Article de méthode

Mesure des cellules vivantes ARNm Dynamique traductionnelle par marquage luminescent fractionné dans des cellules HEK293

DOI :

10.3791/70840

⸱

14 août 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons une méthode souple, compatible avec un débit élevé, permettant de mesurer les dynamiques de traduction d'ARNm vivants dans des cellules HEK293 à l'aide d'un marquage luminescent divisé. Cet essai polyvalent distingue les effets structuraux, soutient l'optimisation de la transcription in vitro et accélère le développement de thérapeutiques à base d'ARNm.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement accéléré de vaccins contre la COVID-19 a illustré le potentiel des thérapies basées sur l'ARN messager (ARNm) à transformer le développement de médicaments. Comme l'ARNm mature, l'ARNm transcrit in vitro possède les mêmes éléments, notamment une coiffe en 5’, des régions non traduites (UTR), une séquence codante et une queue poly(A). Les études antérieures sur l'impact de ces composants sur la traduction de l'ARNm ont principalement utilisé des protéines rapporteuses fortement modifiées, qui présentent une traduction efficace et une grande stabilité protéique. Étant donné que les éléments structuraux de chaque ARNm influencent différemment leur traduction, il est essentiel d'identifier la conception optimale en fonction de la protéine thérapeutique d'intérêt (POI). Pour permettre la caractérisation de la traduction de la POI, un système de complémentation par luciférase divisée a été utilisé. Une courte étiquette peptidique (HiBiT), pouvant être fusionnée à l'une ou l'autre des extrémités de la POI, s'associe à son hétérodimère complémentaire (LgBiT) pour reconstituer une activité enzymatique en présence d'un substrat perméable aux cellules. À ce jour, le marquage par luminescence divisée a été principalement utilisé dans des études à haut débit sur le renouvellement des protéines. Nous avons précédemment montré comment ce marquage par luminescence divisée peut être utilisé pour quantifier de manière haut débit la traduction de l'ARNm dans le temps in cellulo dans des cellules HEK293 exprimant constitutivement l'hétérodimère complémentaire. Ici, nous démontrons davantage la polyvalence de ce test et détaillons comment il peut être utilisé pour optimiser la transcription in vitro et réduire les coûts. Ce système d'analyse permet de distinguer de manière unique les modifications des composants structuraux tout en mettant en évidence les effets de l'optimisation de la séquence codante à l'aide de gènes non modifiés. De plus, nous montrons qu'une réduction de 4 fois de la concentration de la coiffe en 5’ lors de la transcription in vitro conduit à une traduction équivalente in cellulo. Ces résultats illustrent comment le marquage par luminescence divisée peut être facilement intégré dans le flux de travail des thérapies à base d'ARNm, permettant de surveiller en temps réel la dynamique d'expression protéique induite par l'ARNm in cellulo, offrant ainsi une méthode souple pour faire progresser les thérapies fondées sur l'ARNm.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les applications thérapeutiques et de recherche de l'ARN messager (ARNm) se sont rapidement développées ces dernières années, portées par le succès des vaccins à ARNm1,2 et par la reconnaissance croissante de la polyvalence de l'ARN en tant que biomolécule programmable. Un défi central dans ce domaine réside dans la capacité à évaluer de manière quantitative et dynamique l'efficacité de la traduction de l'ARNm dans divers contextes. La méthode décrite ici – qui exploite un système de marquage luminescent divisé – fournit une plateforme souple et évolutible pour l'étude en temps réel de la traduction de l'ARNm in cellulo3. L'objectif global de cette méthode est de permettre aux chercheurs de mesurer comment les caractéristiques de séquence, les modifications chimiques et les éléments structuraux influencent la cinétique de traduction et le renouvellement ultérieur des protéines, offrant ainsi un outil puissant pour optimiser les constructions d'ARNm dans des applications thérapeutiques et fondamentales.

In vitro, l'ARNm transcrit reflète l'architecture essentielle des transcrits matures, intégrant une coiffe en 5′, des régions non traduites (UTR), une séquence codante et une queue poly(A), tout en incluant souvent des nucléotides modifiés afin de réduire l'immunogénicité4,5. De nombreuses études ont montré que chacun de ces éléments – isolément ou en combinaison – peut être conçu de manière à influencer fortement l'efficacité de la traduction et le rendement protéique6,7. Toutefois, la plupart des études antérieures se sont appuyées sur des protéines rapporteuses fortement optimisées telles que la protéine fluorescente verte (GFP)7, NanoLuc8 ou la protéine Spike du SARS-CoV-28,9, qui sont conçues pour être traduites avec une grande efficacité et produire des protéines très stables, et ne reflètent donc pas les défis rencontrés dans les contextes thérapeutiques. Étant donné que les ARNm thérapeutiques codent pour des protéines d'intérêt (POI) variées, chacune soumise à des contraintes structurales spécifiques et à une régulation dépendante du type cellulaire, les principes de conception qui maximisent la traduction pour un construct donné peuvent ne pas s'appliquer à un autre, comme cela a déjà été rapporté3. L'identification de la configuration optimale pour une POI thérapeutique donnée est donc essentielle et nécessite des méthodes capables d'évaluer de manière sensible et systématique la contribution de chaque caractéristique du transcrit à la production protéique.

Les méthodes axées sur le ribosome, telles que le profilage des polysomes, permettent de distinguer les fractions de traduction par centrifugation en gradient10, tandis que le profilage du ribosome (Ribo-séq) offre une résolution au niveau nucléotidique de l'occupation du ribosome, des sites d'initiation et des pauses11. À l'instar du Ribo-séq, d'autres approches basées sur le séquençage, comme le séquençage à haut débit de l'ARN isolé par immunoprécipitation après réticulation (HITS-CLIP) et la purification par affinité des ribosomes en cours de traduction (TRAP), caractérisent davantage la traduction des ARN associés aux protéines liant l'ARN ou aux ribosomes12. Bien que puissantes, ces techniques nécessitent une préparation complexe, un équipement spécialisé et une expertise informatique, ce qui les rend inadaptées au développement de thérapies par ARN messager à haut débit. L'immunoprécipitation des chaînes naissantes13 mesure l'efficacité de traduction à l'aide de protéines marquées par un étiquetage FLAG, immunoprécipitées à partir des ribosomes et quantifiées par transcription inverse quantitative suivie d'une réaction en chaîne par polymérase (qRT-PCR). Bien qu'adaptable aux ARN messagers thérapeutiques, ce dosage est laborieux, manque de résolution temporelle et n'est pas adapté aux applications à haut débit. Le système SunTag14 permet des mesures en temps réel de la production de synthèse protéique et de la régulation traductionnelle à partir de molécules d'ARN messager individuelles, fonctionnant grâce à l'interaction entre un fragment variable monoclonal (scFv) fusionné à la GFP et des répétitions en tandem d'un épitope peptidique. Ce système permet des mesures dynamiques de la traduction et de la localisation avec une résolution au niveau de l'ARN messager unique, et a donc été utilisé pour développer de nombreux systèmes de suivi des chaînes naissantes15,16. Toutefois, cette approche présente un faible débit et nécessite l'utilisation de microscopes à haute puissance.

