Isolement, synthèse et caractérisation des nanoparticules CD47- et Intégrine α4/β1 modifiées par membrane de macrophages et de nanoparticules poly(acide lactique-co-glycolique)

Summary

Ce protocole permet la préparation et la caractérisation de nanoparticules poly(acide lactique-co-glycolique) recouvertes de membrane CD47 et intégrine α4/β1 pour des applications ciblées de délivrance de médicaments.

Abstract

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique et un facteur majeur de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires. L’administration ciblée d’agents anti-inflammatoires aux sites athéroscléreux reste un défi important. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la préparation et la caractérisation des nanoparticules poly(acacide lactique-co-glycolique) (MMM/COL NPs) co-modifiées en membrane recouvertes de macrophages CD47 et intégrine α4/β1. Le protocole comprend la modification des macrophages par transfection plasmidique et stimulation à l’endothéline-1, l’isolation membranaire, la fabrication NP et le revêtement membranaire. Les NP MMM/COL résultants sont évalués à l’aide de caractérisations physicochimiques, d’analyses d’expression protéique, ainsi que d’essais in vitro et in vivo . La validation fonctionnelle inclut l’évaluation de l’association cellulaire avec les cellules endothéliales activées, l’absorption des macrophages, les effets anti-inflammatoires dans les cellules mousses, et la biodistribution dans un modèle d’athérosclérose murine. De plus, des paramètres expérimentaux clés et des étapes de contrôle qualité sont mis en avant pour garantir la reproductibilité et la cohérence entre les laboratoires. Ce protocole offre une approche robuste et évolutive pour générer des NP biomimétiques destinés à des applications ciblées d’administration de médicaments dans la recherche sur l’athérosclérose.

Introduction

L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique qui entraîne des événements cardiovasculaires mortels et des AVC par sténose artérielle de la lumière et rupture instable de la plaque, ce qui représente une charge sanitaire mondiale^{importante 1,2,3}. La régulation à la baisse des réponses inflammatoires au site athéroscléreux est une cible thérapeutique majeure ^4,5. La colchicine, un puissant anti-inflammatoire, a montré des promesses pour réduire les effets cardiovasculaires^{indésirables 6,7}. Cependant, son utilité clinique est limitée par une fenêtre thérapeutique étroite et des effets secondaires systémiques, nécessitant des systèmes d’administration ciblés pour améliorer l’accumulation au site de la plaque tout en minimisant la^{toxicité 8}.

Les nanoparticules recouvertes de membrane cellulaire (NP) sont apparues comme une plateforme puissante pour la délivrance ciblée de médicaments, tirant parti des fonctions biologiques naturelles des cellules sources ^9,10,11. Parmi les types cellulaires impliqués dans l’athérosclérose, les macrophages jouent un rôle central 12,13,14. L’intégrine α4/β1, exprimée sur les macrophages, médiatise le recrutement vers les plaques athérosclérotiques en se liant à la molécule d’adhésion des cellules vasculaires-1 (VCAM-1) exprimée sur les cellules endothéliales (CE) activées. CD47, un signal « ne me mange pas », permet d’éviter la phagocytose par le système des phagocytes^{mononucléaires 15,16}. En ingéniant les membranes macrophages pour surexprimer ces protéines par rapport aux membranes macrophages natives, on peut créer des NP avec un ciblage amélioré via l’interaction intégrine α4/β1–VCAM-1 et une phagocytose réduite via la signalisation^{médiée par CD47 6}. La double stratégie de modification améliore les NP recouverts de membrane natives et les systèmes de ciblage basés sur des ligands en renforçant simultanément le ciblage des EC activés et en réduisant la clairance phagocytaire. Contrairement aux membranes macrophages natives qui expriment uniquement des niveaux de base de ces protéines, notre membrane modifiée offre une fonctionnalité améliorée sans introduire de ligands ciblant synthétiques susceptibles de déclencher une immunogénicité.

Ce protocole détaille la préparation et la caractérisation des NP poly(acide lactique-co-glycolique) chargés de colchicine (NP COL) recouvertes de membranes macrophages co-modifiées CD47- et intégrine α4/β1, générant des NP recouvertes de membrane de macrophages modifiées (NP MMM/COL). Nous décrivons les méthodes pour la modification génétique et pharmacologique des macrophages RAW 264.7, l’isolement des membranes modifiées, la préparation et le revêtement des NP PLGA, ainsi que des tests fonctionnels complets in vitro et in vivo . Cette méthode fournit un cadre reproductible pour préparer et évaluer les NP biomimétiques pour des applications ciblées de délivrance de médicaments dans la recherche sur l’athérosclérose.

Protocol

Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation institutionnelles des animaux de l’hôpital Nankin Drum Tower et suivaient les directives pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire établies par les National Institutes of Health.

