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Article de méthode

Mesure des cellules vivantes ARNm Dynamique traductionnelle par marquage luminescent fractionné dans des cellules HEK293

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DOI :

10.3791/70840

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14 août 2026

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1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons une méthode souple, compatible avec un débit élevé, permettant de mesurer les dynamiques de traduction d'ARNm vivants dans des cellules HEK293 à l'aide d'un marquage luminescent divisé. Cet essai polyvalent distingue les effets structuraux, soutient l'optimisation de la transcription in vitro et accélère le développement de thérapeutiques à base d'ARNm.

Résumé

Le développement accéléré de vaccins contre la COVID-19 a illustré le potentiel des thérapies basées sur l'ARN messager (ARNm) à transformer le développement de médicaments. Comme l'ARNm mature, l'ARNm transcrit in vitro possède les mêmes éléments, notamment une coiffe en 5’, des régions non traduites (UTR), une séquence codante et une queue poly(A). Les études antérieures sur l'impact de ces composants sur la traduction de l'ARNm ont principalement utilisé des protéines rapporteuses fortement modifiées, qui présentent une traduction efficace et une grande stabilité protéique. Étant donné que les éléments structuraux de chaque ARNm influencent différemment leur traduction, il est essentiel d'identifier la conception optimale en fonction de la protéine thérapeutique d'intérêt (POI). Pour permettre la caractérisation de la traduction de la POI, un système de complémentation par luciférase divisée a été utilisé. Une courte étiquette peptidique (HiBiT), pouvant être fusionnée à l'une ou l'autre des extrémités de la POI, s'associe à son hétérodimère complémentaire (LgBiT) pour reconstituer une activité enzymatique en présence d'un substrat perméable aux cellules. À ce jour, le marquage par luminescence divisée a été principalement utilisé dans des études à haut débit sur le renouvellement des protéines. Nous avons précédemment montré comment ce marquage par luminescence divisée peut être utilisé pour quantifier de manière haut débit la traduction de l'ARNm dans le temps in cellulo dans des cellules HEK293 exprimant constitutivement l'hétérodimère complémentaire. Ici, nous démontrons davantage la polyvalence de ce test et détaillons comment il peut être utilisé pour optimiser la transcription in vitro et réduire les coûts. Ce système d'analyse permet de distinguer de manière unique les modifications des composants structuraux tout en mettant en évidence les effets de l'optimisation de la séquence codante à l'aide de gènes non modifiés. De plus, nous montrons qu'une réduction de 4 fois de la concentration de la coiffe en 5’ lors de la transcription in vitro conduit à une traduction équivalente in cellulo. Ces résultats illustrent comment le marquage par luminescence divisée peut être facilement intégré dans le flux de travail des thérapies à base d'ARNm, permettant de surveiller en temps réel la dynamique d'expression protéique induite par l'ARNm in cellulo, offrant ainsi une méthode souple pour faire progresser les thérapies fondées sur l'ARNm.

Introduction

Les applications thérapeutiques et de recherche de l'ARN messager (ARNm) se sont rapidement développées ces dernières années, portées par le succès des vaccins à ARNm1,2 et par la reconnaissance croissante de la polyvalence de l'ARN en tant que biomolécule programmable. Un défi central dans ce domaine réside dans la capacité à évaluer de manière quantitative et dynamique l'efficacité de la traduction de l'ARNm dans divers contextes. La méthode décrite ici – qui exploite un système de marquage luminescent divisé – fournit une plateforme souple et évolutible pour l'étude en temps réel de la traduction de l'ARNm in cellulo3. L'objectif global de cette méthode est de permettre aux chercheurs de mesurer comment les caractéristiques de séquence, les modifications chimiques et les éléments structuraux influencent la cinétique de traduction et le renouvellement ultérieur des protéines, offrant ainsi un outil puissant pour optimiser les constructions d'ARNm dans des applications thérapeutiques et fondamentales.

