Un flux de travail à faible coût basé sur DeepLabCut sans marqueurs pour l’analyse spontanée de la démarche et de la locomotion chez des souris en mouvement libre

Résumé

Nous présentons un flux de travail à faible coût et sans marqueurs utilisant DeepLabCut pour quantifier la démarche et la locomotion spontanées chez des souris en mouvement libre. Ce protocole intègre l’acquisition vidéo à caméra unique, le suivi sans marqueur des repères anatomiques et l’extraction des paramètres locomoteurs spatiotemporels, offrant un cadre non invasif et accessible pour l’analyse du comportement moteur sans équipement spécialisé.

Résumé

La démarche est un biomarqueur fonctionnel largement utilisé pour détecter les altérations motrices à travers diverses maladies et conditions, car elle reflète les changements de coordination, de force, d’équilibre et d’intégration sensorimotrice. Cependant, les méthodes traditionnelles pour analyser la démarche dans des modèles animaux nécessitent souvent des équipements coûteux, des installations complexes ou des procédures invasives pouvant modifier le comportement naturel. Ici, nous présentons un flux de travail à faible coût et sans marqueurs, basé sur DeepLabCut, un logiciel open source d’estimation de poses, pour l’analyse quantitative de la démarche et de la locomotion spontanée chez des souris en mouvement libre. La méthode repose sur l’acquisition vidéo par une seule caméra, le suivi sans marqueur des repères anatomiques et l’extraction des paramètres locomoteurs spatio-temporels, sans besoin de marqueurs physiques ni de matériel spécialisé. Pour démontrer l’applicabilité du protocole, il a été mis en œuvre dans le modèle murin triple transgénique de la maladie d’Alzheimer (3xTg-AD) comme exemple représentatif d’application. Cette approche préserve la liberté de mouvement et minimise le stress lié à la manipulation, permettant une évaluation non invasive du comportement moteur. Le protocole est compatible avec les environnements standards de tests comportementaux. Dans l’ensemble, cette méthode offre un cadre accessible et non invasif pour l’analyse quantitative de la marche et de la locomotion dans la recherche préclinique.

Introduction

La démarche est un processus moteur complexe qui émerge de l’interaction en temps réel des systèmes moteur, sensoriel et cognitif, nécessitant un traitement coordonné du retour sensoriel, du contrôle postural, de la planification motrice et de l’activation musculaire pour générer un mouvement stable et^{adaptatif 1}. En raison de cette nature intégrative, les altérations de la démarche sont de plus en plus reconnues comme des indicateurs fonctionnels de dysfonctionnement neurologique, tant en pratique clinique qu’en recherche expérimentale. Chez l’humain et chez les modèles animaux, l’analyse de la démarche permet de détecter des changements de mobilité, du risque de chute, de la fragilité et de la capacité fonctionnelle, et a été proposée comme biomarqueur de la progression de la maladie et de l’efficacité de l’intervention dans plusieurs^{conditions 2,3,4}.

En recherche fondamentale, en particulier dans les modèles murins, l’évaluation de la marche spontanée et de l’activité locomotrice représente une stratégie largement utilisée pour caractériser les phénotypes moteurs et évaluer l’impact des perturbations physiologiques et des interventions thérapeutiques. La quantification objective des paramètres locomoteurs permet de détecter des altérations motrices subtiles qui ne sont pas capturées de manière fiable uniquement par inspection visuelle, une limitation particulièrement pertinente dans les études précliniques ciblant les phénotypes⁵ précoces ou légers. Dans ce contexte, l’analyse de la démarche est devenue un outil précieux pour étudier les altérations du comportement moteur et identifier les changements fonctionnels associés à différentes conditions expérimentales, telles que les maladies neurologiques et^{neurodégénératives 6}.