Bien que le marquage de la protéine naissante soit inévitable, l'utilisation potentielle d'une petite étiquette peptidique dérivée de la luciférase NanoLuc a été identifiée pour rendre compte de la traduction de l'ARNm dans des cellules vivantes. La luciférase NanoLuc a été conçue de manière à être divisée en deux sous-unités, l'une petite de 11 acides aminés (HiBiT) et l'autre plus grande de 158 acides aminés (LgBiT), qui peuvent rapidement se dimeriser et, en présence de substrat, reconstituer une luciférase fonctionnelle17,18. Le système de marquage luminescent divisé présente plusieurs avantages clés pour l'étude de la dynamique des ARNm. Premièrement, la taille minimale de la petite sous-unité fusionnée à la protéine d'intérêt (POI) permet à la construction codée de rester aussi proche que possible de la protéine native. Étant donné que la longueur de la séquence codante peut directement influencer les rapports de traduction19, la réduction de la taille de l'étiquette améliore notre prédiction de la dynamique de traduction des ARNm synthétiques. Ce stratagème de marquage minimal permet crucialement la détection de différences de traduction induites par des variations synonymes de la séquence codante, permettant d'analyser l'efficacité traductionnelle indépendamment de la séquence ou de la stabilité de la protéine3. Pour cette raison, l'utilisation d'étiquettes plus volumineuses, telles que les protéines fluorescentes ou les luciférase entières, est sous-optimale. Deuxièmement, le système de marquage luminescent divisé utilisé ici permet une génération immédiate du signal. Sa réaction de complémentation rapide et efficace in cellulo présente une affinité élevée (KD = 700 pM) et a déjà permis de mesurer la modulation du renouvellement des protéines avec des relevés espacés de seulement 30 secondes18. Alors que le système initial de marquage luminescent divisé a principalement été comparé à d'autres systèmes de luciférase divisée17,18, son avantage principal dans ce contexte est que la génération du signal n'est pas limitée par la maturation de la protéine. En revanche, les protéines fluorescentes nécessitent une maturation du chromophore, un processus pouvant prendre de plusieurs minutes à plusieurs heures20, ce qui limite la résolution temporelle. Enfin, le système de marquage luminescent divisé utilisé ici surmonte les limitations des systèmes de protéines fluorescentes divisées, qui exigent généralement la formation du chromophore après complémentation21, introduisant ainsi un délai supplémentaire et limitant leur pertinence pour l'observation de processus rapides et dynamiques. Des études antérieures ont démontré l'utilité du marquage luminescent divisé dans les essais de renouvellement protéique et les études de dégradation22,23,24. L'extension de cette technologie éprouvée à la cinétique de traduction constitue un progrès méthodologique important. Par exemple, bien que le profilage des ribosomes permette de révéler la densité ribosomique le long des transcrits, il ne permet pas facilement de capturer les changements dynamiques des taux d'initiation ou d'élongation de la traduction dans différentes conditions. Comme illustré précédemment3, ce système de marquage luminescent divisé peut détecter des différences lors de modifications de la structure du capuchon, de la composition de la région non traduite 5′ (UTR), de l'optimisation des codons, des modifications des nucléotides ou de la longueur de la queue poly(A), tous facteurs déterminants critiques de l'efficacité de la traduction. Cette large applicabilité rend la méthode particulièrement puissante pour disséquer la contribution de chaque caractéristique individuelle de l'ARNm à la production protéique globale. Il convient de noter que, selon l'instrument utilisé, cette technologie permet d'acquérir des données au niveau de la cellule unique ou de la puits entier. Les plateformes d'imagerie capables de capturer des images basées sur la luminescence peuvent permettre d'utiliser cette technologie pour étudier la dynamique de traduction à l'échelle de la cellule unique. Ici, nous nous concentrons sur une application basée sur un lecteur de plaques, au niveau des puits, en raison de son débit moyen à élevé et de ses exigences minimales en matière d'analyse de données.

Les chercheurs envisageant cette méthode doivent évaluer son adéquation en fonction de leurs objectifs expérimentaux spécifiques. Le test est particulièrement utile dans les contextes nécessitant un criblage à haut débit de constructions d'ARNm synthétiques, comme dans les pipelines de conception de thérapeutiques basées sur l'ARNm. Il convient bien aux analyses comparatives des caractéristiques de séquence des ARNm synthétiques – notamment les régions non traduites, l'utilisation des codons ou les modifications des nucléotides – où de subtiles différences d'efficacité de traduction peuvent être détectées3. Étant donné que le système est compatible avec des plates-formes de traduction in vitro, des tests sur cellules vivantes et un test lytique spécifique à un point temporel, il offre une grande flexibilité aux chercheurs souhaitant adapter leur conception expérimentale à des études mécanistiques ou à des recherches appliquées. En même temps, il est important de reconnaître les limites de la technique. De manière cruciale, le test de marquage luminescent divisé ne permet pas de résoudre l'occupation des ribosomes, une capacité qui reste propre aux approches de cartographie des empreintes ribosomiques, et ne mesure pas directement la stabilité ou la dégradation de l'ARN, ce qui pourrait nécessiter des méthodes complémentaires. Toutefois, en raison des limites des techniques existantes centrées sur les ribosomes, les chercheurs dépendent de tests basés sur des marqueurs, comme le système de luminescence divisée, pour étudier l'expression protéique dirigée par l'ARNm au cours du temps comme proxy des dynamiques de traduction. Ainsi, bien que ce système constitue un outil puissant pour surveiller l'expression protéique induite par des ARNm synthétiques, son utilité dépend de savoir si la question de recherche porte sur la production protéique dynamique plutôt que sur le positionnement fin des ribosomes ou la dégradation de l'ARN.

En résumé, le système de marquage luminescent divisé représente une méthode puissante et polyvalente pour l'étude de la traduction des ARNm. Son objectif global est de fournir aux chercheurs un système souple, évolutif, à haut débit, capable de détecter les différences de production protéique résultant d'ARNm synthétiques présentant des éléments structuraux et de séquence variés3. La justification de son développement repose sur la nécessité de surmonter les limites des techniques existantes, en offrant des avantages en termes de sensibilité, d'évolutivité et de résolution temporelle. S'inscrivant dans le contexte plus large de la littérature sur la biologie et les thérapeutiques de l'ARN, cette méthode constitue un ajout précieux au répertoire expérimental, permettant à la fois des avancées fondamentales et translationnelles. En évaluant attentivement les forces et les limites de ce test, les chercheurs peuvent déterminer dans quelle mesure il convient à leurs applications spécifiques, maximisant ainsi son impact dans le domaine en rapide évolution des sciences de l'ARN.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une représentation graphique de l'ensemble du protocole est présentée dans la Figure 1.

1. Préparation du modèle pour la transcription in vitro (IVT)

REMARQUE : Pour préparer le modèle d'ADN pour la transcription in vitro (IVT), assurez-vous que l'ADN plasmidique contient un promoteur pour l'ARN polymérase (généralement T7 ou SP6), des UTR 5’ et 3’, ainsi que le cadre de lecture ouvert du gène d'intérêt (POI) (Figure 1).

