Isolement, synthèse et caractérisation des nanoparticules CD47- et Intégrine α4/β1 modifiées par membrane de macrophages et de nanoparticules poly(acide lactique-co-glycolique)

Zhenqiang Cai; Yuyu Li

doi:10.3791/70791

Method Article

Isolement, synthèse et caractérisation des nanoparticules CD47- et Intégrine α4/β1 modifiées par membrane de macrophages et de nanoparticules poly(acide lactique-co-glycolique)

DOI:

10.3791/70791

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May 29th, 2026

Zhenqiang Cai¹ , Yuyu Li²

¹Department of Cardiology, Anqing Petrochemical Hospital of Nanjing Drum Tower Hospital Group, ²Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University

Summary

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Ce protocole permet la préparation et la caractérisation de nanoparticules poly(acide lactique-co-glycolique) recouvertes de membrane CD47 et intégrine α4/β1 pour des applications ciblées de délivrance de médicaments.

Abstract

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L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique et un facteur majeur de la morbidité et de la mortalité cardiovasculaires. L’administration ciblée d’agents anti-inflammatoires aux sites athéroscléreux reste un défi important. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la préparation et la caractérisation des nanoparticules poly(acacide lactique-co-glycolique) (MMM/COL NPs) co-modifiées en membrane recouvertes de macrophages CD47 et intégrine α4/β1. Le protocole comprend la modification des macrophages par transfection plasmidique et stimulation à l’endothéline-1, l’isolation membranaire, la fabrication NP et le revêtement membranaire. Les NP MMM/COL résultants sont évalués à l’aide de caractérisations physicochimiques, d’analyses d’expression protéique, ainsi que d’essais in vitro et in vivo . La validation fonctionnelle inclut l’évaluation de l’association cellulaire avec les cellules endothéliales activées, l’absorption des macrophages, les effets anti-inflammatoires dans les cellules mousses, et la biodistribution dans un modèle d’athérosclérose murine. De plus, des paramètres expérimentaux clés et des étapes de contrôle qualité sont mis en avant pour garantir la reproductibilité et la cohérence entre les laboratoires. Ce protocole offre une approche robuste et évolutive pour générer des NP biomimétiques destinés à des applications ciblées d’administration de médicaments dans la recherche sur l’athérosclérose.

Introduction

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L’athérosclérose est une maladie inflammatoire chronique qui entraîne des événements cardiovasculaires mortels et des AVC par sténose artérielle de la lumière et rupture instable de la plaque, ce qui représente une charge sanitaire mondiale^importante ^1,2,3. La régulation à la baisse des réponses inflammatoires au site athéroscléreux est une cible thérapeutique majeure ^4,5. La colchicine, un puissant anti-inflammatoire, a montré des promesses pour réduire les effets cardiovasculaires

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Protocol

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Toutes les procédures animales décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation institutionnelles des animaux de l’hôpital Nankin Drum Tower et suivaient les directives pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire établies par les National Institutes of Health.

1. Modification des macrophages RAW 264.7

Préparer les cellules RAW 264,7, compléter le milieu Eagle modifié de Dulbecco complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine, un plasmide de surexpression CD47, un réactif de transfection Lipofe....

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Results

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Les mesures DLS ont été effectuées à l’aide d’un système Zetasizer Nano ZS à 25°C avec un angle de rétrodiffusion de 173°. Les échantillons ont été dilués 20 fois dans de l’eau déionisée (concentration finale d’environ 0,1 mg/mL) et équilibrés pendant 2 minutes avant la mesure. Chaque échantillon a été mesuré en triple licat, et les résultats sont présentés en moyenne ± SD. DLS et TEM révèlent une augmentation de la taille NP après le revêtement membranaire et confirment la formation d’u.......

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Discussion

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Ce protocole fournit une méthode complète pour construire et appliquer des NP membraneuses co-modifiées CD47 et intégrine α4/β1 pour une thérapie ciblée de l’athérosclérose. Les principaux avantages de ce système incluent un ciblage actif via l’interaction intégrine α4/β1–VCAM-1 et une réduction de l’absorption des macrophages associée à la signalisation médiée par CD47, comme le confirment les tests d’absorption in vitro (Figure 3) et les résultats de biodi.......

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Disclosures

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Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents ni d’autres conflits d’intérêts.

Acknowledgements

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Les auteurs remercient le Dr Jinxuan Zhao et le Dr Dr Jiaqi Yu pour leurs conseils scientifiques, ainsi que le personnel de PROMAB pour leur soutien technique.