L’analyse du comportement moteur et de la démarche dans les modèles murins s’est traditionnellement appuyée sur des plateformes technologiques spécialisées conçues pour quantifier les variables cinématiques spatiales et temporelles. Des systèmes tels que les passerelles éclairées, les plateformes instrumentées et les logiciels commerciaux de suivi des mouvements sont couramment utilisés ; Cependant, leur dépendance à des équipements coûteux et à des infrastructures dédiées limite considérablement l’accessibilité pour de nombreux^{laboratoires 7, 8, 9, 10}. Au-delà des considérations économiques, ces approches introduisent des contraintes expérimentales supplémentaires. Plusieurs systèmes exigent que les animaux traversent des couloirs étroits ou des voies très éclairées, imposant des motifs locomoteurs forcés qui réduisent les comportements spontanés, tandis que d’autres reposent sur des marqueurs physiques, des taches de peinture ou des étiquettes adhésives fixées aux membres. De telles interventions peuvent induire du stress, modifier la mécanique de la démarche et perturber l’interprétation physiologique des résultats moteurs 11,12,13,14. Collectivement, ces limitations soulignent la nécessité de méthodologies capables de capturer l’allure dans des conditions naturelles et libres, sans recourir à des procédures invasives ou à des infrastructures coûteuses.

Évaluer la démarche lors d’une locomotion non contrainte permet d’observer des schémas moteurs plus naturels, évitant ainsi les contraintes externes qui régulent artificiellement la vitesse, la trajectoire ou la posture. Cette approche facilite la caractérisation du comportement locomoteur dans des conditions minimalement contraintes. DeepLabCut est un cadre open source basé sur l’apprentissage profond de la pose qui utilise des réseaux de neurones convolutionnels pour suivre des repères anatomiques définis par l’utilisateur sans avoir besoin de marqueurs physiques. En permettant le suivi ponctuel anatomique à partir d’enregistrements vidéo standards, DeepLabCut permet l’extraction de paramètres cinématiques tout en réduisant substantiellement les coûts et la complexité^{expérimentale 15, 16, 17, 18}. Il est important de noter que le suivi sans marqueurs minimise les interférences expérimentales, ce qui le rend adapté aux études du comportement spontané. Cette approche sans marqueur à caméra unique convient particulièrement aux études nécessitant une quantification accessible et non invasive de l’activité locomotrice spontanée et des caractéristiques bidimensionnelles liées à la marche dans des conditions en mouvement libre. Cependant, des plateformes de marche instrumentées ou des systèmes de capture de mouvement tridimensionnelles sont nécessaires lorsque des variables biomécaniques directes, telles que les forces de réaction au sol, la pression plantaire, les angles articulaires ou la cinématique complète tridimensionnelle des membres sont nécessaires.

L’objectif de cet article est de présenter un flux de travail à faible coût et sans marqueurs, basé sur DeepLabCut, pour la quantification non invasive de la marche et de la locomotion spontanée chez des souris en mouvement libre, intégrant l’acquisition vidéo par caméra unique, le suivi anatomique des repères et l’extraction de paramètres locomoteurs spatiotemporels dans un flux de travail accessible qui ne nécessite ni matériel spécialisé ni manipulation invasive. Ce protocole se concentre sur la mise en œuvre méthodologique et les résultats représentatifs du flux de travail.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été menées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité de bioéthique de l’Institut de neurobiologie de l’Université nationale autonome du Mexique, sous le protocole numéro 117.

1. Contexte d’étude

1. Utilisez des souris dans les conditions expérimentales requises pour l’étude. Dans cet article de protocole, nous utilisons le modèle murin triple transgénique de la maladie d’Alzheimer (3xTg-AD), abritant les transgènes APPSwe et tauP301L sur un PS1M146V fond knock-in, ainsi que des souris non transgéniques comme témoins, comme exemple représentatif de mise en œuvre du flux de travail.
2. Génotyper tous les animaux avant le début de l’étude.
3. Maintenir les souris avec nourriture et eau à volonté dans des conditions contrôlées comprenant un cycle clair-obscur de 12:12 h, une température de 22 °C ± 2 °C, et une humidité relative de 60 % ± 5 %, sous supervision vétérinaire.
4. Effectuez des enregistrements pendant la phase lumineuse après une période d’habituation de 60 minutes, en utilisant une seule séance en plein champ par animal afin de préserver un comportement exploratoire spontané et d’éviter une activité réduite associée à une exposition répétée à l’arène.
   REMARQUE : Dans cet article sur le protocole, nous présentons des enregistrements représentatifs exclusivement pour illustrer le flux de travail et le type de sorties locomotrices et de démarche générées par la méthode, plutôt que pour soutenir des comparaisons biologiques entre groupes.

