Pharmacologie en réseau intégrée, métabolomique et validation in vivo de la décoction de Liangxue Dihuang chez la colite ulcéreuse induite par le DSS

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail reproductible intégrant la pharmacologie en réseau, la métabolomique non ciblée et la validation in vivo pour élucider les mécanismes multicomposantes de la décoction de Liangxue Dihuang dans un modèle murin de colite ulcéreuse induit par le sulfate de sodium dextrane.

Résumé

La colite ulcéreuse (CU) est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin caractérisée par une inflammation intestinale persistante et une dysrégulation métabolique. Les formules de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) sont largement utilisées en pratique clinique pour les troubles inflammatoires ; cependant, les approches expérimentales systématiques visant à élucider leurs mécanismes multi-composantes et multi-cibles restent limitées. Cet article présente un protocole expérimental reproductible intégrant la pharmacologie en réseau, la métabolomique non ciblée et la validation in vivo afin d’étudier les effets anti-inflammatoires de la décoction Liangxue Dihuang (LXDHD) dans un modèle murin de l’UC induit par le dextrane sulfate de sodium (DSS). Le flux de travail comprend la préparation de la décoction à base de plantes, la modélisation de la colite induite par le DSS, l’évaluation de l’activité de la maladie, l’évaluation histopathologique et hématologique, la mesure des cytokines sériques, le profilage métabolomique basé sur LC–MS, et l’analyse de réseaux computationnels. Grâce à cette approche intégrée, la colite induite par le DSS a été établie avec succès, et le traitement par LXDHD a entraîné des améliorations mesurables de l’indice d’activité de la maladie, de la longueur du côlon, des lésions histopathologiques, des niveaux de cytokines inflammatoires et des profils métaboliques. Les analyses de pharmacologie de réseau et de métabolomiques ont également démontré que ce protocole permet d’identifier des cibles clés, des voies et des métabolites associés à l’intervention thérapeutique. Ce flux de travail visualisé et standardisé fournit un cadre méthodologique pratique pour étudier les mécanismes pharmacologiques des formules MTC multicomposantes dans les maladies inflammatoires de l’intestin et peut être adapté à d’autres prescriptions à base de plantes et modèles de maladies.

Introduction

La colite ulcéreuse (CU) est une maladie inflammatoire chronique de l’intestin caractérisée par une inflammation muqueuse continue du^{côlon 1}, entraînant des symptômes tels que douleurs abdominales, diarrhée, saignements rectaux et perte^{de poids 2}. L’incidence de la CU a augmenté dans le monde, imposant un fardeau important aux systèmes de santé et altissant de manière significative la qualité de vie des^{patients 3}. Bien que l’étiologie de la CU reste incomplètement comprise, les preuves accumulées indiquent que des réponses immunitaires dérégulées, une production excessive de cytokines inflammatoires, le stress oxydatif et les troubles métaboliques jouent un rôle central dans la pathogenèse de^{la maladie 4,5}.

Les stratégies thérapeutiques actuelles pour la CU incluent principalement les aminosalicylates, les corticostéroïdes, les agents immunosuppresseurs et les biologiques ciblant les cytokines^{inflammatoires 6}. Bien que ces traitements puissent soulager les symptômes et induire une rémission, leur utilisation à long terme est souvent associée à des effets indésirables, des coûts élevés et des réponses thérapeutiques variables ^7,8,9. De plus, une proportion considérable de patients ne parvient pas à obtenir une rémission durable, soulignant la nécessité d’approches thérapeutiques alternatives ou complémentaires avec une sécurité accrue et une efficacité multi-cibles.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est largement utilisée pour le traitement des troubles gastro-intestinaux depuis des siècles et est de plus en plus reconnue pour ses bienfaits potentiels dans les maladies inflammatoires complexes telles que l’UC¹⁰. Contrairement aux thérapies à cible unique, les formules de MTC exercent généralement des effets thérapeutiques via plusieurs composants agissant sur plusieurs cibles et voies, ce qui peut mieux répondre à la nature multifactorielle de l’UC¹¹. Des études cliniques et expérimentales ont suggéré que certaines prescriptions de MTC peuvent moduler les réponses immunitaires, supprimer l’inflammation, protéger l’intégrité de la barrière intestinale et réguler l’homéostasie^métabolique 12,13,14,15.

