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Article de méthode

Traduction d’ARNm in vitro sans cellules chez les lysats de Drosophila

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DOI :

10.3791/70844

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12 juin 2026

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

Dans cet article

Résumé

Ici, nous fournissons des détails sur la préparation des lysats et la réalisation de la traduction in vitro à l’aide d’embryons de Drosophila .

Résumé

La traduction in vitro de l’ARNm sans cellules a joué un rôle crucial dans la compréhension du processus de synthèse protéique lors de l’expression génique chez les eucaryotes. Le développement de lysats à partir de différents systèmes de traduction in vitro a été déterminant pour étudier le rôle de la plupart des composants de la machine de traduction et pour disséquer de nombreuses étapes du processus de synthèse des protéines. Différents aspects de la translation et du contrôle translationnel ont été étudiés à l’aide de lysats de Drosophila melanogaster. Cet article fournit des protocoles détaillés pour la préparation de modèles d’ARNm synthétiques, la culture de mouches vivantes à grande échelle, la préparation de lysats compatibles en traduction à partir d’embryons de Drosophila, et la réalisation de réactions de traduction in vitro sans cellules. Ce protocole convient à toute espèce du genre Drosophila — melanogaster, virilis, pseudoscura, grimshawi, hydei, etc. Nous comparons en outre ce protocole à d’autres systèmes de traduction et discutons des limitations, des étapes critiques et du dépannage. Des résultats représentatifs sont inclus pour aider à évaluer la performance et la reproductibilité du protocole. Enfin, nous discutons des applications potentielles en biotechnologie et en recherche.

Introduction

Depuis plus d’un siècle, Drosophila s’avère être un organisme modèle puissant et génétiquement manipulable pour étudier de nombreux phénomènes et molécules biologiques, y compris le contrôle translationnel et la machine de traduction 1,2,3,4. La traduction in vitro sans cellules de Drosophila est devenue un outil puissant pour étudier la synthèse protéique, car elle peut récapituler de nombreux événements observés in vivo. Ainsi, Drosophila est un système idéal pour découvrir de nouvelles fonctions et molécules assurant la traduction et le contrôle translationnel. Les premières études ont établi un système in vitro, adapté en traduction, chez l’arthropode apparenté aux mouches Artemia salina5, puis plus tard chez Drosophila hydei6.

Par la suite, des lysats réactifs aux ARNm exogènes ont été développés chez Drosophila melanogaster. La plupart des études sur la traduction in vitro de Drosophila ont été réalisées sur des embryons de différents âges, bien que certaines variantes du tampon de réaction de translation aient été utilisées par différents groupes de recherche. À titre de comparaison, les différents phénomènes étudiés et les conditions de réaction de translation sont listés dans le tableau 1. Outre les embryons, des protocoles pour la traduction in vitro sans cellules utilisant les ovocytes de Drosophila 10,22,23,24,25,26 et des lysats de cellules de Schneider ou Kc en culture ont également été développés 17,27,28,29,30,31,32. Une description des composants nécessaires à la translation in vitro et une comparaison entre lysats de différentes espèces sont décrites dans lesréférences 33,34.

Bien que le processus de translation de l’ARNm soit conservé chez les eucaryotes, des différences significatives entre les taxons se trouvent principalement à l’étape d’initiation de la traduction, où diverses molécules répriment ou favorisent la traduction tout au long du développement, de manière spécifique au taxon ou à l’espèce35,36. Ce protocole est très adapté pour étudier la traduction d’ARNm chez les insectes tout au long du développement, pour laquelle les lysats provenant de métazoaires phylogénétiquement éloignés ne peuvent pas être utilisés, y compris les lysats commerciaux de blé ou de lapin. En effet, ce protocole peut récapituler les événements de translation qui se produisent lors de l’embryogenèse, ce qui n’est pas possible avec l’utilisation de lysatsd’ovocytes 23. À ce jour, aucune comparaison n’a été réalisée entre les systèmes embryonnaires, ovocytes et cellules cultivées de Drosophila. Ajouter des modifications post-traductionnelles aux protéines synthétisées in vitro constitue une limitation de ce protocole dans son état actuel. De plus, cette méthode ne fournit pas de quantités préparatoires de protéines comparées aux méthodes de production de protéines recombinantes chez les bactéries.

