Une méthode pour adapter Euglena gracilis à des substrats à base de manioc pour la culture hétérotrophe

Résumé

Ce protocole décrit la méthode étape par étapes pour adapter Euglena gracilis à des substrats à base de manioc et l’évaluation ultérieure de la croissance, de la viabilité et de la production de biomasse sur plusieurs produits de manioc dans des conditions de culture hétérotrophes.

Résumé

Le traitement du manioc génère des sous-produits riches en nutriments qui restent sous-utilisés en raison de la composition variable, des composés cyanogènes et des communautés microbiennes actives. Ce protocole présente une stratégie d’adaptation en plusieurs étapes pour établir une lignée tolérante au manioc d’Euglena gracilis , adaptée à la culture hétérotrophe dans des substrats dérivés du manioc. La méthode commence par une exposition simultanée des cultures d’Euglena à des milieux de manioc autoclavés et non autoclavés, ainsi qu’à un gradient de concentration de garri de 10 à 30 g/L afin d’évaluer la tolérance à la complexité microbienne et la charge du substrat. Les cultures sont ensuite soumises à un gradient de concentration plus élevé de 30 à 50 g/L afin d’évaluer la performance avec des substrats plus denses. La lignée résultante est comparée à une souche sauvage non adaptée sur cinq produits de manioc ; garri, pulpe séchée, granulés, pelures et aliments pour animaux afin d’évaluer la consistance de croissance des matériaux pertinents pour le champ. Le protocole inclut la mesure des variations de pH, des niveaux de cyanure à l’aide de bandes colorimétriques, et la préparation de biomasse séchée pour l’analyse des protéines basée sur la quantification totale de l’azote. Ensemble, ces procédures fournissent un cadre reproductible pour adapter Euglena gracilis à des substrats dérivés du manioc et pour évaluer la performance de la souche à travers divers produits de manioc. Cette méthode permet le développement de lignées d’algues robustes pour une utilisation dans des applications de biotraitement axées sur le manioc et de valorisation des déchets.

Introduction

Le manioc (Manihot esculenta) est une culture alimentaire et industrielle majeure en Afrique de l’Ouest, produisant des sous-produits transformés tels que le garri, la pulpe séchée, les pelures et les^granulés.

Les substrats dérivés du manioc sont principalement composés de glucides fermentescibles et de nutriments résiduels ainsi que d’une teneur mineure en protéines et fibres, bien que la composition puisse varier selon les conditions de traitement et la matière^{d’origine 2,3}. Ils restent sous-utilisés en raison de leur composition hétérogène, de la présence de glycosides cyanogéniques et de la diversité des communautés microbiennes qui apparaissent lors du traitement et de la fermentation^{traditionnels 4}. Ces caractéristiques posent des défis pour la culture microbienne directe et limitent l’intégration des sous-produits du manioc dans les flux de travail standardisés de bioprocédés. Malgré l’abondance de sous-produits dérivés du manioc, il existe actuellement un manque de méthodes reproductibles et bio-durables pour cultiver des systèmes microbiens sur ces substrats chimiquement complexes et microbio-actifs. Un système de culture capable d’enrichir ou de détoxifier une source alimentaire aussi populaire tout en fonctionnant de manière fiable dans ces conditions permettrait des flux de travail plus durables de transformation du manioc et une utilisation circulaire des ressources.

Euglena gracilis est un flagellé unicellulaire au sein des Euglenozoa⁵ , reconnu pour sa pellicule flexible, sa morphologie dynamique et ses capacités d’encystation réversible en réponse à d’importantes fluctuations de la disponibilité des nutriments, de la pression osmotique et de la composition^{chimique 6}. Son adaptabilité métabolique lui permet également de synthétiser le polysaccharide de stockage^{paramylon 6} et de réguler le pH cellulaire par le métabolisme de l’acide organique. Ces caractéristiques métaboliques, en particulier l’accumulation de paramylons, peuvent améliorer le stockage d’énergie et la tolérance au stress, favorisant la survie et l’adaptation sous les conditions variables de nutriments et de produits chimiques caractéristiques des substrats dérivés du manioc. Ces caractéristiques permettent à E. gracilis de persister dans des conditions d’eau douce chimiquement variables, ce qui en fait un candidat prometteur pour la culture sur des substrats hétérogènes et non^{raffinés 7}.

Lorsqu’elles sont exposées à des substrats chimiquement complexes ou micro-actifs, les cultures d’E. gracilis non adaptées présentent souvent des réponses au stress telles qu’une augmentation de l’enkystasyon et une motilité réduite, tandis que les populations adaptées peuvent maintenir une morphologie et une activité métabolique plus^{stables 8}. Les interactions avec les communautés microbiennes associées peuvent également influencer la performance physiologique lors d’une exposition prolongée à des substrats complexes. Ces caractéristiques soulignent la pertinence des approches basées sur l’adaptation lors de la culture d’E. gracilis sur des matériaux dérivés du^{manioc 9}.

Pour relever ces défis, cette méthode utilise une stratégie d’adaptation par étapes conçue pour acclimater progressivement E. gracilis à des substrats dérivés du manioc. Cette approche intègre une exposition contrôlée à une complexité croissante du substrat et à une activité microbienne, permettant de sélectionner des populations capables de maintenir la viabilité et la croissance dans des conditions de culture hétérogènes. Cette conception permet à E. gracilis d’interagir avec, et potentiellement d’en tirer avantages, le microbiote associé, et de s’adapter à l’augmentation des concentrations de milieux du milieu.

Après adaptation, le protocole mène une évaluation comparative des lignées adaptées et non adaptées d’E. gracilis à travers plusieurs produits dérivés du manioc. Ce cadre comparatif permet d’évaluer la consistance de croissance, la stabilité morphologique et les réponses physiologiques dans des conditions de substrat pertinentes pour le terrain, alors que le processus d’adaptation prépare progressivement E. gracilis à naviguer dans la variabilité des nutriments, les facteurs de stress chimique et l’activité microbienne caractéristiques des sous-produits du manioc.

La méthode intègre une surveillance standardisée des niveaux de pH et^{de cyanure 10} pendant la culture, ainsi que la préparation de la biomasse récoltée pour l’analyse des protéines en aval via la quantification totale de l’azote¹¹, permettant de comparer le potentiel nutritionnel entre substrats et souches. Ensemble, ces mesures soutiennent l’évaluation de la stabilité métabolique, des interactions avec le substrat et des caractéristiques de la biomasse lors de la culture et de l’adaptation au manioc, afin de démontrer que la lignée adaptée d’E. gracilis peut croître de manière robuste et constante sur plusieurs sous-produits du manioc.

Cette méthode convient particulièrement aux laboratoires ou à la recherche appliquée avec accès à une infrastructure microbiologique de base et à des substrats dérivés du manioc disponibles localement. Les considérations pratiques incluent la nécessité d’une manipulation cohérente de milieux hétérogènes, l’accès à la microscopie pour surveiller la santé de la culture, et un contrôle attentif du mélange pour éviter les contraintes de cisaillement pendant la culture.

Protocole

Ce protocole utilise des protistes non pathogènes et des substrats végétaux dérivés du manioc. Effectuer toutes les procédures conformément aux exigences institutionnelles de biosécurité et de sécurité chimique pour les matières végétales cyanogéniques.

