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Article de recherche

P. gingivalis/F. nucléatum dans la parodontite apicale chronique sont associés à un raccourcissement gestationnel via la voie TLR4/MyD88/NF-κB

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DOI :

10.3791/70793

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15 mai 2026

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1Department of Cariology and Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, The Affiliated Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, 2Development and Related Diseases of Women and Children Key Laboratory of Sichuan Province, 3Stomatology Disease Institute of Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Xinjiang Medical University, 4Department of Endodontics, Urumqi Stomatological Hospital, 5Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University

Dans cet article

Résumé

Les agents pathogènes oraux associés à la parodontite apicale chronique (P. gingivalis, F. nucleatum) sont évalués à l’aide de modèles murins de PAC et de tests d’infection par trophoblastes humains. Un raccourcissement gestationnel est observé parallèlement à une activation inflammatoire placentaire compatible avec la signalisation TLR4/MyD88/NF-κB. L’ADN bactérien est détectable dans les tissus placentaires/vasculaires, soutenant un lien hématogène et des cibles potentielles d’intervention.

Résumé

La naissance prématurée spontanée (SBT ; accouchement avant 37 semaines) reste une cause majeure de mortalité néonatale, et une infection intra-utérine est impliquée dans une proportion importante des cas. Les preuves émergentes lient des agents pathogènes oraux tels que Porphyromonas gingivalis et Fusobacterium nucleatum à des résultats gestationnels défavorables ; cependant, les voies mécanistes reliant la parodontite apicale chronique (PAC) au risque gestationnel restent incomplètement définies. Chez des souris C57BL/6J gestantes, la PAC a été établie par inoculation de canal et complétée par un modèle de défi nerveux à l’aide de suspensions bactériennes (1 × 108 UFC/mL). La longueur gestationnelle, l’histopathologie placentaire, les marqueurs inflammatoires et les signaux d’ADN bactérien ont été évalués par qPCR. Parallèlement, des trophoblastes humains ont été exposés à P. gingivalis ou F. nucleatum (MOI = 50, 24 h) afin d’examiner la signalisation inflammatoire compatible avec l’activation de l’axe TLR4/MyD88/NF-κB. Par rapport aux témoins, les groupes associés à la PAC ont montré un raccourcissement gestationnel (médian 19,5 vs 20,5 jours), accompagné d’une augmentation des lectures inflammatoires placentaires (incluant des IL-1β et TNF-α élevés) et de caractéristiques histopathologiques compatibles avec une lésion inflammatoire. La qPCR a également indiqué la présence de signaux d’ADN bactérien dans les tissus placentaires et vasculaires. Dans les tests de trophoblast, F. nucleatum a suscité des réponses pro-inflammatoires plus fortes que P. gingivalis, en association avec une phosphorylation accrue de NF-κB. Collectivement, ces résultats suggèrent que les agents pathogènes oraux associés à la PAC pourraient contribuer au raccourcissement gestationnel en provoquant une inflammation placentaire via la signalisation TLR4/MyD88/NF-κB, soutenant ainsi un axe microbien oral–placentaire comme cible potentielle pour atténuer le risque gestationnel lié à l’infection.

Introduction

La naissance prématurée spontanée (SBPT) est définie comme un accouchement survenant entre 20 et 37 semaines de gestation sans interventionmédicale 1. En tant que préoccupation majeure de santé publique mondiale, l’incidence de la SBPT varie d’environ 5 % à 9 % dans les pays développés à 12 % à 18 % dans les régions à ressourceslimitées 2,3. La naissance prématurée et ses complications restent une cause majeure de mortalité chez les enfants de moins de 5 ans, représentant environ un million de décès néonatals chaqueannée. Les survivants rencontrent souvent à la fois des complications immédiates, comme le syndrome de détresse respiratoire, et des séquelles à long terme, notamment la paralysie cérébrale et des retards du développement 5,6, imposant ainsi d’importants fardeaux économiques aux familles et à lasociété 7,8.