2. Matériaux

1. Utilisons les matériaux et équipements listés dans le Tableau des matériaux et équipements pour l’enregistrement et l’analyse de la locomotion et de la démarche spontanées. Voir la Figure 1 pour l’assemblage global de la configuration expérimentale.

3. Habituation et enregistrement de la locomotion spontanée

1. Préparation et habituation des animaux
   1. Transférez soigneusement la souris de sa salle de logement vers la salle de test comportemental au moins 60 minutes avant l’expérience pour permettre l’habituation environnementale.
   2. Maintenir la salle de test comportemental dans des conditions environnementales contrôlées, incluant une température constante de 20 °C à 22 °C, une intensité d’éclairage standardisée (120–150 lux mesurée au niveau de l’arène) et un bruit blanc continu pour minimiser les stimuli auditifs externes.
   3. Pendant la période d’habituation, gardez l’animal dans sa cage sans introduire de stimuli ou d’enrichissement supplémentaires. Manipuler les animaux conformément aux directives institutionnelles de bien-être animal afin de minimiser la variabilité comportementale induite par le stress.
   4. Manipulez l’animal avec des gants propres et des mouvements lents et délibérés. Soulevez doucement l’animal par la base de la queue et soutenez le corps de l’autre main avant de le déposer dans l’arène de champ ouvert.
      Note : ÉTAPE CRITIQUE : Une manipulation incohérente ou un temps d’habituation insuffisant peuvent augmenter les comportements liés à l’anxiété et introduire une variabilité des paramètres locomoteurs. Assurez-vous de procédures d’habituation identiques pour tous les animaux et les séances.
2. Préparation de l’arène en plein champ ouvert et de la caméra
   1. Avant chaque session d’enregistrement, nettoyez soigneusement l’arène acrylique en champ ouvert avec de l’éthanol à 70 % (v/v) pour éliminer les odeurs résiduelles et les indices olfactifs précédents. Laissez la surface sécher complètement avant utilisation.
   2. Manipulez de l’éthanol à 70 % dans un endroit bien ventilé, éloignez-le de la chaleur ou des sources d’inflammation, et laissez l’arène sécher complètement avant utilisation.
   3. Placez l’arène ouverte solidement sur la plateforme en bois, afin de garantir la stabilité de la structure et sans vibrations.
   4. Inspectez les murs en acrylique transparent et la surface du sol mat pour vérifier qu’ils sont exempts de poussière, d’humidité ou de résidus réfléchissants pouvant interférer avec le suivi vidéo.
   5. Placez les lampes blanches latérales externes de chaque côté de l’arène à un angle approximatif de 30 à 45° par rapport au plan de l’arène afin d’assurer un éclairage uniforme dans toute la zone d’enregistrement et de minimiser les ombres, les reflets ou la luminosité excessive. Ajustez la position des lampes avant chaque session et vérifiez que l’éclairage au niveau de l’arène reste dans la plage cible de 120-150 lux.
   6. Positionnez la caméra sous l’arène en vue inférieure à une distance fixe d’environ 80 cm du plan de l’arène, assurant une visibilité complète de la zone d’enregistrement. Notez que cette distance optimale peut devoir être ajustée en fonction de l’ouverture de l’objectif et du champ de vision (FOV) de l’appareil spécifique pour maintenir une couverture complète en arène.
   7. Connectez la caméra au système informatique et lancez le logiciel d’acquisition vidéo avant d’introduire l’animal.
   8. Ajustez la mise au point de la caméra et le champ de vision pour garantir que toute la surface de l’arène soit visible et nettement résolue.
   9. Acquérez une image de référence pour l’étalonnage spatial en plaçant la grille en damier ou le motif de calibration avec des dimensions connues sur le plan de l’arène.
      NOTE : ÉTAPE CRITIQUE : Un alignement précis de la caméra, une distance fixe et un éclairage constant sont essentiels pour une estimation fiable de la pose sans marqueur. Des écarts dans la géométrie ou les conditions d’éclairage peuvent réduire la précision du suivi et compromettre la comparabilité des données entre les sessions.
      REMARQUE : Des matériaux alternatifs, y compris l’acier inoxydable, peuvent être utilisés pour la structure de support externe, à condition que le système reste stable et que l’alignement d’enregistrement soit préservé.