  1. Linéariser l'ADN plasmidique à l'aide d'une enzyme de restriction possédant un site de coupure unique situé après la région UTR 3’ et préparer la réaction selon les instructions du fabricant. Après incubation, purifier la réaction de restriction à l’aide d’un kit de purification de l’ADN basé sur des colonnes centrifugeuses. Quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
  2. Pour confirmer la linéarisation, préparer un gel d’agarose TAE à 1 % contenant le colorant d’ADN bromure d’éthidium à 0,1 µg/mL. Mélanger 150 ng d’ADN digéré avec de l’eau et du tampon de charge. Charger sur le gel d’agarose l’échantillon, le plasmide non coupé et une règle de taille d’ADN, puis faire migrer le gel à 100 V pendant 40 minutes dans un tampon Tris-acétate-EDTA (TAE) 1×. Visualiser à l’aide d’un imager de gels.
    ATTENTION : La solution de bromure d’éthidium est un mutagène puissant et doit être manipulée avec précaution en utilisant des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés.
  3. Si l’ADN plasmidique ne possède pas de queue poly(A) immédiatement après la région UTR 3’, l’introduire par PCR. Réaliser la PCR selon les instructions du fabricant en utilisant une ADN polymérase haute fidélité et des amorces spécifiquement conçues. S’assurer que l’amplicon contient le promoteur T7, le cadre de lecture ouvert et une queue poly(A).
    REMARQUE : Certaines technologies de coiffage peuvent imposer des exigences spécifiques en séquence au niveau du promoteur T7 ; ces exigences peuvent être satisfaites par une conception appropriée de l’amorce avant. L’amorce arrière s’hybride à l’extrémité de la région UTR 3’ et introduit une queue poly(A) (longueur recommandée d’au moins 80 T). Pour les constructions riches en paires GC, une PCR en paliers et/ou l’ajout de 3 % de DMSO sont recommandés.
  4. Pour vérifier le succès de la PCR, préparer un gel d’agarose TAE contenant du bromure d’éthidium (voir étape 1.2). Si la taille du construit est ≥1 kb ou <1 kb, préparer respectivement un gel à 1 % ou à 2 %. Mélanger 5 µL du produit de PCR avec de l’eau et du tampon de charge. Charger sur le gel d’agarose l’échantillon et une règle de taille d’ADN, puis faire migrer à 100 V pendant 40 minutes dans du tampon TAE. Visualiser à l’aide d’un imager de gels.
  5. Après confirmation de la taille par PCR, purifier la réaction de PCR à l’aide d’un kit de purification de l’ADN basé sur des colonnes centrifugeuses. Éluer dans 15–20 µL de tampon d’élution (souvent fourni avec le kit de purification de l’ADN) ou dans de l’eau exempte de nucléase afin de concentrer le modèle d’ADN pour l’utilisation en transcription in vitro (IVT). Quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.

2. Transcription in vitro

  1. Avant de commencer, vaporisez et essuyez le plan de travail, les gants et les pipettes avec une solution de décontamination anti-RNase. Pour améliorer le rendement et la qualité, réalisez cette procédure dans un environnement de hotte stérile.
  2. Dégeler et assembler les composants d'un kit de transcription in vitro (IVT) basé sur T7 selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Certains fabricants recommandent l'utilisation de dithiothréitol (DTT, 0,1 M) afin de limiter l'oxydation de la réaction et d'améliorer son efficacité. Cette étape est recommandée lorsque cela est compatible avec le kit. Si des dNTP modifiés sont utilisés, remplacer le nucléotide non modifié équivalent par la même quantité de nucléotide modifié. Évaluer le rendement à partir d'une réaction demi-échelle, car aucune amélioration substantielle du rendement n'a été observée avec une réaction complète. Lors de la synthèse de plusieurs ARNm, il est recommandé de préparer un mélange maître afin de réduire les erreurs de pipetage et la variabilité.
  3. Pipeter soigneusement et mélanger brièvement, puis incuber à 37 °C pendant 5 h avec un couvercle chauffant pour éviter la condensation. Prolonger l'incubation toute la nuit si nécessaire, car cela a un effet minimal sur le rendement ou l'intégrité de l'ARNm.
  4. Ajouter 1 µL de DNase I et pipeter soigneusement. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
  5. Purification de in vitro ARN transcrit in vitro (IVT)
    1. Nettoyer la réaction d'IVT à l'aide d'un kit de purification de l'ARN basé sur colonne, conformément aux instructions du fabricant (différents kits peuvent entraîner des rendements variables et présenter des capacités de liaison différentes). Pour l'élution, ajouter 60 µL d'eau sans nucléase et incuber à température ambiante pendant 5 min avant la centrifugation.
    2. Alternativement, utilisez la précipitation par chlorure de lithium comme méthode moins coûteuse et plus souple.
      1. Ajouter un volume égal de chlorure de lithium 7,5 M à la réaction, mélanger et incuber à -20 °C toute la nuit.
      2. Centrifuger à 18 300 × g pendant 20 min à 4 °C, puis retirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot d'ARN.
      3. Laver avec 950 µL d'éthanol à 70 % et centrifuger à 18 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Éliminer le surnageant, laisser sécher le culot environ 5 min à température ambiante, puis resuspendre dans de l'eau sans nucléase (60 µL est la quantité standard ; réduire le volume en fonction de la taille du culot afin d'augmenter la concentration).
        ATTENTION : Le chlorure de lithium peut provoquer une irritation cutanée ou oculaire en l'absence d'équipements de protection individuelle (EPI) appropriés. Portez des gants et une protection oculaire lors de la manipulation. L'éthanol est un liquide hautement inflammable et peut provoquer une irritation oculaire. Maintenez-le à l'écart des flammes nues et portez des EPI adaptés, y compris une protection oculaire.
  6. Quantifiez l'ARNm à l'aide d'un spectrophotomètre. Vérifiez que le rapport A260/A280 de l'ARNm est d'environ 2,0 et confirmez que le rapport A260/A230 se situe entre 1,8 et 2,2.
  7. Pour confirmer une transcription in vitro (IVT) réussie, préparer un gel d'agarose à 1 % dans du tampon TAE (non dénaturant) contenant du bromure d'éthidium. Mélanger 500 ng d'ARNm avec de l'eau et du colorant de charge, puis suivre les instructions du fabricant pour la préparation de l'échelle d'ARN et les procédures de dénaturation. Charger le gel d'agarose et l'électrophoréser à 80 V pendant 40 minutes dans du tampon TAE. Visualiser à l'aide d'un système d'imagerie des gels.
  8. Pour une confirmation supplémentaire de la taille correcte de l'ARNm, analyser les échantillons sur un Bioanalyseur.
  9. Pour éviter les cycles de congélation-décongélation, aliquoter l'ARNm en volumes correspondant à ceux nécessaires pour l'expérience. Par exemple, utiliser 1,2 pmol d'ARNm par puits dans une plaque de 96 puits. Ainsi, aliquoter le volume approprié pour 1,2 pmol × n réplicats, puis conserver à -80 °C.

3. Transfection rétrograde des HEK293

REMARQUE : Pour effectuer des mesures temporelles, une lignée cellulaire exprimant de façon constitutive le fragment complémentaire de la luciférase est nécessaire. Cela peut être obtenu en créant une lignée cellulaire stable par transfection d'un plasmide exprimant le fragment de luciférase requis, suivie d'une sélection clonale. Cette approche permet à l'utilisateur de mesurer de manière résolue dans le temps la dynamique de traduction des ARNm dans n'importe quel contexte cellulaire souhaité. En alternative, des lignées cellulaires exprimant le fragment de luciférase requis peuvent être achetées. Ces expériences ont été réalisées à l'aide de cellules HEK293 exprimant de façon constitutive l'hétérodimère complémentaire.

