones restreintes. Selon les réglementations institutionnelles et nationales, aucun permis spécifique n’était requis pour la collecte de biomasse librement disponible dans ces conditions. Voir la Figure 1 pour le flux de travail expérimental intégré utilisé pour la synthèse verte des AgNP et AuNPs en utilisant des systèmes biologiques végétaux, algaliques, fongiques et bactériens.

Figure 1 : Flux de travail intégré pour la synthèse verte des nanoparticules d’argent (Ag) et d’or (Au) (NP) à l’aide de systèmes biologiques. Schéma du flux de travail expérimental pour la synthèse verte des AgNP et AuNP utilisant des systèmes végétaux, algaliques, fongiques et bactériens. Le flux illustre la sélection des sources biologiques, la préparation des extraits ou de la biomasse, la réaction avec des précurseurs métalliques (_{AgNO 3} ou_{HAuCl 4}), les conditions de réaction et la formation de NP. Les systèmes biologiques comprennent l’extrait de feuille de Psidium guayaquilensis , l’extrait d’algues Acanthophora spicifera , le filtrat extracellulaire d’Earliella sp., et les cultures bactériennes MR-1 de Shewanella oneidensis . Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

REMARQUE : Respectez toutes les consignes de sécurité des laboratoires institutionnels lors de la manipulation de produits chimiques et de matériaux biologiques. Consultez les fiches de données de sécurité de tous les réactifs avant utilisation.

1. Synthèse des AgNP utilisant les feuilles de P. guayaquilensis

1. Collection de feuilles
   1. Collectez des feuilles fraîches de P. guayaquilensis pendant la saison sèche à Guayaquil, province de Guayas, Équateur (2°10′S, 80°0′O).
      REMARQUE : Des spécimens de référence de cette espèce endémique ont été déposés à l’herbier GUAY, Faculté des sciences naturelles, Université de Guayaquil, Équateur, ainsi qu’à l’herbier Steere du Jardin botanique de New York (NYBG), New York, États-Unis. Des informations supplémentaires sont disponibles à l’adresse : http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. Préparation de l’extrait de feuille
   1. Lavez soigneusement la matière végétale fraîche avec de l’eau distillée.
      REMARQUE : Assurez-vous d’éliminer complètement les impuretés de surface.
   2. Séchez les feuilles dans un séchoir en plateau avec un flux d’air forcé à 40°C.
      REMARQUE : De basses températures de séchage minimisent la dégradation des composés organiques thermolabiles impliqués dans la réduction d’Ag⁺ .
   3. Broyez le matériau séché à l’aide d’un moulin manuel pour obtenir une fine poudre.
   4. Suspendre 10 g de poudre dans 200 mL d’eau distillée.
   5. Chauffez la suspension à 70°C sous un brassage continu pendant 1 heure.
   6. Laissez l’extrait refroidir à température ambiante (RT, ~28°C).
   7. Filtrez l’extrait sous vide à travers du papier filtre de qualité (Grade 1, pore 11 μm, diamètre 110 mm).
      REMARQUE : Retirez tous les résidus solides du matériel végétal.
   8. Conservez l’extrait filtré à 4°C dans des bouteilles ambrées jusqu’à une utilisation ultérieure.
3. Fabrication d’AGNP phytogéniques à partir d’extraits de feuilles
   REMARQUE : Lors des expériences d’optimisation, il faut varier un paramètre par test tout en maintenant les paramètres restants constants. Évaluer la concentration en nitrate d’argent (_{AgNO 3}) (1–5 mM), la fraction d’extraction (10 %–50 % v/v), le temps de réaction (0,5–1 h) et la température (25°C–80°C). Optimiser les paramètres de synthèse en utilisant une méthodologie de surface de réponse basée sur un DoE composite central. Étudiez chaque facteur à cinq niveaux (-α, -1, 0, +1 et +α). On utilise la longueur d’onde du pic de résonance plasmonique de surface (SPR) (λ_SPR), qui correspond à la taille NP, comme variable^{de réponse 24}. Le plan expérimental comprend 16 points factoriels, 8 points axiaux et 5 réplicés au point central, soit un total de 29 expériences.
   1. Préparez des solutions_{d’AgNO 3} en dissolvant la masse appropriée d’AgNO₃ dans de l’eau distillée pour obtenir des concentrations comprises entre 1 et 5 mM.
      ATTENTION :_{L’AgNO 3} est corrosif et un agent oxydant puissant qui peut provoquer des irritations de la peau et des yeux. Portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et une protection oculaire. Éviter l’exposition à la lumière et éliminer les déchets contenant des produits agricoles conformément aux directives de sécurité institutionnelles.
   2. Mélangez la solution d’AgNO₃ avec l’extrait végétal pour obtenir des fractions d’extrait comprises entre 10 % et 50 % (v/v).
   3. Chauffez et remuez le mélange de réaction à la température sélectionnée (25°C–80°C) pour le temps de réaction souhaité (0,5–1 h).
   4. Laissez le mélange de réaction rester à température réactive pendant 24 heures.
   5. Centrifugez le mélange de réaction brune à 1660 × g pendant 15 minutes à RT. Jetez le surnageant et collectez la fraction solide.
   6. Faites sécher les NP récupérés au four à 60°C.