Ici, nous décrivons des protocoles détaillés pour faire croître régulièrement des cages à grande échelle de mouches de Drosophila , préparer des modèles d’ARNm synthétiques, préparer des lysats adaptés à partir d’embryons, et réaliser des tests de traduction in vitro sans cellule. Le tableau des matériaux montre les réactifs nécessaires tout au long du protocole.

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Protocole

1) Construction de plasmides modèles pour la transcription in vitro

  1. Sélectionnez des plasmides contenant une région non traduite (UTR) de 5', un cistron rapporteur, un UTR de 3' et une queue poly(A) en aval d’un promoteur d’ARN polymérase T7, T3 ou SP6. Assurez-vous que chaque construction contient un site de restriction unique immédiatement en aval de la queue poly(A) pour la linéarisation des plasmides avant la transcription (Figure 1).
    REMARQUE : Le site enzymatique de restriction utilisé doit être soigneusement choisi afin que le site de reconnaissance soit en dehors de la séquence transcrite ou un site qui permette à l’ADN linéarisé de se terminer en A. De plus, l’enzyme de restriction doit laisser un dépassement obtus, ou de 5 pieds, à l’extrémité de 3' du gabarit. Les surplombs 3' peuvent entraîner des produits de transcription aberrants. Si une enzyme avec un surplomb de 3' est utilisée, le fragment doit être émoussé avant utilisation.
  2. Vérifiez tous les concepts par séquençage avant de les utiliser comme modèles pour la transcription in vitro .
    REMARQUE : Des constructions rapporteures luciférase Firefly (FLuc) avec une queue poly(A)71 ont été utilisées pour ce flux de travail. Les constructions FLuc sont dérivées de la cassettepLUC 12. Les informations sur les vecteurs et les kits sont listées dans le tableau des matériaux.

2) Transcription in vitro d’ARNm plaqués et polyadénylés

  1. Linéariser chaque construction plasmidique en utilisant le site de restriction unique en aval de la queue poly(A) (ici, KpnI).
  2. Résoudre l’ADN linéarisé par électrophorèse en gel à 1 % d’agarose appliquée à 100 V pendant 1 heure.
  3. Extraire l’ADN par gel et vérifier son intégrité ainsi que sa bonne linéarisation par électrophorèse en gel d’agarose identique.
    REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de purifier l’ADN linéarisé par gel — si l’ADN est complètement coupé, alors une purification en colonne ou une extraction par phénol/précipitation d’ETOH suffit.
  4. Transcrivez l’ADN linéarisé purifié à l’aide d’un kit de transcription in vitro selon les instructions du fabricant. Inclure un analogue de 5' capsule dans la réaction de transcription pour stabiliser l’ARN et stimuler la traduction.
    REMARQUE : Un analogue fonctionnel de la capsule, tel que l’ARNm 7G(5′)ppp(5′)G, soutient la stabilisation des transcrits et la stimulation par translation. Un analogue non fonctionnel de la capsule, tel que G(5′)ppp(5′)A, soutient la stabilisation des transcrits mais pas la stimulation par translation. Cet inhibiteur de la translation est utilisé lorsque des transcrits bicistroniques sont traduits pour tester la présence de sites d’entrée interne des ribosomes (IRES) qui entraînent la translation du second cistron7. Pour tester la dépendance d’une queue poly(A), celle-ci peut être supprimée dans le plasmide modèle avant la transcription.
  5. Traiter toutes les réactions de transcription avec de la DNase sans RNase afin de retirer le gabarit d’ADN après la transcription conformément aux instructions du fabricant. Tous les kits de transcription in vitro fournissent la DNase sans RNase.
  6. Purifiez le transcrit par précipitation au chlorure de lithium ou nettoyage d’ARN en colonne selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Tous les kits de transcription in vitro fournissent les réactifs chlorure de lithium.
  7. Quantifiez par spectroscopie le transcrit purifié et évaluez l’intégrité de l’ARNm par électrophorèse en gel à 1 % d’agarose exécutée à 100 V pendant 1 heure.
  8. Alyquotez l’ARNm et stockez à -70 °C jusqu’à utilisation.

