Pharmacologie en réseau et vérification expérimentale pour explorer le cortex de la cannelle contre l’ostéonécrose de la tête fémorale induite par des stéroïdes

Résumé

Cette étude vise à explorer les mécanismes potentiels du cortex de cannelle dans le traitement de l’ostéonécrose de la tête fémorale en intégrant la pharmacologie en réseau, les simulations de dynamique moléculaire et les expériences animales.

Résumé

L’ostéonécrose de la tête fémorale induite par des stéroïdes (ONFH) provoque une douleur intense et une mobilité réduite, altissant de manière significative la qualité de vie des patients. Le cortex de cannamomi (CC) a démontré qu’il atténue efficacement cette affection, mais son mécanisme d’action reste flou. Cette étude vise à identifier les composés actifs de la CC et à explorer leurs mécanismes dans la SONFH. Les constituants actifs ont été dépistés à l’aide des bases de données HERB 2.0, PubCem et SwissADME, et leurs cibles correspondantes ont été prédites à l’aide de la base de données Swiss Target Prediction. Les cibles pour SONFH étaient identifiées en croisant des cibles issues des bases de données GEO, DisGeNET, GeneCards et OMIM avec les cibles liées au composé. Un réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) a été construit à l’aide de la base de données STRING, et des analyses d’enrichissement GO et KEGG ont été réalisées via la base de données DAVID. Les interactions composé-cible les plus prometteuses ont été validées par des simulations d’amarrage moléculaire (MD) et de dynamique moléculaire. Les chercheurs ont identifié 563 cibles potentielles, dont 61 liées à SONFH, avec AKT1, HIF-1α et STAT3 servant de nœuds centraux. L’analyse d’enrichissement KEGG a mis en lumière la voie de signalisation HIF-1α comme un mécanisme clé. De plus, des expériences animales ont démontré que la fraction active de CC atténuait efficacement les dommages structurels de la tête fémorale dans un modèle murin avec SONFH. Les résultats suggèrent que la CC pourrait améliorer la SONFH en coordonnant l’adaptation à l’hypoxie et en régulant l’angiogenèse et l’ostéogenèse.

Introduction

L’ostéonécrose de la tête fémorale induite par des stéroïdes (SONFH) est une maladie ostéoarticulaire grave, causée par la perturbation ou la réduction de l’apport sanguin à la tête fémorale par plusieurs¹. La mort des cellules osseuses et des composants de la moelle osseuse entraîne des lésions structurelles au niveau de la tête fémorale et une altération fonctionnelle de l’articulation de^{la hanche 2}. Cliniquement, les patients présentent généralement des douleurs à la hanche et une mobilité^{réduite 3}. Sans traitement efficace, 80 % des patients atteints de SONFH évolueront vers un effondrement fémoral de la tête, nécessitant un remplacement total^{de la hanche 4}. Cela exerce une forte pression psychologique et un lourd fardeau économique sur les^{patients 5}. La pratique clinique recommande l’utilisation d’une combinaison d’anticoagulants, de médicaments fibrinolytiques, de vasodilatateurs et de médicaments abaissant les lipides pour traiter la SONFH, qui ont démontré un certain potentiel clinique mais une efficacité thérapeutique généralement^{limitée 6}.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a de plus en plus démontré son impact positif sur le traitement de la^{SONFH 7}. La MTC montre un potentiel pour le soulagement des symptômes, le contrôle de la maladie, ainsi qu’une meilleure mobilité articulaire ainsi que la qualité de vie des patients⁸. Cliniquement, la CC et ses composants ont été largement utilisés pour améliorer la SONFH, montrant une efficacité^{notable 9}. De nombreuses substances bioactives présentes dans la CC ont diverses actions biologiques, notamment des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes, favorisant l’angiogenèse et améliorant la^{microcirculation.} Des recherches antérieures en ingénierie tissulaire osseuse et en métabolisme ont établi que la cinnamaldéhyde, un constituant actif principal de la CC, peut moduler les voies de signalisation liées au remodelage^{osseux 11}. L’étude initiale indiquait que les pilules de Yougui (YGP) ont un potentiel thérapeutique pour la SONFH en favorisant l’angiogenèse et en augmentant les réponses^{inflammatoires 12}. En tant que médicament souverain dans les YGP, le CC peut réchauffer le yang, bénéficier au qi et débloquer les méridiens, produisant des effets thérapeutiques bénéfiques sur le^{SONFH 13}. Néanmoins, les mécanismes précis sous-jacents à son efficacité restent flous. Clarifier le réseau réglementaire multi-cibles utilisé par CC pour atténuer la SONFH aiderait non seulement à comprendre sa nature pharmacologique, mais encouragerait aussi son usage clinique sensé et la création d’améliorations associées. L’intégration de la bioinformatique à la pharmacologie des réseaux offre une approche efficace pour élucider les mécanismes d’action¹⁴.

La pharmacologie en réseau peut identifier les composants bioactifs dans les plantes et prédire les associations entre ces composants médicamenteux et les cibles^{géniques 15}. La MD est utilisée pour valider les interactions de liaison entre les composés actifs candidats et les cibles thérapeutiques clés. La dynamique moléculaire utilise la mécanique newtonienne pour évaluer la stabilité et la flexibilité de la liaison ligand-récepteur grâce à la simulation^{de mouvement 16}. Les auteurs ont étudié de manière approfondie les effets potentiels de la CC sur le SONFH en utilisant la pharmacologie en réseau, le MD et des simulations de dynamique moléculaire. Ces résultats fournissent une référence pour de futures recherches approfondies sur la base et le mécanisme pharmacodynamiques des matériaux de la CC pour améliorer la SONFH. Le diagramme de flux de l’étude est illustré à la Figure 1.

Protocole

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité d’éthique des expérimentations animales de l’Université de médecine chinoise du Zhejiang (IACUC-20240708-22) et conformes au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par les National Institutes of Health. Dans cette expérience, vingt femelles C57BL/6J âgées de 10 semaines, pesant entre 20 et 22 g, ont été utilisées. Ces souris ont été obtenues auprès du centre animalier de l’Université médicale chinoise du Zhejiang. Voir le tableau des matériaux pour une liste de tous les réactifs, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.

Dépistage des composés actifs et des cibles de CC
Les composés chimiques de CC ont été identifiés à l’aide de l’herbe 2.0¹⁷ avec le mot-clé « CC ». Les produits chimiques sans identifiant PubChem ou avec le même identifiant ont été filtrés. Ensuite, fusionner et supprimer les doublons pour obtenir les sites ciblés correspondant à CC. Effectuer un premier criblage en utilisant la base de données^{PubChem 18} basée sur la règle des cinq de Lipinski (Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹. Les auteurs utilisent la base de données PubChem pour déterminer la représentation SMILES pour chaque composé chimique. En utilisant la base de données SwissADME, les auteurs sélectionnent des composés avec une restriction d’absorption IG « élevée » et des valeurs de ≥2 « Oui » dans la ressemblance de^{médicament 20}. Utilisez la base de données Swiss-Target^{Prediction 21} pour extraire les protéines cibles ayant une probabilité supérieure à zéro. Ensuite, fusionner et supprimer les doublons pour obtenir les sites ciblés correspondant à CC.