      REMARQUE : Une arène opaque ou des matériaux muraux alternatifs peuvent également être utilisés, notamment lorsqu’un contrôle supplémentaire de l’entrée visuelle externe est souhaité, à condition que le système d’enregistrement reste stable et que les interférences visibles externes soient minimisées.
      REMARQUE : Les dimensions de l’arène utilisées dans ce protocole correspondent à la configuration employée pour enregistrer des souris en mouvement libre. Ces dimensions peuvent être ajustées selon le rongeur utilisé et le protocole adopté en champ ouvert, à condition que la visibilité complète de l’animal, l’étalonnage spatial et des conditions d’acquisition cohérentes soient maintenues.
3. Enregistrement du comportement locomoteur spontané
   1. Avant de placer la souris dans l’arène, affichez brièvement l’identifiant animal dans l’image vidéo afin d’assurer une association visuelle directe entre l’enregistrement et la session expérimentale correspondante.
   2. Initiez l’enregistrement vidéo avant de placer la souris au centre de l’arène ouverte afin de capturer le comportement exploratoire initial dès le début de la session.
   3. Placez doucement la souris au centre de l’arène ouverte.
   4. Enregistrez la locomotion spontanée en continu pendant 3 minutes sans introduire de perturbations visuelles, auditives ou tactiles. Dans le protocole actuel, une seule session d’enregistrement était réalisée par souris.
   5. Surveillez le flux vidéo en direct sur l’écran de l’ordinateur pour confirmer l’enregistrement ininterrompu et la capture correcte des mouvements de l’animal.
   6. Vérifiez périodiquement l’alignement des caméras et l’uniformité de l’éclairage entre les sessions afin d’assurer des conditions d’enregistrement cohérentes entre les animaux.
   7. À la fin de la période d’enregistrement, arrêtez l’acquisition vidéo et retirez soigneusement l’animal de l’arène en utilisant la même procédure de manipulation décrite ci-dessus.
   8. Ramenez l’animal dans sa cage et laissez-le se reposer avant toute autre intervention.
      REMARQUE : Évitez de repositionner l’animal lors de l’enregistrement, car les interférences externes peuvent modifier les schémas de démarche spontanés et affecter l’analyse en aval.
4. Nettoyage, stockage des données et complétion de session
   1. Nettoyez à nouveau l’arène en champ ouvert avec 70 % d’éthanol (v/v) après chaque séance et laissez-la sécher complètement avant d’introduire le prochain animal.
   2. Veillez à ne pas laisser de résidus d’éthanol ni d’odeur sur la surface de l’arène avant d’introduire le prochain animal.
   3. Documentez immédiatement l’identifiant de l’animal, la date et l’heure de la session, l’état expérimental et le nom de l’opérateur immédiatement après chaque enregistrement.
   4. Si d’autres animaux sont testés, répétez la procédure en commençant par l’étape 3.1.1 dans des conditions environnementales et expérimentales identiques.
   5. Sauvegardez chaque fichier vidéo dans un dossier dédié en utilisant une convention de nommage standardisée (par exemple, AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4).
   6. À la fin de la journée expérimentale, éteignez le système de caméra et l’équipement d’éclairage pour éviter la dérive des réglages d’éclairage entre les sessions.
      REMARQUE : Bien que 70 % d’éthanol ait été utilisé dans le protocole actuel car il s’agit d’un désinfectant couramment utilisé dans ce type de procédure, des désinfectants compatibles acryliques peuvent également être utilisés pour éviter une détérioration progressive de la surface, à condition que l’arène soit complètement sèche et exempte d’odeur résiduelle avant le prochain enregistrement.
      REMARQUE : Lorsque cela est possible, plusieurs arènes peuvent être préparées pour permettre un passage immédiat entre les séances et faciliter la progression continue de l’expérience entre les animaux.
      Voir Figure 1 pour les matériaux et l’assemblage de l’installation expérimentale, y compris la plateforme en bois (Figure 1A), l’arène acrylique (Figure 1B), le système d’éclairage latéral (Figure 1C), le positionnement de la caméra en vue de bas (Figure 1D) et l’ensemble expérimental (Figure 1E).