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
7-Aminoactinomycine D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	A1310	Colorant de viabilité pour la discrimination live/dead de la cytométrie en flux
Alexa Fluor 488-conjugué anti-lapins pour la chèvre IgG	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	A-11008	Anticorps secondaire pour la coloration par immunofluorescence CD68
Anticorps anti-souris CD47	Abcam (États-Unis)	ab214453	Utilisé pour l’analyse Western blot afin de vérifier l’expression du CD47
Intégrine anti-souris et alpha ; 4 anticorps (B-2)	Santa Cruz Biotechnology (États-Unis)	SC-376334	Utilisé pour l’analyse de Western blot afin de vérifier l’intégrine et l’alpha ; 4 Expression
Intégrine anti-souris & bêta ; 1 anticorps (A-4)	Santa Cruz Biotechnology (États-Unis)	SC-374429	Utilisé pour l’analyse Western blot afin de vérifier l’intégrine et la bêta ; 1 Expression
ApoE^-/^- souris	Le laboratoire Jackson (États-Unis)	N/A	Utilisé pour le modèle d’athérosclérose in vivo
Kit de test BCA	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	23225	Utilisé pour déterminer la concentration en protéines
Plaque en silicone noir	N/A	N/A	Utilisé pour monter l’aorte pour l’imagerie ex vivo
Plasmide CD47 (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (Chine)	G0177361-1	Contient le gène Cd47 de la souris pour la surexpression
Colchicine	Sigma-Aldrich (États-Unis)	C9754	Charge utile thérapeutique dans les nanoparticules
Microscope laser confocal à balayage	Leica Microsystems	TCS SP8	Utilisé pour l’imagerie de fluorescence et l’analyse de co-localisation
Tampon de citrate (pH 6,0)	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	N/A	Utilisé pour la récupération d’antigènes dans la coloration par immunofluorescence
Tubulure de dialyse (MWCO 3 500 Da)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	PURD35030	Utilisation pour la purification des nanoparticules
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	D2447	Solvant pour la préparation des nanoparticules
DiI (1,1&prime ;-dioctadécyl-3,3,3&prime ;,3&prime ;-perchlorate de tétraméthylyindocarbocyanine)	Beyotime (Chine)	C1036	Marquage fluorescent du noyau de nanoparticules
DiO (3,3&prime ;-dioctadécyloxacarbocyanine perchlorate)	Beyotime (Chine)	C1038	Marquage fluorescent de la membrane macrophage
DiR	Beyotime (Chine)	Y239280	Utilisé pour l’imagerie fluorescente in vivo
DAPI	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	D3571	Contre-coloration nucléaire pour l’imagerie à fluorescence
Dulbecco » s Eagle Moyen Modifié (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	11965092	Milieu de culture cellulaire
Analyseur dynamique de diffusion de la lumière (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Royaume-Uni)	N/A	Utilisé pour les mesures de diffusion dynamique de la lumière (DLS) de la taille des nanoparticules, du PDI et du potentiel zêta
Kit ELISA	R& D Systems (États-Unis)	Cela dépend de la cytokine cible	Utilisé pour quantifier les cytokines inflammatoires
Endothéline-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	E7764	Utilisé pour stimuler l’intégrine et l’alpha ; 4/& bêta ; 1 Expression
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, États-Unis)	10091148	Supplément pour milieu de culture cellulaire
Cytomètre en débit	BD en biosciences (États-Unis)	FACSCalibur	Utilisé pour l’acquisition du signal de fluorescence
Logiciel d’analyse de cytométrie en flux (FlowJo v10.8.1)	BD en biosciences (États-Unis)	N/A	Utilisé pour l’analyse des données de cytométrie en flux
Cellules endothéliales des veines ombilicales humaines (HUVEC)	FuHeng Biotechnologies (Chine)	FH1122	Utilisé pour les tests de ciblage in vitro
Logiciel d’analyse d’images (ImageJ)	Instituts nationaux de la santé (États-Unis)	N/A	Utilisation pour l’analyse quantitative d’images
Système d’imagerie in vivo	PerkinElmer (États-Unis)	IVIS Lumina III	Utilisé pour l’imagerie à fluorescence corporelle entière
Isopropanol (60 %)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	34863	Utilisé pour la différenciation lors de la coloration Oil Red O
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	L3000001	Réactif de transfection
Agitateur magnétique et barre d’agitation	N/A	N/A	Utilisé pour la préparation des nanoparticules
Masson' s kit de teinture trichrome	Abcam (États-Unis)	ab150686	Utilisé pour la coloration au collagène
Mini-extrudeur	Lipides polaires Avanti (États-Unis)	610000	Utilisé pour l’extrusion membranaire
Lignée cellulaire Murine RAW 264.7	FuHeng Biotechnologies (Chine)	FH0328	Source des macrophages
Lignée cellulaire musculaire lisse murinaire	FuHeng Biotechnologies (Chine)	FH-Y063	Utilisé pour l’évaluation de la sécurité
Oil Red O	Sigma-Aldrich (États-Unis)	O0625	Utilisé pour la coloration lipidique
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	31985062	Milieu sérique réduit pour la transfection
Lipoprotéine oxydée de basse densité (Ox-LDL)	Yiyuan Biotechnologies (Chine)	YB-002	Utilisé pour induire la formation de cellules de mousse
Pénicilline & ndash ; Streptycine	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	15140122	Complément antibiotique pour culture cellulaire
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	78830	Inhibiteur de la protéase
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	10010023	Lavage et tampon de dilution
Poly(acide lactique-co-glycolique) (PLGA, 50:50 ; MW 90 000)	Dalian Meilun Biotechnologie (Chine)	MB5649-1	Polymère pour la fabrication de nanoparticules
Filtres à membrane en polycarbonate (200 nm, 400 nm)	Whatman (Royaume-Uni)	800282	Utilisé pour l’extrusion
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich (États-Unis)	P9333	Composant du tampon de lyse
Réactif P3000	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	L3000001	Amplificateur de transfection
Microtome rotatif	Leica Biosystems (Allemagne)	RM2235	Utilisé pour le coupement à la paraffine
Pompe à seringue	Appareil Harvard (États-Unis)	70-3007	Utilisé pour la formation contrôlée de nanoparticules
Microscope électronique à transmission (MET)	Thermo Fisher Scientific (États-Unis)	Talos F200S	Utilisation pour l’imagerie par nanoparticules
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (États-Unis)	T2663	Composant tampon
Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-&alpha ;)	R& D Systems (États-Unis)	410-MT	Utilisé pour activer les cellules endothéliales
Eau ultrapure	Milli-Q (Merck, États-Unis)	ZMQSV0T01	Utilisé pour la préparation et la dialyse des nanoparticules

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