1. Modification des macrophages RAW 264.7

1. Préparer les cellules RAW 264,7, compléter le milieu Eagle modifié de Dulbecco complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine, un plasmide de surexpression CD47, un réactif de transfection Lipofectamine 3000, de l’endothéline-1 (ET-1), une solution séline tamponnée phosphate (PBS) et des fournitures de culture tissulaire stérile.
2. Cultivez 264,7 cellules RAW dans un incubateur humidifié à 37°C avec 5 % de CO₂ et maintenez les cellules jusqu’à ce qu’elles atteignent environ 4–5 × 10⁵ cellules par puits dans une plaque à 6 puits.
3. Effectuer la modification CD47
   1. Préparez une solution d’ADN plasmidique en mélangeant 2,5 μg d’ADN plasmidique avec 5 μL de réactif P3000 dans un milieu sans sérum Opti-MEM de 125 μL.
   2. Préparez la solution de réactif de transfection en diluant 3,75 μL de réactif de transfection dans 125 μL de milieu sans sérum.
   3. Utilisez ces volumes pour un format de plaque à 6 puits. Mettre tous les composants à l’échelle proportionnellement pour d’autres formats tout en maintenant un rapport ADN :P3000 de 1:2 (μg :μL) et un rapport ADN :réactif de transfection de 1:1,5 (μg :μL).
      REMARQUE : Par exemple, utilisez 10 μg d’ADN, 20 μL de P3000 et 15 μL de réactif de transfection pour des plats de 10 cm.
   4. Combinez la solution d’ADN avec la solution de réactif de transfection et incubez pendant 15 minutes à 25°C.
   5. Ajoutez les complexes de transfection aux cellules dans le DMEM sans antibiotiques complété avec 10 % de FBS à environ 2–2,5 × 10⁶ cellules par plat de 10 cm.
   6. Remplacez le milieu par un substrat complet frais contenant des antibiotiques 6 h après la transfection.
4. Effectuer la modification de l’intégrine α4/β1
   1. Stimuler les cellules transfectées ou non transfectées avec 100 nM ET-1 dans un milieu sans sérum pendant 24 heures afin de réguler à l’augmentation l’expression de l’intégrine α4/β1.
      REMARQUE : Vérifier l’efficacité de la modification par réaction quantitative en chaîne par polymérase (qPCR) et analyse Western blot pour CD47, intégrine α4 et intégrine β1.

2. Isolement de la membrane macrophage modifiée (MMM)

1. Récoltez les cellules RAW 264.7 modifiées à l’aide d’un racleur de cellules.
2. Centrifugez les cellules à 900 × g pendant 5 minutes à 4°C.
3. Lavez la granule cellulaire trois fois avec du PBS froid à 1×.
4. Resuspendez le pellet cellulaire dans 2 mL de tampon hypotonique pré-refroidi (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM de KCl, 1,5 mM de_MgCl2 et 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyl) et incubez la suspension sur glace pendant 15 minutes.
5. Congèle la suspension dans de l’azote liquide pendant 2 minutes, puis dégèle-la dans un bain-marie à 37°C pendant 5 minutes. Répétez le cycle de gel-dégel cinq fois pour lyser complètement les cellules.
   ATTENTION : L’azote liquide peut provoquer de graves brûlures cryogéniques. Manipulez avec des gants isolants appropriés et une protection faciale.
6. Centrifugez le lysat à 850 × g pendant 10 minutes à 4°C pour retirer les noyaux et les cellules non brisées.
7. Centrifugez le surnageant collecté à 15 000 × g pendant 30 minutes à 4°C. Pour obtenir une pureté membranaire supérieure, transférez le surnageant obtenu après centrifugation de 15 000 × g dans des tubes ultracentrifugeuses et centrifugez à 100 000 × g pendant 1 h à 4°C à l’aide d’une ultracentrifugeuse.
   ATTENTION : Assurez-vous que les tubes ultracentrifugeuses sont correctement équilibrés et homologués pour une centrifugation à haute vitesse afin d’éviter un déséquilibre ou une défaillance du rotor.
   REMARQUE : L’ultracentrifugation produit des membranes plasmatiques purifiées avec une contamination intracellulaire réduite par les organites.
8. Collectez le pellet contenant des fragments de MMM et resuspendez-le dans 300 μL de 1× PBS ou tampon de lyse pour obtenir une concentration protéique d’environ 1 à 2 mg/mL.
9. Déterminez la concentration de protéines membranaires à l’aide d’un kit de quantification des protéines BCA.
   REMARQUE : Les membranes isolées peuvent être stockées à −80°C pour une utilisation ultérieure.