Compilation des cibles géniques associées à la SONFH
Les cibles liées à SONFH ont été obtenues à partir de bases de données : base de données^{DisGeNET 22} ; Base de données^{GeneCards 23} ; Base de données^{OMIM 24}, et base de données^{GEO 25}. Les auteurs ont téléchargé et dédupliqué les gènes SONFH à partir des bases de données OMIM et DisGeNET. Un total de 233 cibles liées à la maladie ont été obtenues à partir de la base de données GeneCards après suppression des doublons. Toutes les cibles récupérées avaient des scores de pertinence supérieurs à 0 et ont été incluses pour les analyses ultérieures. Le score minimal de pertinence parmi les gènes récupérés était de 6,48. Des gènes différentiellement exprimés (DEG) liés à SONFH ont été obtenus à partir de la série GSE123568 sur la plateforme GPL15207 dans la base de données GEO. Les effets du lot ont été corrigés à l’aide du package limma dans R, et les gènes différenciellement exprimés (DEG) ont été identifiés selon les critères de |logFC| > 1 et P < 0,05²⁶. Le package ggplot2 a été utilisé pour créer un graphique volcanique permettant de visualiser la distribution des DEG, et une carte thermique a été produite pour présenter les résultats. La bibliothèque de cibles de maladies SONFH a été établie en supprimant des cibles dupliquées à l’aide du package Venn dans R.

Création du réseau PPI
Sur la base des cibles anticipées des composantes actives des cibles CC et liées à SONFH, un diagramme de Venn a été créé par Venny 2.1.0²⁷. Dans le but d’acquérir des données PPI, les auteurs ont importé les cibles dans la base de données^{STRING 28}. La limite du critère de dépistage de l’organisme était « Homo sapiens » avec un indice de confiance ≥0,4. Les auteurs ont utilisé Cytoscape 3.7.2 pour établir les cibles clés du réseau PPI. La centralité des degrés (DC) a été utilisée pour examiner les cibles clés du réseau PPI. Le filtre des paramètres est plus du double de la valeur médiane. Dans le but de spécifier davantage les cibles clés, l’extension de Cytoscape a été utilisée.

Des analyses d’enrichissement ont été réalisées à l’aide de bases de données de l’ontologie des gènes (GO) et de l’encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG)
Les cibles communes de CC et SONFH ont été analysées pour des analyses d’enrichissement GO et KEGG via la base de données^{DAVID 29}. Pour visualiser les 10 meilleurs termes GO et les 20 meilleurs chemins KEGG, Wei Sheng Xin³⁰ a été utilisé pour dessiner le graphique des bulles d’enrichissement.

Construction du réseau
Les mécanismes moléculaires de la CC dans l’atténuation de la SONFH ont été élucidés à travers les réseaux herbe-composé-cible (H-C-T) et la voie composé-cible (C-T-P). Le logiciel Cytoscape 3.10.3 illustrait les réseaux. Le réseau H-C-T a été développé à partir des composés actifs issus de CC et de leurs cibles communes. Ensuite, utilisez l’outil Analyser le réseau. Pour améliorer la compréhension des relations entre voies, composés et cibles, les 20 principales voies, ainsi que leurs cibles et composés associés, ont été organisées en un réseau C-T-P par Network Tools.

Vérification du MD
Les cibles principales : HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3 et EGFR ont été obtenues à partir de l’analyse IPP. La cible a été recherchée par la base de données^{Uniport 31} avec la limitation Humaine et examinée par la base de données RCSB^{PDB 32}. Des structures protéiques humaines avec une résolution relativement élevée ont été sélectionnées. Les ingrédients actifs ont été identifiés à partir du réseau C-T-P. Leurs structures 3D correspondantes ont été téléchargées au format mol2 depuis la base de données PubChem. Chaque fichier était ouvert en Chem3D et l’énergie minimisée. Ensuite, les auteurs ont utilisé le logiciel^{AutoDockTools 33} pour effectuer la déshydratation, l’hydrogénation et calculer les charges de Gasteiger de la protéine réceptrice. Les ligands et récepteurs étaient conservés au format PDBQT. En fonction de la localisation spatiale et de la capacité de liaison, les auteurs évaluent la faisabilité et la stabilité de l’amarrage. Via l’AutoDock Vina, la boîte de la grille d’amarrage et la macromolécule ont été prédites. Dans cette recherche, toutes les liaisons rotatives du ligand ont été autorisées à tourner librement, tandis que les récepteurs étaient réglés en rigidité. Le score d’amarrage indique l’affinité de liaison entre le récepteur et le ligand ; plus le score est faible, plus l’affinité de liaison est élevée. Conformément à ce principe, les auteurs sélectionnent les conformations ayant l’énergie de liaison la plus favorable afin d’étudier les interactions de liaison des ligands avec les protéines. Les résultats visuels ont été présentés par PyMOL.

Simulation de dynamique moléculaire
Des simulations de dynamique moléculaire ont été réalisées à l’aide de GROMACS³⁴ avec le champ de force CHARMM36. Le complexe protéine-ligand était centré dans une boîte de simulation périodique cubique avec une distance minimale entre la boîte de soluté de 1,0 nm, et le système a été solvé à l’aide du modèle d’eau SPC216. Le système a été neutralisé en ajoutant des contreions Na⁺ et Cl⁻ appropriés. La minimisation d’énergie a été effectuée séquentiellement à l’aide de l’algorithme de descente la plus raide, suivie de la méthode du gradient conjugué pour éliminer les contacts atomiques défavorables. Les interactions électrostatiques à longue portée ont été calculées à l’aide de la méthode Ewald à maillage de particules (PME) avec une distance de coupure de 10 Å. Toutes les liaisons covalentes impliquant des atomes d’hydrogène étaient contraintes à l’aide de l’algorithme LINCS. La température était maintenue à 300 K grâce au thermostat V-rescale, et la pression contrôlée à 1 bar grâce au barostat de Berendsen avec couplage isotrope. Des contraintes de position ont été appliquées au ligand avec une constante de force de 1000 kJ·mol⁻¹·nm⁻² pendant l’étape d’équilibre. Après minimisation d’énergie, le système a été équilibré avec des simulations de 2 ns NVT et 2 ns NPT, suivies d’une simulation de dynamique moléculaire de production de 100 ns avec un pas de temps de 2 fs. Les coordonnées atomiques étaient enregistrées tous les 10 ps pour une analyse de trajectoire ultérieure.

Validation expérimentale dans un modèle murin SONFH
Animaux et l’établissement modèle SONFH
Vingt souris C57BL/6J femelles, âgées de 10 semaines et pesant entre 20 et 22 g, ont été prélevées au centre vétérinaire de l’Université médicale chinoise du Zhejiang. Les souris ont subi une période d’acclimatation de 7 jours dans un environnement contrôlé et ont eu un accès illimité à la nourriture et à l’eau. Toutes les souris ont été réparties au hasard aux groupes (n = 5 par groupe) : le groupe témoin, le groupe SONFH, le groupe SONFH + CC faible dose (CC-Low, 7,5 g/kg/j), et le groupe SONFH + CC à haute dose (CC-High, 15 g/kg/j). Le modèle SONFH a été établi comme décrit précédemment. En résumé, les souris des groupes SONFH, SONFH + CC-Low et SONFH + CC-High ont reçu deux injections intraveineuses de lipopolysaccharide (LPS ; 20 μg/kg) au jour 0. Par la suite, trois injections intramusculaires de méthylprednisolone (MPS ; 40 mg/kg) ont été administrées toutes les 24 heures, débutant 24 heures après les injections LPS. Les souris des groupes traités ont reçu un extrait de CC par gavage oral quotidiennement pendant 6 semaines, à partir du jour de la dernière injection de MPS. Les souris du groupe témoin ont reçu des volumes équivalents de solution saline aux moments correspondants.