L’étiologie de la SBT est multifactorielle, reflétant les interactions entre facteurs maternels, fœtaux et environnementaux, notamment la dysfonction contractile utérine, l’insuffisance cervicale, les troubles endocriniens, les troubles placentaires et les infectionsintra-utérines. L’infection intra-utérine est reconnue comme un facteur majeur et est estimée à représenter environ 30 % à 40 % des cas de naissanceprématurée 10,11. Les agents pathogènes peuvent accéder à la cavité amniotique par des voies ascendantes (par exemple, cervicovaginales) ou hématogènes, activant ainsi les réponses immunitaires de l’hôte et favorisant la libération de cytokines pro-inflammatoires (par exemple, IL-6, TNF-α) et de prostaglandines pouvant précipiter un accouchement12. Les trophoblastes, en tant que composants cellulaires clés de l’interface mère-fœtale, contribuent à la tolérance immunitaire ainsi qu’à la défenseantimicrobienne 13.

Des micro-organismes oraux, dont Porphyromonas gingivalis et Fusobacterium nucleatum, ont été impliqués dans des processus inflammatoires liés au sPTB, potentiellement par bactériémie et/ou dissémination de médiateurs inflammatoires14. Ces espèces sont des agents pathogènes parodontaux établis, et des associations entre parodontite et sPTB ont été rapportées dans des études épidémiologiqueset cliniques 15,16,17. Notamment, P. gingivalis et F. nucleatum sont également fréquemment détectés dans la parodontite apicale chronique (PAC)18,19, mais la relation entre la PAC et les résultats gestationnels défavorables reste relativement peu étudiée, et les voies biologiques pertinentes ne sont pas encore pleinementdéfinies 20. Harjunmaa et al. ont rapporté pour la première fois une association entre la parodontite apicale et la réduction de la durée gestationnelle ainsi que le faible poids à la naissance en 201521. Une étude de suivi menée sur la même cohorte n’a pas soutenu un transfert bactérien direct vers le placenta, suggérant que l’inflammation systémique pourrait représenter un lien plausible entre la parodontite apicale et les résultats degrossesse 22. Conformément à cette interprétation, la parodontite apicale radiographiquement confirmée a été associée à un risque accru d’accouchements prématurés de faible poidsà la naissance 23. En tant qu’infection occulte persistante, la PAC peut contribuer au risque gestationnel par une inflammation systémique chronique de faible grade et/ou une exposition hématogène à des composantsmicrobiens 24,25. Une clarification supplémentaire de la relation PAC–gestation est donc nécessaire pour affiner la compréhension des voies inflammatoires oral-placentaire et pour éclairer les stratégies de prévention du risque gestationnel lié à l’infection.

Des études récentes ont mis en lumière la pertinence de l’axe de signalisation TLR4/MyD88/NF-κB dans la naissance prématurée associée à l’inflammation. Robertson et al. ont identifié TLR4 comme une cible thérapeutique potentielle dans le travail prématuré induit par l’inflammation et ont rapporté des effets préventifs dans des modèles animaux26. Peng et al. ont également montré que miR-199a-3p atténue l’inflammation épithéliale cervicale par la suppression de la voie HMGB1/TLR4/NF-κB 27. De plus, Shen et al. ont décrit les effets antioxydants et anti-inflammatoires de la seringine chez les rats enceintes diabétiques, avec la modulation de la voie TLR4/MyD88/NF-κB impliquée dans les améliorationsobservées 28. Ensemble, ces résultats soutiennent un cadre mécaniste dans lequel la signalisation inflammatoire liée à TLR4/MyD88/NF-κB contribue aux voies associées à l’infection qui influencent la parturition, tout en reconnaissant que plusieurs récepteurs immunitaires innés peuvent agir en parallèle selon le contexte du pathogène.

