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Article de recherche

Cytokines et polymorphismes génétiques inflammatoires associés à une infection pulmonaire nosocomiale après une hémorragie intracérébrale spontanée

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DOI :

10.3791/70761

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4 août 2026

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1Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Jiaxing University, The First Hospital of Jiaxing

Dans cet article

Résumé

Cette étude rétrospective présente un flux de travail reproductible pour la prélèvement sanguin précoce après l’admission, la mesure des cytokines sériques et des récepteurs Toll-like, le génotypage des polymorphismes génétiques inflammatoires et l’évaluation du risque d’infection chez les patients souffrant d’hémorragie intracérébrale spontanée.

Résumé

L’infection pulmonaire nosocomiale est une complication fréquente après une hémorragie intracérébrale spontanée et peut aggraver la récupération neurologique, prolonger les hospitalisations et augmenter la charge clinique. Cette étude clinique et de laboratoire rétrospective présente un flux de travail reproductible pour évaluer les profils biomarqueurs inflammatoires et immunogénétiques de l’hôte associés à une infection pulmonaire nosocomiale après une hémorragie intracérébrale spontanée primaire. Les patients sont classés selon que l’infection pulmonaire nosocomiale survient après l’admission. Le sang veineux périphérique est prélevé au début de la période post-admission dans des conditions pré-analytiques standardisées. Le sérum est séparé, aliquoté et stocké pour la mesure par immunosorbement enzymatique des IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, TLR2, TLR4 et TLR9. Parallèlement, de l’ADN génomique est extrait du sang entier anticoagulé et utilisé pour le génotypage polymorphiste de longueur de fragments de restriction par réaction en chaîne de polymérases de loci sélectionnés liés aux récepteurs de type cytokine et Toll. Le flux de travail comprend également des procédures de contrôle qualité pour la manipulation des échantillons, des mesures ELISA en double, l’évaluation de la pureté de l’ADN, l’appel du génotype et le génotypage répété. L’analyse statistique inclut la comparaison entre groupes des caractéristiques cliniques et des niveaux de biomarqueurs, le test d’équilibre Hardy-Weinberg, l’analyse de régression logistique pour les associations génotype et allèle, l’ajustement pour les covariables cliniques pertinentes, et la correction du taux de fausse découverte pour des comparaisons génétiques multiples. Ce flux de travail combiné clinique, inflammatoire et immunogénétique peut aider à caractériser les profils de risque d’infection après une hémorragie intracérébrale spontanée, bien qu’une validation multicentrée prospective soit toujours nécessaire avant une application clinique de routine.

Introduction

L’hémorragie intracérébrale spontanée (PCI) est un sous-type grave d’AVC causé par une rupture non traumatique des vaisseaux cérébraux et reste une source majeure de décès neurologique et d’incapacité. Cliniquement, l’ICO est couramment classée comme primaire ou secondaire. L’ICH primaire représente la plupart des cas et est principalement liée à l’artériopathie hypertensive ou à l’angiopathie amyloïdecérébrale 1. En revanche, l’IC secondaire est associée à des causes structurelles ou hématologiques, notamment les anévrismes, les malformations artérioveineuses, la maladie de Moyamoya et les troubles de la coagulation. Bien que l’ICH représente une proportion plus faible de tous les AVC que l’AVC ischémique, elle entraîne une mortalité à court terme disproportionnée et une charge fonctionnelle à long terme 2,3,4,5.

Parmi les principales complications hospitalières après une PCI, l’infection pulmonaire nosocomiale est particulièrement fréquente et d’un impact clinique. Des études antérieures ont montré que l’infection pulmonaire peut survenir chez une proportion importante de patients hospitalisés après un AVC ou une hémorragie intracérébrale et est associée à une hospitalisation plus longue, une charge médicale accrue, une récupération neurologique plus faible et une mortalité accrue 6,7,8. L’importance clinique de cette complication va au-delà de la seule gestion respiratoire. Une conscience réduite, des réflexes de déglutition et de toux altérés, l’immobilisation, le soutien mécanique des voies respiratoires et les procédures de drainage invasives peuvent tous augmenter le risque d’infection durant la phase aiguë après l’IC. Parallèlement, une infection pulmonaire peut aggraver l’inflammation systémique, altuer l’apport en oxygène et compliquer les soins neurocritiques, amplifiant ainsi les processus secondaires de lésions.