Collecte et préparation des échantillons
À la fin de la période de traitement de 6 semaines, les souris ont été euthanasiées. Les têtes fémorales bilatérales étaient soigneusement disséquées et prélevées. Pour chaque animal, la tête fémorale gauche était fixée pendant 48 heures à 4 °C pour une décalcification ultérieure et un implantation de paraffine. La tête fémorale droite a été fixée puis directement utilisée pour un micro-scanner sans décalcification.

Analyse histologique (coloration ABH)
Après la décalcification et l’implantation de paraffine, les sections de la tête fémorale ont été colorées à l’aide d’un protocole Alcian Blue/Hématoxyline (ABH) pour évaluer les changements d’ostéonécrose. En résumé, les sections ont été colorées à 1 % de bleu d’alcien (pH 2,5) pendant 30 minutes, rincées, puis contre-colorées avec de l’hématoxyline Harris. Après déshydratation et montage, les lames étaient photographiées au microscope optique. La quantification de l’ostéonécrose a été réalisée par deux observateurs aveuglés à l’aide du logiciel ImageJ. Le rapport des lacunes vides a été calculé comme (nombre de lacunes vides/nombre total de lacunes) × 100 % dans trois champs de haute puissance sélectionnés au hasard par échantillon dans la région sous-chondrale. Le ratio des noyaux pyknotiques a été déterminé de manière similaire.

Analyse par tomodensitométrie micro-computée (Micro-CT)
La microstructure osseuse tridimensionnelle de la tête fémorale a été analysée à l’aide d’un scanner micro-CT haute résolution. Les échantillons fixes étaient analysés à une résolution de 10 μm (70 kV, 114 μA). Un volume sphérique d’intérêt (VOI) standardisé englobant la région primaire portante a été reconstruit et analysé à l’aide du logiciel CTAn. Les paramètres morphométriques suivants ont été quantifiés : Volume osseuse/Volume Total (BV/TV), Épaisseur du trabéculaire (Tb.Th) et Séparation du Trabéculaire (Tb.Sp).

Coloration par immunofluorescence (FI)
Pour évaluer le microenvironnement osseux, une coloration par immunofluorescence a été réalisée sur des sections de paraffine. Après la ponction et le blocage de l’antigène, des sections ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec les anticorps primaires suivants : anti-HIF-1α (1:200), anti-ALP lapin (1:300) et anti-VEGF pour lapin (1:150). Après le lavage, les sections ont été incubées avec un mélange d’anticorps secondaires conjugués au fluorophore : IgG anti-lapin marqué par Alexa Fluor 488, IgG anti-lapin marqué par Alexa Fluor 555. Les noyaux étaient contre-colorés par DAPI. Les images ont été capturées à l’aide d’un microscope à fluorescence sous des réglages d’exposition constants. L’intensité relative de fluorescence pour chaque marqueur a été quantifiée à l’aide du logiciel ImageJ sur trois champs par échantillon.

Analyse statistique
Toutes les données quantitatives sont présentées en moyenne ± écart-type (DS). Une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) suivie du test post hoc de Tukey a été réalisée à l’aide du logiciel GraphPad Prism (version 9.0) pour déterminer la signification statistique entre groupes. Une valeur P inférieure à 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Identification des composants actifs et des cibles prédites de CC et développement du réseau « H-C-T ».
Pour explorer les mécanismes des composants clés et des cibles de la CC dans l’amélioration du SONFH, les auteurs ont utilisé la base de données HERB 2.0 pour identifier tous les composants CC examinés. 85 composés bioactifs probables ont été trouvés parmi les 209 constituants actifs candidats de CC (Tableau Supplémentaire 1). En utilisant la plateforme suisse de prédiction des cibles et en éliminant les entrées dupliquées et invalides, 563 cibles supposées correspondant à ces composants CC ont été obtenues (Tableau Supplémentaire 2). Les auteurs ont identifié les composantes actives et les cibles de la CC.

Étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’apparition et la progression de la SONFH et identifier les cibles biomarqueuses potentielles. L’analyse de l’ensemble de données GSE123568 dans la base de données GEO a identifié des DEG associés à la SONFH, incluant 207 gènes à la hausse et 216 à la baisse. Le graphique volcanique des 425 DEG est montré à la Figure 2A, tandis que les motifs d’expression des 60 DEG les plus élevés classés par niveau d’expression sont présentés sous forme de carte thermique dans la Figure 2B, avec l’intensité des couleurs reflétant les valeurs d’expression transformées en log. Les bases de données DisGeNET, OMIM et GeneCards fournissaient 711 cibles liées à SONFH. En combinant les 425 DEG de la base de données GEO, un total de 1136 cibles sont reliées à SONFH. Après l’élimination des doublons, 1115 cibles liées à SONFH ont été confirmées, comme illustré à la Figure 2C. Les auteurs ont établi de manière préliminaire une bibliothèque cible de maladies pour SONFH.

Pour identifier les cibles et les composants primaires, une analyse d’intersection entre les 563 cibles de CC et les 1115 cibles liées au SONFH a identifié 61 cibles communes (Figure 3A et Tableau supplémentaire 3), qui ont été intégrées à Cytoscape 3.10.3 pour construire le réseau « H-C-T » (Figure 3B). Ce réseau comprenait 147 nœuds et 413 arêtes. L’analyse topologique a indiqué que (s)-4-nonanolide (degré : 16), isohomogénol (degré : 15), acétate de néryle (degré : 14), mélilotocarpe A (degré : 14), 3-méthoxycinnamaldéhyde (degré : 13) ont montré la plus forte connectivité avec les protéines cibles.

Développement et évaluation topologique du réseau PPI.
Pour approfondir les objectifs du CC dans l’amélioration du SONFH. Cytoscape 3.10.3 a été utilisé pour visualiser le réseau PPI après que 61 cibles identiques aient été placées dans la base de données STRING. Il y avait 463 arêtes et 60 nœuds dans le réseau. Dans la Figure 4A, les nœuds passent de plus clair et plus petit à plus foncé et plus grand, indiquant une augmentation du degré de faible à élevé. Le plug-in MCODE a facilité le regroupement de ces cibles en deux modules fonctionnels (Figure 4A), parmi lesquels le cluster 1 contenait 23 nœuds et 216 arêtes, avec un score de 19,636. Pour mieux caractériser l’architecture réseau, DC, BC et CC ont été utilisés comme métriques topologiques. Avec les valeurs médianes de ces paramètres fixées comme points de coupure, les auteurs ont identifié 8 cibles actives (Figure 4B). Le plugin CytoHubba utilisait l’algorithme MCC pour classer les nœuds, identifiant les 10 gènes principaux. (Figure 4C).

Analyse d’enrichissement GO
Pour approfondir les mécanismes de la CC dans l’amélioration de l’ONFH, une analyse d’enrichissement GO a été réalisée sur 61 cibles potentielles, utilisant BP, CC et MF. Un total de 435 mandats GO ont été enrichis, incluant 293 mandats BP, 41 mandats CC et 101 mandats MF. Ces résultats sont présentés dans les tableaux complémentaires 4, 5 et 6. La figure 5A présente visuellement les 10 principaux termes enrichis BP, CC et MF à l’aide d’un graphique à bulles. Les résultats ont indiqué que les termes BP étaient principalement associés à la transduction du signal, à la régulation positive de la transcription par ARN polymérase II, à la régulation négative du processus apoptotique, à la régulation positive de la transcription à base d’ADN, et à la régulation négative de la transcription par ARN polymérase II. L’analyse a révélé que les termes MF étaient principalement impliqués dans la liaison aux protéines, à la liaison des ions métalliques et à la liaison identique aux protéines. Les résultats du CC ont montré que la majorité des cibles étaient principalement situées dans le cytoplasme, la membrane et la membrane plasmique.