In vitro, l'ARNm transcrit reflète l'architecture essentielle des transcrits matures, intégrant une coiffe en 5′, des régions non traduites (UTR), une séquence codante et une queue poly(A), tout en incluant souvent des nucléotides modifiés afin de réduire l'immunogénicité4,5. De nombreuses études ont montré que chacun de ces éléments – isolément ou en combinaison – peut être conçu de manière à influencer fortement l'efficacité de la traduction et le rendement protéique6,7. Toutefois, la plupart des études antérieures se sont appuyées sur des protéines rapporteuses fortement optimisées telles que la protéine fluorescente verte (GFP)7, NanoLuc8 ou la protéine Spike du SARS-CoV-28,9, qui sont conçues pour être traduites avec une grande efficacité et produire des protéines très stables, et ne reflètent donc pas les défis rencontrés dans les contextes thérapeutiques. Étant donné que les ARNm thérapeutiques codent pour des protéines d'intérêt (POI) variées, chacune soumise à des contraintes structurales spécifiques et à une régulation dépendante du type cellulaire, les principes de conception qui maximisent la traduction pour un construct donné peuvent ne pas s'appliquer à un autre, comme cela a déjà été rapporté3. L'identification de la configuration optimale pour une POI thérapeutique donnée est donc essentielle et nécessite des méthodes capables d'évaluer de manière sensible et systématique la contribution de chaque caractéristique du transcrit à la production protéique.

Les méthodes axées sur le ribosome, telles que le profilage des polysomes, permettent de distinguer les fractions de traduction par centrifugation en gradient10, tandis que le profilage du ribosome (Ribo-séq) offre une résolution au niveau nucléotidique de l'occupation du ribosome, des sites d'initiation et des pauses11. À l'instar du Ribo-séq, d'autres approches basées sur le séquençage, comme le séquençage à haut débit de l'ARN isolé par immunoprécipitation après réticulation (HITS-CLIP) et la purification par affinité des ribosomes en cours de traduction (TRAP), caractérisent davantage la traduction des ARN associés aux protéines liant l'ARN ou aux ribosomes12. Bien que puissantes, ces techniques nécessitent une préparation complexe, un équipement spécialisé et une expertise informatique, ce qui les rend inadaptées au développement de thérapies par ARN messager à haut débit. L'immunoprécipitation des chaînes naissantes13 mesure l'efficacité de traduction à l'aide de protéines marquées par un étiquetage FLAG, immunoprécipitées à partir des ribosomes et quantifiées par transcription inverse quantitative suivie d'une réaction en chaîne par polymérase (qRT-PCR). Bien qu'adaptable aux ARN messagers thérapeutiques, ce dosage est laborieux, manque de résolution temporelle et n'est pas adapté aux applications à haut débit. Le système SunTag14 permet des mesures en temps réel de la production de synthèse protéique et de la régulation traductionnelle à partir de molécules d'ARN messager individuelles, fonctionnant grâce à l'interaction entre un fragment variable monoclonal (scFv) fusionné à la GFP et des répétitions en tandem d'un épitope peptidique. Ce système permet des mesures dynamiques de la traduction et de la localisation avec une résolution au niveau de l'ARN messager unique, et a donc été utilisé pour développer de nombreux systèmes de suivi des chaînes naissantes15,16. Toutefois, cette approche présente un faible débit et nécessite l'utilisation de microscopes à haute puissance.

