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Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique scientifique du Service de santé de Concepción. Du tissu osseux humain a été prélevé sur des têtes fémorales données par des patients subissant une chirurgie de remplacement de la hanche à l’Hôpital de traumatologie de Concepción, au Chili, après consentement écrit et éclairé. Les échantillons étaient stockés à −80 °C jusqu’à utilisation. Toutes les procédures respectaient les directives institutionnelles pour l’utilisation éthique des tissus humains en recherche. Tout le tissu osseux humain a été prélevé sur des têtes fémorales données par des patients de l’Hôpital de Traumatologie de Concepción, au Chili, sur consentement éclairé et avec l’approbation du Comité d’éthique scientifique du Service de santé de Concepción. Toutes les procédures sont conformes aux directives institutionnelles concernant l’utilisation des tissus humains.
1. Synthèse GelMA
- Dissoudre 10 g de gélatine A de type A dans 100 mL de solution saline tamponnée phosphate (PBS, pH 7,5) à 60 °C sous brassage constant.
- Réduisez la température à 50 °C et ajoutez 5 mL d’anhydride méthacrylique à un taux de 0,5 mL/min en remuant doucement pendant 1 à 3 heures.
- Diluez le mélange de réaction à 5× avec du PBS préchauffé à 40 °C pour arrêter la réaction.
- Dialysez la solution à l’aide d’une membrane de 12 à 14 kDa contre 3 à 5 L d’eau distillée à 40 °C pendant 5 à 7 jours, en remplaçant l’eau quotidiennement.
REMARQUE : (Étape critique) Assurez-vous d’assurer un remplacement complet quotidien de l’eau pour éliminer l’anhydride méthacrylique non réagi.
- Lyophilisez la solution dialysée pendant 24 heures et conservez le GelMA lyophilisé à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Préparation de l’hydrogel GelMA
- Préparez 10 mL de lots d’hydrogels GelMA à 5, 10 ou 15 p/v %.
- Dissoudre 0,5, 1,0 ou 1,5 g de GelMA lyophilisé dans 9,5 mL d’eau déionisée à 50 °C.
- Refroidissez la solution à 37 °C.
- Ajoutez 0,5 mL de solution photoinitiatrice Irgacure 2959 (0,5 w/v % d’éthanol absolu).
- Mélangez doucement et maintenez la solution à 37 °C jusqu’à une filtration stérile via un filtre à membrane acétate de cellulose de 0,22 μm.
3. Décellularisation osseuse
- Dégel des têtes fémorales progressivement jusqu’à 25 °C. Coupez chaque tête fémorale en deux puis en plus petits morceaux.
- Immergez les pièces dans de l’eau distillée stérile à 60 °C et soniquez pendant 15 minutes (40 kHz, en continu).
- Lavez les échantillons dans 300 mL d’eau distillée préchauffée à 60 °C tout en secouant à 200 tr/min pendant 5 minutes.
- Centrifugeuse à 1850 × g pendant 15 minutes à 25 °C. Répétez les étapes de lavage et centrifugeuse trois fois.
- Stériliser le tissu par sonication (40 kHz, continue) pendant 10 minutes à 60 °C dans une solution contenant 3 % de peroxyde d’hydrogène et 0,02 % d’acide peroxyacétique.
- Transférez le tissu à 300 mL d’éthanol à 70 % et sonicez (40 kHz, continu) pendant 10 minutes à 21 °C.
- Lavez les échantillons deux fois avec 300 mL d’eau distillée, secouez à 200 tr/min pendant 10 minutes à 60 °C, puis centrifugez à 1850 × g pendant 15 minutes à 25 °C.
- D’abord, précongelez l’os à -80 °C pendant 4 heures, puis lyophilisez l’os décellularisé pendant 24 heures en base large pour assurer un séchage uniforme et éviter une hauteur excessive de l’échantillon à 0,05 mbar à -40 à -60 °C.
REMARQUE : (Étape critique) Assurez-vous que l’échantillon ne dépasse pas 2 à 3 cm de hauteur à l’intérieur du récipient afin d’éviter une lyophilisation incomplète.
4. Préparation des microparticules osseuses
- Placez les fragments osseux décellisés dans des flasques Erlenmeyer de 250 mL dans la solution stérilisante et homogénéisez à l’aide d’un homogénéisateur jusqu’à obtenir une solution blanche uniforme (Vidéo complémentaire 1).