3. Préparation des NP PLGA chargés en colchicine (NP COL)

1. Dissoudre 10 mg de PLGA (50:50, MW 90 000) et 1 mg de colchicine dans 1 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO).
   ATTENTION : Le DMSO peut pénétrer la peau et améliorer l’absorption d’autres substances. Portez un équipement de protection individuelle approprié (gants en nitrile, blouse de laboratoire et lunettes de sécurité) lors de la manipulation. Collectez les solutions contenant du DMSO sous forme de déchets solvants organiques et éliminez par l’intermédiaire de services agréés d’élimination des déchets dangereux. La colchicine est toxique et potentiellement tératogène. Collecter tous les matériaux contaminés par la colchicine (solutions, gants et tubes) sous forme de déchets pharmaceutiques dangereux et éliminer par l’intermédiaire de services agréés d’élimination des déchets dangereux conformément aux réglementations institutionnelles et locales.
2. Remuez la solution à 500 tr/min à l’aide d’un agitateur magnétique muni d’une barre de mélange recouverte de 10 mm de Téflon à 25°C.
3. Ajoutez 4 mL d’eau ultrapure goutte par goutte à environ 1 mL/min à l’aide d’une pompe à seringue équipée d’une seringue de 5 mL et d’une aiguille de 26 g à 25°C.
4. Continuez à remuer le mélange pendant 3 heures pour permettre la formation du NP.
5. Transférez la suspension NP dans une poche de dialyse (MWCO 3 500 Da).
6. Dialysez avec 2 L d’eau distillée à 4°C sous un léger remuage à 200 tr/min.
7. Poursuivez la dialyse pendant 24 heures et remplacez complètement le tampon de dialyse à 6, 12 et 24 heures pour retirer la colchicine libre et le DMSO.
   ATTENTION : Collectez tous les solvants et réactifs organiques, y compris ceux issus de la dialyse, sous forme de déchets chimiques organiques. Ne la jetez pas dans le drain. Suivez les protocoles institutionnels d’élimination des déchets dangereux.
8. Récupérer la suspension COL NP dialysée et la stocker à 4°C.
   REMARQUE : Les NP COL peuvent être stockés à 4°C pour un usage à court terme (jusqu’à 3 jours). Pour le marquage fluorescent, incorporez 0,1 % (p/w) de 1,1′-dioctadécyl-3,3,3′,3′-perchlorate de tétraméthylindocarbocyanine (DiI) dans la solution de PLGA lors de l’étape 3.1.
9. Vérifiez la suppression du DMSO et de la colchicine gratuite
   1. Collectez le dialysat final (le tampon après le dernier changement à 24 heures) et analysez-le à l’aide de la spectrophotométrie ultraviolet–visible (UV–vis).
   2. Scannez le dialysat de 200 à 400 nm et comparez-le avec un échantillon témoin (tampon de dialyse fraîche).
   3. Confirmez qu’aucun pic d’absorption n’est présent à environ 210 nm (caractéristique de la DMSO) ou à 345 nm (caractéristique de la colchicine), indiquant une élimination réussie du solvant résiduel et du médicament libre.
   4. Sinon, déterminez la concentration résiduelle de DMSO à l’aide d’un kit de test DMSO selon les instructions du fabricant. Assurez-vous que le DMSO résiduel est inférieur à 0,1 % (v/v) afin d’éviter la cytotoxicité dans les tests en aval.

4. Fabrication de NP à membrane (NP MMM/COL)

1. Sonicez la suspension isolée du MMM (de l’étape 2.7) pendant 20 minutes à l’aide d’un sonicateur à bain-marie à 40 kHz et 110 W. Maintenez le volume d’échantillon à 1 mL dans un tube de 1,5 mL et la température en dessous de 25°C en utilisant un bain de glace selon les besoins.
2. Extrudez la suspension membranaire sonique à travers un filtre à membrane en polycarbonate d’une taille de pore de 400 nm à l’aide d’un mini extrudeur pour former des vésicules membranaires.
3. Mélangez les NP du COL (de l’étape 3.5) avec les vésicules MMM à un rapport masse membranaire/PLGA de 1:1.
   1. Utilisez une suspension membranaire contenant 10 mg de protéines pour 10 mg de PLGA selon la quantification des protéines.
   2. Faites doucement une pipette : mélangez les NP COL avec les vésicules MMM 15 fois à l’aide d’une pipette de 1 mL.
4. Co-extrudez le mélange à travers un filtre à membrane en polycarbonate d’une taille de pores de 200 nm, puis répétez l’extrusion pendant 15 passages.
5. Collectez la suspension résultante contenant les NP MMM/COL et stockez-la à 4°C pour une utilisation immédiate.