Bien que le marquage de la protéine naissante soit inévitable, l'utilisation potentielle d'une petite étiquette peptidique dérivée de la luciférase NanoLuc a été identifiée pour rendre compte de la traduction de l'ARNm dans des cellules vivantes. La luciférase NanoLuc a été conçue de manière à être divisée en deux sous-unités, l'une petite de 11 acides aminés (HiBiT) et l'autre plus grande de 158 acides aminés (LgBiT), qui peuvent rapidement se dimeriser et, en présence de substrat, reconstituer une luciférase fonctionnelle17,18. Le système de marquage luminescent divisé présente plusieurs avantages clés pour l'étude de la dynamique des ARNm. Premièrement, la taille minimale de la petite sous-unité fusionnée à la protéine d'intérêt (POI) permet à la construction codée de rester aussi proche que possible de la protéine native. Étant donné que la longueur de la séquence codante peut directement influencer les rapports de traduction19, la réduction de la taille de l'étiquette améliore notre prédiction de la dynamique de traduction des ARNm synthétiques. Ce stratagème de marquage minimal permet crucialement la détection de différences de traduction induites par des variations synonymes de la séquence codante, permettant d'analyser l'efficacité traductionnelle indépendamment de la séquence ou de la stabilité de la protéine3. Pour cette raison, l'utilisation d'étiquettes plus volumineuses, telles que les protéines fluorescentes ou les luciférase entières, est sous-optimale. Deuxièmement, le système de marquage luminescent divisé utilisé ici permet une génération immédiate du signal. Sa réaction de complémentation rapide et efficace in cellulo présente une affinité élevée (KD = 700 pM) et a déjà permis de mesurer la modulation du renouvellement des protéines avec des relevés espacés de seulement 30 secondes18. Alors que le système initial de marquage luminescent divisé a principalement été comparé à d'autres systèmes de luciférase divisée17,18, son avantage principal dans ce contexte est que la génération du signal n'est pas limitée par la maturation de la protéine. En revanche, les protéines fluorescentes nécessitent une maturation du chromophore, un processus pouvant prendre de plusieurs minutes à plusieurs heures20, ce qui limite la résolution temporelle. Enfin, le système de marquage luminescent divisé utilisé ici surmonte les limitations des systèmes de protéines fluorescentes divisées, qui exigent généralement la formation du chromophore après complémentation21, introduisant ainsi un délai supplémentaire et limitant leur pertinence pour l'observation de processus rapides et dynamiques. Des études antérieures ont démontré l'utilité du marquage luminescent divisé dans les essais de renouvellement protéique et les études de dégradation22,23,24. L'extension de cette technologie éprouvée à la cinétique de traduction constitue un progrès méthodologique important. Par exemple, bien que le profilage des ribosomes permette de révéler la densité ribosomique le long des transcrits, il ne permet pas facilement de capturer les changements dynamiques des taux d'initiation ou d'élongation de la traduction dans différentes conditions. Comme illustré précédemment3, ce système de marquage luminescent divisé peut détecter des différences lors de modifications de la structure du capuchon, de la composition de la région non traduite 5′ (UTR), de l'optimisation des codons, des modifications des nucléotides ou de la longueur de la queue poly(A), tous facteurs déterminants critiques de l'efficacité de la traduction. Cette large applicabilité rend la méthode particulièrement puissante pour disséquer la contribution de chaque caractéristique individuelle de l'ARNm à la production protéique globale. Il convient de noter que, selon l'instrument utilisé, cette technologie permet d'acquérir des données au niveau de la cellule unique ou de la puits entier. Les plateformes d'imagerie capables de capturer des images basées sur la luminescence peuvent permettre d'utiliser cette technologie pour étudier la dynamique de traduction à l'échelle de la cellule unique. Ici, nous nous concentrons sur une application basée sur un lecteur de plaques, au niveau des puits, en raison de son débit moyen à élevé et de ses exigences minimales en matière d'analyse de données.