- Centrifugez à 1850 × g pendant 15 minutes à 25 °C, jetez le surnageant, puis lavez la pellete deux fois avec 300 mL d’eau distillée à 25 °C sous agitation à 200 tr/min pendant 10 minutes. Effectuer une centrifugation finale à 1850 × g pendant 15 minutes à 25 °C.
- Lyophilisez (0,05 mbar à -40 à -60 °C) le matériau obtenu pendant 48 h et conservez à -80 °C jusqu’à utilisation.
- Moudre mécaniquement l’os cortical ou médullaire lyophilisé à l’aide d’un mortier céramique stérilisé jusqu’à obtenir une poudre fine (Figure 1).
- Faites passer la poudre dans une grille ou un tamis de 200 μm, pesez le matériau final et conservez-la à -80 °C.
REMARQUE : (Étape critique) Assurez-vous que la poudre est complètement sèche avant le tamisage afin d’éviter l’agrégation et le choix inexact de la taille des particules.
Vidéo complémentaire 1 : Procédure d’homogénéisation osseuse. Homogénéisation des fragments osseux décellularisés à l’aide d’un homogénéisateur jusqu’à obtenir une suspension blanche uniforme. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure 1 : Préparation des microparticules osseuses. (A) Fragments osseux décellisés après homogénéisation avec un homogénéiseur OV5 et stockage à -80 °C. (B,C) Mortier céramique stérilisé utilisé pour moudre l’os décellisé en une fine poudre. (D) Microparticules osseuses décellularisées finales après tamisage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
5. Fabrication du gel osseux
- Préparez 10 w/v % de GelMA en dissolvant 1 g de GelMA dans 9,5 mL d’eau déionisée à 50 °C.
- Refroidissez la solution à 37 °C et ajoutez la solution de photoinitiateur Irgacure 2959.
- Maintenir la solution à 37 °C et effectuer une filtration stérile à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
- Ajoutez des microparticules osseuses décellularisées (DBMP) à 1 % en mousse/v.
- Mélangez et pipettez soigneusement de haut en bas, en évitant de créer des bulles, à 40 °C jusqu’à obtenir une suspension homogène pour former un gel osseux (BG).
- Conservez votre glycémie à 4 °C pendant jusqu’à 2 semaines.
REMARQUE : (Étape critique) Maintenir l’hydrogel au-dessus de sa température de gélification (≥37 °C) avant l’incorporation de la cellule afin d’éviter une solidification prématurée.
6. Culture primaire des ostéocytes
- Extraction de la moelle osseuse et lavage initial
- Extraire et hacher le tissu de la moelle osseuse à l’intérieur de la tête fémorale à l’aide d’instruments chirurgicaux stériles (Figure 2).
- Transférez le tissu haché dans une boîte de Petri stérile.
- Lavez le tissu trois fois avec un milieu de culture α-MEM complété avec une solution antibiotique-antimycotique (100 μg/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine).
- Rincez une fois avec la solution salée équilibrée de Hank (HBSS).
REMARQUE : (Étape critique) Minimisez le temps entre la récupération et le traitement des tissus afin de préserver la viabilité cellulaire.
- Digestion enzymatique
- Incubez le tissu dans une solution de collagénase de type I pendant 25 minutes à 37 °C avec une légère agitation.
- Laver avec HBSS.
- Répétez les étapes 6.2.1–6.2.2 deux fois supplémentaires (trois digestions totales de collagénase).
- Incubez le tissu dans 0,5 mM d’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA) pendant 25 minutes à 37 °C.
- Laver avec du HBSS et répéter l’étape EDTA deux fois de plus.
- Effectuer une dernière digestion collagénase de type I (25 minutes à 37 °C), suivie d’un lavage HBSS.
REMARQUE : (Dépannage) Une digestion incomplète peut entraîner un faible rendement cellulaire ; prolonger l’incubation enzymatique de 5 à 10 minutes si nécessaire.
- Récupération cellulaire et culture
- Collectez la solution de collagénase et transférez le lavage final HBSS dans un tube centrifuge de 50 mL.
- Centrifugez à 1 000 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
- Jetez le surnageant et resuspendez la boule dans 2 mL de α-EM complet.
- Semez la suspension cellulaire dans deux flasques de culture T75 et incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂.
REMARQUE : Remplacer le milieu de culture tous les 2 à 3 jours jusqu’à obtenir une confluence adéquate (Figure 3).