5. Caractérisation des NP

1. Mesurer le diamètre hydrodynamique, l’indice de polydispersion (PDI) et le potentiel zêta en utilisant la diffusion dynamique de la lumière (DLS) dans les conditions suivantes : température, 25°C ; angle de rétrodiffusion, 173° ; temps d’équilibre, 2 min ; et trois mesures réplicatives par échantillon.
2. Diluez les échantillons 20 fois dans de l’eau déionisée (concentration finale d’environ 0,1 mg/mL).
   REMARQUE : La dilution minimise les effets de diffusion multiple.
3. Visualisez la structure noyau-couche des NP MMM/COL à l’aide de la microscopie électronique en transmission (TEM).
   1. Placez 5 μL de suspension NP (environ 0,1 mg/mL) sur une grille en cuivre recouverte de carbone à décharge luminescente (maille 300).
   2. Laissez l’échantillon adsorber pendant 2 minutes à 25°C.
   3. Enlevez l’excès de liquide en touchant doucement le bord de la grille avec du papier filtre.
   4. Appliquez 5 μL de solution d’acétate d’uranyle à 1 % sur la grille et faites couver pendant 1 minute à 25°C.
   5. Enlever l’excès de tache avec du papier filtre.
   6. Laissez la grille sécher complètement à l’air pendant au moins 10 minutes avant l’imagerie.
      ATTENTION : L’acétate d’uranyle est toxique et radioactif. Manipuler avec un équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse de laboratoire et protection oculaire) et éliminer les déchets conformément aux directives institutionnelles concernant les matières dangereuses.
4. Marquez la membrane avec un colorant perchlorate de 3,3′-dioctacéloxacarbocyanine (DiO) lors de l’étape 2 ou en marquant les cellules intactes avant l’isolement de membrane, puis marquez le noyau PLGA avec du DiI.
5. Analyser la co-localisation des signaux DiO (vert) et DiI (rouge) à l’aide de microscopie à balayage laser confocal (CLSM).
   1. Définir les paramètres d’excitation/émission comme suit : DiO (vert), excitation 488 nm, émission 550 nm ; DiI (rouge), excitation 561 nm, émission 620 nm.
   2. Utilisez un objectif à immersion dans l’huile de 60× (ouverture numérique, 1,4).
   3. Réglez le trou d’épingle sur une unité Airy.
   4. Ajustez le gain du détecteur pour éviter la saturation des pixels.
   5. Acquérir des images à une résolution de 1024 × 1024 pixels avec une moyenne de ligne de 2×.
   6. Maintenez la puissance laser en dessous de 5 % pour minimiser le photoblanchiment.
6. Analysez la présence de CD47, d’intégrine α4 et d’intégrine β1 sur la surface NP du MMM/COL à l’aide d’une analyse par Western blot.
7. Déterminer le chargement et la libération des médicaments
   1. Lysez un volume de 100 μL de NP dans le DMSO et mesurez l’absorption de la colchicine à 345 nm pour déterminer la charge du médicament et l’efficacité de l’encapsulation.
   2. Placez 1 mL de suspension de NP de MMM/COL (contenant environ 100 μg de colchicine) dans un sac de dialyse (MWCO, 3 500 Da).
   3. Scellez le sac et immergez-le dans 50 mL de PBS (pH 7,4) contenant 20 % de FBS dans un bécher en verre de 100 mL.
   4. Maintenez le milieu de démantèlement à 37°C sous un brassage constant à 100 tr/min à l’aide d’un agitateur magnétique muni d’une barre de mélange de 20 mm recouverte de Téflon.
   5. Maintenez les conditions de l’évier tout au long de l’expérience.
      REMARQUE : La solubilité de la colchicine dans le PBS avec 20 % de FBS est de >1 mg/mL ; La concentration maximale de colchicine dans le milieu de libération est de <10 % de la saturation.
   6. À des moments prédéterminés (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 et 62 h), retirez 500 μL de milieu de libération.
   7. Remplacer le volume retiré par un volume égal de PBS fraîchement préchauffé (37°C) contenant 20 % de FBS.
   8. Mesurez la concentration de colchicine dans les échantillons prélevés à l’aide de la spectrophotométrie UV–Vis à 345 nm.
   9. Effectuez toutes les mesures en triple exemplaire.