La présente étude évalue les effets gestationnels associés à la PAC à l’aide de tests complémentaires in vitro de trophoblastes et de modèles murins in vivo . Le modèle de trophoblaste permet une interrogation contrôlée de la signalisation inflammatoire induite par le pathogène, tandis que le modèle de CAP chez la femme maternelle relie les réponses cellulaires aux phénotypes de grossesse au niveau de l’organisme dans des conditions gestationnelles physiologiques. Un modèle de défi nerveux est inclus afin de fournir une voie d’exposition hématogène complémentaire et d’évaluer si les schémas d’activation inflammatoire observés dans le contexte de l’infection buccale se réagrènent lorsque des composants bactériens accèdent à la circulation maternelle. Plus précisément, l’exposition aux trophoblastes à P. gingivalis et F. nucleatum est utilisée pour profiler les réponses des cytokines et l’activation de l’axe TLR4/MyD88/NF-κB, tandis que des expériences animales évaluent la longueur gestationnelle, l’inflammation placentaire et la détection par qPCR des signaux d’ADN bactérien dans la bifurcation carotide et les tissus placentaires. Parce que la qPCR indique la présence d’ADN bactérien plutôt que la viabilité ou la localisation cellulaire, les interprétations concernant la présence microbienne à l’interface mère-fœtale restent prudentes. De plus, les différences entre espèces et l’exposition expérimentale contrôlée peuvent limiter la traduction clinique directe, soulignant la nécessité d’une validation ultérieure dans des contextes humains.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été menées en stricte conformité avec les directives éthiques établies par le Comité d’éthique de la recherche animale du Premier Hôpital affilié de l’Université médicale du Xinjiang (Approbation n° : IACUC-20231121-13) et conformément au guide des National Institutes of Health (NIH) pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire (édition 2011). De plus, cette étude a été réalisée conformément aux directives de l’ARRIVE. Toutes les fournitures (réactifs, consommables, équipements et logiciels) ainsi que leurs informations de fabricant et numéros de catalogue correspondants sont fournies dans le tableau des matériaux afin de faciliter la reproductibilité.

1. Culture bactérienne

Les souches de référence de Porphyromonas gingivalis et Fusobacterium nucleatum (identifiants de souches fournis dans le Tableau des matériaux) ont été traitées dans des conditions anaérobies. Des cultures primaires ont été établies sur des plaques d’agar sanguin pré-réduites de Columbia et incubées anaérobies (85 % de N₂, 10 % d’H₂ et 5 % de CO₂) à 37 °C pendant 48 heures. Pour les préparations expérimentales, une seule colonie bien isolée a été inoculée dans un bouillon d’infusion cérébrale de 40 mL et incubée dans des conditions anaérobies identiques jusqu’à la croissance de la phase moyenne de logarithme (OD660 = 0,6–0,8). Pour minimiser l’exposition à l’oxygène, des étapes d’inoculation et de transfert ont été effectuées à l’intérieur d’un poste de travail anaérobie à l’aide de milieux et d’outils pré-réduits. Les concentrations bactériennes ont été standardisées à 1 ×10 8 UFC/mL pour l’exposition animale en utilisant une quantification basée sur OD660 avec une courbe standard OD–UFC spécifique à la souche générée sous les mêmes conditions de culture ; La courbe d’étalonnage a été établie par dilution en série et par comptage en colonie sur des plaques d’agar anaérobies avec au moins trois calibrations indépendantes. Pour les études d’infection par trophoblastes, les suspensions bactériennes ont été quantifiées à l’aide d’une méthode d’énumération validée et diluées dans un milieu de culture complète sans antibiotiques afin d’obtenir la multiplicité d’infection (MOI) spécifiée immédiatement avant la coculture.

2. Élevage et regroupement des animaux

Les souris C57BL/6J sans agents pathogènes spécifiques (n = 90 ; 60 femelles, 30 mâles) âgées de 6 à 7 semaines ont été logées dans des conditions contrôlées (22 °C ± 2 °C, 60 % ± 10 % d’humidité, 12 heures de cycle lumineux) avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Après une semaine d’acclimatation, les souris ont été réparties aléatoirement en six groupes expérimentaux (n = 15/groupe) : Contrôle normal (NC), PAC avec P. gingivalis (AP), PAC avec F. nucléatum (AF), injection de veine de la queue de solution saline normale (VN), injection de la veine de la queue de P. gingivalis (VP), et injection de la veine de la queue de F. nucleatum (VF). La randomisation et l’allocation de cage ont été enregistrées afin de minimiser le biais d’allocation et les effets potentiels de la cage.