Les chercheurs envisageant cette méthode doivent évaluer son adéquation en fonction de leurs objectifs expérimentaux spécifiques. Le test est particulièrement utile dans les contextes nécessitant un criblage à haut débit de constructions d'ARNm synthétiques, comme dans les pipelines de conception de thérapeutiques basées sur l'ARNm. Il convient bien aux analyses comparatives des caractéristiques de séquence des ARNm synthétiques – notamment les régions non traduites, l'utilisation des codons ou les modifications des nucléotides – où de subtiles différences d'efficacité de traduction peuvent être détectées3. Étant donné que le système est compatible avec des plates-formes de traduction in vitro, des tests sur cellules vivantes et un test lytique spécifique à un point temporel, il offre une grande flexibilité aux chercheurs souhaitant adapter leur conception expérimentale à des études mécanistiques ou à des recherches appliquées. En même temps, il est important de reconnaître les limites de la technique. De manière cruciale, le test de marquage luminescent divisé ne permet pas de résoudre l'occupation des ribosomes, une capacité qui reste propre aux approches de cartographie des empreintes ribosomiques, et ne mesure pas directement la stabilité ou la dégradation de l'ARN, ce qui pourrait nécessiter des méthodes complémentaires. Toutefois, en raison des limites des techniques existantes centrées sur les ribosomes, les chercheurs dépendent de tests basés sur des marqueurs, comme le système de luminescence divisée, pour étudier l'expression protéique dirigée par l'ARNm au cours du temps comme proxy des dynamiques de traduction. Ainsi, bien que ce système constitue un outil puissant pour surveiller l'expression protéique induite par des ARNm synthétiques, son utilité dépend de savoir si la question de recherche porte sur la production protéique dynamique plutôt que sur le positionnement fin des ribosomes ou la dégradation de l'ARN.

En résumé, le système de marquage luminescent divisé représente une méthode puissante et polyvalente pour l'étude de la traduction des ARNm. Son objectif global est de fournir aux chercheurs un système souple, évolutif, à haut débit, capable de détecter les différences de production protéique résultant d'ARNm synthétiques présentant des éléments structuraux et de séquence variés3. La justification de son développement repose sur la nécessité de surmonter les limites des techniques existantes, en offrant des avantages en termes de sensibilité, d'évolutivité et de résolution temporelle. S'inscrivant dans le contexte plus large de la littérature sur la biologie et les thérapeutiques de l'ARN, cette méthode constitue un ajout précieux au répertoire expérimental, permettant à la fois des avancées fondamentales et translationnelles. En évaluant attentivement les forces et les limites de ce test, les chercheurs peuvent déterminer dans quelle mesure il convient à leurs applications spécifiques, maximisant ainsi son impact dans le domaine en rapide évolution des sciences de l'ARN.

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Protocole

Une représentation graphique de l'ensemble du protocole est présentée dans la Figure 1.

1. Préparation du modèle pour la transcription in vitro (IVT)

REMARQUE : Pour préparer le modèle d'ADN pour la transcription in vitro (IVT), assurez-vous que l'ADN plasmidique contient un promoteur pour l'ARN polymérase (généralement T7 ou SP6), des UTR 5’ et 3’, ainsi que le cadre de lecture ouvert du gène d'intérêt (POI) (Figure 1).

  1. Linéariser l'ADN plasmidique à l'aide d'une enzyme de restriction possédant un site de coupure unique situé après la région UTR 3’ et préparer la réaction selon les instructions du fabricant. Après incubation, purifier la réaction de restriction à l’aide d’un kit de purification de l’ADN basé sur des colonnes centrifugeuses. Quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
  2. Pour confirmer la linéarisation, préparer un gel d’agarose TAE à 1 % contenant le colorant d’ADN bromure d’éthidium à 0,1 µg/mL. Mélanger 150 ng d’ADN digéré avec de l’eau et du tampon de charge. Charger sur le gel d’agarose l’échantillon, le plasmide non coupé et une règle de taille d’ADN, puis faire migrer le gel à 100 V pendant 40 minutes dans un tampon Tris-acétate-EDTA (TAE) 1×. Visualiser à l’aide d’un imager de gels.
    ATTENTION : La solution de bromure d’éthidium est un mutagène puissant et doit être manipulée avec précaution en utilisant des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés.
  3. Si l’ADN plasmidique ne possède pas de queue poly(A) immédiatement après la région UTR 3’, l’introduire par PCR. Réaliser la PCR selon les instructions du fabricant en utilisant une ADN polymérase haute fidélité et des amorces spécifiquement conçues. S’assurer que l’amplicon contient le promoteur T7, le cadre de lecture ouvert et une queue poly(A).
    REMARQUE : Certaines technologies de coiffage peuvent imposer des exigences spécifiques en séquence au niveau du promoteur T7 ; ces exigences peuvent être satisfaites par une conception appropriée de l’amorce avant. L’amorce arrière s’hybride à l’extrémité de la région UTR 3’ et introduit une queue poly(A) (longueur recommandée d’au moins 80 T). Pour les constructions riches en paires GC, une PCR en paliers et/ou l’ajout de 3 % de DMSO sont recommandés.
  4. Pour vérifier le succès de la PCR, préparer un gel d’agarose TAE contenant du bromure d’éthidium (voir étape 1.2). Si la taille du construit est ≥1 kb ou <1 kb, préparer respectivement un gel à 1 % ou à 2 %. Mélanger 5 µL du produit de PCR avec de l’eau et du tampon de charge. Charger sur le gel d’agarose l’échantillon et une règle de taille d’ADN, puis faire migrer à 100 V pendant 40 minutes dans du tampon TAE. Visualiser à l’aide d’un imager de gels.
  5. Après confirmation de la taille par PCR, purifier la réaction de PCR à l’aide d’un kit de purification de l’ADN basé sur des colonnes centrifugeuses. Éluer dans 15–20 µL de tampon d’élution (souvent fourni avec le kit de purification de l’ADN) ou dans de l’eau exempte de nucléase afin de concentrer le modèle d’ADN pour l’utilisation en transcription in vitro (IVT). Quantifier l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.

