Construire des modèles efficaces de blastocystes de souris dérivés des cellules souches pour les études environnementales

Summary

Ce protocole décrit la génération et l’analyse des blastoïdes iGATA4, un modèle évolutif basé sur des cellules souches qui reproduit des caractéristiques clés du blastocyste de souris, notamment l’organisation de la lignée et la cavitation, et permet une évaluation reproductible et à haut débit des perturbations environnementales et moléculaires affectant le développement embryonnaire précoce.

Abstract

Les modèles embryonnaires à base de cellules souches offrent une plateforme puissante pour étudier le développement précoce des mammifères et sa sensibilité aux perturbations environnementales. Ici, un protocole robuste et accessible est présenté pour générer des blastoïdes de souris à haute fidélité utilisant des cellules souches embryonnaires (ESC), des cellules souches trophoblastiques (TSC) et des cellules souches embryonnaires conçues pour l’expression inductible de GATA4 (iGATA4-ESC). Ce système produit des blastoïdes iGATA4 qui récapitulent avec précision la morphologie naturelle du blastocyste E4.5, les proportions de lignées et les signatures transcriptionnelles, fournissant un modèle in vitro fiable des compartiments primitifs de l’endoderme (PE), de l’épiblaste (EPI) et du trophectoderme (TE). Ce protocole montre d’abord comment maintenir et préparer les trois populations de cellules souches nécessaires à la formation des blastoïdes. L’assemblage étape par étape des blastoïdes iGATA4 sous conditions de culture préimplantation est ensuite esquissé, mettant en lumière des paramètres expérimentaux critiques. Pour permettre une caractérisation rigoureuse, un flux de travail testé pour la fixation, la coloration et l’imagerie des blastoïdes est fourni. Enfin, un exemple est présenté montrant comment les blastoïdes iGATA4 peuvent être utilisés pour des tests à haut débit. En exposant de larges cohortes de blastoïdes à des facteurs environnementaux définis, les changements de morphologie, d’allocation de lignées et de progression du développement peuvent être quantifiés rapidement et de manière reproductible. Ensemble, ce protocole établit une plateforme évolutive pour modéliser le développement pré-implantation, analyser les décisions précoces de lignée et réaliser des criblages multiparamétriques afin d’évaluer les influences environnementales ou moléculaires sur la formation des blastocystes.

Introduction

Comprendre comment les embryons de mammifères précoces s’auto-assemblent et comment des facteurs environnementaux courants peuvent affecter négativement leur formation nécessite des systèmes modèles reproductibles, expérimentalement accessibles et évolutifs. Des modèles intégrés de type embryonnaire générés par la combinaison de cellules souches embryonnaires et extraembryonnaires fournissent une telle^{plateforme 1,2}. Ce protocole décrit comment les cellules souches embryonnaires (CE), les cellules souches du trophoblaste (TSC) et les ESC conçues pour l’expression inductible de GATA4 (iGATA4-ESC) peuvent être assemblées dans des conditions pré-implantation pour produire des blastoïdes avec des lignées robustes et bien proportionnées d’endoderme primitif (PE), d’épiblastes (EPI) et de trophectoderme (TE). Des travaux récents ont démontré que ces structures, appelées iGATA4-blastoïdes³, ressemblent au blastocyste E4.5 en termes de proportions de lignée, de signatures transcriptionnelles et d’expression des marqueurs fonctionnels. Lorsqu’elles sont cultivées in vitro, 12,5 % de ces structures passent à la morphologie post-implantation. Il est important de noter qu’ils sont adaptés aux tests toxicologiques et environnementaux.

Le développement de cette technique a été motivé par des limitations dans les systèmes blastoïdes^{préexistants 2,4,5}. Bien que de nombreux protocoles^soient 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 génèrent des structures cavitées ressemblant à des blastocystes précoces, la plupart le font avec une efficacité relativement faible ou produisent des structures avec une formation incomplète de PE, des identités cellulaires indéfinies ou des proportions de lignées incorrectes. Ces incohérences réduisent leur adéquation aux études mécanistes et aux écrans de perturbation à haut débit. Parce que la spécification PE in vivo suit l’activation de GATA6, SOX17, GATA4 et^SOX72, et que des défauts soit dans le PE soit dans son dérivé, l’endoderme viscéral (VE), entravent le développement péri-implantatoire 23,24,25,26,27, renforçant ce programme transcriptionnel in vitro Améliore la fidélité des blastoïdes. Les CES portant un transgène conditionnel GATA4 se transdifférencient robustement en EV et, lorsqu’ils sont combinés avec des CES et TSC dans des conditions post-implantation, génèrent des modèles embryonnaires intégrés qui gastrulent et initient l’organogenèse 28,29,30,31. Ici, ce principe est adapté aux conditions préimplantatoires, démontrant que les iGATA4-ESC génèrent de manière fiable des PE et produisent des blastoïdes ressemblant étroitement aux blastocystes^{naturels 3}.

Cette méthode surmonte les limites précédentes de la modélisation des blastocystes utilisant des cellules souches et offre une grande efficacité de formation des blastoïdes (80 % des structures formées sont des blastoïdes, dont 75 % démontrent une organisation et des proportions appropriées de la lignée) ainsi qu’une forte ressemblance embryonnaire. De plus, l’assemblage modulaire des blastoïdes iGATA4, dans lequel chaque lignée de blastocystes est dérivée d’une population de cellules souches cultivées indépendamment, offre un accès expérimental direct à chaque compartiment embryonnaire. Ces propriétés rendent le système particulièrement adapté aux applications de dépistage multiparamétrique. Parce qu’elle produit de larges cohortes de structures morphologiquement cohérentes avec des lignées TE, EPI et PE précisément proportionnées, elle permet des perturbations parallèles et une quantification des réponses spécifiques à la lignée avec une puissance statistique inatteignable avec des embryons naturels.