6. Essais fonctionnels in vitro

1. Semez les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Stimuler les cellules avec un facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) à 10 ng/mL pendant 24 heures afin de réguler à la hausse le VCAM-1.
2. Association cellulaire des NP MMM/DiI avec les HUVEC
   1. Incuber les cellules avec des NP MMM/COL (MMM/DiI NPs) marqués par DiI à une concentration de 50 μg/mL (basée sur la masse centrale du PLGA) pendant 4 heures à 37°C dans une atmosphère à 5 % de CO₂.
   2. Lavez les cellules trois fois avec du PBS pré-refroidi. Centrifugez les cellules à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C après chaque lavage.
   3. Résuspendez les cellules lavées dans des PBS contenant 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA). Ajustez la concentration finale de la cellule à 1 × 10⁶ cellules/mL.
   4. Définissez les paramètres de l’instrument pour la cytométrie en flux ou CLSM. Détecter la fluorescence DiI en utilisant l’excitation à 549 nm et l’émission à 565 nm (canal PE).
   5. Recueillez des données à partir des échantillons. Acquérir au moins 10 000 événements par échantillon pour la cytométrie en flux ou capturer des champs représentatifs pour le CLSM.
   6. Sélectionnez cinq champs représentatifs par échantillon provenant de régions distinctes, sans les bords, à l’aide d’une lentille d’immersion à 60 × huile. Assurez-vous que les cellules sont intactes et ne se chevauchent pas.
   7. Aveuglez les échantillons avant l’acquisition de l’image. Sélectionnez les champs en déplaçant aléatoirement le niveau plutôt que de choisir manuellement des zones spécifiques.
   8. Appliquez les mêmes paramètres de seuil et d’analyse à tous les échantillons en conditions de mise en aveugle.
   9. Excluez les débris cellulaires en utilisant le contrôle FSC-A/SSC-A. Sélectionnez les cellules singlet en utilisant la grille FSC-A/FSC-H.
   10. Sélectionnez des cellules vivantes en utilisant une coloration à la coloration viable. Ajoutez la 7-aminoactinomycine D (7-AAD) à 1 μg/mL, incubez pendant 5 minutes à 4°C dans le noir, et utilisez-les pour la dégagement des cellules vivantes.
   11. Analyser l’intensité de fluorescence pour quantifier l’association cellulaire. Utilisez l’intensité moyenne de fluorescence comme métrique de quantification. Effectuer une analyse des données à l’aide du logiciel d’analyse de cytométrie en flux FlowJo (v10.8.1).
3. Captation cellulaire des NP MMM/DiI par les macrophages RAW 264,7
   1. Incuber des NP MMM/COL marqués par DiI (MMM/DiI NPs) avec des macrophages RAW 264,7 non modifiés à une concentration de 50 μg/mL (basée sur la masse centrale du PLGA) pendant 4 heures à 37°C dans une atmosphère à 5 % de CO₂.
   2. Préparez les cellules pour l’analyse comme décrit aux étapes 6.2.2–6.2.3.
   3. Définir les paramètres de l’instrument pour la détection de DiI en utilisant l’excitation à 549 nm et l’émission à 565 nm (canal PE).
   4. Recueillez des données à partir des échantillons. Acquérir au moins 10 000 événements par échantillon.
   5. Excluez les débris cellulaires en utilisant le contrôle FSC-A/SSC-A. Sélectionnez les cellules singlet en utilisant la grille FSC-A/FSC-H.
   6. Sélectionnez des cellules vivantes en utilisant une coloration à la coloration viable. Ajoutez 7-AAD à 1 μg/mL, incubez pendant 5 minutes à 4 °C dans le noir, et utilisez-les pour la clôture des cellules vivantes.
   7. Analysez l’intensité de fluorescence pour quantifier l’absorption cellulaire. Utilisez l’intensité moyenne de fluorescence comme métrique de quantification. Effectuer des analyses de données à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en écoulement.
4. Dosage à cellules de mousse
   1. Différenciez les cellules RAW 264,7 en cellules mousseuses en incubant avec une lipoprotéine oxydée à basse densité (oxLDL) à 50 μg/mL pendant 48 heures. Confirmez la formation des cellules de mousse par coloration Oil Red O, indiquée par une accumulation intracellulaire de lipides.
   2. Traiter les cellules de mousse avec de la colchicine libre, des NP COL ou des NP MMM/COL à une concentration équivalente de colchicine de 1 μM. Incuber les cellules pendant 24 heures à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Sélectionnez cette concentration en se basant sur des expériences préliminaires dose-réponse évaluant la viabilité cellulaire et l’efficacité anti-inflammatoire.
   3. Mesurez les niveaux de cytokines inflammatoires à l’aide d’un test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA).
      1. Prélever les surnadants en culture cellulaire immédiatement après le traitement (24 heures après le traitement).
      2. Centrifugez les plaques à 300 × g pendant 5 minutes à 4°C pour enlever les débris de cellules.
      3. Transférez les surnatants clarifiés dans des tubes propres et conservez à −80°C jusqu’à analyse.
      4. Mesurez les niveaux de TNF-α et d’interlukine-6 à l’aide de kits ELISA selon les instructions du fabricant.
      5. Effectuer toutes les mesures dans des puits triple et répéter l’expérience trois fois indépendamment.
      6. Indiquez les concentrations de cytokines sous forme de valeurs absolues (pg/mL) sans normalisation supplémentaire, car la densité d’ensemencement cellulaire et les conditions de traitement sont cohérentes dans tous les groupes.

7. Application thérapeutique in vivo dans un modèle d’athérosclérose

REMARQUE : Toutes les procédures animales doivent être approuvées par le Comité Institutionnel de Soins et d’Utilisation des Animaux concerné.