3) Entretien régulier d’une culture de Drosophila à grande échelle

  1. Utilisez la référence Drosophila melanogaster souche sauvage Oregon-R.
  2. Préparez la nourriture pour mouches selon une recette établie par un centre de référence.
    REMARQUE : Les auteurs ont utilisé la recette37 du Bloomington Drosophila Stock Center comme référence pour la préparation des aliments. Les détails de cette recette sont donnés dans le tableau 237. La figure 2 montre le flux de travail global depuis la collecte des embryons jusqu’à la quantification de l’activité de la luciférase.
  3. Placez une cage en acrylique cubique ou cylindrique d’environ 1 m de long et 50 cm de diamètre.
  4. Faites un trou d’environ 30 cm de diamètre dans la partie supérieure de la cage et scellez-la avec un filet (Figure 3).
  5. Placez du papier mouillé sur le dessus du grillage pour fournir de l’eau aux mouches, puis remplacez le papier humide chaque jour (Figure 3).
  6. Gardez la partie avant de la cage ouverte et recouverte de tissu pour permettre l’accès à l’intérieur. Placez de l’acrylique à l’arrière de la cage à mouches en plastique, totalement scellé.
  7. Amplifiez le stock de mouches avant la collecte des embryons et placez ~1 000 jeunes mouches dans la cage. Maintenez constamment la cage des mouches à 22–25 °C.
    REMARQUE : Plusieurs cages à mouches de même dimension et densité peuvent être maintenues en même temps. Les mouches pondent des œufs pendant environ 15 jours et commencent à mourir vers le 20e jour.
  8. Nourrissez les mouches chaque jour avec des assiettes de jus d’agar et de fruit garnies d’une cuillerée de levure de boulanger réhydratée contenant 200 μL d’acide acétique ou de vinaigre.
  9. Pour établir la prochaine génération de mouches, prélever plusieurs plaques d’embryons âgés de 0 à 12 heures. Placez les embryons dans des boîtes en plastique de 22 cm × 17 cm × 10 cm contenant de la nourriture pour mouches à une profondeur de 3 cm. Assurez-vous que les boîtes ont un trou scellé par un treillis afin de permettre la circulation de l’air et d’empêcher la fuite des larves (Figure 4). Ajoutez de la levure sèche active sur la nourriture et laissez les embryons grandir à 25 °C.
  10. Après 3 jours, placez du papier plié de 5 cm de haut dans les boîtes afin que les larves du troisième stade puissent grimper et devenir des nymphes.
  11. Après 10 jours, placez les boîtes contenant les mouches adultes nouvellement écloses dans la cage. Laissez les mouches sortir des jardins et accouplez-vous dans la cage pendant 2 jours.
  12. Pour obtenir des embryons d’un âge spécifique pour la préparation du lysat, ouvrez soigneusement la cage et placez des plaques de jus d’agare à l’intérieur pendant la période de ponte requise.
  13. Retirez les assiettes et ramassez les œufs à l’aide d’un tas de tamis.
    REMARQUE : Pour les lysats embryonnaires de 0 à 12 h, placez deux plaques de jus d’agare dans la cage à 8h00 et retirez-les à 20h00 pour la collecte des embryons.
    1. Prélever les embryons pour la préparation du lysat entre les jours 3 et 10 après l’éclosion des mouches adultes.
    2. En parallèle, prélever les embryons aux jours 2 à 4 et établir une nouvelle génération de mouches dans des boîtes contenant de la nourriture comme décrit ci-dessus.