Cette relation est biologiquement plausible car l’IC n’est pas seulement un événement cérébrovasculaire focal, mais aussi un déclencheur de dysrégulation immunitaire systémique. Une hémorragie cérébrale aiguë peut déclencher des cascades inflammatoires, modifier la signalisation immunitaire innée et perturber l’équilibre entre la neuroinflammation et la défense périphérique de l’hôte. Dans ce contexte, certains patients peuvent devenir plus susceptibles aux infections hospitalières même sous une prise en charge clinique similaire. Par conséquent, une infection pulmonaire après une PCH ne doit pas être considérée uniquement comme une conséquence d’une exposition au chevet ou de soins de soutien ; Il peut également refléter des différences d’activation inflammatoire de l’hôte et de réactivité immunitaire.

Malgré la pertinence clinique de cette complication, les approches pratiques pour la stratification précoce du risque restentlimitées 9. Les approches cliniques existantes de stratification du risque pour une infection pulmonaire post-CHI reposent généralement sur des variables liées au chevet et à l’admission, telles que la gravité neurologique, l’âge, les troubles de la déglutition, les comorbidités, les procédures invasives et la durée d’exposition de l’appareil. Ces outils sont cliniquement utiles car ils peuvent être appliqués rapidement en urgence, en soins intensifs ou en soins neurocritiques. Cependant, les variables cliniques seules peuvent ne pas expliquer entièrement pourquoi les patients avec une sévérité neurologique comparable et une exposition aux soins similaires présentent des résultats d’infection différents. Les biomarqueurs inflammatoires et les facteurs immunogénétiques de l’hôte peuvent donc fournir des informations supplémentaires sur la susceptibilité biologique, notamment durant la période post-admission précoce lorsque la surveillance préventive et les décisions de gestion respiratoire sont prises.

Les cytokines sont des médiateurs centraux des réponses immunitaires et inflammatoires, et les voies du récepteur de type Toll (TLR) jouent un rôle clé dans la reconnaissance des agents pathogènes et l’activation immunitaire innée. Les mesures de cytokines sériques et de protéines TLR peuvent fournir un instantané de l’activation inflammatoire systémique précoce, tandis que certains polymorphismes immunogènes peuvent refléter des différences plus stables de l’hôte dans la production de cytokines, la signalisation des récepteurs ou la régulation inflammatoire. Comparé à l’évaluation clinique seule, un flux de travail combiné biomarqueur et polymorphisme peut capturer à la fois l’état inflammatoire actuel et la réponse immunitaire sous-jacente de chaque patient. Cette approche n’a pas pour but de remplacer l’évaluation clinique au chevet, mais de la compléter en ajoutant des informations de laboratoire et de génétique de l’hôte pouvant aider à identifier les patients nécessitant une surveillance accrue de l’infection après une PCI spontanée.

Sur cette base, nous avons émis l’hypothèse que les patients atteints d’ICO spontanée qui développent une infection pulmonaire nosocomiale présenteraient un profil inflammatoire distinct ainsi qu’une distribution différente de polymorphismes génétiques liés à l’immunité sélectionnés par rapport aux patients restant exempts d’infection. Pour tester cette hypothèse, la présente étude rétrospective en laboratoire clinique a analysé les cytokines sériques post-admission précoces, les niveaux de protéines sériques de TLR2, TLR4 et TLR9, et sélectionné des polymorphismes génétiques inflammatoires chez des patients atteints d’ICH spontanée primaire. Le flux de travail utilise le sang périphérique collecté lors d’une hospitalisation aiguë, la quantification des protéines basée sur ELISA, le génotypage basé sur PCR-RFLP, ainsi que la comparaison statistique entre patients avec et sans infection pulmonaire nosocomiale. L’objectif était de fournir un cadre reproductible pour caractériser les profils inflammatoires et génétiques hôte associés au risque d’infection, soutenant ainsi une reconnaissance plus précoce des patients à haut risque en milieu hospitalier aigu.