1. Préparation et fermentation de milieux à base de manioc

ATTENTION : Les matériaux dérivés du manioc peuvent contenir des glycosides cyanogéniques et libérer du cyanure d’hydrogène dans certaines conditions. Effectuez toutes les étapes de pesée, hydratation, mélange et échantillonnage dans une hotte chimique. Portez une blouse de laboratoire, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité. Décontaminez les surfaces de travail après avoir manipulé des substrats de manioc et éliminez les déchets solides et liquides sous forme de déchets chimiques dangereux conformément aux directives institutionnelles.

1. Préparez les suspensions garri
   Note : Le type sauvage Euglena gracilis a été cultivé dans des conditions d’obscurité constante à 28°C avec des vibrations orbitales à 120 x g. La composition du milieu nutritif hétérotrophe a été préparée sous forme de formulation définie composée de 1,5 % de glucose, 0,5 % d’extrait de levure, 0,1 % de KH2PO4, 0,1 % de MgSO4, 0,2 % (NH4)2SO4, 0,01 % de CaCL2,2H2O plus 0,4 mL/L de solution vitamine bouillante (Vitamine B1 : 2,50g/L ; Vitamine B12 : 12,5 mg/L ; Vitamine B6 : 0,5 mg/L ; Vitamine B7 : 0,025 mg/L) et 2,0 mL/L de solution de stock de métaux traces (Na2EDTA.2H2O : 25,00 g/L ; FeCl3.6H2O : 21,00 g/L ; ZnSO4.7H2O : 11,0 g/L ; MnCl2.4H2O : 4,0 g/L ; CuSO4,5H2O : 0,39 g/L ; H3BO3 : 0,285 g/L ; Na2MoO4,2H2O : 0,9 g/L).
   1. Étiquetez chaque flacon stérile à capsule ventilée de 500 mL avec le type de substrat (garri), la concentration cible (10, 20, 30, 40 ou 50 g ^L-1), l’identification de la réplique et la condition de stérilisation planifiée (autoclavée ou non autoclave).
   2. Placez un bateau de pesée sur la balance analytique et appuyez sur TARE/Zéro pour régler l’affichage à 0,000 g.
   3. Pesez le garri pour correspondre au volume de travail final (par exemple, pour 300 mL, pesez 3,0 g pour 10 g ^L-1, 6,0 g pour 20 g ^L-1, 9,0 g pour 30 g ^L-1, 12,0 g pour 40 g ^L-1, ou 15,0 g pour 50 g ^L-1).
      REMARQUE : La plage de concentration sélectionnée (10–50 g ^L-1) a été conçue pour couvrir des conditions allant de la croissance de base à une forte charge de substrat, permettant d’évaluer l’adaptation à une complexité physicochimique croissante.
   4. Ajoutez aseptiquement le garri pesé dans chaque flasque stérile de 500 mL contenant 300 mL d’eau déionisée ou distillée, puis réappliquez le bouchon ventilé.
   5. Mélangez chaque suspension pendant 3 minutes, jusqu’à homogénéisation du mélange en utilisant l’une des approches suivantes.
      REMARQUE : E. gracilis est sensible au cisaillement mécanique ; Par conséquent, des conditions de mélange ont été choisies pour minimiser le stress induit par l’agitation tout en maintenant un contact adéquat entre les cellules et le substrat.
      1. Pour le mélange manuel, serrez le bouchon ventilé et faites tourner la flasque à la main en cercle pendant 3 minutes jusqu’à ce que les solides soient répartis uniformément.
      2. Pour le brassage magnétique, ajoutez aseptiquement une barre d’agitation stérile à la fiole, placez la fiole sur une plaque de brassage, puis réglez la vitesse à 200 x g pour former un vortex peu profond sans éclaboussures.
   6. Laissez la suspension s’hydrater sans être dérangée pendant 10 minutes à température ambiante (25 °C).
   7. Juste avant la fermentation, homogénéisez doucement le mélange en serrant d’abord le bouchon d’évent et en faisant tourner les flasques à la main pendant 5 fois pour remettre le matériau déposé.
      REMARQUE : Le garri utilisé dans cette étude était un produit dérivé du manioc commercialement disponible. D’après les informations nutritionnelles fournies par le fabricant, il se composait principalement de glucides, avec de faibles quantités de protéines et une teneur en graisses négligeable. Cette composition reflète les substrats typiques de manioc transformés utilisés dans les contextes alimentaires et industriels.
2. Préparez des supports supplémentaires à base de produits de manioc
   1. Étiquetez chaque flasque stérile à capsule ventilée de 500 mL avec le type de substrat (pulpe séchée, granules, pelures ou alimentation animale), la concentration (30 g ^L-1), l’identification de la réplique et la condition de stérilisation (autoclavée ou non autoclave).
   2. Placez un bateau de pesée sur la balance analytique et appuyez sur TARE/Zéro pour régler l’affichage à 0,000 g.
   3. Peser le substrat pour obtenir 30 g ^L-1 en fonction du volume de travail (par exemple, pour 300 mL, pèser 9,0 g).
   4. Ajoutez aseptiquement le substrat pesé dans chaque flasque stérile contenant 300 mL d’eau déionisée ou distillée, puis réappliquez le bouchon ventilé.
   5. Hydratez et mélangez chaque suspension en utilisant l’une des approches suivantes.
      1. Pour le mélange manuel, serrez le bouchon de ventilation et faites doucement tourner la flasque 10 fois toutes les 3 minutes pendant la période d’hydratation.
      2. Pour le brassage magnétique, ajoutez aseptiquement une barre d’agitation stérile et remuez à 200 x g jusqu’à ce que le matériau soit visiblement hydraté et réparti uniformément.
   6. Inspectez visuellement chaque suspension et assurez-vous que les solides sont hydratés et qu’il ne reste pas de gros amas secs.
      REMARQUE : Ne filtrez pas les substrats manioc sauf si cela est nécessaire pour une mesure analytique en aval.
3. Fermentation aérobie de substrats à base de manioc
   1. Confirmez que chaque flasque est équipée d’un bouchon ventilé stérile perméable au gaz pour permettre l’échange de gaz tout en minimisant la contamination environnementale.
   2. Placez les fioles à la verticale à température ambiante (25 °C) dans un espace désigné, à l’écart de la lumière directe du soleil et du flux d’air à fort trafic.
   3. Incubez sans agitation pendant un minimum de 72 heures.
   4. Notez la date et l’heure de début de la fermentation pour chaque flasque et chaque condition.
4. Préparez des médias autoclavés
   1. Après la fermentation, assurez-vous que chaque flasque de 500 mL contient ≤300 mL de liquide (≤ les deux tiers du volume total) afin d’éviter le débordement lors de la stérilisation.
   2. Desserrez le bouchon ventilé en position « serrée aux doigts » adaptée à l’autoclav et appliquez du ruban indicateur autoclave sur la fiole.
   3. Chargez les flasques dans l’autoclave dans un plateau sécurisé pour autoclave et sélectionnez le cycle liquide P13.
   4. Assurez-vous que les paramètres de stérilisation sont à 121 °C pendant 30 minutes (stérilisation liquide) et commencez le cycle.
   5. Après la fin du cycle, laissez la pression de la chambre d’autoclave revenir à la pression atmosphérique avant d’ouvrir la porte. Retirez les flasques à l’aide de gants résistants à la chaleur et laissez-les refroidir à température ambiante.
   6. Conservez les fioles refroidies toute la nuit à température ambiante avant l’inoculation.
      ATTENTION : Les liquides chauds et la vapeur peuvent provoquer des brûlures. Ouvrez lentement la porte de l’autoclave et ne retirez les flasques qu’une fois que la pression s’est égalisée et que les liquides se sont refroidis.
5. Préparez des supports non autoclavés
   1. Utilisez directement un milieu de manioc fermenté sans autoclaver pour préserver les communautés microbiennes indigènes.
   2. Inoculez les milieux non autoclavés immédiatement après la période de fermentation de 72 heures afin de minimiser la contamination environnementale involontaire.
   3. Maintenez une manipulation constante entre les répliques en utilisant le même type de récipient (fioles stériles à bouchon ventilé de 500 mL), le même volume de travail (300 mL) et la même durée de fermentation (≥72h) pour toutes les conditions du substrat.