2. Transcription in vitro

  1. Avant de commencer, vaporisez et essuyez le plan de travail, les gants et les pipettes avec une solution de décontamination anti-RNase. Pour améliorer le rendement et la qualité, réalisez cette procédure dans un environnement de hotte stérile.
  2. Dégeler et assembler les composants d'un kit de transcription in vitro (IVT) basé sur T7 selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Certains fabricants recommandent l'utilisation de dithiothréitol (DTT, 0,1 M) afin de limiter l'oxydation de la réaction et d'améliorer son efficacité. Cette étape est recommandée lorsque cela est compatible avec le kit. Si des dNTP modifiés sont utilisés, remplacer le nucléotide non modifié équivalent par la même quantité de nucléotide modifié. Évaluer le rendement à partir d'une réaction demi-échelle, car aucune amélioration substantielle du rendement n'a été observée avec une réaction complète. Lors de la synthèse de plusieurs ARNm, il est recommandé de préparer un mélange maître afin de réduire les erreurs de pipetage et la variabilité.
  3. Pipeter soigneusement et mélanger brièvement, puis incuber à 37 °C pendant 5 h avec un couvercle chauffant pour éviter la condensation. Prolonger l'incubation toute la nuit si nécessaire, car cela a un effet minimal sur le rendement ou l'intégrité de l'ARNm.
  4. Ajouter 1 µL de DNase I et pipeter soigneusement. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
  5. Purification de in vitro ARN transcrit in vitro (IVT)
    1. Nettoyer la réaction d'IVT à l'aide d'un kit de purification de l'ARN basé sur colonne, conformément aux instructions du fabricant (différents kits peuvent entraîner des rendements variables et présenter des capacités de liaison différentes). Pour l'élution, ajouter 60 µL d'eau sans nucléase et incuber à température ambiante pendant 5 min avant la centrifugation.
    2. Alternativement, utilisez la précipitation par chlorure de lithium comme méthode moins coûteuse et plus souple.
      1. Ajouter un volume égal de chlorure de lithium 7,5 M à la réaction, mélanger et incuber à -20 °C toute la nuit.
      2. Centrifuger à 18 300 × g pendant 20 min à 4 °C, puis retirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot d'ARN.
      3. Laver avec 950 µL d'éthanol à 70 % et centrifuger à 18 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Éliminer le surnageant, laisser sécher le culot environ 5 min à température ambiante, puis resuspendre dans de l'eau sans nucléase (60 µL est la quantité standard ; réduire le volume en fonction de la taille du culot afin d'augmenter la concentration).
        ATTENTION : Le chlorure de lithium peut provoquer une irritation cutanée ou oculaire en l'absence d'équipements de protection individuelle (EPI) appropriés. Portez des gants et une protection oculaire lors de la manipulation. L'éthanol est un liquide hautement inflammable et peut provoquer une irritation oculaire. Maintenez-le à l'écart des flammes nues et portez des EPI adaptés, y compris une protection oculaire.
  6. Quantifiez l'ARNm à l'aide d'un spectrophotomètre. Vérifiez que le rapport A260/A280 de l'ARNm est d'environ 2,0 et confirmez que le rapport A260/A230 se situe entre 1,8 et 2,2.
  7. Pour confirmer une transcription in vitro (IVT) réussie, préparer un gel d'agarose à 1 % dans du tampon TAE (non dénaturant) contenant du bromure d'éthidium. Mélanger 500 ng d'ARNm avec de l'eau et du colorant de charge, puis suivre les instructions du fabricant pour la préparation de l'échelle d'ARN et les procédures de dénaturation. Charger le gel d'agarose et l'électrophoréser à 80 V pendant 40 minutes dans du tampon TAE. Visualiser à l'aide d'un système d'imagerie des gels.
  8. Pour une confirmation supplémentaire de la taille correcte de l'ARNm, analyser les échantillons sur un Bioanalyseur.
  9. Pour éviter les cycles de congélation-décongélation, aliquoter l'ARNm en volumes correspondant à ceux nécessaires pour l'expérience. Par exemple, utiliser 1,2 pmol d'ARNm par puits dans une plaque de 96 puits. Ainsi, aliquoter le volume approprié pour 1,2 pmol × n réplicats, puis conserver à -80 °C.