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Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Hôpital affilié de l’Université de Jiaxing, le Premier Hôpital de Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, Chine (Approbation n° 2025-LP-599). Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été menées conformément aux exigences institutionnelles et aux principes de la Déclaration d’Helsinki. Un consentement écrit éclairé pour la collecte de sang et l’utilisation des données a été obtenu de tous les participants et/ou de leurs représentants légalement autorisés avant la collecte de l’échantillon.

Tous les kits commerciaux, réactifs, consommables, instruments, logiciels, fabricants, numéros de catalogue et spécifications clés de fonctionnement utilisés dans ce flux de travail sont listés dans le tableau des matériaux.

Portée de l’étude, éligibilité et regroupement des patients

Cette étude a été menée sous forme d’analyse de cohorte rétrospective monocentrique de patients présentant une hémorragie intracérébrale spontanée primaire (PCI) admis au Centre d’urgence et de soins intensifs ou à l’unité de soins intensifs de l’Hôpital affilié de l’Université de Jiaxing, le Premier Hôpital de Jiaxing, Jiaxing, Zhejiang, Chine, entre mai 2019 et septembre 2024. Le diagnostic de PCH a été confirmé par tomodensitométrie crânienne ou imagerie par résonance magnétique conformément aux directives chinoises pour le diagnostic et le traitement des hémorragies cérébrales (2019)10.

Les patients étaient éligibles s’ils présentaient une PCI primaire spontanée confirmée par imagerie, étaient admis dans les 3 jours suivant l’apparition des symptômes, et disposaient de variables cliniques clés complètes, ainsi que d’échantillons sanguins périphériques disponibles pour la mesure des biomarqueurs inflammatoires et l’analyse génétique. Les patients ont été exclus s’ils présentaient une hémorragie intracrânienne traumatique, une CHI secondaire, une infection pulmonaire présente avant l’admission ou dans les 48 heures suivant l’admission, une sortie contre avis médical ou un décès dans les 48 heures suivant l’admission, des antécédents de malignité ou de maladie auto-immune, ou des dossiers cliniques, de laboratoire ou de génotypage clés incomplets. Après le dépistage, 360 patients remplissaient les critères d’éligibilité et ont été inclus dans l’analyse finale. Parmi eux, 180 patients ont développé une infection pulmonaire nosocomiale lors de l’hospitalisation, et 180 patients non. Les patients ont été assignés au groupe infection pulmonaire ou au groupe sans infection pulmonaire en fonction de la survenue d’une infection pulmonaire nosocomiale après l’admission.

Avant le regroupement final, le diagnostic par imagerie, le moment d’admission, le moment de l’infection, la disponibilité des échantillons sanguins et la complétude des dossiers cliniques et de laboratoire ont été vérifiés. Cette étape a permis de réduire les erreurs de classification et de garantir que tous les cas inclus disposaient de données complètes pour la comparaison clinique, la mesure des biomarqueurs inflammatoires et le génotypage.

Définition de l’infection pulmonaire nosocomiale

L’infection pulmonaire nosocomiale a été définie sur la base de preuves radiologiques combinées aux critèrescliniques 11. La confirmation radiologique nécessitait une nouvelle lésion infiltrative, consolidative ou dépoliée sur radiographie thoracique ou tomodensitométrie (tomographie électronique) ou progressive ou infiltrative, progressive De plus, au moins deux des critères suivants devaient être présents : température corporelle > 38 °C, sécrétions respiratoires purulentes ou numération anormale des globules blancs périphériques avec globules blancs < 4 × 109/L ou > 10 × 109/L.

L’infection pulmonaire présente avant l’admission ou diagnostiquée dans les 48 premières heures suivant l’admission n’a pas été classée comme une infection pulmonaire nosocomiale. La classification des infections a été vérifiée à l’aide de rapports radiologiques, de relevés de température corporelle, de documents des sécrétions respiratoires, de résultats de numération sanguine périphérique et de diagnostics cliniques.