2. Synthèse des AgNP à l’aide d’extraits d’algues A. spicifera

1. Collection d’algues
   1. Collectez les algues A. spicifera à Valdivia, province de Santa Elena, Équateur (1°57′23,91′′S, 80°43′51,33′′W).
2. Préparation de l’extrait d’algue
   1. Préparez l’extrait d’algue en suivant la procédure décrite à l’étape 1.2. Remplacez les feuilles de la plante par la biomasse d’algues d’A. spicifera .
3. Fabrication d’AgNP phycogènes à partir d’extraits d’algues
   REMARQUE : Effectuez une série de 12 expériences en variant un paramètre à la fois tout en gardant les paramètres restants constants. Évaluer la concentration d’AgNO₃ (1–5 mM), la fraction d’extraction (5 %–25 % v/v), le temps de réaction (1–4 h) et la température (25°C–70°C).
   1. Préparez les solutions d’AgNO₃ et l’extraction d’algues comme décrit aux étapes 1.3.1 et 2.2.
   2. Mélangez la solution d’AgNO₃ avec l’extrait d’algues pour obtenir une fraction d’extraction de 5 % à 25 % (v/v). Chauffer et remuer le mélange de réaction à la température sélectionnée (25°C–70°C) pour le temps de réaction souhaité (1–4 h).
   3. Laissez la solution refroidir en RT pendant 24 heures. Collectez la fraction solide après centrifugation et faites-la sécher au four comme décrit aux étapes 1.3.5 et 1.3.6.