  1. Avant de commencer, décongeler l'ARNm sur de la glace pour éviter sa dégradation.
  2. Préparer les complexes de transfection. Pour une plaque de 96 puits, 1,2 pmol d'ARNm est requis par puit. Si l'expérience est réalisée en duplicata, préparer suffisamment de complexe pour 2,5 duplicata afin de tenir compte des erreurs de pipetage. Ainsi, combiner 3 pmol d'ARNm avec du milieu Opti-MEM à faible teneur en sérum pour obtenir un volume final de 50 µL (20 µL/puit).
  3. Ajouter 0,5 µL de réactif de transfection à base de lipides cationiques (0,2 µL/puit), mélanger par aspiration et distribution répétées à l’aide d’une pipette, puis incuber à température ambiante. Après 5 minutes d'incubation, mélanger à nouveau par aspiration et distribution, puis ajouter 20 µL par puit dans une plaque micropuits blanche de 96 puits à fond plat. Il est recommandé de placer les puits de transfection au centre de la plaque, en laissant les puits périphériques vides.
  4. Préparer les cellules HEK293 en éliminant le milieu et en lavant avec 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca2+ et sans Mg2+. Retirer le liquide de lavage et ajouter 500 µL de trypsine-EDTA, puis incuber à 37 °C pendant 3 minutes.
  5. Pendant la dissociation cellulaire, remplir les puits périphériques de la plaque de 96 puits avec du PBS afin de réduire l'évaporation du milieu pendant la culture cellulaire. Si tous les puits sont nécessaires, la plaque peut être inondée de PBS entre les puits.
  6. Ajouter 4,5 mL de milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM) complété avec 1× de L-glutamine et 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) pour recueillir les cellules. Effectuer un dénombrement cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatique.
  7. Transférer la quantité requise de cellules (suffisante pour semer 1 × 105 cellules par puit) plus 3 puits supplémentaires (pour tenir compte des erreurs de pipetage) dans un tube neuf, puis centrifuger à 500 × g pendant 2 minutes.
  8. Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans le volume requis de milieu Leibovitz L-15 (sans phénol) complété avec 10 % de FBS et le substrat pour cellules vivantes Endurazine (1:200) afin d'obtenir une concentration finale de 1 × 106 cellules/mL. Mélanger à l’aide d’une pipette serologique pour assurer un mélange homogène de l’Endurazine. Ajouter 100 µL (1 × 105 cellules) de cellules resuspendues par puit.
    NOTE : Si des expériences cinétiques sur 72 h sont réalisées, augmenter le volume à 200 µL pour éviter l’évaporation.
  9. Immédiatement après la transfection, placer les cellules dans un lecteur de plaque (luminomètre) réglé à 37 °C. Effectuer des enregistrements à intervalles réguliers avec un temps d’intégration de 1 s. En raison de la complémentation efficace du système, le signal est détectable en quelques minutes. Par conséquent, pour obtenir une mesure de référence précise, cette étape doit être exécutée rapidement. Ces intervalles dépendent de l’expérience et de l’appareil utilisé ; toutefois, dans ces expériences, mesurer toutes les 12 minutes pour des cinétiques de 18 h, et toutes les 48 minutes pour des cinétiques de 72 h, s’est révélé optimal. La luminescence ne nécessite pas de filtre pour la mesure ; toutefois, un meilleur rapport signal/bruit a été observé lors de l’utilisation d’un filtre de 530–540 nm.
    NOTE : Un signal de transfert d'énergie par résonance de bioluminescence (BRET) est produit par la protéine eGFP marquée avec une luciférase fractionnée ; ainsi, un filtre de 530–540 nm captera à la fois un signal luminescent et un signal fluorescent. Pour éviter la détection du BRET, utiliser un filtre de 460–480 nm ou, de manière alternative, utiliser une protéine non fluorescente telle que MYL3 comme référence.

4. Analyse des données

  1. Calculer les variations d’expression en unités de luminescence relative (RLU) en normalisant le signal de chaque condition par rapport à son premier point temporel (t0, normalisé à la moyenne des réplicats techniques), puisque le signal au début du test correspond au niveau de fond.
  2. Réduire la variabilité entre les réplicats biologiques en normalisant par rapport à une condition témoin.
  3. Choisir l’analyse statistique adaptée au test, selon un point temporel unique ou l’aire sous la courbe (AUC), en fonction de la question posée.
    1. Pour un point temporel unique, utiliser les points temporels correspondant au pic d’expression (dépendant du POI) ainsi que le point final. Représenter graphiquement les RLU calculées à l’étape 4.1 pour le point temporel spécifique (par exemple, 240 min) et les analyser à l’aide d’un test statistique approprié.
    2. Évaluer la dynamique de la traduction et de la dégradation des protéines en calculant l’AUC sur une période définie (c’est-à-dire de t0 à 240 min) ou sur toute la durée du test (c’est-à-dire de t0 au point final). Normaliser la valeur d’AUC de chaque réplicat biologique par rapport à la moyenne de l’ARNm de référence, obtenant ainsi une mesure du changement d’expression en AUC qui peut être analysée à l’aide de tests statistiques appropriés.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il existe plusieurs façons d'optimiser le rapport coût-efficacité de ce protocole. Par exemple, la réaction de transcription in vitro (IVT) a été réduite à la moitié du volume recommandé par le fabricant, et il a été constaté que le rendement obtenu suffisait à couvrir la quantité nécessaire pour in cellulo expériences. Il convient de noter que la longueur et la complexité de la séquence influencent le rendement de la transcription in vitro (IVT), de sorte qu'une optimisation réussie du protocole devrait produire au moins 50 µg d'ARNm par réaction de TIV. Tout comme les kits de réaction de TIV, les réactifs de coiffage sont souvent très coûteux. Étant donné qu'un seul brin coiffé est nécessaire par molécule d'ARNm, nous émettons l'hypothèse qu'il y a un excès de molécules de coiffe dans la réaction de TIV par rapport au nombre final de molécules d'ARNm. Il a donc été étudié si le protocole pouvait être davantage optimisé en titrant la quantité de réactif de coiffage ajoutée à la réaction de TIV, dont les résultats sont présentés dans Figure 2. 100 % (10 mM de cap final), 50 %, 25 % ou 0 % (non capé) du réactif de capage a été ajouté à 10 µL Les réactions de transcription in vitro (IVT) et l'ARNm eGFP résultant ont été transfectés dans des cellules HEK293 exprimant constitutivement l'hétérodimère complémentaire. Comme témoin de normalisation, MYL3 (100 % coiffé) a également été transfecté, car ce gène endogène, qui code pour une protéine structurelle enrichie dans le muscle, présente des dynamiques de traduction similaires à celles de l'eGFP, tout en produisant un signal plus proche de celui d'autres gènes endogènes.3. Conformément aux données antérieures3, un ARNm eGFP non capé a entraîné une absence de traduction analogue au témoin sans traitement (Figure 2A). L'ARNm eGFP synthétisé avec 25 % ou 50 % du réactif de coiffage recommandé a montré des niveaux d'expression comparables à ceux obtenus avec 100 %Figure 2A), ce qui donne lieu à aucune différence au niveau des valeurs de la surface sous la courbe (AUC) au cours des 18 heuresFigure 2B). Ces résultats indiquent que, dans ces conditions, le réactif de capage est présent en excès et que la réduction de sa concentration n'altère pas le rendement traductionnel, ce qui est compatible avec une incorporation suffisante de l'enrichissement en « cap ». Les résultats présentés dans Figure 2 sont spécifiques à la marque du réactif de coiffage utilisé et doivent être optimisés en fonction des différents réactifs.