Biosécurité et élimination des déchets

Le sang humain, le sérum et l’ADN d’origine sanguine ont été manipulés selon les précautions standard de biosécurité de niveau 2. Le personnel de laboratoire portait des gants, des blouses de laboratoire, des masques et des lunettes de protection lors de la manipulation sanguine, de l’aliquotation sérique, des tests ELISA, de l’extraction d’ADN, de la préparation PCR, de l’électrophorèse sur gel, de la digestion par restriction et de la visualisation UV. Les tubes sanguins étaient vérifiés pour détecter des fuites ou des casses avant le traitement. La centrifugation était réalisée à l’aide de tubes bouchés ou, lorsque disponible, de seaux centrifugeuses scellés.

Les objets tranchants étaient immédiatement jetés dans des contenants approuvés pour objets tranchants. Des tubes, embouts de pipette, gants, plaques ELISA et autres consommables jetables contaminés par le sang ont été jetés comme déchets biologiques de laboratoire. Les déchets biologiques liquides étaient désinfectés conformément aux procédures institutionnelles avant leur élimination. Les gels d’agarose, les gels de polyacrylamide, les réactifs colorants et les matériaux liés à l’électrophorèse ont été jetés conformément aux exigences institutionnelles en matière de produits chimiques et de laboratoire en matière de déchets.

La préparation du réactif PCR, l’ajout de gabarit d’ADN, la manipulation amplifiée du produit, la digestion de restriction et l’électrophorèse sur gel ont été séparées autant que possible pour réduire la contamination. Des pointes de pipette résistantes aux aérosols étaient utilisées pour la PCR et la manipulation de l’ADN. La visualisation UV n’a été réalisée qu’à l’aide d’un bouclier protecteur ou d’un système de documentation en gel, et l’exposition directe des yeux ou de la peau à la lumière UV a été évitée.

Prélèvement de sang périphérique et traitement des échantillons

Pour réduire la variation pré-analytique, 10 mL de sang veineux périphérique ont été prélevés à 8h00 le matin suivant l’admission, après un jeûne nocturne d’au moins 12 h. 5 mL de sang ont été prélevés dans un tube à vide simple pour la préparation sérique, et les 5 mL restants ont été prélevés dans un tube héparinisé pour l’extraction d’ADN génomique.

Avant le traitement, chaque tube a été vérifié pour l’identification du patient, le temps de prélèvement, le type de tube, le volume sanguin, les fuites, la coagulation visible et l’hémolyse globale. Les échantillons avec un marquage incorrect, un volume sanguin insuffisant, des fuites de tube ou une coagulation visible dans la sonde anticoagulante ont été exclus de l’analyse en aval. Le sang dans le tube nature a été laissé coaguler à température ambiante pendant 60 minutes, puis centrifugé à 1 500 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Le surnageant sérique a été transféré dans des tubes stériles en polypropylène à faible liaison aux protéines sans perturber la couche cellulaire, aliquoté en fractions de 0,5 mL, et stocké à −80 °C jusqu’à analyse.

Les échantillons présentant une hémolyse modérée ou sévère visible ont été exclus de la quantification basée sur ELISA. Des échantillons légèrement hémolysés ont été enregistrés et n’ont pas été utilisés pour l’analyse primaire des cytokines. Des échantillons présentant une turbidité visible, une lipémie évidente, un volume résiduel insuffisant ou une exposition répétée au gel et au dégel ont été signalés avant le test. Aucune aliquote sérique n’a subi plus d’un cycle de congélation-dégel avant analyse.

Quantification des cytokines par ELISA

Les concentrations sériques d’IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ et TNF-α ont été mesurées à l’aide de kits ELISA sandwich humains disponibles dans le commerce, validés pour des échantillons sériques. Les aliquotes sériques ont été décongelées, délicatement mélangées, et inspectées pour détecter hémolyse, turbidité, lipémie, volume insuffisant et antécédents de congélation-dégel avant le chargement.

Les standards, puits vierges et échantillons de sérum étaient chargés en double. Des courbes standard étaient générées sur chaque plaque en utilisant des dilutions sérielles des concentrations standard et un contrôle blanc, selon les instructions du kit. La densité optique a été mesurée à 450 nm, avec une correction de référence à 570 nm, à l’aide d’un lecteur de microplaques calibré. Les concentrations ont été calculées par ajustement de la courbe logistique à quatre paramètres.