3. Synthèse des AgNP utilisant Earliella sp.

1. Collecte et entretien de la culture
   1. Transférer des fragments mycéliaux en croissance active d’Earliella sp. sur des plaques d’agar de pomme de terre dextrose.
      REMARQUE : La souche fongique utilisée dans cette étude a été isolée à partir d’échantillons environnementaux collectés sur le campus de l’ESPOL, en Équateur. L’isolat a été identifié taxonomiquement sur la base de caractéristiques morphologiques et préservé dans la collection de culture du Centre de recherche en biotechnologie de l’Équateur (CIBE, ESPOL) sous le code interne E2. Comme cette souche est maintenue dans une collection institutionnelle et n’a pas été déposée dans un dépôt international, aucun RRID ni numéro d’accès externe n’est disponible.
   2. Incubez les plaques à 28°C pendant 48 heures.
   3. Transférez un fragment mycélial dans le bouillon de dextrose de pomme de terre et faites couver la culture sous agitation constante à 150 tr/min pendant 5 jours.
      REMARQUE : Cette étape favorise la production de biomasse et la sécrétion de métabolites extracellulaires.
   4. Filtrez la culture fongique à travers un papier filtre stérile pour séparer la biomasse mycéliale du bouillon extracellulaire. Prélever le filtrat pour une synthèse NP ultérieure.
      REMARQUE : Le bouillon extracellulaire contient des biomolécules qui agissent comme agents réducteurs et stabilisateurs lors de la synthèse de l’AgNP.
2. Fabrication des AgNP mycogènes
   REMARQUE : Générez 14 conditions expérimentales en variant un paramètre par test tout en maintenant des rapports de volume constants entre le bouillon fongique et la solution_{d’AgNO 3} . Évaluer la concentration d’AgNO₃ (1–10 mM), le pH (4–10 ajusté avec HCl ou NaOH), le temps de réaction (1–4 h) et la température (25°C–70°C).
   ATTENTION : L’acide chlorhydrique (HCl) et l’hydroxyde de sodium (NaOH) sont très corrosifs. Portez un équipement de protection individuelle approprié et effectuez des ajustements de pH lents sous un brassage continu pour éviter les éclaboussures et les surchauffes localisées. Utilisez 1 M de solutions acides ou basiques lors de l’ajustement du pH.
   1. Mélangez le bouillon extracellulaire fongique avec une solution d’AgNO₃ à la concentration souhaitée (1–10 mM) en utilisant un rapport volumique entre 2,5 % et 10 % (v/v) pour obtenir un volume de réaction final de 50 mL. Ajustez le volume de réaction final selon la condition expérimentale testée.
   2. On remue le mélange de réaction à la température sélectionnée (25°C–70°C) pour le temps de réaction souhaité (1–4 h). Laissez la solution refroidir en RT pendant 24 heures. Collectez la fraction solide après centrifugation et faites-la sécher au four comme décrit aux étapes 1.3.5 et 1.3.6.