La décoction Liangxue Dihuang (LXDHD) est une formule classique de MTC traditionnellement utilisée pour « refroidir le sang et dissiper la chaleur » et a été appliquée cliniquement pour les troubles inflammatoires et^{hémorragiques 16}. La prescription comprend plusieurs plantes, dont Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis et Glycyrrhiza uralensis. Des études pharmacologiques modernes ont montré que plusieurs plantes constitutives et leurs composés actifs possèdent des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et^{immunomodulatrices} 17,18,19. Cependant, les effets thérapeutiques globaux et les mécanismes sous-jacents de la LXDHD dans la CU n’ont pas encore été systématiquement élucidés.

La pharmacologie en réseau s’est imposée comme une approche efficace pour explorer les interactions complexes entre les formules à base de plantes multicomposantes et les cibles moléculaires liées aux^{maladies 20}. En intégrant des informations issues de plusieurs bases de données, la pharmacologie en réseau peut prédire les composés actifs potentiels, les cibles thérapeutiques et les voies de signalisation, fournissant une compréhension systémique des mécanismes de la^{MTC 21}. Néanmoins, la pharmacologie en réseau repose principalement sur des prédictions de bases de données et ne reflète pas directement les changements métaboliques in vivo .

La métabolomique, en tant qu’outil puissant pour profiler les altérations métaboliques mondiales, offre des perspectives complémentaires sur la physiopathologie des maladies et les réponses thérapeutiques²². Dans l’UC, les analyses métabolomiques ont révélé des perturbations significatives du métabolisme des lipides et des acides aminés, ainsi que des voies liées au stress^oxydatif 23,24,25. L’intégration de la métabolomique à la pharmacologie en réseau peut aider à combler l’écart entre les cibles moléculaires prédites et les phénotypes métaboliques réels, améliorant ainsi la fiabilité des interprétations mécanistes.

Dans la présente étude, une stratégie intégrée combinant pharmacologie en réseau, métabolomique non ciblée et validation expérimentale a été employée pour étudier les effets anti-inflammatoires et les mécanismes potentiels de la LXDHD dans un modèle murin de l’UC induit par le dextran sulfate de sodium (DSS) (Figure 1A). Cette conception méthodologique globale, intégrant les prédictions in silico avec la validation métabolomique et phénotypique in vivo , est conforme aux cadres de recherche rigoureux^{établis 26}. L’analyse de pharmacologie en réseau a été utilisée pour identifier les composés actifs, les cibles thérapeutiques potentielles et les voies de signalisation enrichies par le traitement LXDHD. Des métabolomiques non ciblées ont été réalisées pour caractériser les altérations métaboliques induites par l’UC et leur modulation par LXDHD. De plus, les résultats clés ont été validés par des expériences in vivo , notamment des évaluations de l’activité de la maladie, des modifications histopathologiques, des paramètres hématologiques et des niveaux de cytokines inflammatoires.

En intégrant prédictions computationnelles, profilage métabolique et validation biologique, cette étude vise à fournir une compréhension complète des mécanismes multi-composants, multi-cibles et multi-voies sous-jacents aux effets thérapeutiques du LXDHD dans l’UC. Ce travail offre non seulement des preuves expérimentales soutenant l’utilisation de la LXDHD comme thérapie complémentaire potentielle pour la CU, mais fournit également un cadre méthodologique pour étudier les mécanismes d’autres formules complexes de la MTC.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales animales ont été menées conformément aux Directives pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Hôpital affilié de l’Université de Médecine Chinoise de Nankin (Approbation n° #2025DW-034-01 ; Date d’approbation : 24 mars 2025). La préparation de la décoction Liangxue Dihuang a été réalisée conformément aux procédures décrites dans la Pharmacopée^{chinoise 27}. Les réactifs, produits chimiques et logiciels utilisés dans le protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de la décoction Liangxue Dihuang (LXDHD)