Les résultats du test n’ont été acceptés que lorsque la courbe standard montrait un schéma concentration-réponse approprié, que les puits vierges présentaient un fond faible et que le coefficient de variation de l’échantillon dupliqué était ≤ 10 %. Les échantillons avec un CV duplicate > 10 % ont été réanalysés à partir de l’aliquote sérique originale lorsque le volume suffisant était disponible. Les échantillons en dehors de la plage fiable de courbes standard ont été dilués ou répétés selon les instructions du kit. Les planches montrant des standards incohérents, un arrière-plan excessif ou des effets de contours évidents étaient répétées.

Les limites de détection analytique inférieures utilisées pour l’acceptation des données étaient de 2,0 pg/mL pour IL-1β, 1,5 pg/mL pour IL-6, 2,0 pg/mL pour IL-10, 3,0 pg/mL pour IL-17, 4,0 pg/mL pour IFN-γ et 2,5 pg/mL pour TNF-α. Les valeurs finales des cytokines ont été vérifiées par rapport aux identifiants d’échantillons, aux cartes de plaques, aux enregistrements de lecture en double et aux notes de qualité de l’échantillon avant analyse statistique.

Quantification des TLR2, TLR4 et TLR9 sériques par ELISA

Les niveaux sériques de protéines TLR2, TLR4 et TLR9 ont été mesurés à l’aide de kits ELISA humains disponibles dans le commerce, validés pour des échantillons sériques. Les échantillons séromiques ont été décongelés, mélangés doucement et inspectés selon les mêmes critères de qualité d’échantillon appliqués à la mesure des cytokines.

Les étalons, puits vierges et échantillons de sérum ont été analysés en double. Les plaques ont été lues à 450 nm avec une correction de référence à 570 nm, et les concentrations ont été calculées à l’aide d’une régression logistique à quatre paramètres. Les résultats étaient acceptés lorsque la courbe standard était valide, que les puits vierges étaient dans la plage de fond attendue, et que le CV dupliqué était ≤ 10 %. Les échantillons dépassant ce seuil de CV en double ont été retestés lorsque suffisamment d’échantillons restaient.

Les limites de détection analytique inférieures utilisées pour l’acceptation des résultats étaient de 0,10 ng/mL pour TLR2, 0,12 ng/mL pour TLR4, et 0,15 ng/mL pour TLR9. Les valeurs finales de TLR2, TLR4 et TLR9 ont été vérifiées par rapport aux identifiants d’échantillon, aux cartes de plaques, aux enregistrements de lecture en double et aux notes de qualité d’échantillon avant analyse statistique.

Extraction d’ADN génomique

L’ADN génomique a été extrait du sang entier anticoagulé à l’héparine à l’aide d’un kit d’extraction d’ADN génomique à base de colonne de silice. Avant l’extraction, des échantillons sanguins anticoagulés ont été vérifiés pour vérifier la correction de l’étiquetage, le volume suffisant, la coagulation visible, la fuite et l’état de stockage.

La pureté et la concentration de l’ADN ont été évaluées par spectrophotométrie. Seuls les échantillons avec un rapport A260/A280 entre 1,80 et 2,00 ont été acceptés pour l’amplification PCR en aval. Les échantillons en dehors de cette plage ont été remesurés après un mélange doux. Si le rapport de pureté anormal persistait, l’extraction d’ADN était répétée lorsqu’il restait suffisamment de sang entier.

L’ADN a été dilué avec de l’eau sans nucléase à une concentration de travail de 50 ng/μL et stocké à -20 °C jusqu’à l’amplification par PCR. Avant la mise en place de la PCR, chaque échantillon d’ADN était vérifié pour la concentration, la pureté, l’identification de l’échantillon et l’historique de congélation-dégel.

Génotypage PCR-RFLP et appel de génotypes

Le génotypage a été réalisé à l’aide du polymorphisme de longueur des fragments de restriction par réaction en chaîne par polymérase (PCR-RFLP) pour IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, TNF-α-308 G/A, TLR2-196 à 174 ins/del, TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile, TLR9 rs187084, IFN-γ +874 A/T, et IFN-γ +2108 A/G. Les séquences d’amorce spécifiques au locus, les tailles d’amplicons attendues, les enzymes de restriction et les schémas digestifs spécifiques au génotype sont fournis dans le Tableau Supplémentaire 1.