3. Établissement du modèle PAC

Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées dans des conditions aseptiques. L’anesthésie a été induite par administration intrapéritonéale de pentobarbital sodium (1,62 mg/30 g de poids corporel) combinée à du sulfate d’atropine (12,5 μg/30 g de poids corporel), et une profondeur anesthésique adéquate a été confirmée par l’absence de réflexe de retrait pédal. Les souris étaient positionnées sur le dosi sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle, et la bouche était doucement ouverte pour permettre une visualisation stable des premières molaires maxillaires bilatérales. Sous grossissement, les chambres pulpaires des premières molaires maxillaires bilatérales ont été ouvertes à l’aide d’une fraise ronde stérile, suivies du retrait du tissu pulpar coronal à l’aide de micro-instruments stériles. Les orifices de canal ont été identifiés à l’aide d’une petite lime endodontique (taille 06–10), et les canaux ont été négociés en douceur pour obtenir une perpétuité tout en évitant une force excessive afin de minimiser le risque de perforation. La chambre était rincée avec du sérum stérile (ou PBS stérile) et séchée avec des pointes en papier stériles avant l’inoculation.

L’inoculation bactérienne a été réalisée à l’aide d’une suspension standardisée à 1 × 108 UFC/mL. Pour rendre le dosage reproductible, le volume délivré était fixé opérationnellement à 2 μL par dent (environ 2 × 105 UFC par dent), administré à l’aide d’une pointe de micropipette calibrée positionnée à l’entrée de la chambre. Une pointe absorbante stérile pré-imbibée avec la même suspension était ensuite placée dans la chambre de pulpe pour maintenir une exposition localisée. Le succès de l’accouchement a été confirmé par un mouillage visible de la pointe du papier et l’absence de fuite dans la cavité buccale. Après l’inoculation, la chambre était séchée à l’air jusqu’à ce qu’aucun liquide visible ne reste, puis scellée avec un adhésif dentaire légèrement durci (20 s), puis restaurée à l’aide d’un composite de résine fluide légèrement durci (20 s). L’intégrité du joint a été confirmée par une inspection visuelle et des sondes délicates ; Les restaurations présentant des failles ou des pertes précoces ont été immédiatement refermées. Des analgésies post-procédurales et un suivi ont été assurés conformément aux directives institutionnelles de soins aux animaux.

Deux semaines plus tard, des radiographies périapicales ont été obtenues pour confirmer l’établissement de la CAP. L’établissement réussi a été défini par une radiolucidité périapicale claire, avec des modifications osseuses environnantes compatibles avec une inflammation périapicale chronique et une destruction osseuse. L’accouplement a été initié deux semaines après l’infection/l’établissement du modèle.

4. Établissement du modèle d’injection de veines de la queue

Les suspensions bactériennes ont été préparées à une concentration de 1 × 108 UFC/mL dans du sérum physiologique stérile. Les souris étaient retenues, et la queue réchauffée pendant 1 à 2 minutes pour dilater les veines latérales de la queue. Les injections étaient effectuées à l’aide d’une aiguille de calibre fin (généralement 29–30 G) insérée en biseau dans la veine latérale de la queue à un angle faible (environ 10–15°). Le placement correct de l’intraveineuse a été confirmé par un éclair de sang dans le moyeu et une perfusion fluide avec faible résistance ; Le placement infructueux a été indiqué par une résistance accrue et/ou la formation d’une blete sous-cutanée, auquel cas l’infusion a été arrêtée et répétée à un site plus proximal après un court réchauffement. Les souris recevaient des injections quotidiennes pendant trois jours consécutifs (100 μL par souris à chaque fois). Après trois jours, les femmes ont été cologées avec des hommes, et les bouchons vaginaux ont été vérifiés le lendemain matin. Après confirmation des bouchons vaginaux (diabète de type 0,5), les injections ont été administrées tous les trois jours (100 μL par souris à chaque fois) jusqu’au 15e jour de gestation.