1. Préparez les matériaux à base de plantes séchés selon la formulation standard de LXDHD. La composition exacte des plantes, les noms botaniques et les dosages exacts prescrits des onze plantes constitutives sont spécifiés dans le Tableau 1.
   REMARQUE : Authentifier tous les matériaux à base de plantes par un pharmacien qualifié avant leur utilisation afin d’assurer l’identité botanique et la cohérence de la qualité. Conservez les enregistrements d’authentification pour la reproductibilité.
2. Préparation de la poudre
   1. Faites sécher à l’air libre tous les matériaux à température ambiante dans un environnement propre et bien ventilé.
   2. Pulvérisez chaque herbe individuellement à l’aide d’un moulin mécanique jusqu’à obtenir une fine poudre.
   3. Combinez les poudres selon les proportions prescrites.
   4. Faites passer la poudre mélangée à travers un tamis de 80 mailles (diamètre intérieur 180 μm ± 7,6 μm) pour garantir une taille uniforme des particules.
   5. Homogénéisez soigneusement la poudre tamisée.
      REMARQUE : Une taille uniforme des particules est essentielle pour une efficacité d’extraction constante. Un broyage incomplet ou un mélange inégal peuvent entraîner une variabilité de la composition chimique.
3. Préparation de l’extrait aqueux LXDHD
   1. Pesez précisément la poudre mixte de plantes et ajoutez de l’eau distillée dans un ratio de 1:10 (v/v).
   2. Chauffez le mélange jusqu’à ébullition et découdez pendant 20 minutes.
   3. Filtrez l’extrait et collectez le filtrat.
   4. Ajoutez de l’eau distillée fraîche au résidu et répétez la décoction pendant 20 minutes supplémentaires.
   5. Combinez les deux filtrats pour obtenir l’extrait liquide final LXDHD.
      REMARQUE : La double décoction est essentielle pour assurer une extraction efficace des composants solubles dans l’eau et modérément solubles.
4. Concentration et stockage
   1. Concentrez la décoction combinée sous pression réduite ou un chauffage doux jusqu’à atteindre la concentration souhaitée.
   2. Laissez l’extrait refroidir à température ambiante.
   3. Conservez l’extrait LXDHD préparé à 4 °C et consommez-le dans les 48 heures.
      REMARQUE : Évitez les cycles répétés de gel-dégel, car ils peuvent dégrader les composés bioactifs et réduire leur reproductibilité expérimentale.
5. Administration
   1. Amenez l’extrait à température ambiante avant l’administration.
   2. Administrez la décoction aqueuse concentrée de LXDHD à la souris par gavage oral aux doses désignées selon le regroupement expérimental.

2. Conception d’expériences animales

1. Animaux et conditions de logement
   1. Obtenez des souris mâles C57BL/6 (âgées de 6 à 8 semaines, 20 à 25 g) auprès d’un fournisseur certifié d’animaux de laboratoire.
   2. Souris d’intérieur dans des conditions de laboratoire standard avec un cycle clair/obscur de 12 heures, une température contrôlée (22–25 °C) et une humidité relative (50 % à 60 %).
   3. Offrez aux souris un accès libre à la nourriture et à l’eau standards tout au long de l’expérience.
   4. Laissez les souris s’acclimater pendant au moins 7 jours avant l’expérimentation.
      REMARQUE : N’incluez que des souris saines avec une activité et un poids corporel normaux dans les expériences suivantes.
2. Groupement et calcul de la dose
   1. Calculer la dose de la LDDHD chez la souris selon le principe de conversion de dose humain–animal décrit dans la Méthodologie des expériences pharmacologiques, basé sur un poids corporel adulte standard de 70 kg et une dose clinique quotidienne de 8,4^{g 28}.
   2. Divisez aléatoirement les souris en groupes suivants (n = 6 par groupe) : groupe témoin normal, groupe modèle UC induit par DSS, groupe LXDHD à faible dose (1,09 g/kg), groupe LXDHD à haute dose (2,18 g/kg) et groupe témoin positif 5ASA (100 mg/kg⁾²⁹.
      REMARQUE : Effectuer la randomisation à l’aide d’une table des nombres aléatoires pour minimiser le biais de sélection.
   3. Induction de l’UC et administration des médicaments
      1. Préparez une solution DSS à 2,5 % (p/v) dans l’eau potable.
      2. Administrez la solution DSS ad libitum aux souris du modèle, des groupes traités par LXDHD et 5ASA pendant 7 jours^{consécutifs et 30}.
      3. Fournir de l’eau potable purifiée aux souris du groupe témoin normal.
      4. Administrez LXDHD et 5ASA aux groupes traités une fois par jour par gavage oral aux doses correspondantes tout au long de la période expérimentale.
      5. Administrer un volume égal de solution de véhicule aux groupes de modèles de contrôle normal et DSS.
         REMARQUE : Préparez la solution DSS à neuf et remplacez-la tous les deux jours. Les lots DSS peuvent varier en puissance inductrice de colite ; Effectuez des tests pilotes lors de l’utilisation d’un nouveau lot. L’établissement réussi du modèle de CU induit par le DSS se caractérise par une perte progressive de poids corporel, une diarrhée sanglante, des scores DAI élevés et un raccourcissement marqué du côlon. Ces critères et la conception méthodologique des expériences murines sont cohérents avec les normes de référence^{établies 31}.
3. Préparation de sérum à vide et contenant des médicaments pour la métabolomique exogène
   1. Utilisez une cohorte distincte de souris mâles en bonne santé C57BL/6.
   2. Divisez aléatoirement les souris en deux groupes : le groupe blanc et le groupe LXDHD.
   3. Administrez LXDHD au groupe LXDHD par gavage oral à 2,18 g/kg une fois par jour pendant 7 jours consécutifs.
   4. Administrez un volume égal d’eau distillée au groupe blanc.
   5. Prélève des échantillons de sang 1 h après l’administration finale.
   6. Prélever des échantillons sanguins pour obtenir du sérum comme décrit ci-dessus à la Section 3.5.