L’amplification par PCR a été réalisée dans un volume de réaction final de 25 μL contenant 2,5 μL de tampon de 10 ×, 2,0 μL de mélange dNTP à 2,5 mM chacun, 1,0 μL d’amorce directe à 10 μM, 1,0 μL d’amorce inversée à 10 μM, 0,25 μL de polymérase ADN Taq à 5 U/μL, 2,0 μL d’ADN génomique à 50 ng/μL, et 16,25 μL d’eau sans nucléase. Le mélange maître PCR a été préparé dans une zone pré-PCR propre, et le gabarit d’ADN a été ajouté en dernier. Un contrôle négatif sans gabarit était inclus à chaque exécution PCR.

Le profil thermique consistait en une dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 minutes, suivie de 35 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 secondes, de recuit à 58–62 °C pendant 30 secondes selon la paire d’amorce, et d’extension à 72 °C pendant 30 secondes, avec une extension finale à 72 °C pendant 7 minutes. Les produits PCR ont d’abord été confirmés sur un gel d’agarose à 1,5 % avant la digestion par restriction.

L’amplification PCR n’était acceptée que lorsque la bande d’amplicon attendue était visible, et le contrôle sans gabarit ne montrait aucune amplification. Des réactions montrant des bandes faibles, une amplification non spécifique, une interférence amorce-dimère ou une contamination dans le témoin négatif ont été répétées à partir du modèle d’ADN original.

Les produits PCR ont été digérés avec l’endonucléase de restriction correspondante à 37 °C pendant 3 heures, dans un volume digestif total de 15 μL selon les instructions du fabricant. Les fragments digérés ont été résolus sur un gel d’agarose à 2,5 % pour la plupart des loci. Le locus TLR2-196 à -174 ins/del a été déterminé sur un gel de polyacrylamide à 8 % afin d’améliorer la discrimination des fragments.

La digestion par restriction n’a été acceptée que lorsque les schémas de fragments correspondaient au profil digestif spécifique au génotype attendu. Des réactions montrant une digestion incomplète, des bandes étalées, des tailles inattendues de fragments ou une séparation incertaine ont été répétées. Les bandes étaient visualisées sous illumination ultraviolette après coloration aux acides nucléiques. Les images du gel étaient sauvegardées avec l’identifiant de l’échantillon, le nom du lieu, la date de diffusion et le numéro du gel.

L’assignation du génotype a été réalisée indépendamment par deux chercheurs de laboratoire aveugles. Les appels génotypiques discordants ou ambigus ont été examinés à l’aide de l’image gélifique originale et répétés par amplification PCR lorsque nécessaire. Dix pour cent des échantillons sélectionnés au hasard ont été ré-génotypés pour le contrôle qualité, et le taux de concordance était de 99,2 %. Les données finales de génotype n’ont été saisies dans l’ensemble de données d’analyse qu’après vérification des identifiants d’échantillons, noms de locs, appels de génotypes et enregistrements de contrôle qualité.

Analyse statistique

Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique approprié. Les ensembles de données cliniques, ELISA et de génotype ont été fusionnés à l’aide de codes patients désidentifiés. Les codes des patients ont été vérifiés pour détecter des duplications, des incompatibilités et des valeurs manquantes avant l’analyse. Une stratégie de cas complet a été utilisée car tous les patients inclus disposaient de données clés cliniques, inflammatoires et de génotypage.

Dans un logiciel d’analyse statistique approprié, le statut d’infection pulmonaire était codé comme variable de groupement, le groupe sans infection pulmonaire étant utilisé comme catégorie de référence. Les variables continues ont d’abord été testées pour la normalité à l’aide du test de Shapiro-Wilk. Les variables continues normalement distribuées ont été exprimées en moyenne ± écart-type et comparées à l’aide du test t de Student à échantillons indépendants. Les variables continues non distribuées anormalement ont été rapportées comme des médianes avec des plages interquartiles et comparées à l’aide du test U de Mann-Whitney. Les variables catégorielles étaient exprimées en comptages et pourcentages et comparées à l’aide du test du chi carré ou du test exact de Fisher, selon le cas.