Bien que les progrès réalisés dans la technologie des coiffes et l'incorporation de nucléotides modifiés aient amélioré l'expression de l'ARNm, le développement d'algorithmes de conception d'ARNm a permis d'améliorer davantage cette expression. Ces algorithmes visent à optimiser la stabilité de l'ARNm et l'utilisation des codons en améliorant respectivement l'énergie libre minimale (MFE) et l'indice d'adaptabilité des codons (CAI). Afin d'évaluer l'effet de l'optimisation sur l'expression de l'ARNm, l'algorithme LinearDesign9 a été utilisé. Cet algorithme repose sur l'entrée d'une valeur lambda, un paramètre d'échelle utilisé dans les formules d'optimisation qui détermine dans quelle mesure l'algorithme privilégie la MFE ou le CAI. Les mêmes paramètres d'optimisation (c'est-à-dire la même valeur lambda) ont été appliqués à quatre facteurs de transcription – HAND2, GATA4, MEF2C et TBX5. La figure 3 examine les effets de l'optimisation sur les taux de traduction. L'optimisation a amélioré les valeurs de MFE et de CAI pour tous les facteurs de transcription, MEF2C présentant les changements les plus importants pour les deux paramètres (figure 3A). Une étiquette luminescente divisée a été fusionnée à l'extrémité C-terminale de chaque construction, précédée d'un lienur GS, et des ARNm ont été synthétisés pour les quatre facteurs de transcription, sous forme non optimisée et optimisée. Afin de s'assurer que chaque ARNm peut être traduit et produire une protéine de poids moléculaire attendu, un système de traduction in vitro à base de lysat de réticulocytes de lapin3 a été utilisé. Les protéines produites ont été séparées par immunotransfert en utilisant la sous-unité enzymatique de la protéine luciférase divisée et un substrat approprié pour détecter l'étiquette luminescente divisée. L'immunotransfert a montré que l'optimisation produisait toujours des protéines correspondant à leur poids moléculaire attendu (figure 3B). Des cellules HEK293 ont été transfectées avec les formes non optimisées ou optimisées de chacun des facteurs de transcription, et des enregistrements en temps réel ont été effectués pendant 18 h. Pour toutes les expériences de 18 h, des mesures issues de trois réplicats biologiques ont été réalisées, et trois réplicats techniques par échantillon ont été utilisés dans chaque expérience répétée. L'optimisation de HAND2 (figure 3C) et de GATA4 (figure 3D) n'a eu aucun effet sur l'expression (selon un test t non apparié à deux échantillons), avec respectivement une augmentation de 1,07 fois et une diminution de 1,25 fois par rapport à leurs homologues non optimisés. En revanche, l'optimisation de MEF2C (figure 3E) et de TBX5 (figure 3F) a entraîné une augmentation statistiquement significative de l'expression, avec une élévation de 2,25 fois (P = 0,0486, n = 3, test t non apparié à deux échantillons) et de 1,72 fois (P = 0,0379, n = 3, test t non apparié à deux échantillons) de l'ASC par rapport à leurs versions non optimisées respectives. Conformément à ces résultats, des différences sont observées non seulement au niveau de l'expression finale, mais aussi dans la forme et la vitesse des courbes d'expression, indiquant que le test permet de détecter des modifications des dynamiques de traduction au fil du temps. Afin de déterminer si cette augmentation de l'expression persiste sur une période plus longue, des cellules HEK293 ont été transfectées avec de l'ARNm MEF2C, et des enregistrements ont été effectués pendant 72 h (figure 3G). Comme pour les expériences de 18 h, des mesures issues de trois réplicats biologiques ont été prises, et trois réplicats techniques par échantillon ont été utilisés dans chaque expérience répétée. De manière similaire à ce qui a été observé après 18 h, l'optimisation de MEF2C a significativement augmenté l'expression, avec une amélioration de 2,5 fois (P = 0,0061, n = 3, test t non apparié à deux échantillons) de l'ASC par rapport à la version non optimisée. Bien qu'une augmentation substantielle de l'expression soit observée avec l'optimisation, ces résultats montrent que, dans ce cas, l'optimisation n'empêche pas la dégradation sur une période de 72 h, les deux formes de MEF2C présentant des pentes similaires à partir de 24 h. Cette dégradation est probablement due à la dégradation de l'ARNm linéaire et/ou à la division cellulaire. Dans leur ensemble, ces résultats démontrent le potentiel des algorithmes de conception d'ARNm à améliorer l'expression de l'ARNm ; toutefois, ils soulignent que l'optimisation doit être effectuée de manière dépendante du gène d'intérêt (POI).