4) Préparation de lysats de translation à partir d’embryons de Drosophila âgés de 0 à 12 h

REMARQUE : Ce protocole n’inclut pas le traitement par nucléase micrococoque. Cette étape a été omise afin d’éviter une dégradation potentielle de l’ARNm exogène rapporteur si l’inactivation de la nucléase est incomplète. La traduction de fond doit être surveillée dans chaque expérience à l’aide d’un témoin sans ARNm.
REMARQUE : Cette méthode est dérivée des protocoles 7,12,14,15,16,17,22 décrits précédemment.

  1. Préparez le tampon de lyse embryonnaire comme décrit dans le tableau 2 et conservez-le à -20 °C dans 1 mL d’aliquotes.
    REMARQUE : Décongelez chaque aliquote jusqu’à 2x pour une utilisation immédiate.
  2. Collectez les embryons à l’aide d’un tamis.
    REMARQUE : Le protocole standard utilise des embryons âgés de 0 à 12 h, mais d’autres âges embryonnaires peuvent également convenir à la préparation du lysat.
  3. Lavez les embryons avec de l’eau du robinet de façon intensive, puis avec un tampon embryonnaire contenant 0,9 % de NaCl + 0,03 % de Triton X-100.
    REMARQUE : Les embryons peuvent être conservés à 4 °C pendant jusqu’à 24 heures avant la production.
  4. Déchorionez les embryons pendant 5 minutes dans 50 % de tampon embryonnaire et 50 % d’eau de Javel domestique (hypochlorite de sodium [NaOCl] 4–6 % et hydroxyde de sodium [NaOH] 0,02–0,1 %).
    ATTENTION : Utilisez des gants et des lunettes en plastique transparent lors de la manipulation de l’eau de Javel.
  5. Lavez-le bien avec de l’eau du robinet. Sécher les embryons avec du papier et les peser.
  6. Transférez les embryons empaquetés dans un homogénéiseur de moulin de tissus en verre sur glace. Ajoutez 1 mL de tampon de lyse embryonnaire pour 1 g d’embryons. Homogénéisez les embryons sur glace avec 20 AVC.
  7. Transférez l’homogénéat dans des tubes microcentrifuge de 1,5 mL. Centrifugez à 15 900 × g pendant 20 minutes à 4 °C.
  8. Récupérer l’interphase dans des aliquotes de 50 μL sur glace. Congèler les aliquotes dans de l’azote liquide et les conserver à -80 °C.
    REMARQUE : L’interphase est une solution liquide trouble située entre les phases supérieure et inférieure. La phase supérieure est une couche de lipides blancs opaques très visqueux. La phase du bas est une pastille solide.
    ATTENTION : Évitez de contaminer la solution d’interphase provenant des phases adjacentes.
    ATTENTION : Utilisez des gants et des lunettes en plastique transparent lors de la manipulation de l’azote liquide.