Les distributions de génotypes dans le groupe sans infection pulmonaire ont été évaluées pour l’équilibre de Hardy-Weinberg avant l’analyse d’association. Les fréquences de génotype et d’allèle ont été résumées par n ( %). Les rapports de cotes et les intervalles de confiance à 95 % pour le risque d’infection pulmonaire ont été estimés à l’aide de modèles de régression logistique multivariée. Le statut d’infection pulmonaire a été saisi comme variable dépendante. Les variables génotype, allèle ou biomarqueur étaient saisies comme variables indépendantes, telles que spécifiées pour chaque analyse.

L’âge et le sexe étaient inscrits à priori dans le modèle principal. IMC, maladie pulmonaire obstructive chronique, maladies cardiaques, fuite du liquide céphalo-rachidien, temps d’ingestion du drain et admission de l’échelle du coma de Glasgow ont été saisies simultanément dans le modèle entièrement ajusté car ces variables étaient cliniquement pertinentes ou présentaient un déséquilibre de base entre les groupes. La multicolinéarité a été évaluée à l’aide de facteurs d’inflation de la variance (VIF), et les VIF <5,0 ont été considérés comme acceptables.

Comme plusieurs polymorphismes ont été testés, la correction du taux de fausse découverte de Benjamini-Hochberg a été appliquée aux analyses d’association génétique12. Les valeurs P issues des tests d’association génétique ont été classées de la plus petite à la plus grande, et la signification corrigée a été déterminée selon la procédure de Benjamini-Hochberg. Tous les tests étaient bidirectionnels, et P <0,05 était considéré comme statistiquement significatif, sauf indication contraire après ajustement par comparaison multiple.

Les résultats finaux ont été vérifiés par rapport au jeu de données source, aux enregistrements de contrôle qualité ELISA, aux enregistrements d’appel de génotypes et aux valeurs des tables avant la préparation du manuscrit. Les résultats ont été interprétés comme des associations plutôt que des effets causals, car l’étude utilisait un plan observationnel rétrospectif.

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Résultats

Indicateurs cliniques

Les caractéristiques cliniques de base sont résumées dans le tableau 1. Un total de 360 patients ayant une hémorragie intracérébrale spontanée ont été inclus dans l’analyse finale, comprenant 180 patients ayant développé une infection pulmonaire nosocomiale lors d’une hospitalisation et 180 patients sans infection. Il n’y avait pas de différences significatives entre les groupes en termes d’âge (62,4 ans ...

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Discussion

L’hémorragie intracérébrale spontanée (PCI) reste l’un des sous-types d’AVC les plus graves et continue d’imposer une mortalité précoce importante et des charges d’invalidité de longuedurée 13. En pratique clinique, les patients atteints de PCI sont particulièrement vulnérables aux complications hospitalières car les lésions neurologiques peuvent affaiblir la protection des voies respiratoires, réduire l’efficacité contre la toux, restreindre la mobilité et augmen...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent ni aucun autre conflit d’intérêts lié à cette œuvre.