2. Établissement des cultures de départ d’E. gracilis

1. Entretien des cultures de troupes d’E. gracilis
   1. Inoculez E. gracilis dans un milieu nutritif hétérotrophe frais et incubez les cultures dans l’obscurité totale à 28 °C avec des vibrations orbitales continues à 120 x g jusqu’à ce que les cultures atteignent une croissance logarithmique moyenne.
   2. Examinez les cultures à l’aide d’un microscope optique composé (champ clair) avec un grossissement total de 100× à 400× (10× oculaire avec 10× à 40× objectifs) afin de confirmer la motilité active, la morphologie cellulaire allongée typique et de faibles niveaux d’encystation.
      REMARQUE : La viabilité a été évaluée en fonction de la présence de cellules intactes avec des limites cellulaires définies et un minimum de débris. La motilité active était définie comme un mouvement directionnel observable des cellules dans le champ de vision. La stabilité morphologique a été évaluée en fonction de la prédominance des formes cellulaires caractéristiques et de la faible fréquence des formes effondrées ou très irrégulières.
   3. Excluez les cultures présentant des débris cellulaires excessifs, une morphologie anormale ou une encystation élevée avant d’être utilisées dans les expériences d’adaptation.
2. Préparez l’inoculum pour l’adaptation
   1. Homogénéisez doucement les cultures de démarrage en serrant le bouchon de ventilation et en faisant tourner les flasques à la main pendant 15 secondes pour assurer une répartition uniforme des cellules sans induire de contrainte de cisaillement.
   2. Déterminez la densité cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer.
      1. Mélangez doucement la culture en la faisant tourner à la main pendant 15 secondes.
      2. Pipeter 1,0 mL de culture dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL.
      3. Nettoyez l’hémocytomètre et la couche de couverture avec 70 % d’éthanol et laissez sécher à l’air.
      4. Pipettez 10 μL de culture sur les deux grilles de l’hémocytomètre et placez la gaine de couverture sur l’échantillon humide.
      5. En utilisant la microscopie en champ clair (objectif 10×), concentrez-vous sur la grille et comptez les cellules dans un ensemble défini de carrés (par exemple, les 4 carrés d’angle de la grande grille).
      6. Appliquer les règles standard de limite (compter les cellules touchant les bordures supérieure et gauche ; exclure les cellules touchant les bordures inférieure et droite).
      7. Répétez les comptes sur la seconde chambre (et/ou rechargez) et calculez la moyenne de cellules/mL.
      8. Calculez la densité cellulaire à l’aide de l’équation suivante : cellules/mL= (moyenne des cellules par carré × 10^{facteur de dilution 4×})/1
         Note : Pour améliorer la visualisation des cellules, diluez l’échantillon avec de l’eau déionisée selon les besoins (par exemple, prélever une aliquote de 100 μL de l’échantillon et diluer dans 600 μL d’eau déionisée, puis répéter l’évaluation de la densité cellulaire)
   3. Ajustez les volumes d’inoculation pour obtenir un inoculum final de 5 % (v/v) sur tous les milieux expérimentaux.
      REMARQUE : Les ratios d’inoculation sélectionnés sont choisis pour garantir une densité cellulaire initiale suffisante et le maintien des cultures.
   4. Préparez des inocules séparés pour chaque condition de traitement afin de maintenir des densités cellulaires initiales constantes entre les groupes expérimentaux.

3. Adaptation initiale dans les médias de manioc autoclavés et non autoclavés

1. Supports d’adaptation inoculés
   REMARQUE : Les volumes d’inocule ont été sélectionnés pour équilibrer une densité cellulaire initiale suffisante avec une sensibilité aux effets d’adaptation, avec des volumes plus faibles utilisés lors de l’adaptation précoce et des volumes plus élevés pour maintenir des cultures stables lors du passage de routine.
   1. Ajouter l’inoculum préparé à E. gracilis dans des milieux de manioc autoclavés et non autoclavés préparés à des concentrations finales de garri de 10 ^gL-1, 20 ^gL-1 et 30 ^gL-1.
   2. Utiliser des volumes d’inoculation égaux dans toutes les conditions de traitement pour standardiser la densité cellulaire initiale.
   3. Pour mélanger les cultures, serrez le bouchon ventilé et faites tourner doucement la fiole en cercle pendant 15 secondes pour répartir les cellules.
   4. Incuber les cultures dans l’obscurité totale à 25 °C pour initier la croissance hétérotrophe.
2. Maintenir les conditions de culture
   1. Pour les milieux non autoclavés, minimisez l’agitation afin de préserver la structure de la communauté microbienne native et la stratification du substrat.
   2. Mélangez toutes les cultures une fois par jour en faisant un léger tourbillonnage manuel pendant 15 secondes pour maintenir le contact entre les cellules d’E. gracilis et le matériau de manioc en suspension.
      ATTENTION : Évitez les secouements vigoureux ou l’agitation continue afin d’éviter les contraintes de cisaillement et la perturbation involontaire des interactions microbien-substrat.
3. Adaptation précoce du surveiller
   1. Toutes les 48 heures, prélèvez aseptiquement 1 mL d’échantillons de chaque culture à l’aide de pointes de pipette stériles.
      1. Serrez le bouchon ventilé et faites doucement tourner la fiole de culture pendant 15 secondes avant l’échantillonnage pour assurer une répartition uniforme des cellules et des matériaux en suspension.
      2. Transférez une aliquote de culture dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL.
      3. Diluez l’échantillon avec de l’eau déionisée selon les besoins pour améliorer la visualisation des cellules individuelles. (par exemple, 100 μL d’échantillon dilué dans 600 μL d’eau déionisée).
      4. Préparez une lame de microscopie montée à l’eau en pipotetant 10 μL de l’échantillon dilué sur une lame de microscope propre et couvrez avec une lame de couvercle.
   2. Évaluer les cultures par microscopie optique
      1. Examinez les échantillons à l’aide d’un microscope optique composé (champ clair) à un grossissement total de 100× à 400× (10× oculaire avec 10× à 40× objectifs).
      2. Évaluer la motilité cellulaire, la morphologie et la fréquence des encystations comme indicateurs de l’état d’adaptation.
         REMARQUE : La viabilité a été évaluée en fonction de la présence de cellules intactes avec des limites cellulaires définies et un minimum de débris. La motilité active était définie comme un mouvement directionnel observable des cellules dans le champ de vision. La stabilité morphologique a été évaluée en fonction de la prédominance des formes cellulaires caractéristiques et de la faible fréquence des formes effondrées ou très irrégulières.
4. Exécution du passage en série pendant l’adaptation
   REMARQUE : Les intervalles d’échantillonnage et de transfert sont fournis selon des plages définies afin de s’adapter à la variabilité de la dynamique de croissance tout en maintenant une synchronisation expérimentale cohérente entre les réplications.
   1. Tous les 7 jours, transférez aseptiquement 20 % (v/v) de chaque culture dans un milieu de manioc fraîchement préparé de la même concentration de garri et de même condition de stérilisation.
   2. Maintenir des volumes de transfert constants entre les passages pour préserver la pression de sélection.
   3. Répétez le passage en série jusqu’à ce que les cultures présentent une croissance constante, une motilité soutenue et une faible fréquence d’encystation dans un milieu manioc ^L-1 de 30 g.
      Point de pause : Les cultures peuvent rester intactes jusqu’à 24 heures entre les étapes de mélange et d’échantillonnage de routine.