Figure 1 : Installation expérimentale pour l’enregistrement vidéo de la locomotion dans l’arène en plein air. (A) structure de support pour l’arène ; (B) une arène en acrylique en plein champ ouvert placée sur la plateforme ; (C) éclairage latéral pour assurer un éclairage uniforme ; (D) positionnement de la caméra pour enregistrer les mouvements depuis en bas ; (E) installation complète. Les pointes blanches indiquent l’orientation de la source lumineuse dans la Figure 1C et de la caméra dans la Figure 1D. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Traitement vidéo et analyse cinématique

1. Préparation vidéo et contrôle qualité
   1. Acquérez des vidéos brutes dans . MOV et les convertir en .avi format pour être compatibles avec DeepLabCut tout en maintenant des paramètres constants de fréquence d’images et de résolution.
   2. Benregistre tous les fichiers vidéo bruts immédiatement après l’acquisition dans un dossier dédié sur l’ordinateur d’analyse et applique une convention de nommage standardisée (par exemple, AnimalID_Session_Date).
   3. Examinez chaque vidéo dans son intégralité pour confirmer que l’enregistrement est complet et exempt d’interruptions, de pertes d’images ou de corruption. Les vidéos présentant des erreurs d’acquisition doivent être exclues de l’analyse.
   4. Convertissez les vidéos en MP4 (H.264) ou au format AVI non compressé si le format original n’est pas compatible avec DeepLabCut.
   5. En option, effectuer un découpage temporel des images vidéo afin d’éliminer les intervalles non expérimentaux au début et à la fin de la séance (par exemple, lors de l’introduction ou du retrait de l’animal de l’arène expérimentale).
   6. Vérifiez que la résolution et la fréquence d’images correspondent aux paramètres d’acquisition utilisés lors de l’enregistrement et restent cohérents sur toutes les sessions.
   7. Vérifiez que toute la surface de l’arène est visible dans l’image vidéo et qu’aucune partie du corps n’est constamment obstruée pendant la locomotion.
   8. Inscriveztoutes les vidéos vérifiées et traitées dans un répertoire dédié au projet pour l’analyse DeepLabCut.
      NOTE : ÉTAPE CRITIQUE : Des fréquences d’images irrégulières, une visibilité partielle de l’arène ou un flou de mouvement réduiront directement la précision du suivi. Les vidéos ne répondant pas aux critères de qualité ne doivent pas être incluses dans la formation ou l’inférence du modèle.
2. Création et configuration du projet
   1. Désignez une bibliothèque vidéo pour le projet, en utilisant soit les mêmes vidéos destinées à l’analyse, soit un sous-ensemble représentatif pour la formation réseau.
   2. Lance l’environnement Python et importe le package DeepLabCut.
   3. Créez un nouveau projet DeepLabCut en utilisant la commande :
   4. deeplabcut.create_new_project('NomDeProjet', 'Auteur', 'CheminVidéo').
   5. Définissez les repères anatomiques (parties du corps) d’intérêt dans le fichier config.yaml, en assurant des définitions claires et anatomiquement cohérentes.
   6. Les définitions des parties du corps doivent être optimisées pour la question expérimentale et rester identiques pour tous les animaux et les séances.
3. Extraction du châssis et étiquetage des parties du corps
   1. Spécifiez start, stop, numframes2extract et cropping_parameters dans le fichier config.yaml selon la durée de la vidéo et la disposition spatiale.
   2. Extraire les représentatifs en utilisant : deeplabcut.extract_frames(config_path, « automatique », « kmeans »/« uniforme »).
   3. Examinez les images extraites pour confirmer l’inclusion de variations dans la posture corporelle, l’orientation, la position des membres et la couverture de la phase de marche sur l’enregistrement. Si des postures spécifiques, des configurations de membres ou des phases locomotrices sont sous-représentées, extraire des cadres supplémentaires pour mieux représenter ces conditions.
   4. Lorsque des phases spécifiques du cycle de marche sont nécessaires, extraire manuellement les images en utilisant : deeplabcut.extract_frames(config_path, « manuel »).
   5. Lancez l’interface graphique d’étiquetage en utilisant : deeplabcut.label_frames(config_path).
   6. Étiquetez tous les repères anatomiques prédéfinis illustrés à la Figure 2, y compris la trame vidéo représentative lors de l’acquisition (Figure 2A), la détection automatisée des points de corps superposée à la trame originale (Figure 2B), ainsi que la représentation schématique des repères du corps définis et des points de référence de l’arène utilisés pour l’analyse (Figure 2C). Suivre des critères anatomiques cohérents (par exemple, nez : extrémité antérieure du museau ; base de la queue : jonction entre l’épine et la queue)