3. Évaluation de l’activité de la maladie

1. Surveillez quotidiennement le poids corporel, la consistance des selles et les saignements fécaux pendant l’expérience.
2. Calculez l’Indice d’Activité de la Maladie (DAI) en fonction de la perte de poids corporelle, de la consistance des selles et des saignements fécals. Le cadre spécifique de notation est détaillé dans le Tableau 3. Calculer le
   score final DAI comme moyenne (ou somme) de ces trois paramètres³².
3. À la fin du 8e jour, anesthésiez les souris de chaque groupe avec 1 % de pentobarbital sodique (30 mg/kg). Prélever environ 400 μL de sang du plexus veineux rétro-orbitaire de chaque souris. Par la suite, euthanasiez les animaux par luxation cervicale afin d’assurer la mort, conformément strictement aux directives de l’American Veterinary Medical Association (AVMA) pour l’euthanasie animale (Figure 1B).
   REMARQUE : Confirmer une anesthésie adéquate en pinçant doucement les orteils et la surface plantaire des pattes postérieures ; L’absence de réponse de sevrage indique une profondeur d’anesthésie suffisante.
4. Prélever les tissus du côlon et mesurer la longueur du côlon comme indicateur de la gravité de la maladie.
   REMARQUE : La longueur du côlon raccourcie est considérée comme une caractéristique de la sévérité³³ de la colite induite par le DSS.
5. Obtention du sérum sanguin
   1. Laissez une partie des échantillons de sang collectés coaguler à température ambiante pendant 1 heure.
   2. Centrifugez à 1 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C pour obtenir le sérum.
   3. Quantifier les niveaux sériques d’interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-17, facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et IL-10.
   4. Prélever des échantillons de tissu du côlon pour une analyse histopathologique.
   5. Utilisez les échantillons sanguins restants pour l’analyse du sang périphérique.
   6. Réservez des échantillons supplémentaires de sérum pour l’analyse métabolomique.

4. Coloration hématoxyline–éosine (H&E)

1. Fixez les tissus du côlon avec du paraformoldéhyde à 4 % pendant au moins 24 heures.
2. Déshydrater les tissus grâce à une série d’éthanol graduée.
3. Clairsez les tissus avec du xylène et les incorporez dans la paraffine.
4. Coupez des coupes de tissu (3 à 5 μm d’épaisseur) à l’aide d’un microtome.
5. Déparaffinez les coupes avec du xylène.
6. Réhydratez les coupes avec de l’éthanol de calibration.
7. Colorez les sections avec de l’hématoxyline pour la visualisation nucléaire.
8. Contre-coloration avec des sections d’éosine pour la coloration cytoplasmique.
9. Observez les changements histopathologiques au microscope optique et capturez des images représentatives à l’aide du logiciel d’imagerie associé.
10. Évaluer les scores histologiques (SCH) en fonction de la gravité de l’inflammation, de la profondeur de la blessure et des lésions cryptiques.
11. Consultez le tableau 4 pour des critères histologiques détaillés.
    REMARQUE : Capturez des images représentatives de l’incrustation, du coupage et de la coloration des tissus pour améliorer la visualisation des protocoles.

5. Analyse du sang périphérique

1. Prélever des échantillons de sang périphérique dans des tubes anticoagulants EDTA-K2 (1,5 mg d’EDTA par mL de sang).
2. Inversez doucement les tubes 8 à 10 fois pour assurer un bon mélange.
3. Analysez les numéros globulaires sanguins à l’aide d’un analyseur vétérinaire en hématologie en trois parties (Mindray BC-2600vet) avec calibration spécifique à l’espèce.
4. Transportez des échantillons à 4 °C.
5. Analysez les échantillons dans les 4 heures suivant la collecte.
   REMARQUE : Excluez les échantillons montrant hémolyse ou coagulation de l’analyse.