5. Établissement du modèle de la souris enceinte

Les souris femelles et mâles ont été cologées dans un ratio de 2:1 (femelle :mâle) pendant la nuit à partir de 20h00 chaque jour. La présence d’un bouchon vaginal ou d’un frottis vaginal spermatozoïde positif à 8h00 le lendemain matin était désignée comme jour gestationnel (DG) 0,5. Pour chaque souris, le poids corporel initial, le poids du prêttum, le poids post-partum, la durée gestationnelle, le poids à la naissance néonatale, la taille de la portée et le nombre de mortinaissances ont été enregistrés. Sur la base d’étudesantérieures, l’accouchement survenant avant le diafrage 18,5 a été défini opérationnellement comme une naissance prématurée chez la souris. Comme le raccourcissement gestationnel peut survenir dans la plage de termes, les résultats de la grossesse ont été interprétés en tenant compte de la distinction entre un accouchement prématuré véritable et un phénotype de raccourcissement gestationnel.

6. Collecte et traitement des échantillons

Au 15e jour gestationnel, trois souris enceintes par groupe ont été sélectionnées au hasard pour un prélèvement placentaire et vasculaire (NC/AP/AF et VN/VP/VF). Après anesthésie induite par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (1,62 mg pour 30 g de poids corporel) et d’atropine sulfate (12,5 μg pour 30 g de poids corporel), des échantillons sanguins ont été prélevés par hémorragie rétro-orbitaire. Les souris étaient euthanasiées dans une chambre de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la mort soit confirmée par l’absence de respiration, de battement de cœur et de réflexe cornéen ; La livraison de dioxyde de carbone a suivi une approche de remplissage progressif, conforme aux recommandations institutionnelles de bien-être animal. La bifurcation de l’artère carotide et les tissus placentaires ont été rapidement collectés à l’aide d’instruments stériles pour réduire la contamination par échantillons croisés. Le tissu placentaire était divisé en deux parties : une partie était stockée à −80 °C, et l’autre partie était fixée dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 24 heures, suivi d’une déshydratation graduée de l’éthanol et d’une incorporation de paraffine. Les souris restantes ont été surveillées pour le poids corporel quotidien, la durée gestationnelle, la taille de la portée et le poids à la naissance néonatale.

7. Culture cellulaire et traitement

La lignée cellulaire de trophoblastes humains HTR-8/SVneo a été cultivée dans un milieu RPMI 1640 complété avec un sérum fœtal bovin inactivé à 10 % de chaleur à 37 °C avec 5 % de CO₂. Pour les expériences d’infection, les cellules HTR-8/SVneo (1 × 106 cellules) en phase de croissance logarithmique ont été ensemées en plaques à 6 puits et laissées à adhérer toute la nuit. Avant le défi bactérien, le milieu était remplacé par un milieu complet sans antibiotiques afin d’éviter les effets antibactériens de transfert lors de la co-culture. Des suspensions bactériennes de P. gingivalis ou F. nucleatum ont été ajoutées à MOI = 50, et chaque puits a été ajusté à un volume final de 2,5 mL à l’aide d’un milieu de culture complet. Les plaques ont été incubées pendant 24 heures. Les surnadants ont été collectés à 24 heures et clarifiés par centrifugation brève pour éliminer les débris avant la mesure des cytokines. Les cellules adhérentes ont été lavées deux fois avec du PBS stérile pour éliminer les bactéries non adhérentes, puis traitées immédiatement pour l’extraction d’ARN ou de protéines selon les flux de travail décrits ci-dessous.

8. Analyse histologique du placenta de la souris

Les tissus placentaires ont été fixés dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant 24 heures, incorporés dans la paraffine, puis sectionnés à une épaisseur de 4,5 μm. Une coloration de routine par hématoxyline et éosine (H&E) a été réalisée pour examiner la morphologie placentaire. Pour la coloration immunohistochimique, la localisation de l’antigène a été visualisée à l’aide d’un substrat peroxydase chromogénique produisant des dépôts bruns aux sites positifs, suivie d’une contre-coloration à l’hématoxyline. Les contrôles négatifs ont été réalisés en remplaçant les anticorps primaires par un sérum non immunitaire.