Remerciements

Les auteurs remercient le personnel clinique impliqué dans les soins aux patients ainsi que les personnes qui ont aidé à la recherche de la littérature et à l’organisation des données. Cette étude a été soutenue par le projet de planification des sciences et technologies de la santé de la ville de Jiaxing (Grant No. JWKJ-25005).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Human TNF-α ELISA KitInvitrogen / Thermo Fisher ScientificKHC3011Kit ELISA pour la mesure quantitative du TNF-α humain dans le sérum.
Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA KitSigma-Aldrich / MerckRAB0744-1KTKit ELISA 96 puits pour la mesure du TLR2 humain dans les échantillons de sérum ou de plasma.
Human TLR4 ELISA Kit, colorimetricNovus Biologicals / Bio-TechneNBP3-11807Kit ELISA sandwich colorimétrique pour la mesure du TLR4 humain dans le sérum, le plasma ou d'autres fluides biologiques.
Human TLR9 ELISA Kit, colorimetricNovus Biologicals / Bio-TechneNBP2-76574Kit ELISA colorimétrique pour la mesure du TLR9 humain dans les échantillons de sérum.
Absorbance microplate readerAgilent BioTek800 TSLecteur de microplaque pour mesure de l'absorbance à 450 nm avec correction de référence à 570 nm.
QIAamp DNA Blood Mini KitQIAGEN51104Kit à membrane de silice pour l'extraction de l'ADN génomique à partir de sang total anticoagulé.
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo ScientificND-ONE-WSpectrophotomètre à microvolume pour l'évaluation de la concentration d'ADN et de la pureté A260/A280.
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems / Thermo Fisher ScientificA24811Cycleur thermique utilisé pour l'amplification PCR en point final dans le génotypage PCR-RFLP.
PCR Master Mix, 2XThermo ScientificK0171Réactif PCR prémélangé contenant la Taq ADN polymérase, les dNTP, le MgCl2 et le tampon de réaction ; utilisé pour l'amplification PCR conventionnelle.
Recombinant Taq DNA PolymeraseThermo ScientificEP0401Source enzymatique alternative pour les réactions PCR locus-spécifiques lorsque des composants PCR séparés sont utilisés au lieu d'un mix master 2X.
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581Eau de qualité biologique moléculaire utilisée pour la mise en place de PCR, la dilution d'ADN et les contrôles sans matrice.
Custom DNA primersSangon BiotechCustom synthesisPrimers locus-spécifiques pour le génotypage PCR-RFLP ; les séquences des primers sont listées dans le Tableau S1 supplémentaire.
Restriction endonucleases for PCR-RFLPThermo Scientific / New England BiolabsEnzymes locus-spécifiques listés dans le Tableau S1 supplémentaireEnzymes de restriction utilisés pour la digestion génotype-spécifique des produits PCR. L'enzyme sélectionnée pour chaque locus doit correspondre au motif de digestion listé dans le Tableau S1 supplémentaire.
Agarose I, molecular biology gradeThermo Scientific17850Agarose pour la préparation de gels à 1,5 % et 2,5 % utilisés pour confirmer les produits PCR et résoudre la plupart des fragments RFLP.
GeneRuler 50 bp DNA LadderThermo ScientificSM0371Marqueur de taille d'ADN pour les amplicons PCR et l'estimation de la taille des fragments RFLP.
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogen / Thermo Fisher ScientificS33102Colorant pour gel d'acides nucléiques pour la visualisation de l'ADN dans les gels d'agarose ou d'acrylamide ; utilisé comme alternative à faible risque à l'éthidium bromide.
Horizontal agarose gel electrophoresis systemBio-RadMini-Sub Cell GT system / 1704360 baseSystème d'électrophorèse pour la séparation sur gel d'agarose des produits PCR et RFLP.
Vertical PAGE electrophoresis systemBio-RadMini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001Système d'électrophorèse vertical pour la séparation sur gel de polyacrylamide à 8 % lorsqu'une discrimination plus élevée des fragments est requise.
Gel documentation system with UV or blue-light transilluminationBio-Rad / equivalent laboratory systemGel Doc XR+ ou équivalentSystème d'imagerie pour documenter les bandes d'ADN colorées après électrophorèse sur gel. Utiliser le mode de protection UV ou de lumière bleue lorsque disponible.
Refrigerated centrifugeEppendorf / equivalent laboratory centrifuge5424 R ou équivalentCentrifugeuse réfrigérée utilisée pour la séparation du sérum à 1 500 × g et 4 °C.
−80 °C ultra-low temperature freezerThermo Scientific / equivalent laboratory freezerForma 900 Series ou équivalentStockage des aliquotes de sérum avant l'analyse ELISA.
IBM SPSS StatisticsIBMVersion 25.0Logiciel statistique utilisé pour les statistiques descriptives, les tests de normalité, les comparaisons de groupes, la régression logistique et l'exportation des résultats du modèle.
Spreadsheet softwareMicrosoftExcel for Microsoft 365Utilisé pour la vérification des données, l'organisation de la carte des plaques, la révision des valeurs en double et la préparation des fichiers d'analyse fusionnés avant l'analyse SPSS.

Références

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