   7. Étiquetez les quatre membres de façon constante en plaçant chaque point de repère au centre de la patte au-dessus des coussinets plantaires au contact du sol.
   8. Enregistrez et inspectez les labels en utilisant : deeplabcut.check_labels(config_path), et corrigez les annotations inexactes si nécessaire.
   9. Lorsque cela est possible, demandez à un second évaluateur formé d’étiqueter un sous-ensemble de cadres pour évaluer la cohérence entre évaluateurs.
      NOTE : ÉTAPE CRITIQUE : Un marquage incohérent ou anatomiquement imprécis est une source majeure d’erreurs de suivi en aval. Veillez à respecter strictement les définitions des points de repère dans tous les cadres.
4. Entraînement des réseaux neuronaux
   1. Entraîner le modèle d’estimation de la pose pour 200 époques et obtenir une erreur d’entraînement moyenne finale (RMSE) de 3,27 pixels et une erreur moyenne de test de 3,59 pixels, correspondant à une performance de suivi stable dans les conditions d’acquisition décrites.
   2. Créez les ensembles de données d’entraînement et d’évaluation en utilisant : deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
   3. Ajustez le paramètre de la fraction d’entraînement dans config.yaml pour définir la proportion d’images utilisées pour l’entraînement.
   4. Vérifiez la disponibilité du GPU en lançant : nvidia-smi.
   5. Commencez la formation en réseau en utilisant : deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, époques=200).
   6. Surveillez la perte d’entraînement et arrêtez l’entraînement une fois que les valeurs de perte se sont stabilisées et qu’aucune amélioration supplémentaire n’est observée.
   7. Si l’entraînement est interrompu, reprenez depuis le dernier point de contrôle enregistré.
   8. Évaluez le modèle entraîné en utilisant : deeplabcut.evaluate_network(config_path) et notez l’erreur moyenne de pixel.
   9. Si l’erreur dépasse le seuil acceptable pour la configuration expérimentale, ajoutez des trames supplémentaires étiquetées ou affinez les annotations et répétez l’entraînement.
      REMARQUE : Les seuils d’erreur de pixel acceptables peuvent varier selon la résolution de la caméra et la taille de l’arène, mais doivent rester constants entre les expériences.
5. Analyse vidéo et quantification de la démarche
   1. Considérons que les points ayant une valeur de vraisemblance inférieure à 0,3 sont manquants.
   2. Interpoler linéairement les points manquants uniquement lorsque les espaces sont ≤ 3 images consécutives ; Excluez les périodes d’écart plus longues de l’analyse.
   3. Définissez les phases de locomotorisation en utilisant un seuil de vitesse du centre du corps de 10 cm/s.
   4. Excluez les mouvements en dessous de ce seuil et les événements transitoires inférieurs à 3 images.
   5. Effectuez une inférence sur des vidéos expérimentales en utilisant : deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=Vrai).
   6. Générez des vidéos étiquetées en utilisant : deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]) pour confirmer visuellement la qualité du suivi (Figure 2).
   7. Définissez le paramètre pcutoff dans config.yaml à 0,6 pour appliquer un seuil de confiance lors de la visualisation et de l’évaluation du suivi.
   8. Importez les fichiers CSV de sortie dans l’environnement de calcul statistique listé dans le tableau des matériaux, ainsi que le paquet d’analyse correspondant et les scripts personnalisés fournis dans le Matériel Supplémentaire 1 pour la quantification comportementale.
   9. Convertissez les indices d’images en temps en utilisant la fréquence d’échantillonnage vidéo d’origine.
   10. Calibrez les dimensions spatiales en transformant les coordonnées des pixels en unités physiques en utilisant les dimensions connues de l’arène et les repères des coins d’arène suivis.
   11. Effectuer le contrôle qualité des coordonnées suivies avant l’extraction métrique.
   12. Considérons les points avec une vraisemblance inférieure à 0,3 comme manquants et remplacez-les par une interpolation linéaire lorsque cela est approprié.
   13. Identifier les trajectoires aberrantes lors de l’inspection visuelle et corriger ou exclure les situations si nécessaire.
   14. Définir les segments de marche en utilisant des critères cinématiques synchronisés basés sur le déplacement du centre du corps et le mouvement des membres postérieurs.
   15. Excluez les comportements non locomoteurs tels que se cabrer, tourner et se toiletter.
   16. Calibrez manuellement et affinez les seuils de définition selon les conditions expérimentales et le modèle animal afin de ne conserver que des périodes locomotrices robustes et continues pour analyse.