6. Dosage immunosorbant lié aux enzymes (ELISA)

REMARQUE : IL-6, IL-17, IL-1β et TNF-α sont des cytokines pro-inflammatoires clés, tandis que l’IL-10 est une cytokine anti-inflammatoire clé. Ces cytokines reflètent la présence et la gravité des réponses^{inflammatoires 34}.
La mesure de ces cytokines est cruciale pour comprendre les processus inflammatoires et évaluer l’efficacité des traitements anti-inflammatoires.

1. Prélève des échantillons de sang du plexus veineux rétro-orbitaire.
2. Laissez les échantillons coaguler à température ambiante pendant 1 heure.
3. Centrifugez à 1 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C pour obtenir du sérum.
4. Mesurez les niveaux sériques d’IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α et IL-10 à l’aide de kits ELISA commerciaux.
5. Mesurez l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques équipé d’un logiciel standard d’acquisition de données.
6. Calculez les concentrations de cytokines à partir de courbes standard.
   REMARQUE : Tester tous les échantillons et standards en double afin de réduire la variabilité technique.

7. Analyse LC–MS de la décoction de Liangxue Dihuang

1. Préparation de l’échantillon
   1. Pèser précisément 10 g de la poudre d’herbes brutes mixtes LXDHD.
   2. Dissous la poudre dans 30 mL d’eau chaude.
   3. Effectuez une extraction ultrasonique pendant 30 minutes.
   4. Mélangez 100 μL de l’extrait avec 400 μL de méthanol.
   5. Vortex pendant 10 minutes.
   6. Centrifugez à 14 000 × g pendant 10 minutes.
   7. Récupérez le surnageant comme solution test.
2. Conditions LC–MS
   1. Effectuer la séparation chromatographique à l’aide d’un système LC couplé à un spectromètre de masse Q.
   2. Utilisez une colonne C18 (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   3. Régler la phase mobile comme suit : solvant A, 0,1 % d’acide formique dans l’eau ; Solvant B, méthanol.
   4. Réglez le débit à 0,30 mL/min.
   5. Réglez la température de la colonne à 35 °C.
   6. Réglez le volume d’injection à 5 μL.
   7. Appliquer le programme d’élution de gradient suivant :
      0–2 min, 5 % B ;
      2–15 min, 5–95 % B ;
      15–18 min, 95 % B ;
      18–18,1 min, 95–5 % B ;
      18,1–22 min, 5 % B.
   8. Définir les paramètres de spectrométrie de masse comme suit : débit de gaz de gaine, 35 arb ; débit de gaz auxiliaire, 10 arb ; tension de pulmonsion, 3,5 kV (positif) et 2,8 kV (négatif) ; température capillaire, 320 °C ; température du chauffage au gaz auxiliaire, 350 °C.
   9. Acquérir des données MS en modes ions positifs et négatifs avec une plage complète de balayage MS de m/z 100–1500 (résolution : 70 000).
   10. Effectuer des scans MS2 (dd-MS2) dépendants des données à une résolution de 17 500.
   11. Traiter les données brutes et identifier les composés à l’aide de la base de données mzCloud.