5) Réaction de translation in vitro

  1. Installez les réactions de translation dans une plaque à 96 puits ou dans des tubes PCR individuels de 0,2 mL sur un thermocycleur PCR. Préparez chaque réaction de translation dans un volume final de 17 μL, incluant 5 μL de lysat embryonnaire et les composants restants de la réaction décrits dans le tableau 2.
    REMARQUE : Le lysat embryonnaire représente 30 % vol./vol. du volume total de la réaction.
  2. Si des protéines recombinantes sont ajoutées à la réaction de traduction, la dialyse contre un pH hepes-koh de 20 mM. Sélectionnez le seuil de volume de la cassette de dialyse et de poids moléculaire selon le volume de l’échantillon et la taille des protéines.
    REMARQUE : L’ajout de protéines recombinantes est pertinent pour étudier les répresseurs translationnels ou les tests dépendants de la dose avec des facteurs d’initiation. Évitez d’ajouter du PBS aux protéines recombinantes utilisées lors de la réaction de traduction. Maintenez le glycérol à 5 % ou moins dans l’échantillon de protéine ou la réaction de traduction. Si possible, évitez d’ajouter du glycérol à la réaction.
  3. Dénaturez l’ARNm en chauffant à 65 °C pendant 2 minutes et en le refroidissant rapidement sur glace pendant 2 minutes avant la réaction de traduction in vitro .
  4. Effectuer la traduction de chaque ARNm en triple exemplaire. Configurez la réaction comme suit : 2,7 μL de cocktail de réaction (Tableau 2) + 5 μL de lysat embryonnaire + ARNm (30 ng) + H2O à 17 μL de volume final. En tant que mélange maître de base, suivez le cocktail de réaction pour une réaction dans le tableau 2 et ajustez le nombre de réactions à effectuer. Incubez la réaction à 25 °C pendant 60 minutes.
    REMARQUE : ATP et GTP ne sont pas ajoutés séparément à la réaction standard décrite ici. À notre avis, compléter la réaction avec de l’ATP/GTP supplémentaire n’a pas amélioré la production de FLuc ni réduit la translation dans les conditions testées. Par conséquent, la réaction est réalisée avec le système régénérant d’énergie décrit dans le tableau 2 sans supplémentation supplémentaire en nucléotides.
  5. Programmez le thermocycleur avec une étape initiale de 5 minutes à 4 °C, suivie de 60 minutes à 25 °C et une dernière étape de 10 minutes à 4 °C.
  6. Arrêtez la réaction en ajoutant 20 μL de tampon de lyse passive froide 1×. Placez la réaction sur la glace pendant 10 minutes supplémentaires.
  7. Conservez les échantillons à -20 °C ou procédez à la quantification de la luciférase.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

6) Quantification de la luciférase synthétisée

  1. Amenez les réactions à température ambiante pendant 20 minutes avant de quantifier l’activité FLuc.
  2. Apportez 10 μL de chaque réaction de translation et 50 μL de substrat de luciférase (pendant au moins 2 h avant utilisation) à température ambiante.
  3. Ajoutez le substrat de luciférase à la réaction de translation. Enregistrez les unités lumineuses relatives à l’aide d’un luminomètre automatique ou manuel. Programmez le luminomètre pour prendre 10 relevés espacés d’une seconde.

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Résultats

Nous avons réalisé des réactions de translation pour analyser la variabilité d’efficacité entre six préparations lysates indépendantes (c’est-à-dire des répétitions biologiques) en utilisant des embryons âgés de 0 à 12 heures. Chaque mesure représente un triplet technique (Figure 5). Une efficacité translationnelle similaire a été observée, bien qu’avec une certaine variabilité. Nous avons également comparé l’efficacité de la traduction entre embryons d’âge ...

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Discussion

Les lysats de Drosophila pour la traduction in vitro sans cellules peuvent produire des résultats reproductibles. Des embryons à différents âges et variations dans la composition des tampons ont été utilisés pour étudier un large éventail de phénomènes fondamentaux dans la synthèse protéique et sa machinerie (Tableau 1). Ici, nous avons décrit une méthode standard adaptée aux embryons de tout âge pour réaliser des études de manière précise et q...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