Figure 2 : Prélèvement de tissu de moelle osseuse. (A) Tête fémorale obtenue par chirurgie de remplacement de la hanche, montrant la région médullaire utilisée pour l’isolement cellulaire. (B) Fragments d’os médullaires hachés placés dans une boîte de Petri stérile avant la digestion enzymatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 3 : Culture primaire des ostéocytes. Ostéocytes attachés et proliférant en monocouche au sein d’un T75 après isolement de l’os médullaire humain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
7. 3D Culture cellulaire
- Préchauffez la quantité d’hydrogel de glucose à 37 °C.
REMARQUE : (Étape critique) Assurez-vous que la zone de travail est exempte de courants d’air ; Le refroidissement accélère le gellage prématuré.
- Décollez les ostéocytes cultivés et centrifugez à 500 × g pendant 5 minutes dans un tube de 15 mL.
- Resuspendez le pellet dans 200 μL de milieu de culture et mélangez avec l’hydrogel de glucose pour obtenir une densité cellulaire finale d’au moins 1000 cellules/μL (désormais, appelée bioencre).
- Aspirez 50 μL de bioencre à l’aide d’une pipette de 1000 μL et maintenez à 37 °C jusqu’au dépôt.
- Pipette 50 μL de bioencre par construction dans chaque puits de la plaque de culture (Vidéo supplémentaire 2) ; Prévoyez environ 5 minutes pour la gélification physique à température ambiante (Figure 4).
- Exposez chaque puits à une lumière UV de 365 nm pendant 1 minute pour obtenir une réticulation irréversible (0,30 J/cm 2).
- Ajoutez un milieu de culture et incubez les constructions à 37 °C, 5 % de CO2 pour les temps requis. Utilisez une plaque séparée pour chaque moment précis.
Figure 4 : Préparation des constructions de culture cellulaire 3D. La plaque de puits contenant du GelMA chargé en cellules se construit immédiatement après le pipetage et après la réticulation UV (365 nm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Vidéo complémentaire 2 : Préparation de constructions 3D chargées de cellules. Dépôt des mélanges hydrogel-cellules dans une plaque à 12 puits en utilisant une technique simple de pipetage avant la réticulation UV. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
8. Test de biocompatibilité
- Taches vivantes/mortes
- Cultivez les échafaudages chargés de cellules pour les intervalles de temps souhaités.
- Lavez doucement avec du PBS stérile.
- Incuber les constructions pendant 30 minutes dans l’obscurité avec une solution vivante/morte contenant 0,2 % d’homodimère-1 d’ethidium (EthD-1) et 0,05 % de calcéine AM dans PBS.
- Imagez immédiatement à l’aide d’un microscope à fluorescence avec des filtres pour la calceine AM (~495/515 nm) et l’EthD-1 (~495/635 nm). Les ensembles de filtres standards à fluorescéine isothiocyanate (FITC) et Texas Red sont compatibles respectivement avec la détection de calceine AM et EthD-1.
- Identifier les cellules vivantes par fluorescence cytoplasmique verte et les cellules mortes par fluorescence nucléaire rouge.
REMARQUE : Les images planaires peuvent être traitées à l’aide d’ImageJ (Fidji). L’objectif objectif, le temps d’exposition, le gain et l’intensité de l’illumination étaient maintenus constants pour tous les échantillons comparés et ajustés uniquement pour éviter la saturation du signal. Pour minimiser les mauvaises interprétations causées par l’autofluorescence, les mêmes réglages d’acquisition ont été maintenus pour tous les échantillons de chaque expérience, et des observations témoins de constructions de microparticules osseuses sans cellules ont été utilisées pour reconnaître le motif de fluorescence de fond associé au biomatériau. Ces contrôles nous ont permis de distinguer le signal dérivé des particules de la véritable coloration des cellules arrondies lors de l’interprétation de l’image.
- Quantification d’Alamarblue
- Préparez une solution de travail à 5 % d’alamarblue en milieu complet.
- Incuber les échafaudages dans une solution d’alamarBlue pendant 2,5 h à 37 °C et 5 % de CO₂, protégés de la lumière.
- Transférer 100 μL de surnageant sur une plaque à 96 puits en triple exemplaire, y compris les commandes.
- Mesurez la fluorescence à 360/40 nm d’excitation et 460/40 nm d’émission.
- Normaliser les valeurs de fluorescence aux témoins afin de déterminer l’activité métabolique relative.