8. Analyse métabolomique sérique non ciblée

1. Préparation de l’échantillon sérique et contrôle qualité (QC)
   1. Échantillons de sérum de dégel sur glace.
   2. Transférez 50 μL de sérum dans un tube centrifugeuse de 1,5 mL.
   3. Ajoutez 200 μL de méthanol froid/acétonitrile (1:1, v/v).
   4. Vortex pendant 1 minute pour précipiter les protéines.
   5. Incubez sur glace pendant 15 minutes.
   6. Centrifugez à 14 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C.
   7. Transférez le surnageant dans un nouveau tube.
   8. Séchez l’extrait à l’aide d’un concentrateur sous vide.
   9. Reconstituer dans 100 μL d’acétoninitrile/eau (1:1, v/v).
   10. Vortex complètement.
   11. Centrifugez à nouveau à 14 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C.
   12. Collectez le surnageant pour l’analyse LC-MS.
   13. Préparez les échantillons de contrôle qualité en regroupant 10 μL d’aliquotes de chaque échantillon.
   14. Injecter un échantillon de contrôle qualité pour chaque 8 à 10 échantillons expérimentaux afin de surveiller la stabilité et la répétabilité de l’instrument.
2. Paramètres d’acquisition LC-MS
   1. Effectuer la séparation chromatographique à l’aide du système LC avec une colonne C18 (150 × 2,1 mm, 1,8 μm).
   2. Réglez la température de la colonne à 35 °C.
   3. Réglez le débit à 0,30 mL/min.
   4. Réglez le volume d’injection à 2 μL (mode positif) ou 5 μL (mode négatif).
   5. Utilisez le solvant A (acide formique à 0,1 % dans l’eau) et le solvant B (acétonitrile avec 0,1 % d’acide formique).
   6. Appliquez un programme d’élution linéaire en gradient.
   7. Faites fonctionner le spectromètre de masse en modes HESI positif et négatif.
   8. Réglez la plage de balayage de masse à m/z 100–1500.
   9. Réglez la tension de pulvérisation à 3,5 kV (positif) et 2,8 kV (négatif).
   10. Réglez la température capillaire à 320 °C.
3. Traitement des données et identification différentielle des métabolites
   1. Importez les données brutes LC-MS (fichiers .raw) dans le logiciel.
   2. Effectuez l’alignement des pics, le picking des pics et la correction de la ligne de base.
   3. Normaliser les caractéristiques de la zone de pic extraite à l’intensité totale des ions.
   4. Identifier les métabolites en comparant avec précision les schémas de masse (tolérance à la masse < 5 ppm) et MS/MS avec les bases de données mzCloud et ChemSpider.
   5. Effectuer une analyse statistique multivariée (PCA et OPLS-DA/PLS-DA).
   6. Définissez les métabolites différentiels en fonction des seuils suivants : VIP > 1,0 et p < 0,05 (test t de l’Étudiant).

9. Analyse de la pharmacologie des réseaux

REMARQUE : La pharmacologie réseau a été employée pour prédire les composants actifs et les cibles clés de la LXDHD dans UC^35,36. La méthodologie comprend l’exploration de bases de données, le traitement de l’information chimique, l’acquisition de données de bioactivité, la récupération de cibles protéiques, le profilage de l’expression génique, la construction de réseaux d’interaction et l’analyse d’enrichissement des^{voies 37,38}.

1. Criblage actif des composés
   1. Récupérer les composés actifs à partir de la base de données et d’analyse des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP) (consultée le 10 décembre 2025) en utilisant OB ≥ 30 % et DL ≥ 0,18.
   2. Compléter les composés via des recherches de littérature dans PubMed et Web of Science (10–15 décembre 2025).
   3. Standardisez les cibles à l’aide de la base de données UniProt (consulté le 15 décembre 2025).
2. Identification des cibles de la maladie
   1. Collecter les cibles liées à l’UC à partir des bases de données GeneCards, OMIM, TTD et DrugBank (consulté le 15 décembre 2025).
3. Construction et analyse du réseau
   1. Identifier les cibles qui se croisent à l’aide du package VennDiagram dans le logiciel R.
   2. Construisez le réseau à l’aide du logiciel Cytoscape.
   3. Analysez la topologie à l’aide du plugin NetworkAnalyzer et du plugin CytoNCA.
4. Identification du réseau PPI et des cibles principales
   1. Importez les cibles qui se croisent dans la base de données STRING.
   2. Restreignez les espèces à Homo sapiens.
   3. Supprimez les nœuds isolés.
   4. Appliquez un seuil de score PPI > 0,9.
   5. Exportez les données et analysez dans le logiciel.
   6. Calculez DC, BC, EC, CC, NC et LAC.
   7. Effectuer un filtrage basé sur la médiane pour générer des sous-réseaux et identifier les cibles principales³⁹.
5. Analyse d’enrichissement de GO et KEGG
   1. Effectuer l’enrichissement GO et KEGG en utilisant des packages R et Bioconductor.
   2. Utilisez les packages R, y compris org. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, enrichplot, stringi et ggplot2.
   3. Fixez des seuils de signification à p = 0,05 et q = 0,05.
   4. Effectuez une analyse GO pour les catégories MF, BP et CC.
   5. Effectuer l’enrichissement et la classification de la voie^{KEGG 40}.
6. Amarrage moléculaire
   1. Téléchargez des structures composées depuis TCMSP au format SDF.
   2. Téléchargez les structures protéiques d’AlphaFold au format PDB.
   3. Effectuer l’amarrage via le serveur web CB-DOCK2 (CADD Lab, Université du Sichuan, Chengdu, Chine).
   4. Définissez les fichiers récepteurs et ligands en conséquence.
   5. Notez la posture de liaison optimale et l’énergie de liaison.
      REMARQUE : L’amarrage a été réalisé à l’aide d’un algorithme génétique⁴¹. Les résultats ont été classés par énergie de liaison.