   17. Calculer les métriques de marche dérivées des relations géométriques et temporelles entre repères suivis à l’aide des segments locomoteurs continus filtrés (Tableau 1). Cela incluait la longueur de la foulée, la longueur du pas, la largeur du pas, la cadence, la durée de la foulée, la durée du pas, le temps de la posture, le temps de balancement, l’amplitude ipsilatérale et les mesures de déplacement spécifiques au membre.
   18. Extraire les métriques en champ ouvert de l’enregistrement complet en utilisant les mêmes données de suivi (Tableau 1). Cela incluait la distance totale parcourue, la vitesse moyenne, le temps passé en mouvement, le pourcentage de temps passé en mouvement, le nombre et la durée des séances de marche, ainsi que la distance cumulée parcourue au centre, à la périphérie et aux coins.
   19. Compiler toutes les sorties dans un fichier maître structuré pour une analyse statistique en aval.
   20. Générez des représentations visuelles (par exemple, trajectoires, cartes thermiques, déplacements temporels, schémas de marche et diagrammes de coordination inter-membres) en utilisant les environnements computationnels listés dans le Table of Materials et les scripts de tracé décrits ci-dessus.
   21. Des visualisations synchronisées représentatives de la confiance en points, de la détection des phases de démarche, de la classification exploratoire des zones et de la coordination inter-membres sont fournies dans la Vidéo Supplémentaire 1 et la Vidéo Supplémentaire 2 pour faciliter l’interprétation du flux de travail analytique.
6. Contrôle qualité et sauvegarde des données
   1. Inspectez visuellement un sous-ensemble aléatoire de vidéos étiquetées pour confirmer la cohérence anatomique entre les images et les séances.
   2. Comparez les positions de référence prédites avec des labels annotés pour vérifier la stabilité et la généralisation du modèle.
   3. Sauvegardez une copie complète du projet, incluant config.yaml, les étiquettes originales, les poids réseau entraînés et les fichiers de sortie.
   4. Documentez les versions logicielles utilisées dans le flux de travail, y compris DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA et l’environnement de calcul statistique, ainsi que les spécifications GPU et la date d’analyse.
   5. Générez un rapport résumé des erreurs moyennes et des temps de traitement à partir de evaluation-results.csv.
   6. Sauvegardez l’ensemble du projet dans une archive locale puis sur un serveur institutionnel ou un stockage cloud sécurisé.
7. Environnement de calcul et ressources de reproductibilité
   1. Capturez les enregistrements vidéo originaux dans . Format MOV à une résolution de 1080 × 1920 pixels et environ 60 FPS.
   2. Pré-traiter et transcoder les vidéos en .avi format.
   3. Lors de cette étape de conversion, recadrez la région d’intérêt, redimensionnez-la à une résolution carrée de 720 × 720 pixels, et standardisez le taux d’images d’images à une fréquence constante de 60 FPS afin d’assurer une quantification temporelle précise lors de l’analyse cinématique ultérieure.
   4. Implémentez le flux de travail de suivi sans marqueurs en utilisant DeepLabCut version 3.0.0rc13 dans un environnement Python configuré avec Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1 et CUDA 11.8.
   5. Entraînez le modèle d’estimation de la pose pour 200 époques et obtenez une erreur d’entraînement moyenne finale (RMSE) de 3,27 pixels et une erreur moyenne de test de 3,59 pixels.
   6. Effectuer une analyse post-suivi en utilisant l’environnement de calcul statistique et les scripts personnalisés fournis dans le Matériel Supplémentaire 1 pour la quantification de la marche et du champ ouvert.
   7. Utilisez un seuil de vitesse centrale du corps de 10 cm/s pour identifier les phases de marche. Combler les espaces jusqu’à 3 trames entre les époques locomotrices et exclure les mouvements transitoires inférieurs à 3 trames afin de conserver les segments de marche continus pour analyse.
   8. Fournissez les paramètres de config.yaml pertinents, des scripts d’analyse représentatifs, des exemples de fichiers vidéo et de suivi, ainsi que les poids des modèles dans le Matériel Supplémentaire 1.
   9. Fournir des détails supplémentaires sur l’implémentation, des métriques d’évaluation du modèle, des spécifications matérielles et des paramètres d’analyse spécifiques au cas dans le Matériel Supplémentaire 1, lorsque cela est pertinent.
      REMARQUE : Ajustez ces paramètres en fonction des conditions d’acquisition utilisées dans chaque expérience.