4. Synthèse des AuNP utilisant C. metallidurans et S. oneidensis

1. Collecte et entretien de la culture
   1. Inoculer des stocks de cellules congelées conservées à 20 % de glycérol à −80°C de C. metallidurans CH34 ou S. oneidensis MR-1 sur des plaques d’agar de soja tryptiques dans des conditions aérobies. Incubez les plaques à 28°C pendant 24 heures.
   2. Sélectionnez une colonie individuelle de chaque assiette et inoculez-la dans 250 mL de bouillon de soja tryptique dans des conditions aérobies. Incubez la culture à 28°C dans un shaker rotatif fonctionnant à 120 tr/min.
   3. Prélèvez les cellules à la phase stationnaire après 72 h d’incubation, lorsque la densité optique à 610 nm (OD₆₁₀) atteint environ 1. Centrifugez les cultures à 10 000 × g pendant 10 minutes à ~20°C.
   4. Lavez les granulés collectés deux fois avec une solution stérile de NaCl à 0,9 % (en semaine). Concentrez les cellules lavées à une valeur OD₆₁₀ d’environ 7.
   5. Générez des stocks de cellules concentrées anoxiques en dégazant les suspensions et en remplissant l’espace de tête avec du gaz_N2 .
2. Fabrication d’AuNP bactériogènes
   REMARQUE : Utilisez une matrice factorielle fractionnaire pour évaluer l’influence des facteurs environnementaux sur la synthèse AuNP²⁵. Construisons la matrice en utilisant 7 facteurs à 2 niveaux sélectionnés selon des études antérieures^26,27. Organisez les expériences dans une matrice orthogonale et randomisez l’ordre expérimental pour minimiser le biais essai-combinaison. L’ordre expérimental résultant est présenté dans Tableau 1.
   1. Dissoudre du trihydrate de chlorure d’or (HAuCl₄) dans de l’eau déionisée pour préparer une solution de réserve à 5 g L⁻¹.
      ATTENTION : HAuCl₄ est toxique et un agent oxydant puissant. Manipulez toutes les solutions à l’intérieur d’une hotte chimique certifiée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité. Évitez le contact avec les matières organiques et jetez les déchets conformément aux protocoles institutionnels de gestion des déchets dangereux.
   2. Préparez les réacteurs expérimentaux en diluant la solution standard à la concentration cible dans une solution de NaCl à 0,9 % (p/v) et en ajustant le pH selon les conditions expérimentales énumérées dans le Tableau 1.
   3. Distribuez 50 mL de la solution métallique préparée dans des flacons propres de sérum de 120 mL. Scellez immédiatement chaque bouteille avec un bouchon en caoutchouc butylique.
   4. Fixez le bouchon avec un joint sertisseur en aluminium et un sertiseur à main. Stériliser les flacons de sérum scellés en autoclavant à 121°C pendant 21 minutes.
   5. Laissez les bouteilles refroidir pour se réchauffer et inspectez visuellement chaque bouteille pour détecter des précipitations.
      REMARQUE : Jetez toutes les bouteilles montrant des précipitations visibles et préparez les réacteurs de remplacement.
   6. Établissement des conditions anoxiques
      1. Connectez chaque bouteille de sérum stérilisée à un système de collecteur de gaz équipé d’une source d’azote de haute pureté (N₂) et d’une pompe à vide.
      2. Générez un espace de tête anoxique en effectuant 21 cycles de purge consécutifs pour chaque réacteur nécessitant des conditions anoxiques selon le tableau 1. Au cours de chaque cycle, appliquer un vide suivi d’un remblai d’azote pendant environ 30 secondes jusqu’à ce que la pression interne revienne à la pression atmosphérique approximative (~1 atm).
         REMARQUE : La vérification directe des conditions anoxiques n’est pas requise ; cependant, l’analyse des gaz en espace de tête, comme la chromatographie en phase gazeuse, peut être utilisée pour confirmer l’élimination de l’oxygène lorsque cela est nécessaire.
         ATTENTION : L’azote gazeux peut déplacer l’oxygène et créer un risque d’asphyxie dans les espaces clos. Assurez-vous d’une ventilation adéquate du laboratoire et vérifiez les connexions sécurisées des conduites de gaz avant utilisation.
      3. Maintenez les réacteurs sous une légère pression positive de_{N 2} après le cycle final de purge.
      4. Étiquetez les réacteurs de 1 à 8 selon l’ordre expérimental. Par exemple, étiquetez la cinquième condition expérimentale comme R5.
   7. Ajout de donneurs d’électrons et inoculation
      1. Injectez le volume requis de solution stérile de donneur d’électrons liquides anoxiques, comme le lactate de sodium, dans la phase liquide des réacteurs désignés selon le Tableau 1 à l’aide d’une seringue et d’une aiguille stériles.
      2. Injecter le volume requis de donneur d’électrons gazeux, tel que H₂, dans l’espace de tête désigné du réacteur à l’aide d’une seringue étanche au gaz.
      3. Inoculez tous les réacteurs biotiques en injectant aseptiquement le volume requis de culture microbienne anoxique concentrée dans la phase liquide.
         REMARQUE : Conserver les cultures concentrées de stock à 4°C avant l’inoculation afin de maintenir la viabilité cellulaire.
   8. Mise en place des expériences de contrôle
      1. Préparez un contrôle abiotique en suivant toutes les étapes décrites à l’étape 4.2 tout en remplaçant l’inoculum microbien par un volume équivalent de milieu de culture anoxique stérile ou de tampon.
      2. Préparez un contrôle des cellules tuées en suivant toutes les étapes décrites à l’étape 4.2 à l’aide d’un inoculum stérilisé par autoclavage.
         REMARQUE : Utilisez les témoins pour prendre en compte la réduction et la biosorption des métaux abiotiques. Préparez le contrôle des cellules tuées en autoclavant des stocks cellulaires viables à 121°C pendant 21 minutes afin d’évaluer la contribution des mécanismes microbiens actifs.
   9. Incubation et temps de réaction
      1. Placez toutes les bouteilles de sérum dans des incubateurs à température contrôlée.
      2. Ajustez la température d’incubation selon les conditions expérimentales spécifiées dans le tableau 1.
      3. Placez les incubateurs sur des plateformes de secouage rotatif et incubez les réacteurs à 120 tr/min.
      4. Laissez les réactions se poursuivre pendant 72 heures.
         REMARQUE : Mettez l’expérience en pause après l’incubation et conservez les flacons de sérum à 4°C jusqu’au traitement de l’échantillon.
         REMARQUE : Quantifier éventuellement le métal dissous résiduel après la biosynthèse NP à l’aide de la spectroscopie d’émission optique plasma couplée inductivement afin d’évaluer l’efficacité de l’élimination des métaux et de distinguer la formation de NP des espèces dissoutes résiduelles.
3. Réplication des conditions optimales
   1. Identifier l’état du réacteur associé au retrait maximal du métal après un criblage primaire et une analyse des données.
   2. Répliquer la condition optimale sélectionnée dans trois bouteilles de réacteur indépendantes afin de confirmer la reproductibilité.
   3. Effectuer la préparation, la mise en place du réacteur et les procédures d’incubation pour les expériences de vérification triple selon les étapes 4.1 et 4.2.
      REMARQUE : Après l’achèvement des expériences, stockez temporairement et identifiez toutes les solutions dissoutes comme déchets aqueux jusqu’à leur élimination par des entreprises certifiées de gestion des déchets conformément au Code organique national de l’environnement et aux directives techniques institutionnelles.