À titre de preuve de principe, les effets de facteurs environnementaux communs présentés aux niveaux^{physiologiques} 32,33,34,35,36,37,38 sur le développement des blastoïdes ont été mesurés. L’impact des modifications de la caféine, de la nicotine, de l’éthanol et des acides aminés sur le taux de carité, la morphologie, la condition physique et les proportions de lignée a été évalué sur une gamme de concentrations et de fenêtres de traitement temporelles. La plupart des conditions (caféine, éthanol, nicotine et celles imitant des régimes pauvres en protéines) entraînaient une formation aberrante de blastoïdes et une altération de la qualité structurelle. En revanche, augmenter la concentration d’acides aminés à chaîne ramifiée (similaire aux régimes riches en protéines) améliorait l’efficacité et la qualité de formation des blastoïdes. Ces résultats reflètent les effets observés sur des blastocystes naturels de souris^{cultivés in vitro 3}, démontrant que ce système capture des phénotypes subtils et dépendant de la dose et soutient des pipelines de dépistage multidimensionnels et évolutifs impossibles à réaliser avec des embryons naturels.

Dans le contexte plus large de la modélisation embryonnaire, cette technique démontre que les mêmes cellules utilisées pour modéliser le développement intégré post-implantation peuvent également être déployées comme modèles pré-implantation. Cette méthode est particulièrement adaptée aux applications nécessitant une modélisation évolutive de structures de type blastocyste avec une formation précise de PE et une intégration robuste des lignées. Cependant, comme pour d’autres modèles de blastocyste à base de cellules souches chez la souris, les blastoïdes iGATA4 ne s’implantent pas et se développent davantage après le transfert à la souris hôte, ce qui ne convient donc pas aux études sur les interactions embryon-mère. Dans l’ensemble, ce protocole offre une approche fiable et accessible pour générer des blastoïdes haute fidélité modélisant les décisions précoces de type cellulaire dans l’embryon de mammiffère.

Protocol

Toutes les procédures décrites dans ce protocole impliquent des lignées cellulaires établies et ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles de biosécurité du California Institute of Technology. Aucun travail vivant sur des sujets animaux ou humains n’a été réalisé.

Plusieurs lignes ESC et TSC ont été testées et ont constaté qu’elles supportent la formation d’iGATA4-blastoïde. Les ESC, iGATA4-ESC et TSC des études^{précédentes 28} ont été utilisés avec succès pour compléter toutes les étapes décrites dans ce protocole. Les mêmes auteurs décrivent la génération d’iGATA4-ESC à partir d’une gamme d’ESC de souris CD1 (ICR) déjà établie.

Les TSC sont cultivés sur des fibroblastes embryonnaires (MEF) de souris disponibles dans le commerce. Tous les produits chimiques, réactifs, kits, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Culture de cellules souches de souris pour la formation de blastoïdes

1. Préparation des plaques d’alimentation MEF
   1. Recouvrir une plaque de culture cellulaire à 6 puits avec 1,5 mL de gélatine à 0,2 % (p/v) dans de l’eau déionisée (DI) par puits. Incubez à 37 °C dans la normoxie pendant au moins 45 minutes.
   2. Pendant l’incubation, préparez un tube centrifuge de 15 mL avec 4 mL de milieu FC (Tableau 1) préchauffé à 37 °C.
   3. Décongelez le flacon MEF dans un bain d’eau en utilisant un mouvement en huit jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’une petite boule de glace. Transférez le contenu dans le tube préparé, puis pipetez de haut en bas pour bien mélanger. Centrifugez à 500 × g pendant 4 minutes.
   4. Aspirez le surnageant et resuspendez le pellet dans 1 mL de medium FC. Ajustez à un volume suffisant pour plaquer ~160 000 cellules par puits dans 1,5 mL par puits.
   5. Aspirez la gélatine et placez 1,5 mL de MEF par puits. Incuber dans des normoxies toute la nuit sans perturbation.
   6. Remplacez le milieu par un nouveau milieu de 1,5 mL par puits le lendemain. Change de substrat toutes les 48 heures. Utilisez les MEF 2 à 7 jours après le dressage. Les MEF peuvent rester en bonne santé plus longtemps, mais leur capacité à soutenir la croissance des TSC peut être compromise.

ATTENTION : Effectuer toutes les cultures cellulaires de souris dans des cabinets de flux laminaire de niveau de biosécurité (BSL) 1 en utilisant la technique BSL-2.

2. Dégel et passage des cellules souches embryonnaires de souris (WT ESC et iGATA4-ESC)
   1. Dégelez les ESC WT ou les iGATA4-ESC en suivant les étapes 1.1.1–1.1.3. Après centrifugation, resuspendez les cellules dans 1 mL de milieu N2B27/2i/LIF (Tableau 1) et semez ~50 000 cellules par puits dans une plaque de 6 puits recouverte de gélatine avec ~1,5 mL par puits. Incubez à 37 °C dans les normoxies et changez de milieu toutes les 48 heures.
   2. Assurez-vous que les colonies sont serrées et rondes avec un minimum de protubérances avant leur passage. Passage tous les 2 à 3 jours.
      REMARQUE : Les ESC WT et les iGATA4-ESC sont morphologiquement indiscernables jusqu’à l’induction avec la doxycycline (DOX).
   3. Enduire une plaque à 6 puits avec 1,5 mL de gélatine à 0,2 % dans de l’eau DI par puits. Incubez à 37 °C pendant au moins 45 minutes.
   4. Ajoutez 500 μL de réactif de dissociation cellulaire par puits et incubez pendant 3 minutes. Ajoutez 2 mL de médium FC tout en pipettant doucement autour des bords. Confirmez > décollement à 90 % sous un microscope. Si les cellules restent attachées, pipetez doucement pour faciliter la resuspension.
   5. Transférez la suspension à cellules dans un tube centrifugeuse de 15 mL et centrifugez à 500 × g pendant 4 minutes.
   6. Aspirez le surnageant et resuspendez le pellet dans 1 mL de milieu N2B27/2i/LIF. Déterminez la concentration cellulaire à l’aide de 10 μL sur un hémocytomètre. Ajustez le volume pour semer ~50 000 cellules par puits.
   7. Aspirez la gélatine et semez les cellules. Incubez dans des normoxies. Changez de milieu le lendemain et toutes les 48 heures par la suite.
3. Dégel et passage des cellules souches trophoblastiques (TSC) de souris
   1. Dégel des CST suivant les étapes 1.1.1–1.1.3. Après centrifugation, resuspendez les cellules dans 1 mL de milieu TSF4H (Tableau 1) et semez ~20 000 cellules par puits dans une plaque de 6 puits recouverte de MEF. Incubez à 37 °C, 5 % de CO₂, 5 % d’O₂ (hypoxie) et changez de milieu toutes les 24 heures.
   2. Assurez-vous que les colonies soient grandes (diamètre >75 μm) et aplaties avant leur passage. Ajoutez 500 μL de réactif de dissociation cellulaire par puits et incubez pendant 5 minutes. Ajoutez 2 mL de medium FC tout en pipettant doucement. Confirmez > détachement à 90 %.
   3. Transférez les cellules dans un tube centrifugeuse et faites tourner à 500 × g pendant 4 minutes.
   4. Resuspendre dans un TSF4H moyen de 1 mL. Déterminez la concentration et ajustez à ~20 000 cellules par puits.
   5. Placez sur des MEF et éclovez en hypoxie. Changez de milieu toutes les 24 heures et passez tous les 2 à 3 jours avant la fusion de la colonie.