figure-results-1
Figure 1 : Flux opérationnel pour la synthèse d'ARNm et le test de détection luminescente divisée dans des cellules HEK293. Pour réaliser la transcription in vitro (IVT) destinée au test de détection luminescente divisée, s'assurer que le plasmide contient un promoteur pour l'ARN polymérase (T7 ou SP6), des UTR 5’ et 3’, ainsi que la séquence codante pour la protéine d'intérêt fusionnée à une petite sous-unité de luciférase HB (HiBiT). Le plasmide est linéarisé à l'aide d'une enzyme de restriction à site unique, fournissant ainsi le modèle pour la PCR Poly T, qui servira ensuite de matrice pour la IVT. L'ARNm est synthétisé, complexé avec des liposomes, puis rétro-transféré dans des cellules HEK293 exprimant constitutivement la grande sous-unité de luciférase (LB), qui peuvent être immédiatement placées dans un lecteur de plaques pour des enregistrements en temps réel. Une fois l'expérience terminée, une analyse des données est effectuée afin de normaliser les résultats et réaliser une analyse statistique ultérieure. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Une réduction quadruple de la concentration du réactif de coiffage produit une expression comparable de l'eGFP par rapport à la concentration complète. (A) Essai cinétique sur cellules vivantes dans des cellules HEK293 transfectées par un ARNm eGFP avec différentes concentrations de réactif de coiffage, MYL3 ou contrôle sans traitement (Mock), les données étant normalisées à t0 ; chaque point représente la moyenne d'au moins trois réplicats biologiques par point temporel. (B) Le changement relatif de la surface sous la courbe (AUC) pour un suivi sur 18 heures, réalisé à partir d'au moins trois réplicats biologiques, a été obtenu en normalisant par rapport à l'échantillon de référence MYL3, puis comparé par ANOVA à un facteur suivi du test de comparaisons multiples de Tukey. Les données sont présentées comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (ESM), chaque point représentant la moyenne d'un réplicat biologique. ***P < 0,001. (eGFP – protéine fluorescente verte améliorée ; AUC – surface sous la courbe ; RLU – unités de luminiscence relative) Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : L'optimisation de la séquence améliore la traduction de l'ARNm de manière dépendante du facteur d'intérêt (POI). (A) L'optimisation de la séquence d'ARNm par LinearDesign a entraîné respectivement une diminution et une augmentation de l'énergie libre minimale (MFE) et de l'indice d'adaptation des codons (CAI) pour chaque facteur de transcription. (B) Des réactions de lysat réticulocytaire de lapin (RRL) ont été réalisées pendant 120 min avec des ARNm codant pour les versions non optimisées ou optimisées de HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5, ou sans ARN. Les protéines produites ont été analysées par immunobuvardage et détectées par chimiluminescence après incubation de la membrane avec la sous-unité enzymatique du système de luciférase divisée et le substrat approprié. Essai cinétique cellulaire en temps réel dans des cellules HEK293 transfectées avec HAND2 non optimisé ou optimisé (C), GATA4 (D), MEF2C (E) ou TBX5 (F), ainsi que MYL3 et Mock. Les données ont été normalisées à t0, et les points représentent la moyenne de trois réplicats biologiques par point temporel. Le changement d'expression (fold change) de l'aire sous la courbe (AUC) sur un suivi de 18 h pour trois réplicats biologiques a été obtenu en normalisant par rapport à l'échantillon de référence MYL3, puis comparé à l'aide d'un test t non apparié avec correction de Welch. Les données sont présentées comme moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM), chaque point représentant la moyenne d'un réplicat biologique. *P < 0,05. (G) Essai cinétique cellulaire en temps réel dans des cellules HEK293 transfectées avec MEF2C non optimisé ou optimisé, MYL3 et Mock ; les données ont été normalisées à t0, les points représentent la moyenne de trois réplicats biologiques par point temporel. Le changement d'expression (fold change) de l'aire sous la courbe (AUC) sur un suivi de 72 h pour trois réplicats biologiques a été obtenu en normalisant par rapport à l'échantillon de référence MYL3, puis comparé à l'aide d'un test t non apparié avec correction de Welch. Les données sont présentées comme moyenne ± SEM avec chaque point représentant la moyenne d'un réplicat biologique. **P < 0,01. (MFE – énergie libre minimale ; CAI – indice d'adaptation des codons ; RRL – lysat réticulocytaire de lapin ; AUC – aire sous la courbe ; RLU – unités de luminescence relative) Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le domaine des thérapeutiques à base d'ARNm s'est considérablement développé ces dernières années, soulignant l'importance de la conception et de l'optimisation des séquences comme étape cruciale dans le processus de développement. De nombreux efforts ont été consacrés à la création d'outils informatiques capables de prédire les structures et compositions d'ARN les plus efficaces, l'optimisation des séquences ayant particulièrement retenu l'attention8,9. Bien que ces outils soient puissants, la validation expérimentale de ces conceptions reste une étape essentielle du processus. Toutefois, cette validation s'est principalement appuyée sur des protéines rapporteuses, telles que la GFP7, la NanoLuc8 et la protéine Spike du SARS-CoV-29 , qui sont déjà des protéines extrêmement stables et hautement traduites. Pour surmonter cette limitation, un système de luciférase divisée a été intégré à un processus d'analyse afin d'étudier la dynamique de traduction d'ARNm transcrit in vitro dans des cellules HEK293, permettant ainsi une résolution temporelle3, et a mis en évidence les limites de l'utilisation de protéines rapporteuses pour détecter les modifications de traduction induites par l'ingénierie de l'ARNm. L'article décrivant cette méthode présente les étapes nécessaires pour réaliser ce test, montre que la réaction d'IVT peut être miniaturisée et que la concentration du capuchon 5’ peut être réduite sans conséquence sur la traduction, réduisant ainsi les coûts. En nous appuyant sur nos observations antérieures, nous soulignons qu'une approche dépendante de la protéine d'intérêt (POI) est nécessaire pour optimiser la séquence d'ARNm et obtenir une expression accrue.

Tel que décrit ici, le test à balise luminescente divisée constitue un protocole relativement simple permettant une mesure à débit moyen de la traduction de l'ARNm, offrant aux utilisateurs la possibilité d'étudier en temps réel l'expression temporelle de leur protéine d'intérêt (POI). Toutefois, plusieurs étapes critiques et considérations sont nécessaires pour obtenir des résultats robustes. Premièrement, tous les résultats en aval dépendent de la qualité de l'ARNm, qui débute par la transcription in vitro (IVT) et la décontamination du matériel utilisé à cet effet. Après la synthèse, le stockage de l'ARNm est essentiel : celui-ci doit être conservé sur glace après l'élution, et une fois la taille de l'ARNm confirmée, il est aliquoté en volumes de travail afin d'éviter les cycles de congélation-décongélation, puis stocké à -80 °C. Deuxièmement, le choix de la plaque 96 puits est d'une importance capitale et doit rester constant entre les expériences. Pour ce protocole, veillez à utiliser une plaque 96 puits entièrement blanche. Des plaques à fond transparent et parois blanches peuvent être utilisées si un suivi de la morphologie cellulaire est requis ; toutefois, ces dernières produisent un signal nettement plus faible, rendant les deux types de plaques non interchangeables. Il a été observé que, lors de la mesure de la traduction des mêmes ARNm dans une plaque à fond transparent et parois blanches, le signal luminescent obtenu était 5 fois inférieur à celui mesuré dans une plaque entièrement blanche en parallèle. Cette précision technique peut avoir un impact significatif lors de l'évaluation de gènes présentant une dynamique traductionnelle inefficace. Outre l'introduction d'incohérences dans les données, la réduction du signal pourrait empêcher la détection de différences subtiles induites par des modifications de la séquence ou de la structure de l'ARNm. Troisièmement, l'utilisation du milieu L-15 est essentielle dans ce test, car il permet de maintenir la viabilité cellulaire dans un environnement dépourvu d'apport en CO225, offrant ainsi une flexibilité quant au luminomètre utilisé. De plus, l'utilisation d'un milieu L-15 sans phénol réduit le signal de fond lors de la mesure de la luminescence. Enfin, la culture et la mesure de la luminescence doivent être effectuées à 37 °C (ou dans les conditions de culture adaptées au type cellulaire étudié). Réaliser cette expérience à température ambiante modifierait considérablement les résultats, car la vitesse d'élongation de la traduction serait réduite26, empêchant ainsi l'observation de cinétiques normales.

La polyvalence de in vitro La conception du ARNm transcrit peut être transférée au processus de synthèse, ce qui permet de nombreuses modifications. Comme observé, la concentration du cap 5’ peut être réduite de quatre fois tout en obtenant une expression comparable, permettant aux chercheurs de réduire les coûts. Bien que l'efficacité de coiffage n'ait pas été mesurée directement après la transcription in vitro (IVT), une proportion croissante d'ARNm non coiffés dans le pool d'IVT entraînerait une diminution du signal, comme le montre l'ARNm non coiffé ; ce phénomène n'a pas été observé. De plus, étant donné que l'eGFP est une protéine relativement petite de seulement 27 kDa, cette modulation de la concentration en cap devrait facilement s'appliquer à des gènes plus grands, car il y aura moins de transcrits à coiffer après l'IVT. Il existe plusieurs analogues du cap possédant différentes modifications de méthylation, qui influencent l'immunogénicité.3 et expression protéique27De plus, le processus de coiffage peut être réalisé de manière co-transcriptionnelle (comme démontré ici) ou post-transcriptionnellement à l’aide du virus de la vaccine, ce qui permet d’atteindre une efficacité de coiffage de 100 %.28 mais nécessite des étapes de purification supplémentaires. Pour la production d'ARNm à l'échelle du laboratoire, des colonnes de purification sont couramment utilisées car elles sont rapides et efficaces, mais coûteuses. Une approche moins coûteuse et plus polyvalente est la précipitation par chlorure de lithium, qui, bien qu'elle soit plus longue, permet de concentrer l'ARNm et n'impose pas de limite de rendement liée à la capacité de liaison de la colonne ; elle est donc adaptée à une montée en échelle. Comme les colonnes de purification, cette méthode n'élimine pas complètement l'ARN double brin et les fragments d'ARN tronqués, qui sont responsables de l'immunogénicité.29De façon similaire au « capuchon » 5’, l’ajout de la queue poly(A) peut être réalisé selon différentes méthodes alternatives à celle décrite ici. De manière analogue à l’introduction de la queue par PCR, l’ADN plasmidique peut être conçu pour contenir une queue poly(A) ; toutefois, ces longues séquences peuvent subir des recombinaisons, entraînant des séquences poly(A) hétérogènes et raccourcies. Toutefois, la segmentation poly(A) – l’insertion d’espacers hétéronucléotidiques – a permis de minimiser ces effets.30,31. Alternativement, la queue poly(A) peut être générée à l'aide d'une poly(A) polymérase indépendante du modèle, ce qui permet la synthèse de queues poly(A) plus longues32 mais au risque d'une hétérogénéité affectant les exigences réglementaires33.