Réacteur / Bactéries	Température (°C)	Atmosphère	Donneur d’électrons	Densité optique (OD610)	pH	[Or] (mM)
1 / CMC	37	N2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	N2	C3H 5O3−	1	1	0.2
3 / SOM	37	O2	C3H 5O3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / SOM	37	N2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H 5O3−	1	5	2
7 / SOM	28	N2	C3H 5O3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

Tableau 1 : Plan expérimental factoriel fractionné utilisé pour la synthèse bactériogène d’AuNP. Ce tableau résume les conditions expérimentales évaluées pour la synthèse d’AuNP en utilisant S. oneidensis MR-1 (SOM) ou C. metallidurans CH34 (CMC). Les variables comprenaient la température d’incubation, l’atmosphère en espace de tête, le donneur d’électrons, la densité optique de l’inocule (OD₆₁₀), le pH de la solution et la concentration initiale d’Au³⁺ .

5. Caractérisation des AgNP et AuNP

REMARQUE : Utilisez la spectroscopie ultraviolet–visible (UV–Vis) comme méthode accessible pour confirmer la formation de NP par résonance plasmonique de surface. Utilisez la microscopie électronique en transmission (MET) pour évaluer directement la morphologie et la taille des NP. Des caractérisations physicochimiques supplémentaires peuvent être réalisées à l’aide de techniques complémentaires telles que la diffusion dynamique de la lumière (DLS), la diffraction des rayons X (XRD), la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et la spectroscopie à dispersion d’énergie (EDS) afin d’évaluer la répartition des tailles, la cristallinité, la chimie des surfaces et la composition élémentaire lorsque une caractérisation plus complète est^{requise 28,29}.