1. Établir un modèle animal
   1. Établir un modèle de plaque athéroscléreuse vulnérable chez des souris mâles de 8 semaines avec apolipoprotéine E. knockout (ApoE⁻/⁻) (fond C57BL/6).
   2. Nourrissez les souris avec un régime riche en graisses contenant 15 % de graisses et 0,25 % de cholestérol ad libitum pendant une semaine avant l’opération, puis continuez pendant 4 semaines après l’opération.
   3. Anesthésiez les souris avec de l’isoflurane (2 %–3 % pour l’induction et 1,5 %–2 % pour l’entretien) et administrez de la buprénorphine (0,1 mg/kg, par voie sous-cutaine) pour l’analgésie lors de la chirurgie de constriction carotide.
   4. Contrète l’artère carotide commune gauche à l’aide d’une aiguille de 0,3 mm de diamètre placée à côté de l’artère. Attachez une ligature en soie 6-0 autour de l’artère et de l’aiguille, puis retirez l’aiguille pour créer une constriction partielle.
   5. Confirmez la formation de la plaque vulnérable à 4 semaines après l’opération par une évaluation histologique.
   6. Effectuer des colorations hématoxyline et éosine (H&E), huile rouge O, et la coloration trichrome de Masson pour évaluer la morphologie de la plaque, le dépôt lipidique et la teneur en collagène.
   7. Définir les plaques vulnérables par la surface de la plaque > 40 % de la section transversale du vaisseau, l’épaisseur de la calotte fibreuse < 120 μm, la surface du noyau lipidique > 40 % de la surface totale de la plaque, et une infiltration importante de macrophages CD68 positives.
2. Injecter 100 μL de NP MMM/COL marqués DiI par voie intraveineuse via la veine colaire à une dose de 2 mg/kg (basée sur la masse centrale de PLGA).
   1. Imagez les souris un jour après l’injection à l’aide d’un système d’imagerie in vivo pour évaluer la biodistribution de l’ensemble du corps.
      1. Anesthésiez les souris avec de l’isoflurane (3 % pour l’induction et 1,5 % à 2 % pour l’entretien, avec des débits d’oxygène de 1 et 0,5 L/min respectivement). Surveillez la profondeur de l’anesthésie par la fréquence respiratoire et le réflexe pincé des orteils.
      2. Placez les souris sur position allongée sur une scène chauffée à 37°C pour maintenir la température corporelle lors de l’imagerie.
      3. Acquérez des images de fluorescence en utilisant les réglages DiI (excitation 549 nm et émission 565 nm) avec un filtre CY3 ou TRITC. Utilisez le mode d’exposition automatique (généralement 50–200 ms) et l’acquisition par épifluorescence.
      4. Capturez simultanément des images en champ clair correspondant pour référence anatomique à une résolution de 1024 × 1024 pixels.
   2. Prélève les organes majeurs et les artères carotides pour l’imagerie fluorescente ex vivo.
      1. Anesthésiez les souris avec de l’isoflurane (3 % pour l’induction et 2,5 % à 3 % pour l’entretien).
      2. Perfusez les souris avec 20 mL de PBS glacé (pH 7,4) par ponction du ventricule gauche à un débit de 5 mL/min pour éliminer le sang résiduel et les NP non liés.
      3. Prélève les organes (cœur, aorte, foie, rate, rein et poumon) immédiatement après la perfusion, 24 heures après l’injection.
      4. Rincez les organes prélevés dans du PBS bien froid pour retirer le sang de surface.
      5. Ouvrez l’aorte longitudinalement et épinglez-la à plat (côté endothélial vers le haut) sur une plaque en silicone noire à l’aide de broches en acier inoxydable.
      6. Gardez les tissus dans des PBS bien froids et réalisez des images fluorescentes ex vivo dans les 30 minutes suivant la récolte. Retirez l’excès de PBS de la surface tissulaire immédiatement avant l’imagerie.
3. Effectuer la dosification et le traitement
   1. Déterminer la dose de colchicine à partir de l’étude dose-réponse préliminaire (0,01–0,45 mg/kg, n = 7/groupe). Choisissez 0,05 mg/kg de colchicine comme dose thérapeutique.
   2. Administrez 100 μL par injection dans la veine de la queue, correspondant à une dose NP de 2 mg/kg (masse centrale de PLGA) et une dose de colchicine de 0,05 mg/kg. Injectez une fois par jour pendant 14 jours consécutifs.
   3. Randomisez les souris en groupes de traitement (PBS, colchicine libre et NP MMM/COL) à l’aide d’un générateur de nombres aléatoires. Effectuer toutes les quantifications par deux observateurs aveugles aux groupes de traitement.
   4. Adoptez des critères humains, notamment >20 % de perte de poids corporel, une mobilité réduite ou des signes de détresse.
4. Effectuer une analyse des points d’extrémité
   1. Euthanasiez les souris 24 heures après la dernière injection. Prélève les artères carotides et les aortes. Évaluer la charge de plaque par la tache rouge O en face de l’aorte.