4. Sélection à haute concentration (30–50 g/L)

1. Préparer des substrats à forte charge
   1. Préparez des milieux de manioc à base de garri à des concentrations finales de 30 ^gL-1, 40 ^gL-1 et 50 ^gL-1 en suivant les procédures décrites dans la Méthode 1.
   2. Laissez les substrats s’hydrater complètement pendant la période de fermentation afin d’assurer une exposition uniforme des cellules aux composants dissous et particulaires.
   3. Resuspendez doucement les particules déposées en faisant tourner les flasques à la main pendant 10 à 15 secondes juste avant l’inoculation.
2. Inoculer les cultures à forte charge
   1. Inoculez chaque milieu de manioc à haute concentration avec 5 % (v/v) de la lignée d’E. gracilis précédemment adaptée à 30 ^gL-1 garri.
   2. Standardisez les volumes d’inoculation à toutes les concentrations afin de maintenir des densités cellulaires initiales comparables.
   3. Incuber les cultures dans l’obscurité totale à 25 °C avec des secouements orbitaux continus à 120 x g pour maintenir des conditions de croissance hétérotrophes.
   4. Mélangez les cultures une fois par jour en faisant légèrement tournoyer manuellement pendant 15 secondes pour maintenir le contact entre les cellules et le substrat en suspension sans induire de contrainte de cisaillement
3. Surveille les performances sous une forte charge de substrat
   1. Inspectez les cultures toutes les 48 heures pour détecter des changements visibles de turbidité, de pigmentation et d’interaction entre les cellules d’E. gracilis et le matériau sédimentaire de manioc.
   2. Collecter aseptiquement de petites aliquotes et examiner les cellules à l’aide d’un microscope optique composé à un grossissement total de 100× à 400× (10 × oculaires avec 10× à 40 × objectifs).
   3. Évaluer la motilité, la morphologie cellulaire et la fréquence des encystations comme indicateurs de tolérance physiologique à une concentration accrue dans le substrat (voir la Méthode 2).
4. Confirmer l’adaptation à de fortes concentrations de substrat
   1. Identifier les cultures qui maintiennent une motilité soutenue, une morphologie cohérente et une faible fréquence d’encystation à des concentrations de manioc de ≥40 g ^L-1.
   2. Désigner les cultures répondant à ces critères comme la lignée gracilis adaptée au manioc pour une évaluation expérimentale ultérieure.

5. Tests comparatifs de croissance dans les médias produits de manioc

1. Préparer des conditions de test par paires
   1. Pour chaque produit de manioc, y compris le garri, la pulpe séchée, les granulés, les pelures et les aliments pour animaux, préparez deux récipients identiques contenant la même concentration et le même volume de substrat.
   2. Inoculer un vaisseau avec la lignée adaptée au manioc E. gracilis et le vaisseau apparié avec la souche sauvage non adaptée.
   3. Utilisez des volumes d’inoculation égaux pour chaque condition appariée afin d’assurer des densités cellulaires initiales comparables entre les lignées
2. Maintenir des cultures appariées
   1. Incuber toutes les cultures appariées dans l’obscurité totale à 25 °C avec des secouements orbitaux continus à 120 x g pour maintenir des conditions de croissance hétérotrophes.
   2. Mélangez les cultures une fois par jour par inversion manuelle douce pour maintenir le contact entre les cellules et le substrat en suspension.
   3. Enregistrer des changements visibles, notamment la turbidité, la pigmentation et les schémas de décantation, tout au long de la période d’incubation.
3. Enregistrer les différences morphologiques observées
   1. À des intervalles d’échantillonnage définis, il faut prélever aseptiquement des aliquotes de chaque culture pour une analyse microscopique (voir la méthode 2.2 pour la collecte des aliquotes et l’analyse au microscope)
   2. Examinez les échantillons à l’aide d’un microscope optique composé (champ clair) à un grossissement total de 100× à 400× (10× oculaire avec 10× à 40× objectifs).
   3. Documentez les différences entre cultures adaptées et sauvages en ce qui concerne la motilité, la fréquence des encystations et la morphologie cellulaire globale.

6. Surveillance du pH

1. Prélève des échantillons de pH
   1. Aux jours 0, 3, 6, 9 et 12, prélèvez aseptiquement 1 mL de culture de chaque condition expérimentale à l’aide de pointes de pipette stériles.
   2. Laissez les échantillons reposer sans être dérangés pendant 2 minutes afin de permettre la déposation des solides en suspension.
   3. Transférez soigneusement le surnageant clarifié dans un tube de microcentrifuge propre sans déranger le matériau déposé.
2. Mesurer le pH
   1. Calibrez le pHömètre selon les instructions du fabricant en utilisant des tampons standard appropriés avant la mesure.
   2. Insérer la sonde de pH calibrée dans le surnageant clarifié sans déranger de matière déposée résiduelle.
   3. Notez les valeurs de pH immédiatement après la stabilisation de la lecture du pH.
   4. Rincez soigneusement la sonde avec de l’eau déionisée entre les échantillons pour éviter toute contamination croisée.

7. Test du cyanure utilisant des bandes colorimétriques

ATTENTION : Les surnatants contenant du cyanure sont dangereux. Effectuez toutes les étapes de prélèvement et de test dans une hotte chimique ou dans un espace bien ventilé. Portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et une protection oculaire. Évitez le contact direct de la peau avec des échantillons et des bandelettes de test et jetez les bandes usagées et les déchets liquides conformément aux directives institutionnelles pour l’élimination des déchets chimiques dangereux.