Figure 2 : Flux de travail représentatif pour le suivi sans marqueur des points corporels et l’analyse de la démarche à partir d’enregistrements vidéo. (A) Image vidéo représentative d’une souris se déplaçant librement dans l’arène en champ ouvert pendant l’acquisition. (B) Exemple de détection automatisée des points corporels superposée à l’image vidéo originale après estimation de la pose, illustrant les repères anatomiques utilisés pour l’analyse. (C) Représentation schématique des repères corporels définis et des points de référence de l’arène utilisés pour la reconstruction de la foule, l’étalonnage spatial et l’analyse lomotrice quantitative. Points de repère et points de référence de l’arène : museau, gorge, centre du corps, centre du corps gauche (bcl), centre du corps droit (bcr), hanche gauche (hipl), hanche droite (hipr), base de la queue, centre de la queue, extrémité de la queue, patte avant gauche (lfp), patte arrière gauche (lhp), patte avant droite (rfp), patte arrière droite (droite), haut gauche (tl), haut à droite (tr), bas gauche (bl) et bas droit (br). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Résultats

Après l’application du flux de travail de suivi et d’analyse, le traitement automatisé a reconstruit la locomotion spontanée en champ ouvert en utilisant le point de repère défini du centre du corps et a généré des résultats quantitatifs adaptés à l’analyse en aval. Les graphiques de trajectoire représentatifs illustrent comment le protocole capture le déplacement spatial à travers l’arène, l’occupation temporelle et la dynamique de la vitesse lors de l’exploration libre. Les variables de champ ouvert présentées dans cet...

Discussion

Cette étude présente une approche à faible coût et sans marqueurs pour analyser la locomotion spontanée et la démarche sur des souris en mouvement libre, en utilisant l’acquisition vidéo standard et l’estimation de la pose basée sur DeepLabCut, dans un flux de travail accessible. Ce flux de travail permet d’extraire les variables locomotrices et liées à la démarche à partir des enregistrements vidéo tout en préservant le comportement locomoteur naturel et en réduisant les interférences e...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
70% ethanol	Générique	N/A	Nettoyage de l'arène entre les sessions
Lampes à lumière blanche ajustables	Générique	N/A	Maintenir une illumination constante (100–150 lx)
Rideaux noirs/contrôle de l'éblouissement	Générique	N/A	Réduire la lumière externe/les reflets
Modèle de grille en damier	Générique	N/A	Image de référence pour la calibration spatiale
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	Open-source	N/A	Logiciel d'estimation de pose
Caméra vidéo numérique (HD, 16:9; ≥60 fps)	Générique	N/A	Paramètres fixes entre les sessions
Station de travail GPU Nvidia	Construction personnalisée	N/A	Matériel pour l'entraînement/l'inférence du modèle
Luxmètre	Générique	N/A	Vérifier l'illumination au niveau de l'arène
PyTorch	Fondation Pytorch	N/A	Framework requis par DeepLabCut
Arène ouverte en acrylique transparent (42 × 42 × 42 cm)	Fabriqué sur mesure / En interne	N/A	Arène à ciel ouvert
Support de caméra sous l'arène (vue à 90°)	Fabriqué sur mesure / En interne	N/A	Support stable pour l'enregistrement inférieur
CUDA	Nvidia Corporation	N/A	Traitement parallèle accéléré par GPU
Langage de programmation R	R Foundation	N/A	Langage de programmation pour l'analyse de données