1. Spectroscopie UV–Vis
   1. Installation des instruments
      1. Allumez le spectrophotomètre UV–Vis et laissez l’instrument chauffer pendant au moins 15 minutes pour assurer la stabilité du signal.
      2. Sélectionnez le mode de balayage spectral et configurez la plage de longueurs d’onde de 300 à 800 nm en utilisant un intervalle de données de 1 nm.
2. Préparation de l’échantillon
   1. Collectez des aliquotes de suspensions AgNP ou AuNP fraîchement synthétisées. Diluez les échantillons avec de l’eau distillée lorsque nécessaire pour maintenir des valeurs d’absorption dans la plage de détection linéaire.
3. Mesure UV-Vis des NP
   1. Effectuez la correction de base en utilisant de l’eau distillée comme solution vierge.
   2. Transférez l’échantillon préparé dans une cuvette, placez la cuvette dans le porte-échantillon, et enregistrez le spectre UV–Vis sur la plage de 300 à 800 nm.
   3. Identifier la bande SPR correspondant à la formation NP.
      REMARQUE : Les AgNP présentent généralement des bandes SPR entre 405 et 425 nm, tandis que les AuNP présentent généralement des bandes SPR entre 520 et 550 nm.
4. Microscopie électronique en transmission
   REMARQUE : Analysez la morphologie et la taille des NP à l’aide d’un MET opérant à 80 kV et équipé d’un appareil photo numérique haute résolution.
   1. Transférez 1,5 mL de suspension NP dans un tube centrifugeuse et centrifugez à 5000 × g pendant 5 minutes en RT.
   2. Jetez le surnageant et conservez la pastille.
   3. Ajoutez 1 mL de solution de fixation contenant 4 % de paraformoldéhyde et 5 % de glutaraldéhyde préparée dans un tampon de cacodylate de 0,1 M au pellet. Incubez l’échantillon pendant 25 heures en temps de réanimation. Ensuite, lavez le pellet toute la nuit avec un tampon cacodylate de sodium 0,1 M.
   4. Centrifugez l’échantillon à 5000 × g pendant 5 minutes puis jetez le surnageant.
   5. Ajoutez 1 mL de tétraoxyde d’osmium (_{OsO 4}) à 1 % (p/v) préparé dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M pour fixation pendant 3 heures.
      ATTENTION :_{OsO 4} est hautement toxique et volatile. Manipulez toutes les solutions exclusivement à l’intérieur d’une hotte chimique certifiée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité.
   6. Centrifugez l’échantillon à 5000 × g pendant 5 minutes puis jetez le surnageant.
   7. Déshydratez l’échantillon à l’aide d’une série d’éthanol graduée. Ajoutez 50 % d’éthanol, faites éclore pendant 15 minutes. Répétez la procédure séquentiellement en utilisant 70 % et 90 %. Déshydratation complète avec trois incubations consécutives en éthanol absolu pendant 30 minutes par incubation.
   8. Intégrez la pastille dans de la résine époxy à RT selon les instructions du fabricant.
   9. Préparez des sections semi-fines (~1 μm) et colorez les sections avec du bleu de toluidine pour une observation préliminaire.
   10. Coupez des sections ultrafines (~60 nm) à l’aide d’un couteau diamanté et colorez les sections avec de l’acétate d’uranyle suivi de citrate de plomb.
   11. Montez les sections sur des grilles TEM et chargez-les dans le microscope électronique à transmission.
   12. Acquérir des images TEM pour évaluer la morphologie et la taille des NP.

Résultats

Les AgNP ont été synthétisés avec succès par des voies vertes et biosynthétiques en utilisant différents agents réducteurs biologiques, et des conditions de synthèse idéales ont été identifiées pour chaque méthode. Dans la synthèse verte médiée par l’extrait de feuille de P. guayaquilensis , les conditions optimales consistaient en une concentration d’AgNO₃ de 5 mM, un rapport extracte/solution métallique de 25 % (v/v), une température de réaction de 80°C, et un temps...