Analyse KEGG
Pour fournir des informations sur les mécanismes biochimiques potentiels par lesquels le CC pourrait améliorer le SONFH, une analyse d’enrichissement des voies KEGG a été réalisée afin d’élucider les mécanismes biochimiques par lesquels le CC pourrait améliorer le SONFH. En utilisant un critère de sélection de P < 0,05 et FDR < 0,05, 48 entrées d’enrichissement KEGG ont été identifiées (Tableau Supplémentaire 7). Les 20 voies les plus significativement enrichies, déterminées par l’enrichissement des plis et le comptage, ont été visualisées à l’aide de diagrammes de bulles et de barres (Tableau 1, figures 5B et 5C). À l’aide de Cytoscape 3.10.3, un réseau C-T-P de 167 nœuds et 589 arêtes a été construit (Figure 5D). Les effets de CC sur SONFH sont principalement liés à l’infection par l’herpèsvirus associée au sarcome de Kaposi, à la voie de signalisation HIF-1, ainsi qu’aux lipides et à l’athérosclérose, comme l’indiquent les analyses fonctionnelles GO et d’enrichissement des voies KEGG.

Vérification du MD
Pour évaluer les interactions potentielles entre les composés actifs et les cibles clés, les 10 composés du réseau C-T-P, dont l’anéthiole, le mélilotocarpe A, l’acétate de néryle, l’acide caprylique, l’isohomogénol, le 3-méthoxycinamaldéhyde, le (s)-4-nonanolide, la myristicine, le bornéol et l’acétate de cinnamyl, ont été amarrés aux cibles clés AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC et EGFR. Les résultats complets de l’amarrage pour toutes les paires composé–cible sont résumés dans le Tableau Supplémentaire 8, et des informations détaillées sur les composés, cibles et paramètres d’amarrage sont fournies dans le Tableau Supplémentaire 9. La figure 6 présente une carte thermique de la distribution d’énergie de liaison.

Dans l’ensemble, plusieurs paires composé-cible ont montré des affinités de liaison relativement favorables, avec des valeurs d’énergie de liaison plus faibles indiquant des interactions prédites plus stables. Notamment, les résultats de l’amarrage ont montré une hétérogénéité claire dans les affinités de liaison entre les composés et les cibles. Certains composés, comme le mélilotocarpe A, ont constamment montré des affinités de liaison relativement fortes entre plusieurs cibles, tandis que d’autres ont montré des interactions plus modérées ou faibles, ce qui suggère que différents composés peuvent contribuer de manière inégale aux effets pharmacologiques prévus.

De plus, la variabilité a également été observée entre les cibles. Par exemple, certaines cibles telles que STAT3 et EGFR ont montré des affinités de liaison relativement modérées ou faibles avec plusieurs composés, certaines valeurs approchant -5,0 kcal/mol, comparées à des cibles telles que AKT1 ou SRC. Ce schéma indique que toutes les cibles principales ne fonctionnent pas nécessairement comme partenaires directs de liaison à haute affinité des composés identifiés et peuvent plutôt jouer des rôles régulateurs indirects au sein du réseau d’interaction. Ces différences peuvent être liées à des variations de compatibilité structurelle entre ligands et sites de liaison aux protéines, ainsi qu’aux caractéristiques inhérentes des cibles.

Parmi les paires évaluées, AKT1 présentait la plus faible énergie de liaison avec le mélilotocarpe A (-9,6 kcal/mol), suggérant une interaction potentiellement favorable. La figure 7 illustre le mode de liaison prédit de ce complexe. Plus précisément, SER205 d’AKT1 forme des liaisons hydrogène avec le mélilotocarpe A, l’anethole et la myristicine. De plus, le mélilotocarpe A était prévu pour former des liaisons hydrogène avec GLY309 de HIF-1α, LEU438 et THR440 de STAT3, SER433 et ARG412 d’ESR1, ainsi que ARG500 et GLU510 de SRC.

Pour identifier les composés candidats représentatifs, l’énergie de liaison la plus faible pour chaque cible a été utilisée, et un seuil d’énergie de liaison de ≤ -5,0 kcal/mol a été fixé pour indiquer des interactions relativement stables. Sur la base de ces critères, le mélilotocarpe A, l’anethole et la myristicine ont été identifiés comme des composés clés potentiels. Dans l’ensemble, la majorité des composants actifs de CC ont montré des interactions potentielles avec les cibles thérapeutiques sélectionnées, certains composés montrant des tendances de liaison relativement plus fortes à travers plusieurs cibles. Cependant, il convient de noter que la DM est une approche computationnelle simplifiée qui fournit des prédictions préliminaires d’interactions potentielles et peut ne pas tenir pleinement compte de la flexibilité des protéines et des environnements biologiques complexes. Par conséquent, ces résultats doivent être interprétés avec prudence, et les interactions observées ne constituent pas une preuve définitive d’une liaison directe.

Simulation de dynamique moléculaire
Pour évaluer davantage la stabilité des complexes, les auteurs ont sélectionné les complexes AKT1-melilotocarpan A, HIF-1α-melilotocarpan A et STAT3-melilotocarpan A pour des simulations de dynamique moléculaire. Parmi les cibles prédites, STAT3 et HIF-1α ont été sélectionnées pour des simulations de MD en raison de leur rôle central dans le réseau PPI et de leur pertinence biologique pour la pathologie de SONFH. STAT3 a montré l’un des degrés de connectivité les plus élevés du réseau PPI, indiquant un rôle potentiel de régulation dans plusieurs voies de signalisation. HIF-1α a été sélectionné car l’analyse d’enrichissement KEGG a identifié la voie de signalisation HIF-1 comme l’une des voies les plus pertinentes associées à l’angiogenèse et à l’adaptation à l’hypoxie dans l’ostéonécrose.

Parallèlement, les auteurs se sont concentrés sur AKT1 comme cible représentative en raison de ses scores d’accostage élevés et de leur pertinence directe pour les caractéristiques pathologiques de la SONFH, en particulier l’angiogenèse induite par l’hypoxie et la régénération osseuse. En raison des limites des ressources computationnelles, trois complexes représentatifs ont été sélectionnés pour des simulations MD détaillées, une stratégie couramment adoptée dans les études de simulation moléculaire basées sur la pharmacologie en réseau. L’écart quadratique moyen de la racine (RMSD) évalue efficacement la stabilité conformationnelle des complexes protéine-ligand, où des valeurs plus basses indiquent une plus grande stabilité structurelle. Comme montré à la Figure 8A, le complexe AKT1-melilotocarpan A a terminé sa relaxation dans les 12 premières secondes et a ensuite atteint un plateau stable, avec seulement une fluctuation transitoire observée autour de 50-55 ns avant de revenir rapidement à l’équilibre. Le RMSD global pendant toute la simulation était d’environ 0,369 nm. La figure 8B illustre que le complexe HIF1A-melilotocarpan A a subi une relaxation dans les 16 premiers ns, suivie du maintien d’un plateau stable. Une brève fluctuation s’est produite entre 38 et 42 ns, après quoi une restabilisation rapide a été observée. Le RMSD total pour ce complexe était de 0,25 nm. À la Figure 8C, le complexe STAT3-melilotocarpan A a subi une relaxation en 0,3 ns, puis a atteint un plateau stable. La brève fluctuation s’est produite entre 5 ns et 80 ns. La simulation globale était d’environ 0,21 nm. Comme le montrent les complexes AKT1-melilotocarpan A, HIF-1α-melilotocarpan A et STAT3-melilotocarpan ont maintenu la stabilité sans altération notable, indiquant une combinaison relativement stable.