Bien que le dosage par balise luminescente fractionnée décrit soit extrêmement efficace pour mesurer l'expression protéique d'ARNm exogènes, certaines limitations doivent être prises en compte selon la question de recherche. Premièrement, il est nécessaire de créer une lignée cellulaire exprimant de façon constitutive une moitié de la luciférase fractionnée. Bien que des lignées prêtes à l'emploi puissent être achetées, celles-ci sont actuellement limitées aux seules cellules HEK293. Si la génération d'une lignée stable dans le type cellulaire d'intérêt s'avère difficile, un dosage lytique existe et nous avons constaté qu'il produit le même résultat chez les HEK293, les cellules souches embryonnaires humaines et les cardiomyocytes différenciés3. Toutefois, le choix du point temporel pour ce dosage lytique, dans l'étude publiée précédemment3, s'appuyait sur les données obtenues avec les cellules HEK293 vivantes. Deuxièmement, ce dosage permet une résolution temporelle en cellules vivantes, mais ne fournit pas de résolution spatiale en cellules vivantes, ce qui pourrait intéresser certains chercheurs. Cependant, un anticorps primaire performant est disponible et fonctionne bien en immunocytochimie fluorescente contre la courte balise peptidique de luciférase utilisée dans ces expériences, permettant ainsi d'analyser la localisation du POI traduit. De plus, un microscope capable d'imagerie luminescente pourrait fournir des données avec une résolution au niveau cellulaire unique. Une approche offrant des informations spatiotemporelles est SunTag, qui mesure la traduction active et la localisation par imagerie en cellules vivantes, grâce aux interactions entre une protéine scFv marquée GFP se liant à des épitopes peptidiques14,34. Toutefois, 24 répétitions en tandem de ces épitopes sont nécessaires, ce qui pourrait potentiellement perturber la traduction, tandis que le flux opératoire présente un débit relativement faible. Troisièmement, la balise luminescente fractionnée permet de mesurer l'abondance d'ARNm, mais pas en cellules vivantes. Dans nos travaux antérieurs3, une qRT-PCR a été réalisée sur des ARN extraits à l'aide d'amorces spécifiques au transcrit exogène, confirmant ainsi les niveaux d'ARNm pour évaluer l'efficacité de transfection entre différents construits et la décroissance entre différents points temporels. Une autre approche a utilisé le Northern blotting pour mesurer la stabilité de l'ARNm35. Toutefois, ces deux approches sont laborieuses et ne permettent pas de mesures continues. À ce jour, aucune méthode ne permet de mesurer simultanément la traduction et l'abondance d'ARNm en cellules vivantes, ce qui constitue une piste potentielle pour améliorer le développement de dosages dans ce domaine.

Le système de luciférase séparée a été initialement utilisé pour étudier la dynamique des protéines, mais il apparaît ici que ce dosage a des implications majeures dans d'autres domaines de recherche. Alors que les thérapies basées sur l'ARNm sont au premier plan des nouvelles approches de thérapie génique, ce dosage est particulièrement adapté pour permettre aux chercheurs de caractériser l'expression de leurs candidats thérapeutiques potentiels et de l'optimiser afin d'améliorer cette expression. Comme mentionné précédemment, l'optimisation des codons est devenue un outil puissant dans la conception des ARNm avec le développement de plusieurs méthodes8,9,36. Lorsqu'une approche d'optimisation uniforme de la séquence a été appliquée à quatre facteurs de transcription, elle a amélioré à la fois l'énergie libre minimale (MFE) et l'indice d'usage des codons (CAI) pour tous les gènes, mais seule l'expression de MEF2C et de TBX5 a augmenté. Notamment, en permettant la détection de différences d'expression découlant uniquement de variations synonymes dans la séquence codante, cette approche fournit une plateforme unique pour étudier l'efficacité de la traduction dans des cellules vivantes avec une résolution temporelle élevée. Ces résultats montrent que l'optimisation de la séquence doit prendre en compte, de manière dépendante de la protéine d'intérêt (POI), la teneur initiale en GC, l'utilisation des codons et la structure secondaire de l'ARN afin d'obtenir une expression améliorée. Bien que davantage de constructions doivent probablement être testées, le dosage par balise luminescente séparée présente un potentiel pour des analyses à haut débit permettant d'identifier le candidat optimal pour la POI. De plus, comme indiqué précédemment3, ce dosage peut mesurer les effets de perturbations apportées à n'importe quelle séquence ou composant structural de l'ARNm, précisant davantage ses applications. En dehors de l'étude de modifications de l'ARNm, le dosage par balise luminescente séparée pourrait également être utilisé dans la recherche sur la délivrance et la formulation. Même avec des améliorations apportées aux caps 5’ et l'utilisation de nucléotides modifiés, l'ARNm exogène nécessite un système d'emballage pour éviter sa dégradation et favoriser sa prise en charge cellulaire37. Bien que les nanoparticules lipidiques38, les vésicules extracellulaires39 et les biomimétiques40 soient actuellement les principales technologies de délivrance de l'ARNm, des développements supplémentaires restent nécessaires. L'encapsulation d'ARNm marqué par une balise luminescente séparée dans l'un de ces vecteurs permettrait de caractériser leur efficacité de délivrance et d'évaluer des vecteurs modifiés de manière moyenne à haute performance. En dehors des recherches centrées sur la traduction, le dosage par balise luminescente séparée est facilement utilisable en biologie fondamentale. Que ce soit pour évaluer les effets de perturbations de séquences ou d'éléments structuraux sur la traduction de l'ARNm, pour interférer avec le fonctionnement du mécanisme de traduction ou pour sonder le protéasome, le système de marquage par balise luminescente séparée constitue une option intéressante.