10. Analyse statistique

1. Effectuez une analyse statistique à l’aide du logiciel GraphPad Prism.
2. Exprimez les données quantitatives en moyenne ± écart-type (DS).
3. Testez la normalité avec le test de Shapiro–Wilk.
4. Tester l’homogénéité de la variance en utilisant le test de Brown–Forsythe.
5. Effectuer une ANOVA unidirectionnelle avec le test post hoc de Tukey pour les données normalement distribuées.
6. Effectuer le test de Kruskal–Wallis avec le test de Dunn pour les données non paramétriques.
7. Considérons p < 0,05 comme statistiquement significatif.
   REMARQUE : Une valeur p plus petite indique une plus grande différence statistique entre les groupes.

Résultats

Analyse de la pharmacologie de réseau du LXDHD dans la UC

La pharmacologie en réseau a été appliquée pour prédire les cibles thérapeutiques potentielles et les mécanismes moléculaires de la LXDHD en CU. Un total de 211 composés aux propriétés pharmacocinétiques favorables ont été sélectionnés à partir de la base de données TCMSP, dont 36 de Scutellaria baicalensis, 37 de Phellodendron chinense, 10 de Rehmannia glutinosa

Discussion

Cette méthode présente un flux de travail expérimental visualisé et reproductible intégrant la pharmacologie de réseau, la métabolomique non ciblée et la validation in vivo pour étudier les effets anti-inflammatoires des formules de MTC dans un modèle murin de CU induit par le DSS. Contrairement aux études pharmacologiques conventionnelles qui se concentrent principalement sur des conclusions mécanistiques isolées, ce protocole met l’accent sur la robustesse du cadre méthodologi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acide 5-aminosalalicylique (5-ASA)	Sigma-Aldrich	A3537	Médicament témoin positif pour la colite ulcéreuse ; administré à 100 mg/kg par gavage oral.
Acétonitrile (grade LC-MS)	Merck	100030	Utilisé pour la préparation d’échantillons métabolomiques et la phase mobile LC-MS.
Base de données de la structure des protéines AlphaFold	EMBL&ndash ; Institut européen de bioinformatique	https://alphafold.ebi.ac.uk/	Base de données utilisée pour obtenir les structures tridimensionnelles prédites des protéines cibles.
Angelica sinensis (Dang Gui)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (Dose : 1,6 g).
CB-Dock2	Laboratoire CADD	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	Plateforme web utilisée pour l’amarrage moléculaire et la prédiction du ligand et ndash ; modes de liaison aux protéines.
Agrumes aurantium (Zhi Ke)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (Dose : 0,5 g).
Logiciel Découverte de Composés	Thermo Fisher Scientific	Version 3.3	Utilisé pour le traitement des données LC&ndash ;MS et l’identification des composés.
Logiciels CTAn	Bruker	Version 1.17	Utilisé pour la reconstruction d’images 3D Micro-CT et l’analyse de l’érosion osseuse.
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Version 3.8.0	Logiciels utilisés pour la construction et la visualisation de réseaux.
Sulfate de Dextrane Sodium (DSS)	MP Biomédicals	160110	Poids moléculaire 36 000&ndash ; 50 000 Da ; Utilisé pour induire une colite ulcéreuse chez la souris.
Tubes anticoagulants EDTA-K2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Utilisé pour la collecte de sang périphérique.
Solution de coloration à l’éosine	Biosharp	N/A	Utilisé pour la contre-coloration cytoplasmique dans H& Coloration en E.
Éthanol	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	64-17-5	Utilisé pour la déshydratation des tissus.
Acide formique (grade LC-MS)	Merck	5.33002	Utilisé pour la préparation de la phase mobile LC-MS.
Glycyrrhiza uralensis (Gan Cao)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (Dose : 0,5 g).
GraphPad Prism	Logiciel GraphPad	Version 9.0	Utilisé pour l’analyse statistique et la présentation graphique.
Analyseur d’hématologie	Mindray	BC-2600vet	Analyseur hématologique vétérinaire en trois parties pour l’analyse sanguine de routine.
Solution de coloration à l’hématoxyline	Biosharp	BL700B	Utilisé pour H& Coloration électronique des sections de tissu du côlon.
Centrifugeuse à grande vitesse	Hitachi	CT15E/CT15RE	Utilisé pour le sérum et la préparation d’échantillons.