2. Formation des blastoïdes iGATA4

1. Préparation de la plaque d’agrégation de micropuits pour l’agrégation cellulaire
   1. Ajoutez 500 μL de solution de rinçage anti-adhérence à chaque puits d’une plaque d’agrégation Microwell. Centrifugez à 2 000 × g pendant 5 minutes avec un équilibrage approprié pour éliminer l’air piégé des micropuits. Incubez à 37 °C dans la normoxie pendant au moins 1 heure ou toute la nuit.
2. Préparation des blastoïdes, jour 0 — Préparation et plaquage des WT et iGATA4-ESC
   1. Pré-réchauffer les milieux N2B27/2i/LIF, FC et FCYL (FC + 10 ng/mL LIF recombinant de souris (mLIF) + inhibiteur de ROCK Y27632 à 2 μM) à 37 °C. Préparez de la gélatine à 0,2 % dans de l’eau DI et ayez le réactif de dissociation cellulaire prêt.
   2. Aspirez la solution anti-adhérence sans toucher le fond du puits. Laver deux fois avec 1 mL de PBS et une fois avec 1 mL de médium FCYL. Faites une pipette le long du mur pour éviter d’endommager les micropuits.
   3. Préparez une plaque de 6 puits recouverte de gélatine (incubation ≥45 min) pour les cellules de passage.
   4. Récolter les WT et les iGATA4-ESC en aspirant le milieu et en ajoutant un réactif de dissociation cellulaire de 500 μL par puits. Incubez pendant 3 minutes à 37 °C. Ajoutez 2 mL de FC medium et pipettez doucement. Confirmez un détachement complet au microscope. Transférez dans un tube de 15 mL et centrifugez à 500 × g pendant 4 minutes.
   5. Resuspendez dans un médium FCYL de 1 mL. Déterminez la concentration cellulaire à l’aide de 10 μL sur un hémocytomètre. Ajustez à 500 000 à 700 000 cellules/mL. Calculer le volume requis pour 5 ESC WT et 5 iGATA4-ESC par micropuits (6 000 cellules par puits).
      REMARQUE : Optimisez pour d’autres lignes ESC si besoin. Une plage de départ est de 4 à 7 ESC par micropuits avec un ratio de 1:1 entre les ESC et les iGATA4-ESC.
   6. Préparez 500 μL de suspension à cellules par puits. Ajouter goutte par goutte à la plaque d’agrégation Microwell à l’aide d’une pipette de 1000 μL. Centrifugez à 100 × g pendant 3 minutes et vérifiez la répartition uniforme. Incubez pendant 6 heures jusqu’à ce que les agrégats se forment.
   7. Passage des ESC restants comme décrit dans la Section 1.2.
3. Préparation du blastoïde, jour 0 — Préparation du médium TX
   1. Préparez un milieu basal TX de ~20 mL à l’aide de DMEM/F12 (Tableau 2). Préparez-vous à neuf pour chaque expérience.
      1. Ajoutez 200 μL 200 mM de supplément L-alanyl-L-glutamine (2 mM finaux). Conservez le stock à 4 °C.
      2. Ajoutez 200 μL 10 000 U/mL de pénicilline/streptomycine (100 U/mL finaux chacun). Conserver à −20 °C.
      3. Ajoutez 40 μL 32 mg/mL d’acide L-ascorbique (64 μg/mL finaux). Préparez dans de l’eau DI, filtrez la stérilisation et conservez à −20 °C.
      4. Ajoutez 20 μL de sélénite sodique (14 ng/mL finaux). Préparez et conservez à −20 °C.
      5. Ajoutez 240 μL de NaHCO₃ (543 μg/mL finaux). Mélangez soigneusement après décongélation.
      6. Ajouter 20 μL d’holo-transférrine (10,7 μg/mL finaux). Mélangez après décongélation.
      7. Ajoutez ~37,5 μL d’insuline (19,4 μg/mL final ; dépendant du lot). Conserver à 4 °C.
   2. Juste avant utilisation, ajoutez Y27632 à une concentration finale de 20 μM, CHIR99021 à 3 μM, IL-11 à 30 ng/mL, FGF4 à 25 ng/mL, l’héparine à 1 μg/mL, mLIF à 10 ng/mL, TGFβ à 15 ng/mL, et 8Br-cAMP à 25 μM.
4. Préparation du blastoïde, jour 0 — Préparation et plaquage des TSC
   1. TSF4H, FC (Tableau 1) et médias TX pré-chauffés (Section 2.3). Préparez les plaques recouvertes de gélatine (≥45 min) pour l’épuisement du MEF.
   2. Prélever les TSC en ajoutant 500 μL de réactif de dissociation cellulaire par puits et en incubant pendant 5 minutes en hypoxie. Ajoutez 2 mL de FC medium et pipettez doucement. Confirmez le détachement. Transférez dans un tube et centrifugez à 500 × g pendant 4 minutes.
      REMARQUE : Les CST cultivés >4 jours peuvent nécessiter jusqu’à 10 minutes de traitement par réactif de dissociation cellulaire.
   3. Résuspendez dans un milieu TSF4H de 1 mL et ajustez au volume approprié pour le placage en un fractionnement 1:2.
   4. Placez sur des puits recouverts de gélatine pour l’épuisement du MEF. Incuber ~45 minutes en hypoxie. Assurez-vous que les MEF s’attachent tandis que les TSC restent en grande partie non attachés.
   5. Remplacer un milieu de 900 μL provenant des puits de plaques d’agrégation de micropuits par un milieu TX de 500 μL. Retour à l’hypoxie.
   6. Transférer le surnageant contenant du TSC dans un tube sans perturber les MEF attachés. Déterminer la concentration (cible 500 000–700 000 cellules/mL).
   7. Calculer le volume pour 12 TSC par micropuits (14 400 cellules par puits). Centrifugez si une concentration supplémentaire est nécessaire.
      REMARQUE : Optimiser pour d’autres lignes TSC (10 à 15 cellules par micropuits recommandé).
   8. Ajoutez une suspension de 500 μL par puits en chute. Centrifugez à 100 × g pendant 3 minutes. Confirmez la distribution et éclovez en hypoxie pendant 24 heures.
   9. Adopter les TSC restants au besoin (Section 1.3).
5. Préparation du blastoïde, jour 1 — Induction
   1. Environ 24 h après l’ajout du TSC, ajoutez 20 μL de 5 mM 8Br-cAMP et 1 μL de 1 μg/mL DOX par puits. Incubez pendant 48 à 72 heures en hypoxie.
6. Préparation du blastoïde, jour 3 — Fixation
   1. Resuspendez les granulats à l’aide d’une pointe de pipette coupée de 1000 μL. Transférez dans des tubes de 2 mL et laissez sédimenter pendant 5 minutes.
   2. Retirez le surnageant et ajoutez 250 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %. Resuspendez-le doucement.
      ATTENTION : Manipulez le PFA dans une hotte à fumée avec un équipement de protection approprié.
   3. Incubez 15 minutes, en faisant un coup toutes les 5 minutes.
   4. Retirez le PFA et ajoutez 300 μL DE PBST (PBS + 0,1 % Tween-20). Mélangez doucement. Conserver à 4 °C pendant <1 semaine avant de teindre.
7. Immunofluorescence des blastoïdes
   1. Transférez 150 μL par échantillon sur une plaque à fond en U à 96 puits.
   2. Ajoutez un tampon de perméabilisation de 100 μL et incubez 20 minutes. Remplacez par une solution primaire d’anticorps et incubez toute la nuit à 4 °C.
   3. Laver 3× avec du PBST (5 min chacun). Ajoutez des anticorps secondaires.
   4. Incuber 2 h à température ambiante dans le noir.
   5. Laver 3× puis transférer dans une antenne d’imagerie.
   6. Image utilisant microscopie confocale (≥25× objectif, NA ≥0,8).