   2. Quantifier la surface de la plaque
      1. Quantifiez la surface de la plaque en pourcentage d’aire O-positif au rouge d’huile de la surface totale de la lumière aortique en sections transversales (cinq sections par souris) à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image.
      2. Ouvrez l’image dans le logiciel d’analyse d’image ImageJ.
      3. Cliquez sur Image → Tape → 8 bits pour convertir l’image en niveaux de gris.
      4. Cliquez sur l’image → ajuster → seuil. Sélectionnez la méthode d’Otsu et appliquez le seuil pour identifier les régions Oil Red O-positive.
      5. Appliquez les mêmes paramètres de seuil à toutes les images d’échantillon et enregistrez les paramètres de seuil pour vérification.
      6. Cliquez sur Analyser → Définir les mesures et sélectionnez Surface.
      7. Cliquez sur Analyser → Mesurer pour quantifier les régions sélectionnées.
      8. Exportez les données quantifiées.
   3. Évaluer la stabilité de la plaque
      1. Évaluer la stabilité de la plaque par coloration histologique des coupes transversales carotidiennes à l’aide de H&E, Oil Red O et coloration trichrome de Masson. Quantifiez le collagène en pourcentage de la zone bleue trichrome positive de Masson dans la surface de la plaque.
      2. Préparer des sections incrustées dans la paraffine à une épaisseur de 5 μm et des sections congelées à température de coupe optimale à une épaisseur de 8 μm.
      3. Effectuez la coloration H&E en déparaffinant et réhydratent les sections, suivie d’une coloration à l’hématoxyline pendant 5 minutes et d’une coloration à l’éosine pendant 2 minutes à température ambiante (RT ; 23°C ± 2°C).
      4. Effectuez une coloration en huile rouge O sur les sections congelées en incubant avec une solution de travail huile rouge O pendant 15 minutes à RT. Différenciez les sections à 60 % d’isopropanol pendant 2 secondes et rinçez avec de l’eau distillée.
      5. Effectuez la coloration trichrome de Masson selon les instructions du kit en incubant des sections avec de l’hématoxyline de fer de Weigert pendant 10 minutes, la fuchsine acide de Ponceau pendant 5 minutes, l’acide phospholybdique pendant 5 minutes et le bleu d’aniline pendant 5 minutes à la RT.
      6. Images histologiques ouvertes dans un logiciel d’analyse d’images.
      7. Appliquez un seuil de couleur pour identifier les régions positives au collagène. Effectuez un seuil automatique et appliquez les mêmes paramètres à toutes les images d’échantillonnage.
      8. Paramètres de seuil d’enregistrement pour la vérification.
      9. Définissez la surface totale de la plaque comme la somme de toutes les surfaces placiques à l’intérieur de l’intimité vasculaire.
      10. Mesurez la surface de la plaque en traçant manuellement les limites ou en utilisant la segmentation automatique du seuil pour identifier toutes les régions de plaques.
      11. Mesurez la surface positive au collagène.
      12. Calculez la teneur en collagène comme une surface positive au collagène divisée par la surface totale de la plaque × 100 %.
   4. Évaluer le contenu des macrophages
      1. Effectuer une coloration par immunofluorescence CD68 pour évaluer la teneur en macrophages. Quantifier la teneur en macrophages en pourcentage de la zone CD68 positive de la surface de la plaque.
      2. Préparez des sections tissulaires (5 μm d’épaisseur pour les sections enfouies dans la paraffine). Effectuer la récupération d’antigènes à l’aide d’un tampon de citrate (pH 6,0) sous haute pression pendant 2 minutes.
      3. Bloc sections avec 5 % de BSA pendant 30 minutes en RT.
      4. Incubez des sections avec l’anticorps primaire monoclonal anti-souris CD68 (clone D4B9C, dilution 1:200 dans 1 % de BSA) pendant la nuit à 4°C.
      5. Incuber des sections avec un anticorps secondaire anti-lapin-lapin-IgG conjugué Alexa Fluor 488 (dilution 1:500) pendant 1 heure à la RT.
      6. Contre-coloration des noyaux avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 minutes.
      7. Images à fluorescence ouvertes dans un logiciel d’analyse d’images.
      8. Identifier les régions CD68 positives en utilisant le seuil. Effectuez un seuil automatique et appliquez les mêmes paramètres à toutes les images d’échantillonnage.
      9. Paramètres de seuil d’enregistrement pour la vérification.
      10. Mesurer la zone CD68 positive.
      11. Calculer la teneur en macrophages en zone CD68-positive divisée par la surface totale de plaque × 100 %.