Dans l'ensemble, le système de balisage luminescent divisé décrit ici offre un dosage souple et robuste permettant de suivre temporellement l'expression protéique dirigée par ARNm synthétique, en tant qu'indicateur des dynamiques de traduction. La mise en œuvre d'un dosage sur cellules vivantes permet de surmonter de nombreuses limitations antérieures dans le domaine de la traduction de l'ARNm et révèle des informations cruciales sur la dynamique de la synthèse protéique et la dégradation de la protéine d'intérêt (POI). Étant donné que les transcrits possèdent des profils régulatoires et d'expression différents, il est essentiel de caractériser la POI thérapeutique, ce qui permettra aux thérapeutiques basées sur l'ARNm de continuer à évoluer et de passer à la clinique.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont aucune incompatibilité d'intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient Laura Itzhaki pour la lignée cellulaire HEK293 LgBiT. Ce travail a été soutenu par une subvention de projet et une bourse de translation du British Heart Foundation (G114642 et G919651 attribuées à CHW) ainsi que par une subvention de recherche en sciences de la vie de GenScript (CAPB).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétiqueSigma-AldrichA6283Composant du tampon TAE
AgaroseSigma-AldrichA9539Électrophorèse sur gel
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BBioanalyseur utilisé pour le contrôle qualité de l'ARNm
CLARIOstar Plus LuminometerBMG Labtech430-501S-FLecteur de plaque/luminomètre utilisé pour mesurer la luminescence
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113Capuchon 5' utilisé pour la transcription in vitro (IVT)
DMEM, glucose élevé, pyruvateThermo Fisher Scientific41966029Milieu utilisé pour la culture des cellules HEK293-LgBiT
DNase INew England BiolabsM0303Dégrade le modèle d'ADN après la réaction d'IVT
Solution tampon phosphate salin de Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537Pour le lavage des cellules et l'ajout dans la plaque afin d'éviter l'évaporation
EDTA, pH 8,0, sans RNaseThermo Fisher ScientificAM9260Composant du tampon TAE
Bromure d'éthidiumSigma-AldrichE1510Colorant pour l'électrophorèse sur gel
Sérum de veau fœtal (FBS)Sigma-AldrichF7524Supplément ajouté au DMEM
Kit HiScribe T7 High Yield RNA SynthesisNew England BiolabsE2040Kit de transcription in vitro (IVT)
Milieu Leibovitz L-15, sans phénol rougeThermo Fisher Scientific21083027Milieu utilisé pour la culture des cellules HEK293-LgBiT pendant les mesures de luminescence
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-024Supplément ajouté au DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Réactif de transfection à base de lipides
Solution de précipitation au chlorure de lithiumThermo Fisher ScientificAM9480Approche alternative pour la purification de l'ARNm après la réaction d'IVT
Kit de purification Monarch Spin PCR & ADNNew England BiolabsT1130Kit de purification après linéarisation du plasmide
Spectrophotomètre UV-Vis microvolume NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WSpectrophotomètre utilisé pour quantifier la concentration d'ADN et d'ARNm
Substrat cellulaire vivant Nano-Glo EndurazinePromegaN2570Substrat nécessaire à la luminescence ajouté au milieu L-15 
Kit de purification NucleoSpin RNAMacherey-Nagel12708612Purifie l'ARNm après la réaction d'IVT
Plaque microplaque Nunc 96 puits, traitée Nunclon Delta, fond platThermo Fisher Scientific136101Plaque utilisée pour le semis des cellules HEK293-LgBiT et les mesures ultérieures
Milieu Opti-MEM à faible teneur en sérumThermo Fisher Scientific31985062Milieu utilisé pour la réaction de transfection
Kit de PCR haute fidélité PhusionNew England BiolabsE0553Kit de PCR
Échelle d'ARN RiboRuler à large gammeThermo Fisher Scientific11883993Échelle d'ARN pour l'électrophorèse sur gel
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020Spray de décontamination contre les RNases
Base TRIZMASigma-AldrichT6066Composant du tampon TAE
Solution de trypsine-EDTASigma-AldrichT4174Réactif de dissociation cellulaire
Eau distillée ultra-pure sans DNase ni RNaseThermo Fisher Scientific10977035Utilisée pour la préparation du modèle et pour l'IVT

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-2615.
  2. Baden LR et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2021;384(5):403-416.
  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  6. Sample PJ et al. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809.
  7. Leppek K et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536.
  8. Vostrosablin N et al. mRNAid, an open-source platform for therapeutic mRNA design and optimization strategies. NAR Genom Bioinform. 2024;6(1):lqae028.
  9. Zhang H et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 2023;621(7978):396-403.
  10. Chasse H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017;45(3):e15.
  11. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218-223.
  12. Choe HK, Cho J. Comprehensive genome-wide approaches to activity-dependent translational control in neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1592.
  13. Cacioppo R, Lindon C. Immunoprecipitation of reporter nascent chains from active ribosomes to study translation efficiency. Bio Protoc. 2023;13(18):e4821.
  14. Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014;159(3):635-646.
  15. Pichon X et al. Visualization of single endogenous polysomes reveals the dynamics of translation in live human cells. J Cell Biol. 2016;214(6):769-781.
  16. Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 2016;352(6292):1430-1435.
  17. Dixon AS et al. Nanoluc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem Biol. 2016;11(2):400-408.
  18. Schwinn MK et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chem Biol. 2018;13(2):467-474.
  19. Wang T et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Res. 2013;41(9):4743-4754.
  20. Balleza E, Kim JM, Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat Methods. 2018;15(1):47-51.
  21. Koker T, Fernandez A, Pinaud F. Characterization of split fluorescent protein variants and quantitative analyses of their self-assembly process. Sci Rep. 2018;8(1):5344.
  22. Hoare BL, Kocan M, Bruell S, Scott DJ, Bathgate RAD. Using the novel HiBiT tag to label cell surface relaxin receptors for BRET proximity analysis. Pharmacol Res Perspect. 2019;7(4):e00513.
  23. Boursier ME et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020;295(15):5124-5135.
  24. Winter GE et al. Drug development: Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381.
  25. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am J Hyg. 1963;78:173-180.
  26. Farewell A, Neidhardt FC. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;180(17):4704-4710.
  27. Mandell ZF et al. CleanCap M6 inhibits decapping of exogenously delivered IVT mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36(1):102456.
  28. Ensinger MJ, Martin SA, Paoletti E, Moss B. Modification of the 5'-terminus of mRNA by soluble guanylyl and methyl transferases from vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(7):2525-2529.
  29. Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive, and diverse in character RNA-seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9253-9263.
  30. Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA. 2019;25(4):507-518.
  31. Spiewla T et al. Poly(A) tail segmentation improves the stability of the template DNA and increases the translatability of &lt;em&gt;in vitro.&lt;/em&gt; transcribed mRNA. bioRxiv. 2025:2025.10.21.683660.
  32. Martin G, Keller W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 1998;4(2):226-230.
  33. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-281.
  34. Mateju D et al. Single-molecule imaging reveals translation of mRNAs localized to stress granules. Cell. 2020;183(7):1801-1812.e1813.
  35. Schwaller N, Karousis ED. Protocol for monitoring mRNA translation and degradation in human cell-free lysates. STAR Protoc. 2025;6(3):104073.
  36. Li Y et al. Deep generative optimization of mRNA codon sequences for enhanced mRNA translation and therapeutic efficacy. Nat Commun. 2025;16(1):9957.
  37. Pardi N et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015;217:345-351.
  38. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
  39. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020;367(6478).
  40. Yin M et al. Delivery of mRNA using biomimetic vectors: Progress and challenges. Small. 2024;20(43):e2402715.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Traduction de l ARNmimagerie sur cellules vivantestranscription in vitrodynamique d expression des prot inescompl mentation de la lucif raseoptimisation de la s quence codantemodification de la coiffe en 5th rapies base d ARNm

Articles connexes