1. Prélève des échantillons de cyanure
   1. Aux jours 0, 4, 8 et 12, retirez aseptiquement 1 mL de surnageant de culture de chaque condition expérimentale à l’aide de pointes de pipette stériles.
   2. Laissez les échantillons reposer sans être dérangés pendant 2 minutes afin de permettre la déposation des solides en suspension.
   3. Collectez soigneusement le surnageant clarifié sans déranger les particules.
2. Effectuer un test colorimétrique au cyanure.
   1. Immergez un test de bande de test au cyanure colorimétrique dans le surnageant clarifié pendant la durée spécifiée par le fabricant.
   2. Retirez la bande et laissez un développement complet des couleurs pendant le temps recommandé dans des conditions ambiantes.
   3. Comparez la bande développée à l’échelle de référence fournie par le fabricant pour déterminer la concentration de cyanure.
3. Niveaux records de cyanure
   1. Notez les concentrations de cyanure pour chaque échantillon à tous les moments selon l’échelle de référence.
   2. Photographiez chaque bande de test développée à côté de l’échelle de référence ou conservez la bande selon les recommandations du fabricant pour une vérification future.

8. Entretien et consolidation des cultures adaptées d’E. gracilis

1. Combinez les cultures adaptées
   1. Après une adaptation réussie à des concentrations de manioc de ≥40 ^gL-1 garri, on confirme visuellement la présence de cellules viables d’E. gracilis dans chaque culture réplicée.
   2. Combinez délicatement toutes les fioles répliquées de la lignée adaptée en un seul vaisseau stérile en utilisant une technique aseptique pour générer une culture maîtresse homogène.
2. Préparez le support de maintenance
   1. Préparez des milieux frais à base de manioc à la concentration de maintien sélectionnée en suivant les procédures décrites dans la Méthode 1.
   2. Sélectionnez des milieux autoclavés ou non autoclavés en fonction des besoins expérimentaux en aval.
   3. Maintenez la même condition de stérilisation sur tous les passages suivants afin d’assurer la cohérence de l’exposition aux micros.
3. Inoculer les cultures d’entretien
   1. Inoculez un milieu d’entretien frais avec 20 % (v/v) de la culture maître consolidée.
   2. Mélangez doucement les cultures en tourbillonnant manuellement pour répartir les cellules uniformément sans induire de contrainte de cisaillement.
   3. Incuber les cultures dans l’obscurité totale à 25 °C avec des vibrations orbitales continues à 120 x g pour maintenir des conditions de croissance hétérotrophes.
4. Effectuer la maintenance et le passage réguliers
   1. Maintenir les cultures par une inversion manuelle douce une fois par jour afin d’éviter une sédimentation prolongée des cellules et du substrat.
   2. Tous les 30 jours, consolidez les cultures d’entretien en combinant des flasques réplicatives à l’aide d’une technique aseptique.
   3. Re-inoculez des milieux d’entretien frais à l’aide de la culture consolidée comme décrit à la Section 8.3.
5. Surveiller la stabilité de la culture
   1. À chaque passage, évaluer la morphologie et la motilité cellulaires à l’aide d’un microscope optique composé (champ clair) à un grossissement total de 100× à 400× (10× oculaire avec 10× à 40× objectifs).
   2. Des changements enregistrés vers une augmentation de l’enkysmatisation, l’accumulation de débris cellulaires ou une réduction de la motilité comme indicateurs d’une stabilité de la culture en déclin.

9 Récolte de biomasse pour l’analyse des protéines en aval

1. Prélèvement d’échantillons de culture
   1. À l’extrémité souhaitée, transférez les volumes de culture dans des tubes centrifuge stériles.
   2. Assurez-vous que les échantillons représentent la culture complète en mélangeant doucement en faisant tourner les flasques avant le transfert.
2. Récolte de la biomasse par centrifugation
   1. Centrifugez les échantillons à ≥3 500 × g pendant 10 minutes pour pelleter la biomasse. Répétez cette étape si les sédiments ne se sont pas complètement déposés.
   2. Confirmez la formation d’une pelote à cellules compactes au fond du tube.
3. Supprimer le surnageant
   1. Décantez soigneusement ou pipettez le surnageant sans déranger la pellete.
   2. Éliminer le surnageant selon les protocoles de gestion des déchets de laboratoire.
4. Préparer la biomasse pour l’analyse en aval
   1. Conservez la granule cellulaire pour un traitement ultérieur (par exemple, séchage, stockage ou analyse des protéines).
   2. Si elles ne sont pas traitées immédiatement, conservez les granulés à 4 °C pour une utilisation à court terme ou congelez-les selon le cas pour un stockage à long terme.

10. Gestion et archivage des données

1. Organiser un ensemble de données
   1. Entrez toutes les mesures quantitatives, y compris le pH, la concentration de cyanure, les évaluations de viabilité, le nombre de cellules et les valeurs de biomasse, dans un tableau électronique marqué.
   2. Sauvegardez les images de microscopie et les notes d’observation associées à l’aide de noms de fichiers standardisés indiquant le type de substrat, la concentration, l’identité de la souche, le numéro de réplication et la date d’échantillonnage (par exemple, 25-01-NAG40G_WT1_05).
2. Préparer des ensembles de données pour l’analyse
   1. Vérifiez que toutes les réplications expérimentales et les moments programmés sont représentés et complets dans l’ensemble de données.
   2. Numérisez toutes les notes manuscrites de laboratoire et sauvegardez tous les fichiers électroniques pour un stockage sécurisé afin d’éviter la perte de données. L’analyse des données et la génération de figures ont été réalisées à l’aide d’un logiciel de tableur (Microsoft Excel) et, le cas échéant, de R (R Foundation for Statistical Computing). Toutes les analyses de crottage peuvent être reproduites à l’aide de calculs basés sur des tableaux, R étant utilisé uniquement pour la visualisation complémentaire.

Résultats

Les résultats représentatifs suivants illustrent les résultats attendus lorsque le protocole décrit est appliqué avec succès, ainsi que la gamme des résultats observés dans des conditions sous-optimales. Les données représentatives correspondant à ces résultats sont présentées dans la Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, Figure 5, Figure 6, Figure 7. Ensemble, ces résultats fournissent des conseils pratiques pour interpréter la dynamique de croissance, la viabilité, la morphologie et les résultats protéiques lors de l’adaptation d’E. gracilis à des substrats à base de manioc dans des conditions de culture hétérotrophes et entièrement sombres. De plus, ces résultats valident les principaux résultats biologiques du protocole, notamment une adaptation réussie, une croissance soutenue, une grande viabilité, une morphologie stable, une performance constante à travers les substrats et une production de protéines mesurable.

Tout au long des expériences, trois réplications par traitement (tous types de milieux de manioc) ont été utilisées. Nous reconnaissons que le nombre de réplications dépend de la discrétion et des limites logistiques de tout groupe suivant les protocoles ci-dessus. L’application réussie de ce protocole aboutit à une croissance hétérotrophe soutenue d’E. gracilis dans des milieux à base de garri dans des conditions entièrement sombres. Les résultats positifs se caractérisent par des trajectoires de croissance sigmoïdes et fluides, une divergence limitée entre les réplicés et des densités cellulaires stables en phase tardive. Les traits morphologiques qui ont signifié des résultats positifs et ont été observés de manière constante dans des populations adaptées comprenaient la rondeur cellulaire et l’épaisseur des membranes cellulaires. En revanche, les cellules effondrées malades apparaissent généralement irrégulières, fragmentées ou structurellement compromises et sont associées à une viabilité réduite, les distinguant des formes intactes, arrondies ou semi-encisées observées dans des cultures adaptées. À titre de référence, des images représentatives d’E. gracilis de type sauvage présentant une morphologie allongée caractéristique sont incluses (Figure 8) afin de distinguer la structure cellulaire de base des formes adaptées ou modifiées. Les cultures cultivées à 30 g de ^L-1 garri ont montré une croissance intégrée plus élevée, mesurée par la surface sous la courbe de croissance (AUC), comparée à des concentrations plus faibles, ce qui suggère une utilisation plus efficace du substrat de manioc et une adaptation physiologique réussie (Figure 1).