Pour améliorer la reproductibilité et la transparence, l’évaluation immunohistochimique utilisait une approche de notation semi-quantitative prédéfinie. L’intensité de la coloration a été notée comme 0 (aucune), 1 (faible), 2 (modérée) ou 3 (forte), et le pourcentage de cellules positives a été noté 0 (<5 %), 1 (5–25 %), 2 (26–50 %), 3 (51–75 %) ou 4 (>75 %). Un score d’immunoréactivité a été calculé en multipliant les scores d’intensité et de pourcentage pour chaque champ. Pour chaque placenta, au moins cinq champs de haute puissance non chevauchants provenant de régions anatomiques comparables ont été notés. Le notation a été réalisée indépendamment par deux observateurs aveuglés par l’attribution des groupes, et les désaccords ont été résolus par un examen conjoint.

9. Détection quantitative en temps réel par PCR des signaux d’ADN bactérien dans la bifurcation carotide et le placenta de la souris

L’ADN tissulaire a été extrait à l’aide d’un flux de travail d’extraction d’ADN tissulaire à base de colonne de silice. Les lysats tissulaires ont été clarifiés par centrifugation à 12 000 × g pendant 5 minutes à 20–25 °C, et des surnadants ont été appliqués sur des colonnes de silice pour la liaison à l’ADN par centrifugation à 12 000 × g pendant 1 minute à 20–25 °C. Les étapes de lavage étaient effectuées selon le flux de travail, chaque lavage étant suivi d’une centrifugation à 12 000 × g pendant 1 minute à 20–25 °C. Un dernier essorage à sec a été effectué à 12 000 × g pendant 2 minutes à 20–25 °C pour éliminer l’éthanol résiduel. L’ADN a été élué dans un tampon d’élution de 50 μL après une incubation de 2 minutes à 20–25 °C et collecté par centrifugation à 12 000 × g pendant 1 minute à 20–25 °C. L’ADN génomique bactérien a été extrait en utilisant un flux de travail d’extraction d’ADN bactérien à base de colonne de silice, en utilisant les mêmes paramètres de centrifugation liation/lavage/centrifugation sèche/élution, sauf indication contraire du flux de travail.

La concentration et la pureté de l’ADN ont été mesurées à l’aide d’un quantificateur d’acides nucléiques à microvolume, et l’intégrité a été évaluée par électrophorèse sur gel d’agarose. Des échantillons d’ADN qualifiés étaient stockés à –20 °C pour une analyse ultérieure. Les gènes bactériens cibles ont été amplifiés et clonés à l’aide d’amorces listées dans le Tableau Supplémentaire 1, les conditions PCR étant détaillées dans les Panneaux Supplémentaires 2 et Panneaux Supplémentaires 3. Les bandes cibles amplifiées ont été purifiées, clonées selon les spécifications du Tableau Supplémentaire 4 , puis transformées en cellules Escherichia coli DH5α compétentes. Les souches contenant des plasmides recombinants ont été vérifiées pour garantir la correction des séquences d’insertion, et l’ADN plasmidique a été extrait pour une préparation standard. Des courbes standard ont été générées en réalisant la qPCR sur des étalons plasmidiques dilués en série contenant des fragments de gènes bactériens ciblés. Les signaux d’ADN bactérien P. gingivalis 16S et F. nucleatum 16S dans les échantillons de bifurcation carotide et placentaire ont été détectés quantitativement par PCR en temps réel, avec des nombres de copies d’ADN calculés à partir des valeurs de Ct à l’aide de la courbe standard. Les systèmes et programmes de réaction sont détaillés respectivement dans le Tableau Supplémentaire 5 et le Tableau Supplémentaire 6. Parce que la qPCR indique des signaux d’ADN bactérien plutôt que la viabilité ou la localisation cellulaire, les interprétations concernant la présence microbienne à l’interface materno-fœtale restent prudentes.