3. Transfection rétrograde des HEK293

REMARQUE : Pour effectuer des mesures temporelles, une lignée cellulaire exprimant de façon constitutive le fragment complémentaire de la luciférase est nécessaire. Cela peut être obtenu en créant une lignée cellulaire stable par transfection d'un plasmide exprimant le fragment de luciférase requis, suivie d'une sélection clonale. Cette approche permet à l'utilisateur de mesurer de manière résolue dans le temps la dynamique de traduction des ARNm dans n'importe quel contexte cellulaire souhaité. En alternative, des lignées cellulaires exprimant le fragment de luciférase requis peuvent être achetées. Ces expériences ont été réalisées à l'aide de cellules HEK293 exprimant de façon constitutive l'hétérodimère complémentaire.

  1. Avant de commencer, décongeler l'ARNm sur de la glace pour éviter sa dégradation.
  2. Préparer les complexes de transfection. Pour une plaque de 96 puits, 1,2 pmol d'ARNm est requis par puit. Si l'expérience est réalisée en duplicata, préparer suffisamment de complexe pour 2,5 duplicata afin de tenir compte des erreurs de pipetage. Ainsi, combiner 3 pmol d'ARNm avec du milieu Opti-MEM à faible teneur en sérum pour obtenir un volume final de 50 µL (20 µL/puit).
  3. Ajouter 0,5 µL de réactif de transfection à base de lipides cationiques (0,2 µL/puit), mélanger par aspiration et distribution répétées à l’aide d’une pipette, puis incuber à température ambiante. Après 5 minutes d'incubation, mélanger à nouveau par aspiration et distribution, puis ajouter 20 µL par puit dans une plaque micropuits blanche de 96 puits à fond plat. Il est recommandé de placer les puits de transfection au centre de la plaque, en laissant les puits périphériques vides.
  4. Préparer les cellules HEK293 en éliminant le milieu et en lavant avec 2 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca2+ et sans Mg2+. Retirer le liquide de lavage et ajouter 500 µL de trypsine-EDTA, puis incuber à 37 °C pendant 3 minutes.
  5. Pendant la dissociation cellulaire, remplir les puits périphériques de la plaque de 96 puits avec du PBS afin de réduire l'évaporation du milieu pendant la culture cellulaire. Si tous les puits sont nécessaires, la plaque peut être inondée de PBS entre les puits.
  6. Ajouter 4,5 mL de milieu de culture de Dulbecco modifié (DMEM) complété avec 1× de L-glutamine et 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) pour recueillir les cellules. Effectuer un dénombrement cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatique.
  7. Transférer la quantité requise de cellules (suffisante pour semer 1 × 105 cellules par puit) plus 3 puits supplémentaires (pour tenir compte des erreurs de pipetage) dans un tube neuf, puis centrifuger à 500 × g pendant 2 minutes.
  8. Éliminer le surnageant et resuspendre les cellules dans le volume requis de milieu Leibovitz L-15 (sans phénol) complété avec 10 % de FBS et le substrat pour cellules vivantes Endurazine (1:200) afin d'obtenir une concentration finale de 1 × 106 cellules/mL. Mélanger à l’aide d’une pipette serologique pour assurer un mélange homogène de l’Endurazine. Ajouter 100 µL (1 × 105 cellules) de cellules resuspendues par puit.