3. Écrans à haut débit utilisant le modèle iGATA4-blastoïde

1. Préparation et test des facteurs environnementaux iGATA4-blastoïdes
   1. Préparez la plaque d’agrégation des micropuits comme décrit dans la Section 2.1 et générez les blastoïdes iGATA4 en suivant les sections 2.2 à 2.4. Préparez suffisamment de puits, y compris des contrôles appropriés. Inclure un contrôle à blanc (blastoïdes préparés selon le protocole standard), un contrôle porte-porteurs, et une ou plusieurs conditions expérimentales.
   2. Incubez les blastoïdes toute la nuit en cas d’hypoxie. Environ 24 h après le semis du TSC, préparez un milieu TX complété en 8Br-cAMP, doxycycline (DOX) et le composé d’intérêt (ou de contrôle du porteur). Les conditions suivantes ont été testées :
      1. Caféine : 3,5 mg/L, diluée à partir de réserves d’eau ultrapure.
      2. Nicotine : 330 ng/L, diluée à partir de stocks à 100 % d’éthanol (EtOH).
      3. Éthanol : 17 mM, dilué à partir d’EtOH absolu.
      4. Acides aminés à chaîne ramifiée élevée (BCAA) : +5 %, +25 %, +50 % par rapport aux concentrations de base (0,45 mM de L-leucine, 0,45 mM de L-valine, 0,42 mM de L-isoleucine), préparés à partir de stocks concentrés dans de l’eau ultrapure.
      5. Faibles en méthionine et leucine : −5 %, −25 %, −50 %, −100 % par rapport aux concentrations de base (0,12 mM de L-méthionine, 0,45 mM de L-leucine), préparés avec DMEM/F12 sans Met/Leu. Le DMEM sans Met/Leu (LM-DMEM) est complété avec un mélange nutritif F-12 de 1x Ham’s avant utilisation.
         ATTENTION : Préparez et manipulez des stocks concentrés de caféine et de nicotine dans une hotte à fumée en utilisant un équipement de protection individuelle approprié (EPI ; gants, blouse de laboratoire, protection oculaire). L’éthanol est inflammable et doit être tenu à l’écart des sources de chaleur.
   3. Aspirez le milieu de chaque puits et ajoutez 1 mL de milieu TX contenant un composé. Traitez un puits à la fois pour éviter le séchage. Retournez l’assiette à l’incubateur d’hypoxie et la culture jusqu’au troisième jour.
   4. Capturez des images représentatives en champ clair le troisième jour à l’aide d’un microscope à lumière transmise. Fixer les structures et effectuer l’immunofluorescence comme décrit aux sections 2.6 et 2.7.
      REMARQUE : Ajustez les fenêtres de traitement en fonction de l’objectif expérimental. Les traitements peuvent être appliqués lors de l’agrégation précoce (jour 1) ou aux stades avancés (par exemple, expansion de la cavité). Des fenêtres exemples incluent les jours 1 à 3, 1 à 2 (suivis de remplacement de supports), et jours 2 à 3.
2. Analyse multiparamétrique iGATA4-blastoïde
   1. Utilisez des images en champ clair pour quantifier le pourcentage de puits contenant des structures cavitées (c’est-à-dire des structures avec une cavité centrale clairement définie) et mesurer le diamètre blastoïde.
      1. Images en ouvert dans le logiciel d’analyse d’images.
      2. Utilisez l’outil ligne droite pour tracer une ligne à travers chaque structure.
      3. Mesurez le diamètre en utilisant Analyze > Measure.
   2. Sélectionnez des échantillons immunocolorés représentatifs (20 à 40 structures par réplication biologique, avec au moins trois réplications biologiques par condition) et l’image décrite à la Section 2.7.
   3. Quantifier le nombre total de cellules et la composition de la lignée à l’aide de marqueurs d’immunofluorescence : TE (CDX2-positif), EPI (SOX2-positif et SOX17-négatif) et PE (SOX17-positif).
   4. Évaluer l’organisation structurelle et la morphologie en déterminant si les cellules PE sont spatialement séparées des cellules EPI au sein de la masse cellulaire interne (ICM) (classification binaire : oui/non).
   5. Classez la morphologie comme bonne (structure claire semblable à un blastocyste avec cavité définie et compartiments TE, EPI et PE bien organisés), médiocre (anomalies mineures telles qu’une forme irrégulière ou une cavité partiellement formée), ou mauvaise (anomalies majeures telles que l’absence de cavité ou des lignées désorganisées/non triées).
   6. Quantifier des paramètres supplémentaires, notamment la taille ou le volume de la cavité, le cas échéant. Utilisez des outils bioinformatiques ou d’autres outils pour le tracé et l’analyse statistique, ainsi que des logiciels d’analyse d’images 3D pour le comptage cellulaire et/ou la préparation d’images pour l’affichage.