Les résultats sous-optimaux sont couramment observés à des concentrations de garri plus faibles (10–20 g ^L-1), où la croissance est détectable mais réduite en intensité et plus variable selon les réplications. À des concentrations plus élevées (40–50 g ^L-1), les cultures peuvent atteindre des densités cellulaires maximales élevées ; cependant, ces conditions présentent fréquemment une stabilisation retardée ou une variabilité temporelle accrue (Figure 2).

Dans les expériences réussies, la viabilité cellulaire reste élevée tout au long de la période de culture, avec seulement de légères fluctuations en milieu d’expérience. Les tests d’exclusion du bleu de trypan indiquent que les cultures maintenues à 30 g de ^L-1 garri conservent une forte proportion de cellules viables (non colorées) par rapport aux cellules non viables (colorées en bleu) à travers les périodes échantillonnées (Figure 3). Les écarts par rapport à ce schéma, notamment une proportion accrue de cellules colorées, une motilité réduite ou des déplacements vers des morphologies arrondies ou effondrées, peuvent indiquer des conditions sous-optimales et servir de déclencheurs précoces au dépannage. Les évaluations de viabilité et morphologique étaient basées sur des critères d’observation cohérents, incluant l’intégrité cellulaire, la motilité directionnelle et la prévalence relative des formes allongées versus arrondies ou effondrées.

Les résultats sous-optimaux se caractérisent par des réductions transitoires de viabilité, le plus souvent observées à des concentrations de garri plus élevées. Une récupération partielle peut être observée à des moments ultérieurs ; cependant, ces conditions présentent une variabilité accrue de la viabilité sur la période de culture (Figure 4). Ces schémas de croissance montrent que les concentrations intermédiaires de substrat (par exemple, 30 g ^L-1) assurent un équilibre entre la disponibilité des nutriments et le stress, ce qui entraîne une croissance plus stable. Ces tendances reflètent l’impact des conditions de prétraitement et de l’adaptation progressive sur la performance des cultures, car l’exposition progressive à une complexité croissante du substrat favorise une meilleure stabilité physiologique et un comportement de croissance reproductible. Des concentrations plus faibles limitent la production de biomasse, tandis que des concentrations plus élevées entraînent une plus grande variabilité et un retard de stabilisation.

L’évaluation morphologique fournit un indicateur qualitatif du statut d’adaptation. Les résultats positifs incluent l’émergence et la persistance de cellules arrondies ou semi-encisées avec une motilité réduite qui restent intactes à travers des sous-cultures répétées (Figure 5).

En revanche, les cultures sous-optimales, principalement associées à des souches sauvages ou à des adaptations précoces, présentent des transitions brusques de cellules allongées et mobiles à des morphologies irrégulières ou effondrées qui coïncident avec une stabilité de croissance réduite.

Lorsque le protocole est appliqué à d’autres substrats dérivés du manioc, y compris la pulpe, les granulés et les pelures, les cultures adaptées d’E. gracilis présentent une croissance reproductible sur plusieurs types de substrats. Les résultats positifs se caractérisent par une stabilisation plus précoce des courbes de croissance et une diminution du déclin en phase avancée par rapport aux cultures de type sauvage (Figure 6).

Les résultats sous-optimaux incluent un début de croissance retardé ou une variabilité accrue de la réplication, en particulier dans les substrats à plus grande hétérogénéité physique.

La mise en œuvre réussie du protocole donne une biomasse d’E. gracilis avec une teneur en protéines brutes mesurable, quantifiée par analyse en laboratoire externe utilisant la méthode de combustion (Dumas). Les pourcentages de protéines observés dans les cultures adaptées sont comparables à ceux mesurés dans les cultures de type sauvage, avec une production totale plus élevée correspondant à une accumulation accrue de biomasse (Figure 7).

La surveillance de la chimie des médias a soutenu les interactions culture-substrat lors de l’adaptation et a validé l’inclusion des mesures de pH et de cyanure dans le protocole. Les valeurs de pH ont montré des changements progressifs au fil du temps, indiquant une activité métabolique et une utilisation du substrat, avec des tendances plus stables dans les cultures adaptées. Les mesures au cyanure ont également confirmé cela, les cultures adaptées montrant des réductions des niveaux détectables, tandis que les cultures sauvages restaient plus variables. Ensemble, ces résultats démontrent que ces étapes de suivi capturent efficacement les changements dans la chimie des médias liés à l’adaptation et soutiennent l’interprétation de la performance culturelle. Bien que les mécanismes sous-jacents n’aient pas été étudiés, cela représente un domaine important pour de futures recherches, en particulier pour des applications à l’échelle industrielle.

Le flux de travail de maintenance et de consolidation à long terme a soutenu la viabilité continue de la lignée adaptée d’Euglena gracilis sur de longues périodes de culture. Les cultures maintenues par des passages répétés conservaient systématiquement la motilité, la morphologie caractéristique et un comportement de croissance stable sur les cycles de maintenance. Bien que la performance à long terme n’ait pas été évaluée quantitativement, ces observations fournissent des preuves représentatives que la lignée adaptée peut être maintenue de manière fiable dans les conditions spécifiées.

Ensemble, ces résultats confirment que le protocole d’adaptation soutient une croissance robuste, une viabilité et une production de biomasse d’E. gracilis sur des substrats à base de manioc, avec des performances constantes et des niveaux de cyanure réduits au fil du temps.

Toutes les figures et tableaux sont fournis comme des fichiers séparés et ne sont pas intégrés dans le document manuscrit. Les préférences de placement des figures et des tables sont indiquées dans le texte du manuscrit à l’aide de notes entre crochets (par exemple, (Figure 1)). Sauf indication contraire, tous les chiffres et tableaux doivent apparaître sous la section Résultats Représentatifs dans la publication finale.

Toutes les figurines sont soumises sous forme de fichiers individuels, avec des figurines multipanneaux fournies sous forme d’une seule image combinée. Les images de microscopie comportent des barres d’échelle dans chaque panneau. Les figures de données incluent des axes étiquetés avec des unités de mesure définies, et les barres d’erreur sont spécifiées dans les légendes correspondantes.

Tous les tableaux sont soumis sous forme de fichiers .xls ou .xlsx individuels et contiennent des données numériques brutes ou résumées sans mise en page décorative.

