Article de méthode

Perfusion microvasculaire surveillée par imagerie laser à contraste de speckles lors d’une lésion ischémie-rénale de réperfusion chez la souris

DOI :

10.3791/70762

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27 février 2026

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1Department of Cardiology, First Affiliated Hospital & Cardiovascular Research Center, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Un système d’imagerie laser à contraste de tapets a été utilisé pour surveiller les changements du flux sanguin microvasculaire rénal lors de l’ischémie rénale unilatérale après la résection du rein droit chez la souris.

Résumé

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L’imagerie par contraste par tache laser (LSCI) est une technique non invasive permettant de mesurer la perfusion sanguine superficielle sur de grandes surfaces. Grâce à sa haute résolution spatiotemporelle, le LSCI semi-quantifie les variations hétérogènes du flux sanguin dans différentes régions de la zone imagée. Ici, nous démontrons la technique de la LSCI pour enregistrer le flux sanguin lors d’une lésion unilatérale de la réperfusion rénale (IRI) chez la souris. Après la néphrectomie droite, la position de la souris et le point focal de l’objectif du système LSCI ont été ajustés pour garantir que le rein gauche soit dans le champ de vision. Des scanners LSCI ont été réalisés avant, pendant et après l’ischémie du rein. De plus, en sélectionnant les régions d’intérêt (ROI), le flux sanguin dans ces régions était simultanément surveillé. La méthode de LSCI visualise la micro-perfusion du rein et permet une cartographie en temps réel du flux sanguin. Il peut être utilisé pour surveiller le flux sanguin microvasculaire et évaluer l’effet d’une intervention sur la cinétique de reperfusion et l’homogénéité spatiale lors de l’IRI rénale de la souris ou d’autres modèles animaux similaires.

Introduction

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La lésion ischémie-reperfusion (IRI) est l’une des principales causes d’atteinte rénale aiguë (AK), associée à une morbidité élevée et à une forte mortalité chezles patients 1,2. Le changement de l’hémodynamique rénale est l’un des facteurs critiques de l’AKI 1 induite par la résistance à la résistance (IR1). Le dysfonctionnement microcirculatoire provoqué par la résistance aux RI est une cause majeure du développement de lésions, conduisant à une privation d’oxygène et à un dysfonctionnement mitochondrial descellules 3,4. Par conséquent, la surveillance en temps réel des changements de flux sanguin est une méthode efficace pour garantir une ischémie ou une réperfusion réussie du rein et évaluer le degré d’IRI dans les modèles animaux pour la maladie.

Il existe plusieurs techniques pour mesurer la perfusion microvasculaire des tissus, notamment la fluidité Doppler laser (LDF)5, l’imagerie autofluorescente de nicotinamide adénine dinucléotide déshydrogénase (NADH) 6,7,8, l’imagerie infrarouge9 et l’angiographie indocyanine green (ICG) 10. Parmi eux, l’imagerie infrarouge et l’imagerie autofluorescence NADH mesurent indirectement la perfusion microvasculaire. La LDF, à l’aide d’une sonde optique, ne surveille que le flux sanguinrégional 5, et la LDF à balayage n’est pas assez rapide pour surveiller les changements en temps réel de la perfusion microvasculaire tissulaire sous les conditions I/R 11. L’angiographie ICG peut également identifier les vaisseaux bloquésrénaux 10 mais nécessite l’administration d’un agent de contraste, ce qui limite son utilisation à un nombre limité de mesures12. L’imagerie par contraste de taches au laser (LSCI) est une méthode efficace et non invasive pour surveiller la microperfusion rénale entemps réel 13. Il a été utilisé pour générer des informations spatialement résolues liées à la dynamique du flux sanguin. Lorsqu’un faisceau cohérent est projeté sur une surface rugueuse, les ondes lumineuses réfléchies ou diffusées interféreront entre elles en raison de différences minimes de trajectoire, formant une distribution aléatoire de motifs de taches claires et sombres, appelée « tache ». Le LSCI cartographie la vitesse du flux sanguin dans les tissus superficiels en analysant le degré de flou de la « tache dynamique » produite lorsque la lumière laser irradie letissu 12,14,15. Dans cette étude, le système LSCI fonctionnait à une longueur d’onde laser de 785 nm avec une résolution spatiale de 3 μm, un champ de vision ajustable entre 6,3 mm × 4,7 mm et 42 mm × 31 mm, et une vitesse d’imagerie allant jusqu’à 120 images par seconde, permettant une cartographie en temps réel haute résolution de la perfusion microvasculaire corticale. À la lumière de ces avantages, l’ICSL a été appliquée dans divers contextes expérimentaux et cliniques pour la surveillance du flux sanguin, notamment les brûlures16, la perfusionrétinienne 17, le flux sanguincérébral 18, l’œsophage19 et l’intestin20.