Results

Maintenir les ESC et les iGATA4-ESC (normoxia) et TSC (hypoxie) dans des conditions de culture appropriées est essentiel pour une génération blastoïde réussie. Lorsqu’ils sont cultivés comme décrit, les ESC et les iGATA4-ESC devraient être en grande partie indiscernables, formant des colonies de taille moyenne, rondes et bien définies après 3 jours. L’apparition de colonies aplaties ou de bords saillants indique une différenciation naissante, et de telles cultures ne doivent pas être utilisées pour la formation de blastoïdes. Les CST doivent former des colonies épithéliales plates avec des bords légèrement surélevés et des centres plus plats. Des colonies de TSC trop développées ou fusionnées (généralement après >3 jours de culture) entraînent souvent de mauvais résultats blastoïdes (Figure 1).

Lors de l’assemblage des blastoïdes iGATA4, plusieurs premiers signes indiquent le succès du protocole (Figure 2A, B). Environ 6 heures après l’agrégation des ESC et de l’iGATA4-ESC, les granulats de cellules serrées devraient être visibles au fond des micropuits. Les agrégats lâches suggèrent une exposition excessive aux réactifs de dissociation cellulaire, ce qui réduit l’adhésion cellule-cellule. Progression vers l’étape suivante (ajout de TSC ; Section 2.4) ne devrait se produire qu’une fois que des agrégats serrés sont observés (Figure 2B, point temporel D0.5). L’immunocoloration à ce stade devrait montrer des agrégats homogènes SOX2⁺ et GATA4⁻ (Figure 2B, point temporel D0.5).

Après l’ajout de TSC et l’incubation nocturne, un seul agrégat cohésif entouré de cellules CDX2⁺ devrait être visible (Figure 2B). La présence de grandes cellules non agrégées à la surface des agrégats indique souvent des MEF résiduels. La contamination par MEF peut réduire l’efficacité de formation des blastoïdes ; par conséquent, un épuisement adéquat de la MEF est crucial pour obtenir une population majoritairement TSC avant l’agrégation. Un filtre de 40 μm peut être utilisé pour éliminer les MEF résiduels, bien que cela puisse réduire le rendement du TSC. Une couverture CDX2⁺ incomplète ou excessive peut être corrigée en ajustant le nombre de TSC ajoutés par micropuits (plage recommandée : 10–15).

Après l’ajout de DOX et de 8Br-cAMP, les caries sont généralement observées au jour 2 et peuvent persister jusqu’au jour 3. Sous microscopie à champ clair, les cavités apparaissent comme des espaces vides clairs à l’intérieur des blastoïdes (Figure 2B, C ; ligne blanche pointillée). Les cellules GATA4⁺ apparaissent peu après l’induction de DOX et se trient progressivement vers la surface du compartiment de type ICM (Figure 2B). La formation réussie des blastoïdes se caractérise par une grande efficacité de cavitation (typiquement ~80 % des structures par plaque d’agrégation de micropuits ; Figure 2D), un épithélium externe monocouche de type TE CDX2⁺, une cavité de type blastocèl, et un compartiment arrondi de type ICM contenant des cellules SOX2⁺ de type EPI superposées par des cellules GATA4⁺ de type EPI (Figure 2C–E).

Les résultats sous-optimaux courants incluent des structures non cavitées, des blastoïdes de forme irrégulière avec plusieurs cavités ou compartiments de type ICM, et des puits contenant peu de structures ou de débris cellulaires. Bien qu’environ 20 % de structures anormales soient attendues (Figure 2C), des taux plus élevés peuvent indiquer des problèmes tels qu’une mauvaise préparation du milieu TX, une mauvaise qualité des cellules de départ, un manque d’ajout de DOX ou 8Br-cAMP le premier jour, ou un déplacement des structures lors des changements de milieu.

Pour les applications de criblage à haut débit, les puits non traités et les puits de contrôle des véhicules devraient produire des blastoïdes comparables aux conditions de contrôle positif (Figure 3A,B). Les traitements expérimentaux peuvent affecter plusieurs indicateurs de qualité, notamment la taille des blastoïdes (Figure 3C), l’efficacité de cavitation, le nombre total et spécifique de cellules (Figure 3D), le tri PE et la morphologie globale (Figure 3E). Par exemple, un traitement par caféine, nicotine ou éthanol lors de la formation blastoïde a entraîné des structures plus petites avec une efficacité de cavitation réduite, un nombre de cellules totaux ou ICM plus faible, un tri PE altéré et une morphologie moins bonne. En revanche, l’augmentation des concentrations d’acides aminés à chaîne ramifiée a produit des blastoïdes plus grands et plus fortement cavités, avec un nombre cellulaire accru et une morphologie améliorée (Figure 3C–E). Une variabilité biologique entre les expériences est attendue, soulignant l’importance d’inclure à la fois les témoins vierges et porteurs dans chaque expérience.