    NOTE : Si des expériences cinétiques sur 72 h sont réalisées, augmenter le volume à 200 µL pour éviter l’évaporation.
  9. Immédiatement après la transfection, placer les cellules dans un lecteur de plaque (luminomètre) réglé à 37 °C. Effectuer des enregistrements à intervalles réguliers avec un temps d’intégration de 1 s. En raison de la complémentation efficace du système, le signal est détectable en quelques minutes. Par conséquent, pour obtenir une mesure de référence précise, cette étape doit être exécutée rapidement. Ces intervalles dépendent de l’expérience et de l’appareil utilisé ; toutefois, dans ces expériences, mesurer toutes les 12 minutes pour des cinétiques de 18 h, et toutes les 48 minutes pour des cinétiques de 72 h, s’est révélé optimal. La luminescence ne nécessite pas de filtre pour la mesure ; toutefois, un meilleur rapport signal/bruit a été observé lors de l’utilisation d’un filtre de 530–540 nm.
    NOTE : Un signal de transfert d'énergie par résonance de bioluminescence (BRET) est produit par la protéine eGFP marquée avec une luciférase fractionnée ; ainsi, un filtre de 530–540 nm captera à la fois un signal luminescent et un signal fluorescent. Pour éviter la détection du BRET, utiliser un filtre de 460–480 nm ou, de manière alternative, utiliser une protéine non fluorescente telle que MYL3 comme référence.

4. Analyse des données

  1. Calculer les variations d’expression en unités de luminescence relative (RLU) en normalisant le signal de chaque condition par rapport à son premier point temporel (t0, normalisé à la moyenne des réplicats techniques), puisque le signal au début du test correspond au niveau de fond.
  2. Réduire la variabilité entre les réplicats biologiques en normalisant par rapport à une condition témoin.
  3. Choisir l’analyse statistique adaptée au test, selon un point temporel unique ou l’aire sous la courbe (AUC), en fonction de la question posée.
    1. Pour un point temporel unique, utiliser les points temporels correspondant au pic d’expression (dépendant du POI) ainsi que le point final. Représenter graphiquement les RLU calculées à l’étape 4.1 pour le point temporel spécifique (par exemple, 240 min) et les analyser à l’aide d’un test statistique approprié.
    2. Évaluer la dynamique de la traduction et de la dégradation des protéines en calculant l’AUC sur une période définie (c’est-à-dire de t0 à 240 min) ou sur toute la durée du test (c’est-à-dire de t0 au point final). Normaliser la valeur d’AUC de chaque réplicat biologique par rapport à la moyenne de l’ARNm de référence, obtenant ainsi une mesure du changement d’expression en AUC qui peut être analysée à l’aide de tests statistiques appropriés.

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Résultats

Il existe plusieurs façons d'optimiser le rapport coût-efficacité de ce protocole. Par exemple, la réaction de transcription in vitro (IVT) a été réduite à la moitié du volume recommandé par le fabricant, et il a été constaté que le rendement obtenu suffisait à couvrir la quantité nécessaire pour in cellulo expériences. Il convient de noter que la longueur et la complexité de la séquence influencent le rendement de la transcription in vitro (IVT), de sorte qu'une optimisation réussie du protocole devrait produir...