Kit IL-10 ELISA (souris)	MEIMIAN	MM-0176M2	Utilisé pour évaluer les niveaux sériques d’IL-10.
Kit IL-17 ELISA (souris)	Abclonal	RK00039	Utilisé pour mesurer les niveaux sériques d’IL-17.
IL-1 & bêta ; Kit ELISA (souris)	Abclonal	RK00006	Utilisé pour la détection des sériques IL-1 et bêta ; Des niveaux.
Kit IL-6 ELISA (souris)	Abclonal	RK00008	Utilisé pour quantifier les niveaux sérics d’IL-6.
Logiciel ImageJ (Fidji)	Instituts nationaux de la santé (NIH)	Version 1.53c	Logiciel open source utilisé pour le traitement et la quantification d’images.
Leica Application Suite X (LAS X)	Leica Microsystems	Version 3.7	Logiciel d’imagerie utilisé pour capturer des lames histopathologiques.
Méthanol (grade LC-MS)	Merck	106035	Utilisé pour la préparation d’échantillons métabolomiques et la phase mobile LC-MS.
Souris (Mâle C57BL/6)	Anokang Biotechnology Co., Ltd.	N/A	Animaux expérimentaux (6 ans et ndash ; 8 semaines, 20 et ndash ; 25 g) utilisé pour le modèle UC induit par le DSS.
Base de données mzCloud	Thermo Fisher Scientific	https://www.mzcloud.org/	Base de données utilisée pour la correspondance spectrale MS/MS.
Microscope optique	Leica	DM500	Utilisé pour l’observation histopathologique.
Paeonia lactiflora (Chi Shao)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (dose : 0,6 g).
Paeonia suffruticosa cortex (Mu Dan Pi)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (Dose : 0,5 g).
Paraformoldéhyde (4 %)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	N/A	Utilisé pour fixer les tissus du côlon.
Microtome pathologique	Leica	RM2016	Utilisé pour la préparation de sections de tissu paraffine.
Phellodendron chinense (Huang Bo)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (Dose : 0,5 g).
Platycladus orientalis (Ce Bai Ye Tan)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (Dose : 0,7 g).
Spectromètre de masse exactif à haute résolution Q	Thermo Fisher Scientific	Q Exactive	Spectromètre de masse basé sur Orbitrap pour l’analyse LC&ndash ; MS.
R Software	Fondation R pour l’informatique statistique	Version 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	Logiciels utilisés pour les analyses d’enrichissement GO et KEGG.
Rehmannia glutinosa (Sheng Di Huang)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (Dose : 2,1 g).
Sanguisorba officinalis (Di Yu Tan)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (dose : 0,6 g).
Saposhnikovia divaricata (Fang Feng)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (Dose : 0,3 g).
Scutellaria baicalensis (Huang Qin)	Hôpital de médecine chinoise de la province du Jiangsu	Promotion : 2409001	Herbe constitutive de LXDHD (Dose : 0,5 g).
Pentobarbital sodique (1 %)	Sigma-Aldrich	P3761	Utilisé pour l’anesthésie animale avant la collecte d’échantillons.
Logiciel SoftMax Pro	Dispositifs moléculaires	Version 7.1	Logiciels d’acquisition et d’analyse de données utilisés avec le lecteur de microplaques pour ELISA.
Base de données STRING	STRING Consortium	https://string-db.org/	Base de données utilisée pour les protéines & ndash ; analyse des interactions protéiques.
Base de données TCMSP	Plateforme TCMSP	https://tcmsp-e.com/	Base de données utilisée pour dépister les composés actifs et prédire les cibles médicamenteuses.
TNF-& alpha ; Kit ELISA (souris)	Abclonal	RK00027	Utilisé pour déterminer le TNF-et l’alpha sériques ; des concentrations.
Système Ultimate 3000 RS LC	Thermo Fisher Scientific	Ultimate 3000 RS	UHPLC couplé à la spectrométrie de masse.
Nettoyeur ultrasonore	Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd	KQ3200E	Utilisé pour l’extraction ultrasonique de LXDHD.
Base de données UniProt	UniProt Consortium	https://www.uniprot.org/	Base de données utilisée pour la standardisation des noms de gènes et de protéines.
Mélangeur à vortex	Beijing PowerStar Technology Co., Ltd	LC-Vortex-P1	Utilisé pour le mélange d’échantillons.
Colonne Welch AQ-C18 (150 et fois 2,1 mm, 1,8 et mu ; m)	Welch Materials	AQ-18-15021	Colonne utilisée pour la séparation des métabolites et des composants à base de plantes.
Xylène	Chengdu Cologne Chemicals Co., LTD	1330-20-7	Utilisé pour le déblaiement des tissus lors du traitement histologique.