Figure 1 : Exemples de WT ESC, iGATA4-ESC et TSC de bonne ou mauvaise qualité. Micrographies en champ clair des ESC WT, iGATA4-ESC et TSC montrant les morphologies de colonie attendues après 2 à 3 jours de culture dans N2B27/2i/LIF (ESCs) ou milieu TSF4H (TSC). Le panel intitulé « WT ESCs – mauvaise qualité » montre des cellules à morphologie sous-optimale, y compris des colonies aplaties avec des bords saillants (pointes de flèches rouges). Le panneau « TSC envahi par la végétation » montre des colonies TSC fusionnées et agrandies après 4 jours de culture. Barre d’échelle : 100 μm pour tous les panneaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Morphologie schématique et attendue des blastoïdes iGATA4. Reproduit à partir de Developmental Cell, Vol. 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S et al., Modèles embryonnaires de souris dérivés de cellules souches efficaces pour les études environnementales, pp. 193–207.e6, Copyright (2025)³, avec l’autorisation d’Elsevier. (A) Représentation schématique du développement naturel des blastocystes chez souris (en haut) et modélisation des blastocystes à base de cellules souches à l’aide des ESC WT, iGATA4-ESC et TSC.
(B) Des micrographies montrant la morphologie attendue et l’expression des marqueurs à différents stades du protocole. Projection d’intensité maximale (MIP) ; des lignes pointillées délimitent la cavité. Barre d’échelle : 20 μm. (C) Image en champ clair des blastoïdes iGATA4 au jour 3. Barre d’échelle : 100 μm.
(D) Taux de cavitation des iGATA4-blastoïdes générés à partir de TSC pré-cultivés dans des normoxies ou hypoxies ; Les agrégats ont été cultivés dans des conditions hypoxiques. n ≥ 4 ; Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne. (E) Immunocoloration des blastocystes E4.5 et des blastoïdes iGATA4 du jour 3 pour les marqueurs de lignée (CDX2, cyan ; 4 OCTOBRE, rouge ; GATA4, vert). Projection d’intensité maximale (MIP) ; un seul plan Z montré là où indiqué. Barre-échelle : 25 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3. Effets des facteurs environnementaux sur la formation et la qualité des blastoïdes. (A) Images 3D d’immunofluorescence représentatives (en haut) et reconstructions de surface IMARIS (en bas) de blastoïdes iGATA4 traitées avec des facteurs environnementaux (caféine, nicotine, éthanol et affections imitant des régimes riches et pauvres en protéines). Barres d’échelle : 25 μm pour toutes les images. (B) Schéma du flux de travail expérimental. (C) Diamètre blastoïde sous différentes conditions de traitement. Cette plage représente les 10e à 90e percentiles ; les cases indiquent la plage interquartile ; la ligne indique le terre-plein central. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples. (D) Quantification du nombre total de cellules (gris), trophectodermes (cyans), épiblastes (rouge) et endodermes primitifs (vert) dans les blastoïdes contrôlés et traités. Les barres représentent la moyenne ; Les barres d’erreur représentent l’écart-type. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle avec comparaisons multiples. (E) Quantification de la proportion de blastoïdes classés comme « bons » (tri correct de la lignée avec peu d’anomalies morphologiques), « médiocres » (morphologie largement correcte avec des anomalies mineures, y compris un tri incomplet de l’EPI–PE), ou « mauvais » (morphologie sévèrement anormale avec une organisation de lignée perturbée) sous des conditions de contrôle et de traitement. L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’ANOVA bidirectionnelle par rapport aux conditions témoins. Pour tous les panneaux, n ≥ 3. La signification statistique est indiquée comme *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Médias	Réactif	Concentration finale
FC
	DMEM	N.A.
	FBS inactivé par la chaleur (iFBS)	15%
	GlutaMax	2 mM
	2-Mercaptoéthanol (2-ME)	0,1 mM
	Acides aminés non essentiels (NEAA)	1x
	Na Pyruvate	1x
	Pénicilline–Streptomycine	1x
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	NeurobasalA	50%
	Supplément B27	1x
	Supplément N2	0,5x
	2-ME	100 μM
	Pénicilline–Streptomycine	1%
	GlutaMax	2 mM
	PD0325901	1 μM
	CHIR99021	3 μM
	LIF recombinant de souris	10 ng/mL
TSF4H
	Megacell RPMI-1640 Medium	N.A.
	iFBS	20%
	GlutaMax	2 mM
	Na Pyruvate	1x
	Pénicilline–Streptomycine	1x
	FGF4	25 ng/mL
	Héparine	1 μg/mL

Tableau 1 : Recettes multimédias pour FC, N2B27/2i/LIF et TSF4H. Recettes pour préparer des médias FC, des médias N2B27/2i/LIF et des médias TSF4H, avec les concentrations finales.

Composant	Concentration finale	Concentration des stocks	Solvant et stockage	Volume à ~20 mL
8Br-cAMP	25 μM	5 mM	PBS, conserver à -20 °C	100 μL
CHIR99021	3 μM	10 mM	DMSO, conserver à -20 °C	6 μL
DMEM/F12	N/A	N/A	Conserver à 4 °C	20 mL
FGF4	25 ng/mL	100 μg/mL	0,1 % de BSA dans PBS, conserver à -20 °C	5 μL
Supplément de L-alanyl-L-glutamine	2 mM	200 mM	Conserver à 4 °C	200 μL
Héparine	1 μg/mL	1 mg/mL	PBS, conserver à -20 °C	20 μL
Holo-transférrine	10,7 μg/mL	10,7 mg/mL	Eau DI, conserver à -20 °C	20 μL
TGF-β1 humain	15 ng/mL	20 μg/mL	4 mM HCl + 0,1 % de BSA, conserver à -20 °C	15 μL
IL-11	30 ng/mL	25 μg/mL	0,1 % de BSA dans PBS, conserver à -20 °C	24 μL
Insuline	19,4 μg/mL	9,5 - 11,5 mg/mL	La concentration dépend du lot, conserver à 4 °C	33,7–40,8 μL, ajustez le volume selon la concentration du stock.
L-acide ascorbique-2-phosphate magnésium	64 μg/mL	32 mg/mL	Eau DI, conserver à -20 °C	40 μL
LIF recombinant de souris	10 ng/mL	10 μg/mL	PBS + 0,1 % BSA, conserver à -20 °C	20 μL
NaHCO3	543 μg/mL	45,25 mg/mL	Eau DI, conserver à -20 °C	240 μL
Pénicilline/Streptomycine	1x	100x	Conserver à -20 °C	200 μL
Sélénite de sodium	14 ng/mL	14 μg/mL	Eau DI, conserver à -20 °C	20 μL
Y27632	20 μM	20 mM	DMSO, conserver à -20 °C	20 μL