La flexibilité des résidus d’acides aminés dans les protéines a été évaluée à l’aide de la fluctuation quadratique moyenne (RMSF). Figure 9A, la fluctuation globale moyenne des résidus était d’environ 0,17 nm, suggérant que la stabilité était principalement maintenue par le noyau structurel et la poche de liaison. La plus grande flexibilité était largement limitée aux régions intrinsèquement mobiles telles que les segments terminaux et les zones de boucle, plutôt que le cœur de poche. Il est bien connu que ces régions sont flexibles par nature. La figure 9B montre qu’environ 94 % des résidus présentaient des valeurs RMSF inférieures à 0,20 nm, et seulement environ 6 % dépassaient 0,30 nm, indiquant que l’ossature globale des protéines et les résidus internes ont fluctué dans une plage stable. La figure 9C montre que le résidu global moyen était d’environ 0,17 nm. Aucune fluctuation dépassant 0,15 nm n’a été identifiée dans les données, indiquant que la poche de liaison a maintenu une conformation stable tout au long de la simulation. Les complexes AKT1-melilotocarpan A et HIF-1α-melilotocarpan A ont démontré une interaction forte et stable.

Les liaisons hydrogène sont essentielles pour favoriser les interactions protéine-ligand. La figure 10A montre que les complexes AKT1-melilotocarpan A formaient typiquement une liaison hydrogène, le nombre de liaisons hydrogène variant entre 0 et 2. Entre le mélilotocarpe A et HIF-1α sont séparés de moins de 0,35 nm. AKT1 interagit fréquemment en proximité avec le mélilotocarpe A. Les complexes HIF-1α-melilotocarpan A forment 0 à 2 liaisons hydrogène, principalement une liaison hydrogène, comme montré à la Figure 10B. À la figure 10 C, le nombre de liaisons hydrogène du complexe STAT3-melilotocarpan A est de zéro à quatre. La plupart du temps, les atomes de A entre le mélilotocarpe A et HIF-1α sont séparés par moins de 0,35 nm. Les complexes HIF-1α-melilotocarpan A établissent 1 à 3 paires de contacts étroits et parfois même 7 à 9 paires. Cela suggère des interactions efficaces de liaison hydrogène entre la petite molécule et les protéines cibles. En résumé, les complexes AKT1-melilotocarpan A et HIF-1α-melilotocarpan A démontrent stabilité et solidité.

La CC inhibe la réaction inflammatoire et l’apoptose chez les souris SONFH
L’analyse histologique utilisant la coloration ABH a révélé des changements ostéonacrótiques prononcés dans le groupe SONFH, caractérisés par une augmentation des lacunes vides, des noyaux pyknotiques et une architecture trabéculaire perturbée, tandis que ces caractéristiques pathologiques ont été nettement atténuées après le traitement CC (Figure 11A). L’analyse quantitative a confirmé que les rapports entre lacunes vides et noyaux pyknotiques étaient significativement réduits dans les groupes traités à CC par rapport au groupe SONFH (Figure 11B–C). L’analyse micro-CT a révélé une perte osseuse trabéculaire sévère dans le groupe SONFH, qui a été partiellement inversée par l’administration de CC (Figure 11D). De manière constante, le traitement par CC a considérablement augmenté la VB/TV et la tuberculose. Tout en diminuant Tb.Sp par rapport au groupe SONFH (Figure 11E–G). La coloration par immunofluorescence a montré une expression élevée de HIF-1α et une réduction des niveaux d’ALP dans le groupe SONFH, accompagnés d’une expression modifiée de VEGF. Le traitement par CC a modulé l’expression de HIF-1α et VEGF et a augmenté les signaux ALP, indiquant une amélioration du microenvironnement osseux et de l’activité ostéogénique (Figure 11H).

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Les ensembles de données utilisés ou analysés lors de l’étude actuelle sont disponibles au lien : https://zenodo.org/records/19730455.