Il convient de noter que le LSCI évalue principalement la perfusion dans les tissus superficiels, fournit des valeurs de flux relatives plutôt qu’absolues, et peut être influencé par les propriétés optiques tissulaires et les artefacts de mouvement. Ces caractéristiques inhérentes sont prises en compte lors de l’interprétation des données d’imagerie.

Ce travail, utilisant un modèle impliquant la néphrectomie droite pour faciliter l’exposition et l’imagerie du rein controlatéral, a surveillé les changements de la perfusion microvasculaire avant, pendant et après l’ischémie dans un modèle murin unilatéral I/R rénal, utilisant le LSCI, et a démontré l’hétérogénéité spatiale du flux sanguin à la surface du rein.

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Protocole

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Toutes les procédures animales étaient conformes au NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Shantou University Medical College. Pour éliminer les différences d’effets IRI basées sur le genre et la souche, seules les souris mâles C57BL/6N ont été utilisées dans l’étude. Toutes les souris ont été jumelées en âge et en poids afin d’obtenir des résultats comparables. Un échantillon de n = 5 a été utilisé, conformément aux études méthodologiques antérieures utilisant LSCI pour la validationtechnique 21. Les animaux ont reçu des soins humains et ont été euthanasiés après les expériences par inhalation deCO2 . Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

Avant de commencer la chirurgie, activez le système d’imagerie à contraste de taches laser. Le système utilisé dans cette étude fonctionne avec un laser de 785 nm. Réglez la distance de travail à environ 15-20 cm au-dessus du champ opératoire. Le système calcule le flux sanguin dans des unités de perfusion laser à speckle (LSPU) en se basant sur l’algorithme de contraste spatial. Assurez-vous que l’instrument est bien échauffé et stable avant de continuer.

1. Préparation animale et laparotomie

  1. Stérilisez la table d’opération avant chaque intervention. Préparez et placez tous les matériaux nécessaires (instruments stérilisés et cotons-tigons, gaze, anesthésiques pré-dilués, bouillotte, pince vasculaire, solution saline, crème dépilatoire, boules de coton, points de suture, antiseptiques cutanés et suture) sur la table chirurgicale.
  2. Administrez du méloxicam (0,2 mg/kg de poids corporel ; injection sous-cutanée) à la souris 30 minutes à l’avance pour soulager la douleur.
  3. Versez une certaine quantité de solution saline stérilisée dans un récipient propre. Ensuite, prenez une gaze et découpez une ouverture appropriée au milieu.
  4. Anesthésiez une souris par injection intraperitonéale de 2,5 % de tribromoéthanol (400 mg/kg de poids corporel ; auparavant dilué dans du sérum stérile).
    REMARQUE : Le tribromoéthanol a été utilisé comme anesthésiant lors du processus de néphrectomie droite. Et de l’isoflurane à 1 % a été utilisé pour l’anesthésie lors de procédures prolongées de surveillance du flux sanguin.
  5. Placez la souris sur la bouillotte avec du ruban adhésif et utilisez une crème dépilatoire pour enlever les poils de la zone de l’abdomen de la souris. Tout au long de l’opération, utilisez la bouillotte pour maintenir la température rectale à 37 °C ± 0,5 °C.
  6. Désinfectez d’abord la peau de la zone chirurgicale avec de l’alcool à 75 %, puis avec de l’iodophore à l’aide d’un coton-tige.
  7. Utilisez des pinces pour pincer l’orteil de la souris. Une fois que la souris ne montre aucune réponse à la douleur, faites une incision verticale le long de la ligne médiane de l’abdomen à l’aide de ciseaux. Séparez doucement la peau du péritoine, puis ouvrez le péritoine et pénétrez dans la cavité abdominale.
  8. Appliquez un écarteur sur la souris pour optimiser la visibilité et couvrez le champ opératoire avec de la gaze, tout en alignant l’espace sur la gaze avec la cavité abdominale, puis humidifiez-le avec du sérum physiologique.