Tableau 2 : Recette médiatique pour le TX. Recette pour préparer le substrat TX, avec des détails sur la préparation et le stockage des petites molécules et autres réactifs, ainsi que les concentrations finales.

Discussion

Les blastoïdes iGATA4 fournissent un modèle très efficace, semblable à un embryon, basé sur des cellules souches du blastocyste de souris en auto-organisant trois types cellulaires cultivés in vitro : les ESC, les GATA4-ESC inductibles (iGATA4-ESC) et les TSC cultivés par hypoxie. Ces structures récapitulent des caractéristiques clés du blastocyste E4.5, y compris des proportions de lignées appropriées et une identité transcriptionnelle, et peuvent être utilisées pour le criblage environnemental multiparamétrique, reflétant de manière fiable les défauts développementaux du stade^{blastocyste 3}. Une étude récente démontre également que l’agrégation des ESC, iGATA4-ESC et TSC dans des milieux blastoïdes basaux produit également une formation de blastoïdes à haute efficacité, soulignant la robustesse et l’adaptabilité de cette approche en laboratoire et dans les conditions de culture³⁹. Les iGATA4-ESC ont déjà démontré qu’ils récapitulent les fonctions des cellules VE dans des modèles embryonnaires à base de cellules souches^{post-implantation} 28,29,30,31. Ensemble, ces résultats illustrent comment les iGATA4-ESC peuvent servir de substituts flexibles et fiables pour les cellules EP/EV dans la modélisation embryonnaire basée sur des cellules souches à travers les stades du développement.

Plusieurs étapes du protocole sont cruciales pour obtenir des blastoïdes de haute qualité. Cela inclut la qualité des populations cellulaires de départ, en particulier les TSC cultivées par hypoxie (Figure 1) ; la préparation du substrat TX, qui doit être fraîchement préparé le jour 0 (Tableau 2 ; Section 2.3) ; et une manipulation soigneuse des plaques après agrégation. Les indicateurs clés du succès du protocole incluent l’efficacité de cavitation (typiquement ~80 %), la morphologie appropriée (structures de ~100 μm de diamètre avec une cavité de type blastocoel, une couche externe de type TE CDX2⁺, et une masse interne de cellules SOX2⁺ et GATA4⁺ triée avec un rapport PE d’environ 3 TE :1 EPI :1), ainsi que la présence d’une couche de type GATA4⁺ de type PE correctement triée. Ce sont des métriques couramment utilisées dans le domaine 1,2,4,5. Parmi les blastoïdes cavités, environ 75 % des structures présentent toutes ces caractéristiques. Ces indicateurs peuvent être utilisés comme indicateurs initiaux pour le dépannage. Une qualité cellulaire sous-optimale se reflète généralement dans une morphologie anormale des colonies, entraînant des structures mal agrégées ou non cavitées. Une préparation inadéquate du milieu peut entraîner une agrégation incomplète ou des défauts de lignée, tandis qu’une manipulation rugueuse peut entraîner plusieurs agrégats par micropuits ou puits vides.

Une optimisation supplémentaire peut inclure l’ajustement du nombre de cellules ensemencées (plages de départ recommandées : 4–7 ESC et iGATA4-ESC, et 10–15 TSC par micropuits), l’affinement des méthodes d’appauvrissement du MEF (par exemple, filtration via une tamoire cellulaire de 40 μm) et la modification de la composition du milieu TX. Par exemple, la suppression de FGF4 et d’héparine peut toujours permettre une formation efficace de blastoïdes tout en favorisant une identité plus murale de type TE. Les blastoïdes iGATA4 peuvent être maintenus en culture jusqu’à 6 jours ; cependant, les structures des jours 4 à 6 augmentent souvent en taille tout en conservant des proportions de type blastocyste de la lignée. Le protocole donne des résultats cohérents entre les réplications biologiques, mais des contrôles appropriés doivent être inclus dans chaque expérience.

Comparé à d’autres systèmes blastoïdes chez la souris, qui varient en populations cellulaires de départ et en conditions^{de culture} 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , les blastoïdes iGATA4 atteignent à la fois une grande efficacité de formation et une représentation précise de la lignée. Bien que de nombreux protocoles existants génèrent des structures cavitées et soient précieux pour des applications biologiques spécifiques, ils présentent souvent une formation incomplète de PE, des identités cellulaires hétérogènes ou indéfinies, ou des proportions de lignées incorrectes. En combinant trois populations de cellules souches dirigées par lignée de manière progressive, les blastoïdes iGATA4 surmontent ces limites et fournissent un système reproductible, modulaire et expérimentalement accessible.

Malgré ces avantages, plusieurs limites subsistent. Une culture in vitro prolongée dans un milieu TX au-delà de 4 à 6 jours entraîne une prolifération excessive, même si les proportions de lignées restent proches de blastocystes. Environ 12,5 % des blastoïdes iGATA4 passent à des morphologies de type péri-implantation in vitro, caractérisées par un épiblaste pseudostratifié en forme de coupe entourant une cavité pro-amniotique, un compartiment extraembryonnaire élargi semblable à un ectoderme adjacent à l’épiblaste proximal, et une couche externe viscérale semblable à un endoderme. Cependant, les blastoïdes iGATA4 ne s’implantent pas et se développent davantage après leur transfert dans une souris hôte. Par conséquent, les blastoïdes iGATA4, et plus largement les blastoïdes, ne conviennent pas à l’étude de l’implantation ou des interactions embryon-mère.