Figure 1 : Dynamique de croissance d’E. gracilis cultivée à 10, 20 et 30 gL-1 garri dans des conditions entièrement obscures. Les densités moyennes des cellules sont indiquées dans le temps pour chaque concentration de substrat. Les barres d’erreur représentent le SEM entre réplications biologiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Performance de croissance d’E. gracilis à des concentrations élevées de garri (30–50 g ^L-1). Les trajectoires de densité cellulaire illustrent les différences de densité de pic, de temps de stabilisation et de variabilité à travers des concentrations de substrat plus élevées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Tendances de viabilité cellulaire d’E. gracilis cultivées à 30 ^gL-1 garri mesurées par exclusion de Trypan Blue. La proportion de cellules viables est indiquée à travers les points temporels échantillonnés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Fluctuations de viabilité d’E. gracilis cultivées à des concentrations garri plus élevées. Les changements transitoires de viabilité cellulaire sont montrés tout au long de la période expérimentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Morphologie représentative des populations adaptées d’E. gracilis. Des images représentatives de microscopie optique inversée montrent des cellules arrondies et semi-enquistées observées après adaptation. Barre d’échelle = XX μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Performance de croissance d’E. gracilis adapté et de type sauvage sur des substrats dérivés du manioc. Les trajectoires de croissance sont indiquées pour les cultures adaptées et sauvages cultivées sur plusieurs produits de manioc. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : Teneur en protéines brutes et production totale de protéines de la biomasse d’E. gracilis cultivée en manioc. La teneur en protéines a été quantifiée par analyse externe à l’aide de la méthode de combustion SGS (Dumas). La production totale de protéines est affichée parallèlement à l’accumulation de biomasse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 8 : Morphologie représentative de l’E. gracilis sauvage dans des conditions standard (grossissement 40X). Image représentative d’Euglena gracilis saine et non adaptée montrant une morphologie allongée caractéristique sous microscopie optique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

Un facteur central du succès de ce protocole est l’équilibre entre la concentration dans le substrat de manioc et la stabilité physiologique lors de la culture hétérotrophe d’E. gracilis. Les matériaux dérivés du manioc introduisent une hétérogénéité physique, des particules résiduelles et une cinétique de libération de nutriments variable qui influence directement le comportement de croissance et la stabilité de la culture ^2,3. Parmi les étapes du protocole, la préparation du substrat et la sélection de la concentration représentent donc les points de contrôle les plus sensibles. Comme le démontrent les Résultats Représentatifs, les concentrations intermédiaires de substrats soutiennent de manière fiable une croissance soutenue avec une divergence de réplication limitée, tandis que des concentrations plus faibles limitent l’accumulation de biomasse et des concentrations plus élevées augmentent la variabilité temporelle et les réponses aux contraintes transitoires. Ces résultats soulignent qu’une charge maximale du substrat n’assure pas nécessairement une performance optimale ou stable lors du travail avec des matériaux agro-industriels hétérogènes. Les étapes de prétraitement sélectionnées et les plages de concentration du substrat ont été conçues pour défier progressivement E. gracilis sous une complexité chimique et microbienne croissante. Les différences observées de stabilité et de viabilité de la croissance à travers ces conditions confirment la validité de cette approche par étapes et confirment que les concentrations intermédiaires dans les substrats offrent un équilibre entre la disponibilité des nutriments et le stress physiologique.

La manipulation de la culture lors de la croissance hétérotrophe influence encore les résultats d’adaptation. Un mélange constant mais doux dans des conditions entièrement sombres était essentiel pour maintenir le contact entre les cellules d’E. gracilis et le substrat en suspension tout en évitant une contrainte de cisaillement excessive. Un mélange insuffisant favorisait la sédimentation et localisait les gradients de nutriments, confondant à la fois les mesures de croissance et de viabilité, en particulier dans les milieux non^{autoclavés 12}. Ces observations s’alignent avec des rapports précédents montrant que l’hétérogénéité spatiale et l’exposition inégale du substrat peuvent obscurcir les réponses physiologiques dans les systèmes de culture microbienne. Le protocole met donc l’accent sur l’inversion de routine plutôt que sur l’agitation continue, comme compromis pratique entre homogénéité et intégrité de la culture.

Pour s’adapter à la variabilité inhérente aux substrats basés sur le manioc, le protocole intègre plusieurs points de dépannage et de flexibilité. L’autoclavage des milieux fermentés de manioc a amélioré la consistance à court terme en réduisant la charge microbienne et en modifiant la structure du substrat, notamment lors des premiers stades d’adaptation. En revanche, les milieux non autoclavés peuvent être utilisés efficacement après une adaptation réussie, à condition que la densité et le mélange des inoculations soient suffisants pour maintenir une croissance stable. Cette approche par étapes est cohérente avec des études antérieures montrant que la pression sélective progressive permet aux populations microbiennes de tolérer une complexité environnementale croissante au fil du^{temps 13,14}. La surveillance longitudinale était essentielle dans ce contexte, car les réductions transitoires de croissance ou de viabilité se sont fréquemment rétablies lors des passage suivants sans compromettre le succès global de l’adaptation.

Les tests de viabilité et la surveillance morphologique ont servi d’outils de diagnostic rapide tout au long du processus d’adaptation. L’exclusion du bleu de Trypan fournissait un indicateur quantitatif de la robustesse physiologique, tandis que l’évaluation de la motilité et de l’encystation par microscopie a permis d’alerter précocement des conditions sous-optimales telles que la charge excessive du substrat ou l’acclimatation^{retardée 15}. Il est important de noter que le protocole met l’accent sur les tendances dans le temps plutôt que sur des mesures en point unique, car les fluctuations à court terme de viabilité ou de morphologie n’étaient pas toujours prédisatrices d’un échec culturel à long terme. Cette perspective longitudinale s’est avérée cruciale pour distinguer les réponses transitoires au stress du déclin physiologique soutenu. Les réductions des niveaux détectables de cyanure observées lors de la culture suggèrent une détoxification partielle des substrats dérivés du manioc dans les conditions décrites. Ces réductions peuvent résulter d’une combinaison de dégradation associée à la fermentation, de volatilisation et d’activité microbienne. Bien que les mécanismes biochimiques spécifiques et la cinétique de l’élimination du cyanure n’aient pas été directement étudiés dans cette étude, ces observations soutiennent l’inclusion de la surveillance du cyanure comme indicateur pratique de la transformation du substrat et de la faisabilité de la culture lors de l’adaptation.

Plusieurs limites de la méthode doivent être reconnues. Premièrement, le pourcentage de protéines brutes ne capture pas entièrement la valeur nutritionnelle ni la qualité fonctionnelle des protéines, et l’interprétation doit prendre en compte la production totale de biomasse en parallèle des indicateurs^{de composition 16}. Deuxièmement, l’utilisation de substrats peu traités et hétérogènes introduit une variabilité qui ne peut être éliminée, même avec une préparation standardisée. Ce défi est bien reconnu dans le bioprocédé^{agroindustriel 17} et reflète des contraintes réelles plutôt que des lacunes expérimentales. Troisièmement, bien que le protocole soit optimisé pour la culture à l’échelle laboratoire et pilote, l’échellement au-delà des volumes à l’échelle du laboratoire nécessitera un contrôle supplémentaire de la dynamique du mélange, du transfert d’oxygène et de la gestion des solides, ainsi qu’une prise en compte de la configuration du réacteur et des conditions hydrodynamiques, comme cela a été démontré pour d’autres systèmes microalgaux et^{protistes 18}.