Discussion

En comparant les voies de synthèse évaluées en termes de faisabilité, de contrôle de la taille du NP, de coût opérationnel, de reproductibilité et d’efficacité globale du procédé, la synthèse médiée par la plante utilisant l’extrait de feuille de P. guayaquilensis a démontré l’équilibre le plus favorable parmi les méthodes de synthèse d’AgNP étudiées. Ce protocole offrait un meilleur contrôle de la taille des NP grâce à une optimisation systématique et une caractérisation micros...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Absolute ethanol	Merck	E7023	TEM dehydration series
Aluminum crimp seals	Dwk Wheaton	224178-01	Pour les flacons de sérum
Bottles de verre ambré	Duran	2180154	Stockage protégé de la lumière
Spectromètre ATR-FTIR	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Plage spectrale: 300–3600 cm-1
Autoclave	Yamato	SM300	Stérilisation à 121 °C
Bouchons en caoutchouc butyle	Dwk Kimble	73827-21	Scellement hermétique
Centrifugeuse	BIOBASE	BKC-TH20RL	Centrifugeuse de table
Acide chloroaurique trihydraté (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Précurseur d'or
Couteau de diamant	Aurion	Dyatom 45	Sectionnement ultra-mince TEM
Eau distillée ou déminéralisée	Methrom	N/A	Préparation de solution
Résine époxy (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	Milieu d'incorporation TEM
Papier filtre, qualité Grade 1	Merck Whatman	WHA1001110	Taille des pores: 11 µm; diamètre: 110 mm
Spectromètre infrarouge à transformée de Fourier (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Plage spectrale: 300–3600 cm-1
Système de collecteur de gaz	Fabriqué sur mesure	N/A	Pour les cycles de purge
Seringue hermétique	Hamilton	1001 RN	1 mL
Glutaraldéhyde	VWR	219859510	Glutaraldéhyde à 5%, paraformaldéhyde à 4% dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516	Préservation de stock à 20%
Sertisseur manuel	Biomed	USYGQ-20Z	Scellement hermétique des flacons de sérum
Moulin/broyeur manuel	Corona	L10000	Broyage de la biomasse des plantes
Acide chlorhydrique (HCl)	Merck	320331	Ajustement du pH
Gaz hydrogène (H2)	Linde	Grade industriel	Gaz donneur d'électrons
Système ICP-OES	Varian	Vista-MPX	Quantification des métaux
Incubateur	Memmert	SM 400	Incubation à température contrôlée
Four laboratoire	Barnstead	M100	Séchage des nanoparticules
Citrate de plomb	Merck	7398	Coloration TEM
Acide nitrique (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Réactif acide
Gaz d'azote (N2)	Linde	Grade industriel	Conditions anoxiques
Tétroxyde d'osmium (OsO4)	Merck	201030	Fixation TEM
Paraformaldéhyde	VWR	101176-014	Glutaraldéhyde à 5%, paraformaldéhyde à 4% dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M
Agar de Dextrose de Pomme de Terre (PDA)	Merck	110130	Culture fongique
Bouillon de Dextrose de Pomme de Terre (PDB)	Merck	P6685	Milieu microbiologique
Agitateur rotatif	JoanLab	OS-20Pro	Incubation à agitation contrôlée
Flacons de sérum (120 mL)	Wheaton	223748	Verre borosilicaté
Nitrate d'argent (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	Réactif ACS, ≥99,0%
Tampon de cacodylate de sodium	VWR	11650	Glutaraldéhyde à 5%, paraformaldéhyde à 4% dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M
Chlorure de sodium (NaCl)	Carl Roth	3957.1	Solution de lavage à 0,9%
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Ajustement du pH
Lactate de sodium	Sigma-Aldrich	L7022	Donneur d'électrons/source de carbone
Seringues et aiguilles stériles	BD	Diverses	Manipulation de liquides stériles
Plaque de chauffage avec agitation	Biologix	01-310X	Chauffage et agitation
Bleu de toluidine	EMS	DcU-10	Coloration des sections semi-fines
Microscope électronique à transmission (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Équipé d'une caméra numérique haute résolution
Sècheuse à plateau avec flux d'air forcé	Fabriqué à la main	N/A	Séchage de la biomasse à 40 °C
Agar Tryptique Soja (TSA)	Oxoid	CM01301	Milieu microbiologique
Bouillon Tryptique Soja (TSB)	Carl Roth	X938.1	Milieu microbiologique
Acétate d'uranyle	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	Coloration TEM
Spectrophotomètre UV–Vis	Thermo Scientific	Genesys 10S	Analyse spectrale UV–Vis
Pompe à vide	KNF ou équivalent	N 820 G	Pour conditions anoxiques
Matériaux biologiques
Matériel biologique	Source	Identifiant	Commentaires/Description
Acanthophora spicifera	Collection locale	N/A	Biomasse d'algues marines
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	Souche bactérienne
Earliella scabrosa	CIBE-ESPOL	E2	Collection fongique institutionnelle
Psidium guayaquilensis	Collection locale	N/A	Biomasse de plante sauvage
Shewanella oneidensis MR-1	BCCM/LMG	LMG 19005	Souche de collection de cultures