N.B-Á et G.H. étaient soutenus par le programme de financement intramuros de l’Institut National du Cancer (Instituto Nacional de Cancerología, INCan), au Mexique ; D.E.V. est boursier posdoctoral du programme Secretaría de Ciencia, Humanidades, Tecnología e Innovación (SECIHTI) « Estancias posdoctorales por México para la Formación y Consolidación de las y los Investigadores por México, 2022 ». Nous remercions Fannis Missirlis et Bety Osorio (CINVESTAV, Mexique) pour les mouches.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aluminum foil sheetReynoldsN/AStandard household aluminum foil; any equivalent commercial brand acceptable.
Amino acids mixturePromegaL4461N/A
Apple cider vinegarHeinzN/ACommercial apple cider vinegar (5% acidity); any equivalent brand acceptable.
Apple or grape fruit juiceJumexN/ACommercial grape juice; or any equivalent commercial brand.
Bacteriological agar Merck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
Boric acid (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent, Molecular Biology grade, ≥99.5%, powder; used for preparation of TBE buffer.
Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structureBioLabsS1411SN/A
Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structure analogNew England BiolabsS1404SN/A
Cap: Non-functional cap analogue G(5´)ppp(5´)ANew England BiolabsS1406N/A
Centrifuge Tube (15 mL)Corning 430053N/A
Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11836170001N/A
Creatine phosphokinase from rabbit muscleMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
Creatine phosphoric acid, disodium saltMerck1120A47950N/A
Dehydrated baker´s yeastFleischmann'sN/ACommercial active dry yeast; any equivalent brand acceptable.
Diethyl pyrocarbonate Merck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchD4004N/A
Drosophila melanogaster wild-type strain Oregon-RBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; mutant strains of Drosophila melanogaster, as well as wild-type reference strains of other Drosophila species, such as virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, etc. are also provided by this Stock Center.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS reagent, 99.4-100.6%, powder; used for preparation of TBE buffer.
HEPESSigmaSLBH4583V99.5%(titration)
Hydrogen peroxide (H2O2)EquateN/ACommercial (~2.5-3.5% hydrogen peroxide solution; any equivalent brand acceptable.
In vitro transcription mMessage mMachine T7, T3, or SP6 KitThermo Fisher ScientificAM1344 and AM1348N/A
KOAc, also termed KCH3COOMerck/Sigma-AldrichSeveralN/A
Lb broth (lennox)Merck/Sigma-AldrichL30221kg 
Luciferase assay systemPromega E1501N/A
MAXIscript T7, T3, or SP6 in vitro transcription KitInvitrogenAM1316 and AM1312N/A
Mg(OAc)2, also termed Mg(CH3COO)2Merck/Sigma-AldrichSeveralN/A
NaCl (sodium chloride)J.T Baker B17W53ACS Reagent
OligonucleotidesAny companyN/ASequence-specific.
Pasive lysis 5X bufferPromegaE1941N/A
Pipet TipsAxygenT-200-Y200 microliters yellow tips.
Pipet TipsAxygenT-1000-B1ml blue tips.
Pipet Tips AxygenT-3000.5-10 microliters clear tips.
Propionic AcidMerck/Sigma-Aldrich79-09-04ACS reagent grade, ≥99.5%, liquid.
PYREX® 5 mL Glass Pestle Tissue Grinder  PYREX®  7724-5N/A
QIAprep spin plasmid miniprep kitQiagen27106N/A
QIAquick gel extraction kitQiagen28704N/A
Rabbit reticulocyte lysate (RRL)Promega L4960N/A
Renilla luciferase (RLuc) assay systemPromega E2820N/A
RNasin ribonuclease inhibitorPromegaN2111AN/A
RNeasy minielute RNA clean up kitQiagen74204N/A
Slide-A-Lyzer Dialysis CassettesThermo Scientific87735 (However, it depends on the molecular size cutoff).N/A
Sodium hypochlorite (bleach)CloroxN/ACommercial bleach (~5-6% NaOCl); any equivalent commercial brand with similar concentration acceptable.
SpermidineMerck85558N/A
Stainless steel sieveN/AN/AAny commercial supplier.
Taq plus precision DNA polymeraseStratagene600211-51N/A
Transfer ribonucleic acid (tRNA) from bovine liver type XIMerck/Sigma-Aldrich9014-25-9 or R4752N/A
Tris (Tris base)IBI ScientificIB70145Molecular biology grade powder; used for preparation of TBE buffer.
Triton X-100SigmaSLBX9437Laboratory Grade
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500N/A
Unflavored gelatin powderKnoxN/ACommercial unflavored gelatin powder; any equivalent brand acceptable.
Unrefined cane sugar (piloncillo)N/AN/ACommercial Mexican unrefined whole cane sugar; any equivalent brand acceptable.
Vector: pBluescript SK or KS (+/-)Stratagene200301N/A
Vector: pGEM-T or pGEM-T Easy. Promega

Références

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