10. Détection ELISA des facteurs inflammatoires dans des échantillons de sérum de souris et des surnadants en culture cellulaire

Tous les réactifs et échantillons ont été équilibrés à température ambiante avant les essais. Les niveaux sériques de TNF-α et IL-1β ont été mesurés à l’aide de flux de travail ELISA chez la souris, et les niveaux de TNF-α et d’IL-1β dans les surnadants en culture cellulaire ont été déterminés à l’aide de flux de travail ELISA humain, en suivant les procédures du kit. Des étalons et des échantillons ont été mesurés dans des puits en double, et des courbes standard ont été générées pour chaque plaque. Les doublons techniques ont été moyennés pour obtenir une valeur par réplication biologique.

11. Autres analyses de biologie moléculaire

Pour la qRT-PCR, l’ARN total a été extrait de cellules cultivées en utilisant un flux d’extraction d’ARN à base de phénol-chloroforme. Après séparation de phase, la phase aqueuse a été clarifiée par centrifugation à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C, puis l’ARN a été précipité, lavé et resuspendu selon le flux de travail. La concentration d’ARN a été mesurée à l’aide d’un analyseur d’acides nucléiques, et l’intégrité de l’ARN a été évaluée par électrophorèse sur gel d’agarose. La transcription inverse a été réalisée pour générer l’ADNc, et la PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour quantifier les niveaux d’ARNm de TNF-α et d’IL-1β. Les séquences d’amorces sont listées dans le Tableau Supplémentaire 7, les mélanges de réactions dans le Tableau Supplémentaire 8, et les programmes de réactions dans le Tableau Supplémentaire 9.

Pour le Western blotting, des lysats protéiques provenant de tissus placentaires de souris ou de cellules trophoblastiques ont été clarifiés par centrifugation à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C, quantifiés, puis soumis à SDS-PAGE, suivis d’un transfert membranaire et d’une détection par anticorps via un flux de travail d’imagerie fluorescente. La charge égale en protéines a été fixée à 30 μg par voie. Les images membranaires originales non recadrées, y compris les marqueurs de poids moléculaire, ont été conservées pour toutes les taches présentées dans les figures et sont disponibles DOI : 10.57760/sciencedb.28254. Sauf indication contraire, « n » désigne des réplications biologiques (animaux individuels ou cultures cellulaires indépendantes), tandis que les répétitions techniques sont utilisées pour le contrôle qualité et ne remplacent pas la réplication biologique.

12. Analyse statistique

Les analyses statistiques étaient réalisées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique, et les chiffres générés à l’aide d’un logiciel de graphisme (listé dans le tableau des matériaux). Les données continues normalement distribuées ont été présentées comme moyenne ± écart-type et analysées par ANOVA unidirectionnelle avec des tests post-hoc appropriés, tandis que les données anormalement distribuées ont été exprimées en médiane (intervalle interquartile) et analysées à l’aide du test de Kruskal–Wallis avec des comparaisons par paires appropriées. Les seuils de signification statistique ont été fixés à P < 0,05, P < 0,01 et P < 0,001. Sauf indication contraire, « n » désigne des réplications biologiques, et les répliques techniques (par exemple, puits ELISA dupliqués) ont été moyennées pour obtenir une seule valeur par réplication biologique.

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Résultats

L’infection par P. gingivalis ou F. nucleatum est associée à un raccourcissement gestationnel et à une élévation des cytokines pro-inflammatoires sériques chez la souris
Les statistiques de base concernant les variations de poids maternel, les résultats néonatals et la durée gestationnelle sont résumées dans le tableau 1 et la figure 1. Les trajectoires de poids maternel et les conditions néonatales n’on...