Figure 1 : Organigramme de la stratégie d’étude en pharmacologie en réseau pour l’amélioration des CC de la SONFH. La figure 1 montre que l’étude identifie des cibles potentielles des principes actifs issus de CC à partir de la base de données, avec la SONFH comme maladie principale. Après avoir croisé ces éléments avec des cibles liées à la maladie, un réseau « composant–cible–voie » et des termes GO, KEGG ont été construits. Un amarrage moléculaire et une simulation de dynamique moléculaire sont ensuite utilisés pour évaluer l’affinité de liaison entre les composants clés et les cibles centrales, la confirmation finale étant effectuée par une vérification expérimentale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Dépistage de cibles intersectantes associées à SONFH. (A) Graphique volcanique représentant la distribution des gènes exprimés différemment dans des échantillons de maladies. Les points rouges indiquent des gènes à la hausse des éléments, les points bleus des gènes à la baisse et les points gris des gènes sans expression différentielle significative. (B) Carte thermique montrant les schémas d’expression des 60 gènes exprimés différemment, avec des colonnes correspondant aux échantillons et des rangées correspondant aux gènes. (C) Diagramme de Venn montrant le chevauchement des cibles liées à la maladie obtenues à partir de différentes bases de données. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Dépistage des cibles intersectantes entre CC et SONFH. (A) Diagramme de Venn illustrant la répartition de 61 cibles communes partagées entre les cibles prédites des composés actifs dans CC (jaune) et les cibles de maladies liées à SONFH (violet). (B) Le réseau Herbe-Composé-Cible (H-C-T) illustre les interactions entre les composés et leurs cibles correspondantes. Le nœud carré bleu représente la maladie, les nœuds carrés verts désignent les composés actifs, et les nœuds carrés orange indiquent des cibles communes. Les arêtes désignent les interactions entre les composés et leurs cibles. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Identification des cibles candidates via analyse PPI. (A) Réseau PPI regroupé avec le plugin MCODE. (B) Flux de travail schématique du criblage topologique au sein du réseau PPI. (C) Gènes clés extraits du réseau PPI par le plugin CytoHubba. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Résultats de l’analyse d’enrichissement GO et analyse d’enrichissement des voies KEGG pour les 61 cibles courantes. (A) Graphique à bulles affichant les 10 principaux termes d’analyse d’enrichissement GO pour BP, CC et MF. (B) Graphique à bulles représentant les 20 principales voies KEGG significativement enrichies. (C) Répartition des 20 voies enrichies les plus importantes selon la classification fonctionnelle KEGG. (D) Réseau illustratif C-T-P illustrant les mécanismes potentiels par lesquels la CC pourrait améliorer l’ostéonécrose de la tête fémorale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Carte thermique de l’énergie de liaison des interactions entre les composés actifs de CC et les cibles clés (kcal/mol). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Modes de liaison des cibles clés avec des composés actifs spécifiques. AKT1-melilotocarpan A (A1), HIF-1α-melilotocarpan A (B1), STAT3-melilotocarpan A (C1), ESR1-melilotocarpan A (D1), CASP3-melilotocarpan A (E1), SRC-melilotocarpan A (F1), EGFR-melilotocarpan A (G1), AKT1-anéthole (H1), AKT1-myristicine (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) et (H2) illustrent respectivement leurs modes de liaison 2D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 8 : RMSD des valeurs RMSD MD. (A) pour les complexes AKT1-Melilotocarpan A. (B) Les valeurs RMSD des complexes HIF-1α-Melilotocarpan A. (C) Les valeurs RMSD des complexes STAT3-Melilotocarpan A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 9 : RMSF de MD. (A) Les valeurs RMSF des complexes AKT1-Melilotocarpan A. (B) Les valeurs RMSF des complexes HIF-1α-Mélilotocarpe A. (C) Les valeurs RMSF des complexes STAT3-Melilotocarpan A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 10 : Liaisons H de MD. (A) Les valeurs des liaisons H des complexes AKT1-Melilotocarpan A. (B) Les valeurs de liaison H des complexes HIF1A-Melilotocarpan A. (C) Les valeurs de liaison H des complexes AKT1-Melilotocarpan A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 11 : La CC inhibe la réponse inflammatoire et l’apoptose dans la tête fémorale, améliorant ainsi la SONFH. (A) Sections représentatives de la tête fémorale colorées avec l’ABH. Les lacunes vides sont indiquées par des pointes de flèches noires, et les noyaux pyknotiques sont indiqués par des flèches. (Si si et do) Analyse quantitative du rapport entre lacunes vides (B) et nombre de noyaux pyknotiques (C). n = 5. (D) Reconstructions micro-CT tridimensionnelles représentatives des têtes fémorales. (E–G) Quantification des paramètres micro-CT, y compris la fraction volumique osseuse (BV/TV), la séparation trabéculaire (Tb.Sp) et l’épaisseur trabéculaire (Tb.Th). (H) Coloration immunofluorescence représentative de HIF-1α, VEGF et ALP dans les coupes de la tête fémorale ; les noyaux étaient contre-colorés par DAPI. Les données sont présentées en moyenne ± DE (n = 5). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Mandat		Enrichissement des plis	Valeur P	Comte	Identifiants utilisateurs
Cancer de la vessie		28.44	1.23E-07	7	CREBBP, CXCL8, NOS2, MMP2, STAT3, F2, PTGS2, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, EP300, PPARG, NFE2L2, BCL2L1
Voie de signalisation HIF-1		16.66	6.56E-10	11	SRC, MMP2, STAT3, HIF1A, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA, CASP3, ERBB2, KDR, PDCD4, PTPN6
Résistance aux inhibiteurs de la tyrosine kinase de l’EGFR		16.66	3.84E-07	8	CCR1, CREBBP, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3 ,EP300, TYK2, PTGS2, HIF1A, MTOR, VEGFA
Jonction d’Adherens		12.54	1.64E-05	7	CREBBP, ABCB1, CASP3, ERBB2, STAT3, PDCD4, EP300, PTGS2, MMP9, EGFR, MTOR, VEGFA
Résistance endocrinienne		11.78	2.35E-05	7	CREBBP, NO 2, NUMÉRO 3, ERBB2, STAT3, SERPINE1, EP300, HIF1A, EGFR, MTOR, VEGFA
Voie de signalisation AGE-RAGE dans les complications diabétiques		11.55	2.63E-05	7	CCR1, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3, CXCR2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
Protéoglycanes dans le cancer		11.43	1.19E-10	14	CXCL8, SRC, NOS3, CASP3, STAT3, PPARG, MMP9, BCL2L1, NFE2L2
Voie de signalisation de la relaxine		10.25	1.02E-05	8	OXTR, NOS2, NOS3, ERBB2, PTAFR, KDR, NOS1, EGFR, VEGFA
Infection par l’herpèsvirus associée au sarcome de Kaposi		10.20	1.45E-08	12	SRC, ERBB2, STAT3, KDR, EGFR, MTOR, BCL2L1, VEGFA
Voie de signalisation de l’hormone thyroïdienne		9.56	7.64E-05	7	NOS2, SRC, NOS3, MMP2, NOS1, MMP9, EGFR, VEGFA
Contrainte de cisaillement des fluides et athérosclérose		8.21	0.000177	7	CREBBP, CXCL8, SRC, CASP3, STAT3, EP300, TYK2, MMP9
Hépatite B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP, STAT3, EP300, PTPN6, TYK2, EGFR, MTOR, BCL2L1
Voie de signalisation JAK-STAT		7.93	5.35E-05	8	SRC, VDR, STAT3, CYP3A4, ESR1, EGFR, MTOR, VEGFA
Infection par cytomégalovirus humain		7.34	6.2E-06	10	CREBBP, CASP3, EP300, TYK2, PTGS2, EGFR, MTOR, VEGFA
Lipides et athérosclérose		6.94	0.000035	9	CXCL8, SRC, MMP2, ERBB2, MMP9, EGFR, VEGFA
MicroARN dans le cancer		6.25	2.06E-06	12	CREBBP, SRC, ERBB2, EP300, PTPN6, PTPRF, EGFR
Cancérogenèse chimique - activation des récepteurs		6.14	0.000265	8	SRC, MMP2, ERBB2, ESR1, MMP9, EGFR, MTOR
Voies dans le cancer		5.94	6.64E-10	19	CXCL8, NOS3, CASP3, MMP2, STAT3, SERPINE1, VEGFA
Voie de signalisation calcique		5.90	0.00011	9	KAT2B, CREBBP, SRC, EP300, HIF1A, ESR1, MTOR
Infection par le papillomavirus humain		4.00	0.00324	8	SRC, NOS3, MMP2, KDR, MMP9, NFE2L2, VEGFA

Tableau 1 : Résultats d’enrichissement KEGG des 20 principales voies enrichies.

Tableau complémentaire 1 : Informations de base sur les composés actifs dans CC.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 2 : Les cibles de 85 composantes actives dans CC.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 3 : Informations sur 61 cibles courantes CC-SONFH.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 4 : Résultats des termes de catégorie de processus biologiques issus de l’analyse d’enrichissement GO.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 5 : Résultats des termes de catégorisation des composants cellulaires issus de l’analyse d’enrichissement GO.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 6 : Résultats des termes de la catégorie de fonctions moléculaires issues de l’analyse d’enrichissement GO.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 7 : Résultats des voies issues de l’analyse d’enrichissement KEGG.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 8 : Énergies de liaison d’amarrage moléculaire (kcal/mol) des paires composé-cible.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 9 : Détails des cibles et composants pour l’amarrage moléculaire.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans cette étude, les auteurs ont obtenu 85 composés bioactifs à partir de CC via plusieurs bases de données et ont effectué des dépistages, parmi lesquels les principaux composants chimiques incluent l’anethole, le mélilotocarpe A et la myristicine. Pour identifier les cibles, les auteurs ont croisé 563 cibles CC de médicaments avec 1116 cibles liées au SONFH, obtenant finalement 61 cibles. Les auteurs ont importé 61 cibles communes dans les bases de données STRING et DAVID afin de construire un réseau PPI et d’étudier d’éventuelles voies pharmacologiques. Les résultats ont révélé 10 cibles clés dans le réseau PPI, dont HIF-1α et STAT3. L’ischémie et l’hypoxie sont deux des principales caractéristiques pathogènes de la SONFH, selon des recherches^{antérieures 35}. La CC peut exercer des effets positifs dans la SONFH à travers de multiples processus biologiques, notamment l’angiogenèse et la régulation transcriptionnelle. Cela pourrait être réalisé via la voie de signalisation HIF-1α, la contrainte de cisaillement fluide et l’athérosclérose, les lipides et l’athérosclérose, la voie de signalisation AGE-RAGE dans les complications diabétiques, ainsi que d’autres voies de signalisation, selon l’analyse d’enrichissement KEGG. Cela suggère que la CC pourrait agir sur SONFH à travers ces cibles clés et les voies associées. Pour clarifier davantage si les composants de la CC sont étroitement liés aux cibles, sur la base des résultats de recherche en pharmacologie en réseau ci-dessus, à savoir les résultats de dépistage des principes actifs de la prescription de composés et des résultats de dépistage des cibles dans le réseau PPI, les auteurs ont réalisé des simulations de dynamique moléculaire du mélilotocarpe A-AKT1, mélilotocarpe A-HIF-1α, et les complexes STAT3-melilotocarpan. Cela montre que le mélilotocarpe A se lie régulièrement à AKT1, HIF-1α et STAT3, donc le CC peut effectivement avoir des effets positifs en agissant sur ces cibles clés. En somme, grâce à un mécanisme multi-composants, multi-cibles et multi-voies, la CC peut exercer des effets protecteurs sur la qualité de vie des patients atteints de SONFH.