Comparé aux méthodes existantes de culture d’E. gracilis qui reposent sur des sucres raffinés ou des systèmes phototrophes strictement contrôlés, ce protocole offre un avantage méthodologique distinct en permettant la croissance sur des substrats à faible coût dérivés du manioc dans des conditions entièrement hétérotrophes. Cette approche évite la dépendance aux sources de carbone^{purifiées 19,20} et ne nécessite pas d’infrastructures d’éclairage spécialisées, élargissant ainsi la flexibilité opérationnelle de la culture d’E. gracilis. Cela est particulièrement pertinent pour les applications axées sur l’efficacité des ressources, la valorisation des déchets et la production décentralisée dans les régions productrices de manioc.

L’importance plus large de cette méthode réside dans son applicabilité à des domaines de recherche axés sur l’adaptation microbienne, le biotraitement durable et la valorisation de la biomasse. En associant l’exposition incrémentale aux substrats avec des outils de surveillance simples et peu coûteux, le protocole fournit un cadre reproductible pour intégrer des substrats non traditionnels dans les flux de travail de culture microbienne. Bien que développés pour E. gracilis, les principes sous-jacents de l’adaptation par étapes, de l’évaluation longitudinale de la performance et de la prise de décision éclairée par la morphologie sont largement transférables à d’autres systèmes microalgaux et protistes explorés pour des applications en bioéconomie^{circulaire 21,22.} Ainsi, ce protocole sert non seulement de méthode de cultivation, mais aussi de cadre généralisable pour l’adaptation microbienne appliquée sous contraintes réelles de substrat. Cette méthode a été conçue en ayant l’accessibilité comme objectif principal et convient donc particulièrement aux laboratoires ou aux milieux de recherche appliquée disposant d’une infrastructure microbiologique de base et d’un accès aux ressources biologiques clés, en particulier les cultures Euglena gracilis et les substrats dérivés du manioc. De plus, le système offre une flexibilité temporelle, car les milieux à base de manioc peuvent être préparés et fermentés toute l’année sans contraintes saisonnières. Bien que ce protocole ait été développé et validé à l’échelle du laboratoire, son utilisation de substrats dérivés du manioc à faible coût et ses besoins de traitement minimes favorisent une possibilité d’évolutivité vers des systèmes de culture plus grands.

Bien que ce protocole établisse un cadre reproductible pour l’adaptation et la culture, des analyses quantitatives supplémentaires de la cinétique de croissance, de la productivité de la biomasse et de l’efficacité de conversion des substrats seront importantes pour optimiser la performance dans des applications à grande échelle ou industrielles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Autoclave - 533LS Steam Stérilisateur	Getinge	533LS	Stérilisation à la vapeur des milieux de culture de manioc. Stériliser les milieux en utilisant un cycle liquide.
Bright-Line™ Hématimètre lame de remplacement	Millipore Sigma	BR723015- 100EA	Lames de recouvrement spéciales épaisses conçues pour l'utilisation avec l'hématimètre.
Pulpe séchée de manioc	Psaltry International	N/A	Substrat de manioc fourni
Pellets de manioc	Psaltry International	N/A	Substrat de manioc fourni
Peaux de manioc	Psaltry International	N/A	Substrat de manioc fourni
Substrat de manioc (garri)	Fournisseur local	N/A	Garri dérivé du manioc utilisé comme source de carbone; préparé avec de l'eau déionisée.
Centrifugeuse Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifugeuse	Thermo Scientific Sorvall ST16 Centrifugeuse	75004241	Capable de ≥3 500 × g, utilisée pour la récolte de la biomasse.
Tubes de centrifugation Par exemple Axygen (A Marque Corning)	Corning	MCT-150-C-S	Stériles, volume minimum de 1,5 mL
Eau propre Par exemple UltraPure™ DNase/RNase- Eau distillée exempte	ThermoFisher Scientific	10977035	Déionisée ou distillée. Utilisée pour la préparation des milieux
Microscope optique composé	Olympus	N/A	Microscope composé standard adapté à l'observation et au dénombrement des cellules de routine.
Test du cyanure Bandelettes, colorimétrique. CN- 10-30 mg/L	MQuant	110044	Détection semi-quantitative du cyanure. Eliminer comme déchet dangereux
Barquette de pesage stérile standard	Fisher Scientific	01-549-750	Utilisée pour le pesage des substrats de manioc et de la biomasse sèche.
Euglena gracilis (lignée adaptée au manioc)	N/A	N/A	Souche adaptée au manioc générée dans cette étude
Euglena gracilis (Type sauvage)	N/A	N/A	Souche de référence non adaptée. Maintenir les mêmes conditions standard.
Composants du milieu de croissance d'Euglena	Diverses	N/A	Milieu d'Euglena de base préparé selon les formulations standard du laboratoire.
Lyophiliseur à console FreeZone de 6 litres	Labconco	70061xxxx	Utilisé pour la déshydratation de la biomasse
Hématimètre avec lignes standard	Weber Scientific	NC1587539	Utilisé pour le dénombrement manuel des cellules.
Agitateur magnétique avec plaque chauffante	IKA	N/A	Facultatif; améliore la cohérence lors de la préparation des milieux et de la suspension des substrats.
Micropipettes (P20, P200, P1000)	Eppendorf	N/A	Pipettes à volume réglable utilisées pour les transferts liquides aseptiques.
Mini-centrifugeuse	Eppendorf	N/A	Facultatif; facilite la granulométrie rapide lors de la récolte de la biomasse.
Parafilm	Bemis	PM996	Utilisé pour le scellement temporaire des flacons ou des plaques lorsque les bouchons aérés ne sont pas disponibles.
Bandelettes indicatrices de pH	Fisher Scientific	13-640-520	Alternative au pHmètre pour une évaluation qualitative rapide des milieux de culture.
pHmètre avec sonde Thermo Scientific Orion Star A211 pHmètre de banc Thermo Scientific Orion	Thermo Scientific Orion Star A211 pHmètre de banc Thermo Scientific Orion	13-645-519	Calibré avant utilisation. Pour mesurer le pH du surnageant de culture
Stockage réfrigéré (4°C)	Frigidaire	FRT18S6JW7	Stockage à court terme des milieux
Incubateur à agitateurs (sombre)	Thermolyne	M49235	Incubateur à agitateurs orbital capable de 100–150 RPM, plage de température 24–28 °C; utilisé dans l'obscurité pour favoriser la croissance hétérotrophe d'Euglena.
Flacon de pulvérisation (32oz)	Boardwalk	BWK03010	Utilisé pour la stérilisation sur le plan de travail et la manipulation aseptique de routine (solution d'éthanol à 70%)
Logiciel de tableur	Microsoft Excel	N/A	Collecte, organisation et analyse des données
Embouts de pipettes stériles	Eppendorf	N/A	Embouts stériles jetables compatibles avec les pipettes P20, P200 et P1000.
Pipettes sérologiques stériles (5, 10, 25 mL)	Corning	N/A	Pipettes stériles individuellement emballées utilisées pour les transferts de culture et l'échantillonnage.
Solution de bleu de trypan 0,4%, liquide, filtrée stérile, adaptée à la culture cellulaire	Sigma-Aldrich	T8154	Colorant vital utilisé pour l'évaluation de la viabilité cellulaire par le test d'exclusion du bleu de trypan.
Tubes pour le prélèvement d'échantillons (50 mL)	Falcon	14-432-22	Pour le prélèvement d'échantillons de pH et de cyanure
Flacons Erlenmeyer avec bouchon aéré (250