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Discussion

Ces dernières années, l’accumulation de preuves a suggéré des liens étroits entre la santé bucco-dentaire et les résultats de la grossesse, suscitant une attention croissante sur les associations potentielles entre la parodontite apicale chronique (PAC) et les résultats indésirables de la grossesse, y compris les phénotypes liés à la naissanceprématurée 31 . Une revue systématique indique que la base de preuves cliniques actuelle reste limitée et hétérogène, mais ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun intérêt concurrent à déclarer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le Laboratoire clé de la Fondation pour le développement et les maladies associées des femmes et des enfants de la province du Sichuan (Grant No. FYYFEJB2025002).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Chromogenic Peroxidase SubstrateAgilent DakoK3468Substrat chromogène peroxydase pour IHC
Defibrinated sheep blood, sterileThermo Fisher (Remel)R54012Additif pour gélose au sang (5%)
Dental X-ray unit / radiography systemPlanmecaIntra (modèle)Radiographies périapicales pour la confirmation du CAP
DNeasy Blood & Tissue KitQIAGEN69504Extraction d'ADN sur colonne de silice à partir de tissus/bactéries
E. coli DH5α Competent CellsTaKaRa9057Transformation pour la construction de plasmides standard
Eosin Y solution, alcoholicSigma-Aldrich (Merck)HT110132Coloration H&E
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, AustraliaGibco (Thermo Fisher Scientific)10099-141Supplément au milieu complet 
Flowable resin composite3MFiltek Supreme Flowable 6010Restauration après scellage; photopolymérisation
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum reference strainATCC25586Culture anaérobie; exposition CAP et queue
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 9 (version)Analyse statistique et génération de figures
Hematoxylin solutionSigma-Aldrich (Merck)HHS32Contre-coloration H&E
HTR-8/SVneo human trophoblast cell lineATCCCRL-3271Essais d'infection in vitro 
Human IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DLB50Mesure d'IL-1β dans le surnageant cellulaire
Human TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DTA00DMesure de TNF-α dans le surnageant cellulaire
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µmMillipore (Merck)IPFL00010Transfert Western blot fluorescent
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR925-68071Anticorps secondaire fluorescent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR926-32211Anticorps secondaire fluorescent
IκBα (44D4) Rabbit mAbCell Signaling Technology4812Anticorps primaire (WB)
K-File (endodontic file)Dentsply Sirona (Maillefer)A012D015Instrumentation canalaire (exemple de taille 15)
LED dental curing light3MElipar DeepCure-S (modèle)Polymérisation de 20 s (selon le protocole)
Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MLB00CMesure d'IL-1β dans le sérum
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MTA00BMesure de TNF-α dans le sérum
MyD88 (D80F5) Rabbit mAbCell Signaling Technology4283Anticorps primaire (WB)
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WQuantification d'ADN/ARN
Near-infrared imaging systemLI-COROdyssey CLx (modèle)Imagerie Western blot fluorescente
NF-κB p65 (D14E12) Rabbit mAbCell Signaling Technology8242Anticorps primaire (WB)
PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+Gibco (Thermo Fisher Scientific)10010-023Lavage cellulaire et préparation des réactifs
Penicillin-Streptomycin Gibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Antibiotiques 
Pentobarbital sodium saltSigma-Aldrich (Merck)P3761Induction de l'anesthésie (dosage selon le protocole)
Peroxidase blocking solutionAgilent DakoS2023Bloquer la peroxydase endogène pour IHC
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAbCell Signaling Technology3033Anticorps primaire (WB)
Porphyromonas gingivalis reference strainATCC33277Culture anaérobie; exposition CAP et queue
PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real Time)TaKaRaRR037ASynthèse de cDNA
Real-time PCR systemApplied BiosystemsQuantStudio 5 (modèle)Quantification qPCR des cibles 16S
Round bur (sterile)Dentsply SironaH1-010Ouverture d'accès pour la chambre pulpaire de la première molaire maxillaire
RPMI 1640 MediumGibco (Thermo Fisher Scientific)11875-093Base du milieu de culture HTR-8/SVneo
SYBR-safe DNA gel stainInvitrogenS33102Visualisation d'ADN
TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0TaKaRa9760Mini-préparation de plasmides pour les standards
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820AMélange maître qPCR (à base de colorant)
TLR4 (D8L5W) Rabbit mAbCell Signaling Technology14358Anticorps primaire (WB)
TRIzol ReagentInvitrogen15596-026Extraction d'ARN phénol-chloroforme
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco (Thermo Fisher Scientific)25200-056Décollement cellulaire
T-Vector pMD19 (Simple)TaKaRa3271Clonage du produit PCR pour les courbes standard
Universal dental adhesive3MScotchbond Universal Adhesive 26200Sceller la chambre pulpaire après inoculation

Références

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