La base moléculaire de l’échec des blastoïdes à s’implanter reste incertaine, bien que les preuves actuelles suggèrent qu’une modélisation incomplète du trophectoderme pourrait être un facteur contributif. Les cellules de type TE dans les blastoïdes iGATA4 présentent une identité moléculaire trop polaire. Les efforts futurs pour concevoir des TSC qui ressemblent davantage à des cellules TE murales, ou pour introduire des lignées cellulaires alternatives qui reproduisent mieux des TE compatibles pour l’implantation, représentent des orientations prometteuses pour surmonter ces limites. La nature modulaire des blastoïdes iGATA4, dans lesquels des modifications spécifiques aux TE peuvent être mises en œuvre indépendamment de la formation EPI et PE, rend ce système particulièrement adapté à de tels développements.

Pris ensemble, le protocole iGATA4-blastoïde offre une plateforme robuste et évolutive pour étudier la spécification de la lignée et les processus précoces de développement chez l’embryon de mammiffère. Sa reproductibilité et son adaptabilité le rendent particulièrement adapté aux applications de dépistage environnemental, pharmacologique et génétique à haut débit. Ainsi, les iGATA4-blastoïdes représentent un système puissant pour étudier les mécanismes précoces du développement et évaluer comment diverses perturbations influencent le développement préimplantation.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	Utilisé pour la préparation générale des milieux
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	Utilisé pour la préparation des milieux TX et la cavitation des blastoïdes
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	Plaque d'agrégation en micropuits ; Utilisé pour la préparation des blastoïdes
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Utilisé pour la préparation des blastoïdes
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	Pipettes à grand diamètre pour le déplacement des blastoïdes lors de la coloration immunologique.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Utilisé pour la préparation des milieux
Caffeine	Sigma	58-08-2	Utilisé comme facteur environnemental pour tester dans les iGATA4-blastoïdes
CDX2 antibody, mouse	Biogenex	MU392A5UC	Pour l'immunofluorescence, utilisé à 1:200
CellXpert (normoxia incubator)	Eppendorf	6731010015	D'autres marques/modèles peuvent également fonctionner.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	Utilisé pour la préparation des milieux
Countess Cell Counting Chamber slides	Invitrogen	C10228	Utilisé à des fins générales de culture tissulaire
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	Utilisé pour l'immunofluorescence, utilisé à 1:500-1:1 000
DMEM	Gibco	11995040	Utilisé pour la préparation des milieux FC
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	Utilisé pour la préparation des milieux N2B27 et TX
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	Supplément DMEM-LM avec poudre de mélange nutritif Ham's F-12 pour obtenir une concentration finale de 1x pour obtenir du DMEM/F12 sans Met et sans Leu
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	Utilisé pour l'immunofluorescence, utilisé à 1:500-1:1 000
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	Utilisé pour l'immunofluorescence, utilisé à 1:500-1:1 000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	Utilisé pour l'immunofluorescence, utilisé à 1:500-1:1 000
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	Utilisé pour l'immunofluorescence, utilisé à 1:500-1:1 000
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Utilisé pour l'immunofluorescence. Décongeler à 4°C; et conserver en aliquots à -20°C;.
Doxycycline	Sigma	D9891-5G	Pour l'induction iGATA4 lors de la préparation des blastoïdes
Eppendorf Centrifuge 5702	Eppendorf	5702	utilisé dans notre laboratoire, d'autres fonctionneront. Nécessite des adaptateurs de tube et de plaque.
Falcon 96-well Clear Round Bottom Not Treated Microplate, with Lid, Individually Wrapped	Corning	351177	Utilisé pour l'immunofluorescence
FGF4	R&D Systems	5846-F4	Utilisé pour la préparation des milieux
Fiji	Schindelin et al., 2012	https://imagej.net/Fiji	Utilisé pour l'analyse d'images
GATA4 antibody, rabbit	Cell Signalling	36966S	Utilisé pour l'immunofluorescence, utilisé à 1:500
Gelatin solution, 2%	Sigma	G1393	Utilisé à des fins générales de culture tissulaire
Glass Bottom Dish 35 mm	Ibidi	81218-200	Pour l'immunofluorescence et l'imagerie
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	Supplément de L-alanyl-L-glutamine ; Utilisé pour la préparation des milieux
Ham's F-12 Nutrient Mix powder	Thermo Fisher Scientific	21700075	Utilisé comme supplément pour DMEM-LM, pour les conditions de régime pauvre en protéines.
Heparin	Sigma	H3149	Utilisé pour la préparation des milieux
Heracell VIOS 160i (hypoxia incubator)	Thermo Fisher Scientific	51030400	D'autres marques/modèles peuvent également fonctionner.
Holo-transferrin	Sigma	T4132	Utilisé pour la préparation des milieux TX.
Human recombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	Utilisé pour la préparation des milieux TX.
IL-11	PeproTech	200-11	Utilisé pour la préparation des milieux TX.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	Utilisé pour l'analyse d'images et la préparation des images.
Inactivated Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV	Utilisé pour la préparation des milieux
Inducible GATA4 ESCs (tetO-GATA4-ESCs)	Amadei et al., 2021	NA	Ligne cellulaire disponible auprès du laboratoire Zernicka-Goetz sur demande
Insulin	Sigma	I9278	Utilisé pour la préparation des milieux TX.
Irradiated C57bl/6 Mouse Embryonic Fibroblasts	Thermo Fisher Scientific	A34960	Utilisé comme couche nourricière pour la culture TSC. Décongeler comme indiqué dans le protocole et utiliser dans la semaine.
L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium	Sigma	A8960	Utilisé pour la préparation des milieux TX.
L-isoleucine	Thermo Fisher Scientific	73-32-5	Utilisé pour compléter les milieux TX.
L-leucine	Thermo Fisher Scientific	61-90-5	Utilisé pour compléter les milieux TX.
L-valine	Thermo Fisher Scientific	72-18-4	Utilisé pour compléter les milieux TX.
Megacell RPMI-1640 Medium	Sigma	M3817	Utilisé pour