2. Néphrectomie droite

  1. Utilisez un coton-tige-coton pour pousser doucement l’intestin d’un côté de la gaze, exposant ainsi le rein droit et les tissus environnants. Repliez la gaze pour recouvrir l’intestin et humidifiez-le avec une solution physiologique normale pour éviter que l’intestin ne se dessèche.
  2. Utilisez des pinces inclinées pour soulever l’uretère droit. Passer deux fils de suture 6-0 à travers l’uretère et effectuer la ligature à deux positions.
  3. Tranchez l’uretère entre les deux ligatures à l’aide de microciseaux.
  4. Après avoir humidifié les boules de coton avec du sérum physiologique normal, utilisez une pince fine pour les ramasser, poussez doucement le foie vers le haut, puis fixez-le avec les boules de coton, afin d’exposer les reins et les vaisseaux sanguins du côté droit.
  5. Utilisez des pinces inclinées pour séparer de façon directe les coussinets adipeux périnéphriques le long du côté du rein droit jusqu’à ce que l’artère et la veine rénales soient complètement exposées.
    REMARQUE : Séparer simultanément la masse de tissu surrénalien située au-dessus du rein.
  6. Faites glisser soigneusement des pinces angulées sous l’artère et la veine rénales pour créer un canal. Ensuite, passez une suture tressée en soie 6-0 autour des vaisseaux pour les ligare.
  7. Coupez l’artère rénale et la veine obstruées situées près du rein. Retirez le rein ainsi que les tissus adhérents restants.
  8. Retirez la boule de coton utilisée pour retenir le foie.

3. Surveillance du flux sanguin rénal à l’aide d’imagerie laser Speckle Contrast Imaging (LSCI) lors de l’ischémie-réperfusion

  1. Activez le système LSCI et le logiciel dédié de l’instrument.
  2. Cliquez sur Image originale et Aperçu pour voir l’image brute, non traitée, du champ chirurgical.
  3. Modifier la position des souris, maintenir l’anesthésie avec de l’isoflurane à 1 % délivré à 600 mL/min via un cône nasal, et ajuster le grossissement de l’appareil tout en observant l’image originale pour obtenir une vue claire du rein ciblé.
  4. Cliquez sur Affichage simultané pour voir l’image du flux sanguin en temps réel. Réglez le grossissement à 2,5× et sélectionnez Ajustement automatique du flux sanguin pour optimiser l’image. Ensuite, verrouillez les paramètres de flux sanguin. De plus, configuré pour enregistrer une image tous les 5000 ms.
    REMARQUE : Des boules de coton humides peuvent être utilisées pour assurer la stabilité du rein et empêcher les organes et tissus environnants de s’en éloigner, accentuant ainsi la distinction entre la zone rénale et le fond.
  5. Réglez la taille des paramètres de la surface carrée à 112 et disposez les 5 aires carrées uniformément dans une orientation fixe sur la vue reinale. Cliquez sur l’Enregistrement et Enregistrement en temps réel de l’image pour commencer à enregistrer les données de flux sanguin.
    REMARQUE : La machine enregistrera automatiquement les unités de perfusion de speckles laser (LSPU), qui représentent les unités de flux sanguin en temps réel dans les ROI et peuvent être utilisées pour des analyses. Pendant le processus de détection, les mouvements liés à la respiration ou des changements environnementaux peuvent provoquer un déplacement du champ de vision. Si le système indique cela dans la zone de détection, l’enregistrement actuel doit être arrêté. Puis cliquez sur Enregistrement en temps réel de l’image et enregistrez à nouveau.
  6. Après avoir enregistré une base de 30 minutes, séparez le tissu adipeux entourant les vaisseaux rénaux gauches. Utilisez les pinces hémostatiques pour saisir une micropince et la placer sur l’artère rénale gauche et la veine près de l’hilum. Continuez la surveillance en temps réel pendant encore 30 minutes.
  7. Relâchez la micro-serre pour initier la réperfusion. Surveillez et enregistrez la récupération en temps réel du flux sanguin microvasculaire rénalien.
  8. Une fois la réperfusion du flux sanguin survue pendant au moins 60 minutes, arrêtez de surveiller et suturez l’incision abdominale avec une suture tressée en soie 7-0.