Le groupe de recherche s’est concentré sur l’élucidation des mécanismes par lesquels les YGP exercent des effets thérapeutiques dans les maladies osseuses. Les recherches précédentes indiquaient que les YGP améliorent la formation osseuse et améliorent la microarchitecture trabéculaire de la tête fémorale en activant la β-caténine pour inhiber l’ostéoclastogenèse et promouvoir l’ostéogenèse lors du SONFH³⁶ chez le lapin. De plus, les chercheurs ont constaté que les YGP exercent des effets thérapeutiques sur la SONFH principalement en soulageant l’inflammation et en favorisant l’angiogenèse¹². Les YGP peuvent non seulement atténuer la SONFH, mais aussi améliorer l’ostéoporose. En inhibant la voie de signalisation IL-17/NF-κB et en diminuant les réponses immunitaires Th17, les YGP parviennent à stopper la perte osseuse induite par^{l’ovaire 37}. Grâce à des expériences sur les animaux, les chercheurs ont confirmé que Cornus officinalis, l’un des composants des YGP, exerce des effets sur le SONFH en inhibant la sécrétion des médiateurs inflammatoires et l’apoptose des cellules^{osseuses 38}. La CC, qui peut réchauffer le yang, bénéficier au qi et débloquer les méridiens, est l’herbe principale des YGP, jouant un rôle crucial dans l’amélioration de la SONFH et le soulagement de la souffrance des patients. En résumé, ces études reflètent l’attention de longue date portée à l’élucidation des mécanismes des YGP dans l’ostéonécrose et à la localisation de la CC comme une plante principale digne d’une investigation mécanisiste dans la SONFH.

Parmi les ingrédients actifs prédits, l’anéthie, la myristicine et d’autres ingrédients ont montré une activité biologique contre les maladies osseuses. Il a été démontré que l’anéthole inhibe l’élévation des marqueurs de résorption osseuse. L’anéthole réduit finalement la différenciation des ostéoclastes et la fonction résorptive en inhibant les voies en aval et les facteurs régulateurs^{clés 39}. Les recherches indiquent que l’anéthole présente des propriétés anti-inflammatoires et inhibe la différenciation adipogénique dans les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse humaine (hBMSC)⁴⁰. La myristicine inhibe l’inflammation et protège les cellules musculaires lisses vasculaires en supprimant les voies PI3K/Akt et^{NF-κB 41}. La ferroptose est l’un des mécanismes clés sous-jacents à la pathogenèse de la SONFH. La ferroptose est un type de mort cellulaire programmée causée par la peroxydation lipidique dépendante du fer. La myristicine prévient la ferroptose, protégeant ainsi l’homéostasie redox des membranes cellulaires^{des ostéoblastes 42}. L’autre ingrédient du bornéol a été confirmé comme inhibant la formation d’anneaux d’actine, une caractéristique des ostéoclastes résorbibles qui réfléchissent la polarisation cellulaire, en moins de 30^{minutes 43}. Ces résultats indiquent que ces composantes pourraient être très importantes pour l’effet protecteur de la CC dans le SONFH, et mérite une exploration plus approfondie. Parmi tous ces ingrédients, le Mélilotocarpe A a été choisi comme ligand représentatif car il présentait les affinités de liaison les plus stables avec plusieurs cibles centrales dans l’analyse de la DM. Parmi les composés les mieux classés, le Mélilotocarpe A a montré des interactions de liaison constamment fortes avec plusieurs protéines clés du réseau PPI, ce qui suggère qu’il pourrait représenter un composant bioactif majeur du CC.

De plus, les résultats du réseau PPI ont révélé que, en particulier, HIF-1α et STAT3, pourraient être les cibles principales. HIF-1α est le médiateur central de la réponse cellulaire à l’hypoxie. Dans les expériences SONFH, l’activation de HIF-1α favorise l’angiogenèse et la réparation osseuse, soulageant ainsi la nécrose fémorale⁴⁴. De plus, des recherches ont montré que HIF-1α peut exercer un effet protecteur sur le tissu cartilagineux en conditions^hypoxiques. La régulation à la hausse de HIF-1α supprime la ferroptose et active STAT3 pour accélérer la différenciation des monocytes de moelle osseuse en ostéoclastes⁴⁶. STAT3 est un activateur de transduction et de transcription du signal. Les HBMSC favorisent la conversion de STAT3 en p-STAT3, augmentant ainsi la prolifération des chondrocytes, la migration et les effets anti-apoptotiques en conditions^{hypoxiques 47}. STAT3 renforce la différenciation ostéogénique et les effets anti-apoptotiques des hBMSC tout en augmentant leur sécrétion de facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) pour favoriser la régénération microvasculaire^{osseuse 48}. AKT1 est une protéine kinase qui agit comme un médiateur clé de la signalisation de l’angiogenèse. AKT1 est impliqué dans le couplage angiogenèse osseuse-ostéogenèse et la formation osseuse^{trabéculaire 49}. En somme, ces cibles centrales convergent vers l’angiogenèse, l’adaptation à l’hypoxie, l’inflammation et le remodelage osseux, ce qui suggère que la CC pourrait exercer des effets protecteurs contre la SONFH en modulant ces cibles et leurs voies de signalisation associées.

Pour explorer le mécanisme de la CC dans l’amélioration de la SONFH, les chercheurs ont mené une analyse GO et une analyse d’enrichissement KEGG. Les résultats de GO montrent que les gènes cibles sont principalement enrichis dans des fonctions biologiques telles que la réponse à l’hypoxie, la réponse cellulaire au lipopolysaccharide et la régulation positive de l’angiogenèse. L’analyse d’enrichissement KEGG a suggéré que les effets pharmacologiques de la CC dans la SONFH sont principalement liés à la voie de signalisation AGE-RAGE dans les complications diabétiques, la voie de signalisation HIF-1α, les lipides et l’athérosclérose, ainsi qu’à d’autres voies de signalisation. La SONFH survient lorsque le flux sanguin vers la tête fémorale est interrompu, entraînant un manque de soutien nutritionnel pour la tête fémorale et déclenchant l’apoptose cellulaire⁵⁰. HIF-1 se compose de HIF-1α et HIF-1β, HIF-1α jouant un rôle clé dans la réponse transcriptionnelle aux environnements hypoxiques et^{ischémiques 47}. Des études antérieures ont démontré que, via la cascade de signalisation VEGF/AKT/mTOR, HIF-1α coordonne l’ostéogenèse et l’angiogenèse, renforçant ainsi de manière critique la différenciation ostéogénique des cellules souches dérivées des adipes. Après l’ischémie, une hypoxie tissulaire se développe, entraînant une élévation marquée de HIF-1α au sein des cellules. ce qui augmente les niveaux d’expression du VEGF et favorise par conséquent la réparation et la régénération vasculaire⁵¹. L’hypoxie perturbe la production d’énergie mitochondriale et augmente la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ces changements favorisent l’ostéostopogène, inhibent l’activité des ostéoblastes et induisent finalement l’apoptose des ostéocytes. Une forte expression de HIF-1α déplace le métabolisme énergétique cellulaire de la phosphorylation oxydative vers la glycolyse, réduit la production de ROS, et atténue ainsi l’apoptose chez les ostéoblastes et ostéocytes^52,53. L’os spongieux soutient la fonction hématopoïétique de la moelle osseuse et stocke des minéraux tels que le calcium. Une activité accrue de HIF-1α peut directement augmenter la formation osseuse^{de la schience 54}. De plus, HIF-1α maintient la survie des chondrocytes et l’homéostasie en conditions^{hypoxiques 45}. Par conséquent, la voie de signalisation HIF-1α est devenue une cible thérapeutique pour l’ONFH, avec une application thérapeutique potentielle pour l’ONFH.