Results

Les mesures DLS ont été effectuées à l’aide d’un système Zetasizer Nano ZS à 25°C avec un angle de rétrodiffusion de 173°. Les échantillons ont été dilués 20 fois dans de l’eau déionisée (concentration finale d’environ 0,1 mg/mL) et équilibrés pendant 2 minutes avant la mesure. Chaque échantillon a été mesuré en triple licat, et les résultats sont présentés en moyenne ± SD. DLS et TEM révèlent une augmentation de la taille NP après le revêtement membranaire et confirment la formation d’u...

Discussion

Ce protocole fournit une méthode complète pour construire et appliquer des NP membraneuses co-modifiées CD47 et intégrine α4/β1 pour une thérapie ciblée de l’athérosclérose. Les principaux avantages de ce système incluent un ciblage actif via l’interaction intégrine α4/β1–VCAM-1 et une réduction de l’absorption des macrophages associée à la signalisation médiée par CD47, comme le confirment les tests d’absorption in vitro (Figure 3) et les résultats de biodi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomycine D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	A1310	Colorant de viabilité pour la discrimination live/dead de la cytométrie en flux
Alexa Fluor 488-conjugué anti-lapins pour la chèvre IgG	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	A-11008	Anticorps secondaire pour la coloration par immunofluorescence CD68
Anticorps anti-souris CD47	Abcam (États-Unis)	ab214453	Utilisé pour l’analyse Western blot afin de vérifier l’expression du CD47
Intégrine anti-souris et alpha ; 4 anticorps (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (États-Unis)	SC-376334	Utilisé pour l’analyse de Western blot afin de vérifier l’intégrine et l’alpha ; 4 Expression
Intégrine anti-souris & bêta ; 1 anticorps (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (États-Unis)	SC-374429	Utilisé pour l’analyse Western blot afin de vérifier l’intégrine et la bêta ; 1 Expression
ApoE-/- souris	Le laboratoire Jackson (États-Unis)	N/A	Utilisé pour le modèle d’athérosclérose in vivo
Kit de test BCA	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	23225	Utilisé pour déterminer la concentration en protéines
Plaque en silicone noir	N/A	N/A	Utilisé pour monter l’aorte pour l’imagerie ex vivo
Plasmide CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (Chine)	G0177361-1	Contient le gène Cd47 de la souris pour la surexpression
Colchicine	Sigma-Aldrich (États-Unis)	C9754	Charge utile thérapeutique dans les nanoparticules
Microscope laser confocal à balayage	Leica Microsystems	TCS SP8	Utilisé pour l’imagerie de fluorescence et l’analyse de co-localisation
Tampon de citrate (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	N/A	Utilisé pour la récupération d’antigènes dans la coloration par immunofluorescence
Tubulure de dialyse (MWCO 3 500 Da)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	PURD35030	Utilisation pour la purification des nanoparticules
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	D2447	Solvant pour la préparation des nanoparticules
DiI (1,1&prime ;-dioctadécyl-3,3,3&prime ;,3&prime ;-perchlorate de tétraméthylyindocarbocyanine)	Beyotime (Chine)	C1036	Marquage fluorescent du noyau de nanoparticules
DiO (3,3&prime ;-dioctadécyloxacarbocyanine perchlorate)	Beyotime (Chine)	C1038	Marquage fluorescent de la membrane macrophage
DiR	Beyotime (Chine)	Y239280	Utilisé pour l’imagerie fluorescente in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	D3571	Contre-coloration nucléaire pour l’imagerie à fluorescence
Dulbecco » s Eagle Moyen Modifié (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	11965092	Milieu de culture cellulaire
Analyseur dynamique de diffusion de la lumière (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Royaume-Uni)	N/A	Utilisé pour les mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) de la taille des nanoparticules, du PDI et du potentiel zêta
Kit ELISA	R& D Systems (États-Unis)	Cela dépend de la cytokine cible	Utilisé pour quantifier les cytokines inflammatoires
Endothéline-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	E7764	Utilisé pour stimuler l’intégrine et l’alpha ; 4/& bêta ; 1 Expression
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, États-Unis)	10091148	Supplément pour milieu de culture cellulaire
Cytomètre en débit	BD en biosciences (États-Unis)	FACSCalibur	Utilisé pour l’acquisition du signal de fluorescence
Logiciel d’analyse de cytométrie en flux (FlowJo v10.8.1)	BD en biosciences (États-Unis)	N/A	Utilisé pour l’analyse des données de cytométrie en flux
Cellules endothéliales des veines ombilicales humaines (HUVEC)	FuHeng Biotechnologies (Chine)	FH1122	Utilisé pour les tests de ciblage in vitro
Logiciel d’analyse d’images (ImageJ)	Instituts nationaux de la santé (États-Unis)	N/A	Utilisation pour l’analyse quantitative d’images
Système d’imagerie in vivo	PerkinElmer (États-Unis)	IVIS Lumina III	Utilisé pour l’imagerie à fluorescence corporelle entière
Isopropanol (60 %)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	34863	Utilisé pour la différenciation lors de la coloration Oil Red O
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	L3000001	Réactif de transfection
Agitateur magnétique et barre d’agitation	N/A	N/A	Utilisé pour la préparation des nanoparticules
Masson' s kit de teinture trichrome	Abcam (États-Unis)	ab150686	Utilisé pour la coloration au collagène
Mini-extrudeur	Lipides polaires Avanti (États-Unis)	610000	Utilisé pour l’extrusion membranaire
Lignée cellulaire Murine RAW 264.7	FuHeng Biotechnologies (Chine)	FH0328	Source des macrophages
Lignée cellulaire musculaire lisse murinaire	FuHeng Biotechnologies (Chine)	FH-Y063	Utilisé pour l’évaluation de la sécurité
Oil Red O	Sigma-Aldrich (États-Unis)	O0625	Utilisé pour la coloration lipidique
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	31985062	Milieu sérique réduit pour la transfection
Lipoprotéine oxydée de basse densité (Ox-LDL)	Yiyuan Biotechnologies (Chine)	YB-002	Utilisé pour induire la formation de cellules de mousse
Pénicilline & ndash ; Streptycine	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	15140122	Complément antibiotique pour culture cellulaire
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	78830	Inhibiteur de la protéase
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	10010023	Lavage et tampon de dilution
Poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA, 50:50 ; MW 90 000)	Dalian Meilun Biotechnologie (Chine)	MB5649-1	Polymère pour la fabrication de nanoparticules
Filtres à membrane en polycarbonate (200 nm, 400 nm)	Whatman (Royaume-Uni)	800282	Utilisé pour l’extrusion
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	P9333	Composant du tampon de lyse
Réactif P3000	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	L3000001	Amplificateur de transfection
Microtome rotatif	Leica Biosystems (Allemagne)	RM2235	Utilisé pour le coupement à la paraffine
Pompe à seringue	Appareil Harvard (États-Unis)	70-3007	Utilisé pour la formation contrôlée de nanoparticules
Microscope électronique à transmission (MET)	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	Talos F200S	Utilisation pour l’imagerie par nanoparticules
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (États-Unis)	T2663	Composant tampon
Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-&alpha ;)	R& D Systems (États-Unis)	410-MT	Utilisé pour activer les cellules endothéliales
Eau ultrapure	Milli-Q (Merck, États-Unis)	ZMQSV0T01	Utilisé pour la préparation et la dialyse des nanoparticules