4. Récupération et soins post-opératoires

  1. Administrez des liquides avec une injection intraperitonéale de 1 mL de solution saline pour éviter la déshydratation après l’opération.
  2. Gardez les souris sur la bouillotte. Surveillez attentivement les souris jusqu’à ce qu’elles aient repris connaissance, paraissent alertes et capables de se redresser.

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Résultats

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Cet article visait à détecter les changements du flux sanguin rénal lors de l’AKI induite par la résistance à la résistance inférieure. Nous avons donc utilisé un modèle murin courant impliquant une néphrectomie droite (Figure 1A) suivie d’une procédure IR sur le rein controlatéral (Figure 1B). Comme une surveillance en temps réel du flux sanguin pendant l’IRI était nécessaire, toutes les manipulations sur les souris ont été eff...

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Discussion

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Ce travail décrit l’application d’un système LSCI pour la visualisation en temps réel et haute résolution de la dynamique du flux sanguin microvasculaire rénal lors de l’IRI chez la souris. Le protocole offre un avantage significatif par rapport aux mesures d’extrémité traditionnelles ou aux méthodes à résolution spatiale limitée, telles que le LDF, en fournissant une carte de perfusion bidimensionnelle qui capture l’hétérogénéité régionale au sein de la microcirculation rénale. L’effica...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été financé par le Programme de recherche en équipe innovante pour les universités de la province du Guangdong (2022KCXTD009).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Conteneur absorbeur (pour l’anesthésie)Shenzhen Laiyue Biotech Co., Ltd, Chine10-0210
Alcool, médical (75 %)HENGLIYA, Xinjiang, ChineN/ADésinfectant cutané
Vaporisateur anesthésiqueMidmarkhttps://www.midmark.com/animal-health/products/anesthesia/detail/matrx-vip-3000-veterinary-vaporizer
Cotonne-tigesQingdao Hainuo Biological Engineering Co., Ltd, Chinehttps://www.hainuocn.com/index/detail/448.html
Crème dépilatoireVEEThttps://www.veet.com.cn/jingchun/whx
Pansement en gazeWinner Medical Co., Ltd, Shenzhen, Chinehttps://www.winnermedical.com/gauze-bandage.html
BouillotteRenqiu Dingsheng Heating Equipment Co., Ltd, ChineHD-1902Pour maintenir la température corporelle
Solution iodophoreTaixinkang, Jinxian, Chinehttps://www.11467.com/nanchang/co/120661.htmAntiseptique cutané
IsofluraneRWD Life Science Co., Ltd, ChineR510-22-10Anesthésique par inhalation
Système d’imagerie par contraste de taches laser (LSCI)Hubei Xunwei Optoelectronic Technology Co., Ltd, ChineSIM BFI HR PROSystème équivalent MoorFLPI-2
MéloxicamQilu Animal Health Products Co., Ltd, Chinehttps://en.qiludb.com/companion_animal/500.html0,2 mg par kg de poids corporel ; Analgésique
Micro-pinceShanghai Medical Instrument (Group) Co., Ltd, ChineW40140Pince vasculaire
Solution saline normale (0,9 % de chlorure de sodium)Cisen Pharmaceutical Co., Ltd, Chinehttps://www.cisen-pharma.com/index/shows?catid=42&id=62
Suture tressée en soie (6-0)Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd, Chinehttp://www.fdma.com.cn/products_detail/12.htmlPour la ligation des vaisseaux
Suture tressée en soie (7-0)Wego Terumo (Weihai) Medical Products Co., Ltd, Chinehttps://www.weigaoholding.com/Pour la fermeture de la plaie, des sutures chirurgicales non absorbables avec l’aiguille courbée
Seringue (1 mL)Shandong Ande Healthcare Apparatus Co., Ltd, Chinehttps://www.andehealthcare.com/html/chanpinzhanshi/Medication-Delivery/syringes/131.htmlAvec une aiguille de 26 G
TribromoéthanolSigma-AldrichT48402-100Gsolution à 2,5 % ; Anesthésique injectable

Références

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Mots-clés

Imagerie par tavelure lasersurveillance du flux sanguinrein de sourisimagerie en temps r elmicrocirculation r nalechirurgie animale

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