Dans la voie de signalisation AGE-RAGE, les produits finaux de glycation avancée (AGE) résultent de la réticulation covalente non enzymatique des glucides avec des protéines, des graisses ou d’autres macromolécules^{biologiques 55}. Les AGES peuvent endommager les cellules et les tissus par des dommages inflammatoires et oxydants. À travers quatre voies, les signaux sont transduits par l’interaction ÂGE-RÉGÉNÉRATION. Il s’agit de 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK, et (4) NADPH oxydase-ROS⁵⁶. Finalement, le NF-κB phosphorylé pénètre dans le noyau pour transcrire l’expression des cytokines pro-inflammatoires, des facteurs de croissance, des cytokines profibrotiques et du stress oxydatif. L’étude a montré que AGE-RAGE favorise l’apoptose des ostéoblastes via la voie de signalisation MAPK et l’activation du stress oxydatif, et inhibe la différenciation ostéogénique en supprimant les niveaux des capteurs de stress du réticulum endoplasmique, ainsi que par la méthylation de l’ADN/la voie^{Wnt 57}. De plus, des études ont indiqué que les AGE et les RAGE participent à la calcification^{vasculaire 58}.

Dans la voie de signalisation lipidique et athérosclérose, les lipides oxydés activent le PPARγ. C’est un régulateur maître de l’adipogenèse qui inhibe la différenciation ostéogénique⁵⁹. De plus, plusieurs études ont montré que les lipides influencent la différenciation et la maturation des ostéoclastes et ostéoblastes, perturbant ainsi l’homéostasie^{osseuse 60}. De nombreuses études fondamentales ont démontré l’implication significative de l’apoptose dans les mécanismes physiologiques et pathologiques de la SONFH. Des expériences animales in vivo ultérieures ont également confirmé que la fraction active de CC supprime efficacement l’apoptose et l’inflammation dans la SONFH, atténuant ainsi la progression de la maladie.

Conformément à ces résultats, la pharmacologie en réseau et les analyses expérimentales suggèrent que la CC pourrait améliorer la SONFH en coordonnant l’adaptation à l’hypoxie, en régulant l’angiogenèse et en modulant les processus métaboliques. L’analyse quantitative par micro-CT a révélé que l’intervention CC restaurait significativement la fraction volumique osseuse (BV/TV), réduisait la séparation trabéculaire (Tb.Sp, Tb.Th) et favorisait la récupération de la microstructure osseuse. L’analyse d’enrichissement KEGG a également mis en lumière la voie de signalisation HIF-1α comme un mécanisme clé sous-jacent à ces effets. Collectivement, ces expériences animales indiquent que la CC peut atténuer la SONFH en régulant les processus biologiques liés à l’hypoxie et à l’inflammation, et en favorisant l’angiogenèse et le remodelage osseux, potentiellement via des voies clés telles que la voie de signalisation HIF-1α.

Bien que quelques résultats préliminaires importants aient été obtenus, cette étude présente encore certaines limitations. Les auteurs se sont appuyés uniquement sur des méthodes modernes de bioinformatique, notamment la pharmacologie des réseaux et la médecine médicale, ainsi que sur certaines expériences animales, pour explorer le rôle des CC dans le SONFH. Par conséquent, la fiabilité et la précision des prédictions doivent être vérifiées davantage in vivo et in vitro . Cette étude fournit des indices préliminaires sur les mécanismes par lesquels le CC améliore la SONFH, qui nécessitent une validation expérimentale supplémentaire. En intégrant la pharmacologie en réseau avec la MD, les auteurs ont cartographié systématiquement les ingrédients bioactifs candidats, les cibles clés et les voies enrichies de la CC dans la SONFH. En conclusion, cette étude a étudié les effets protecteurs potentiels de la CC dans la SONFH grâce à la pharmacologie intégrative en réseau et à la validation in vivo . Les résultats indiquent que les mécanismes étaient principalement associés à la modulation de la voie de signalisation HIF-1 et à la promotion de la régénération ostéogénique. Comme illustré dans la figure correspondante, l’amélioration de la CC a significativement modulé l’expression de protéines clés, dont HIF-1α, VEGF et ALP, de manière dépendant de la dose, renforçant ainsi son rôle dans la coordination de l’adaptation à l’hypoxie, de l’angiogenèse et de l’activité ostéogénique. Ces résultats ont été corroborés par une analyse micro-CT, qui a démontré que l’intervention CC restaurait efficacement la fraction de volume osseuse et améliorait la microstructure trabéculaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4 % de PFA	biosharp	BL539A
Éthénol absolu	Groupe Sinopharm Co.Ltd	10009218
Kit de tache Alcian Blue	Solarbio	G1563
ALP	ariggo	ARG57422
AutoDock Vina	Recherche Scripps		Version 1.2.7
AutoDockTools	Recherche Scripps		Version 1.5.7
Plateforme en ligne de bioinformatique			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 champ de force			Utilisation pour la paramétrisation MD
CTD			https://ctdbase.org
Cytoscape	Cytoscape Consortium		Version 3.10.3 ; plugins : CytoHubba, CytoNCA
Solution de coloration DAPI	Beyotime Biotech Inc	C1006-50 mL
DAVID	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Visualiseur Discovery Studio	BIOVIA		BIOVIA Discovery Studio 2020 ; Visualisation de l’amarrage
DisGeNET			https://disgenet.com
Décalcification de l’EDTA	Beyotime Biotech Inc	C0167-3L
Solution bloquante de peroxydase endogène	Beyotime Biotech Inc	P0100A
GeneCards			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Anti-lapin de chèvre IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
Sérum de chèvre	Beyotime Biotech Inc	C0265
GraphPad Prism	GraphPad (Dotmatics)		Version 10 ; Analyse statistique et graphiques
GROMACS	GROMACS		Version 2022 ; CHARMM36 champ de force
Herb 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1 & alpha ;	Hangzhou Huaan	HA721997
Équipements micro-CT haute résolution	Bruker	SkyScan
Filtre de Règle de Lipinski			Mw & Le ; 500; miLogP & le ; 5; HBD & le ; 5; HBA & LE ; 10
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich	L4516
Méthylprednisolone	Groupe Sinopharm Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
Balsam neutre	biosharp	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
Paraffine	Groupe Sinopharm Co.Ltd	C416770020
Ewald maillage de particules (PME)			Électrostatique longue portée
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrö ; Coup de circuit		Visualisation et préparation des protéines
R	CRAN		Version 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
STRING			https://string-db.org
SwissADME	Institut suisse		http://www.swissadme.ch
SwissTargetPrediction	Institut suisse		http://www.swisstargetprediction.ch
Modèle d’eau TIP3P			Utilisé pour la solvatation
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	Hangzhou Huaan	ET1604-28
Weishengxin			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	Microsoft		Utilisé pour le traitement de données, l’amarrage moléculaire et les simulations MD
Xylène	Groupe Sinopharm Co.Ltd	10023418