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Discussion

Le domaine des thérapeutiques à base d'ARNm s'est considérablement développé ces dernières années, soulignant l'importance de la conception et de l'optimisation des séquences comme étape cruciale dans le processus de développement. De nombreux efforts ont été consacrés à la création d'outils informatiques capables de prédire les structures et compositions d'ARN les plus efficaces, l'optimisation des séquences ayant particulièrement retenu l'attention8,9. Bien que...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucune incompatibilité d'intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs remercient Laura Itzhaki pour la lignée cellulaire HEK293 LgBiT. Ce travail a été soutenu par une subvention de projet et une bourse de translation du British Heart Foundation (G114642 et G919651 attribuées à CHW) ainsi que par une subvention de recherche en sciences de la vie de GenScript (CAPB).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétiqueSigma-AldrichA6283Composant du tampon TAE
AgaroseSigma-AldrichA9539Électrophorèse sur gel
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BBioanalyseur utilisé pour le contrôle qualité de l'ARNm
CLARIOstar Plus LuminometerBMG Labtech430-501S-FLecteur de plaque/luminomètre utilisé pour mesurer la luminescence
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113Capuchon 5' utilisé pour la transcription in vitro (IVT)
DMEM, glucose élevé, pyruvateThermo Fisher Scientific41966029Milieu utilisé pour la culture des cellules HEK293-LgBiT
DNase INew England BiolabsM0303Dégrade le modèle d'ADN après la réaction d'IVT
Solution tampon phosphate salin de Dulbecco (PBS)Sigma-AldrichD8537Pour le lavage des cellules et l'ajout dans la plaque afin d'éviter l'évaporation
EDTA, pH 8,0, sans RNaseThermo Fisher ScientificAM9260Composant du tampon TAE
Bromure d'éthidiumSigma-AldrichE1510Colorant pour l'électrophorèse sur gel
Sérum de veau fœtal (FBS)Sigma-AldrichF7524Supplément ajouté au DMEM
Kit HiScribe T7 High Yield RNA SynthesisNew England BiolabsE2040Kit de transcription in vitro (IVT)
Milieu Leibovitz L-15, sans phénol rougeThermo Fisher Scientific21083027Milieu utilisé pour la culture des cellules HEK293-LgBiT pendant les mesures de luminescence
L-glutamineThermo Fisher Scientific25030-024Supplément ajouté au DMEM
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Réactif de transfection à base de lipides
Solution de précipitation au chlorure de lithiumThermo Fisher ScientificAM9480Approche alternative pour la purification de l'ARNm après la réaction d'IVT
Kit de purification Monarch Spin PCR & ADNNew England BiolabsT1130Kit de purification après linéarisation du plasmide
Spectrophotomètre UV-Vis microvolume NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WSpectrophotomètre utilisé pour quantifier la concentration d'ADN et d'ARNm
Substrat cellulaire vivant Nano-Glo EndurazinePromegaN2570Substrat nécessaire à la luminescence ajouté au milieu L-15 
Kit de purification NucleoSpin RNAMacherey-Nagel12708612Purifie l'ARNm après la réaction d'IVT
Plaque microplaque Nunc 96 puits, traitée Nunclon Delta, fond platThermo Fisher Scientific136101Plaque utilisée pour le semis des cellules HEK293-LgBiT et les mesures ultérieures
Milieu Opti-MEM à faible teneur en sérumThermo Fisher Scientific31985062Milieu utilisé pour la réaction de transfection
Kit de PCR haute fidélité PhusionNew England BiolabsE0553Kit de PCR
Échelle d'ARN RiboRuler à large gammeThermo Fisher Scientific11883993Échelle d'ARN pour l'électrophorèse sur gel
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020Spray de décontamination contre les RNases
Base TRIZMASigma-AldrichT6066Composant du tampon TAE
Solution de trypsine-EDTASigma-AldrichT4174Réactif de dissociation cellulaire
Eau distillée ultra-pure sans DNase ni RNaseThermo Fisher Scientific10977035Utilisée pour la préparation du modèle et pour l'IVT

Références

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