Cette étude présente une méthode d’alimentation à base de gélatine qui permet une administration orale précise, non invasive et basée sur la masse corporelle, chez les poissons-zèbres adultes. Le protocole démontre une acceptation fiable de l’alimentation et, à titre de preuve de principe, une livraison réussie de MK-801, ce qui a entraîné les effets comportementaux attendus.
Article de méthode
Une approche simple et précise basée sur l’alimentation pour la délivrance orale de médicaments chez les poissons
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les méthodes typiques d’administration de médicaments chez les poissons (par exemple, dosage par bécher, injections intrapéritonéales ou gavage oral) sont chronophages, imprécises et/ou gaspilleuses. Parce que ces méthodes sont également stressantes pour les animaux, elles sont mal adaptées à l’administration répétée ou à long terme de médicaments et aux expériences comportementales sensibles aux complications liées à la manipulation, limitant ainsi l’utilité des modèles de poissons en recherche biomédicale. Pour surmonter ces obstacles, une méthode d’alimentation à base de gélatine a été développée afin de permettre un dosage rapide et précis de médicaments chez les poissons avec un minimum de perturbation. La méthode consiste à préparer des bouchées d’alimentation individuellement adaptées composées de gélatine, d’extrait de crevette saumurée, de spiruline et du médicament de prédilection. Les propriétés malléables à la chaleur de la gélatine permettent de liquéfier une préparation homogène unique, de la répartir précisément selon la masse corporelle individuelle, puis de la resolidifier en bouchées personnalisées. À titre de preuve de principe, l’antagoniste des récepteurs NMDA MK-801 (4 mg kg⁻1) a été administré à des poissons-zèbres adultes avant le nouveau test en aquarium, entraînant des effets comportementaux compatibles avec une réduction des comportements anxieux. Cette approche convient parfaitement à la pharmacologie comportementale et s’adapte facilement à d’autres organismes modèles aquatiques.
Introduction
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est largement utilisé en recherche biomédicale pour étudier le développement, la physiologie, le comportement etla pharmacologie 1,2,3. Cependant, l’utilité du poisson-zèbre pour les études pharmacologiques, en particulier chez les animaux adultes, est limitée par la disponibilité de méthodes d’administration de médicaments à la fois précises et minimementperturbatrices 4.
Les techniques d’administration de médicaments couramment utilisées chez le poisson zèbre, telles que le dosage par bécher, l’injection intrapéritonéale et le gavage oral, présentent chacune des inconvénients importants. L’exposition par immersion corporelle complète via le dosage au bécher offre un contrôle limité sur l’absorption du médicament, entraîne des déchets substantiels de composés et introduit une variabilité due aux différences de taux d’absorption et de stabilitédu composé 5,6,7. Les approches basées sur l’injection et la masque orale permettent une dosisation plus précise mais nécessitent anesthésie, contention et manipulation répétée, qui peuvent toutes provoquer des réponses de stress tout en augmentant le risque de blessure ou d’hypoxie, ce qui peut perturber les mesures comportementales etphysiologiques 8,9,10. Ces limitations posent particulièrement problème pour les expériences impliquant des administrations répétées ou à long terme de médicaments.
Pour relever ces défis, une méthode d’alimentation à base de gélatine a été développée, permettant une administration rapide, précise et non invasive du poisson-zèbre11. Cette approche permet d’incorporer des composés pharmacologiques dans de petits morceaux d’alimentation individuellement adaptés composés de gélatine, d’extrait de crevette saumurée et de spiruline. La délivrance de médicaments à base d’aliments est une alternative non invasive qui s’aligne sur les principes des 3R (remplacement, réduction et affinement) dans la recherche animale éthique. Bien que des études antérieures aient démontré la faisabilité de la délivrance de médicaments à base d’aliments chez les poissons-zèbres adultes 12,13,14, les approches existantes reposent sur des matrices alimentaires hétérogènes ou des volumes d’alimentation fixes qui ne tiennent pas compte de la variation individuelle de la masse corporelle. La méthode décrite ici répond à ces limitations en permettant un calibrage de la dose basé sur le poids.
Ce protocole fournit une description détaillée, étape par étape, de la préparation et de l’administration d’aliments à base de gélatine chez les poissons-zèbres adultes. Bien que la méthode soit démontrée à l’aide d’un test comportemental, le test du nouveau bac, elle est largement applicable à d’autres domaines de la biologie du poisson-zèbre et devrait être adaptable à d’autres organismes modèles aquatiques. Ce protocole offre une solution pratique pour les chercheurs recherchant une administration de médicaments efficace, reproductible et à faible stress chez les poissons-zèbres, en particulier pour les études nécessitant une manipulation pharmacologique précise, répétée et/ou à long terme.
Protocole
Des poissons-zèbres adultes AB et TL (4 à 12 mois) adultes mâles et femelles AB et TL (âgés de 4 à 12 mois) ont été utilisés dans cette étude. Tous les animaux étaient élevés et hébergés à l’université Wayne State. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité Institutionnel de Soins et d’Utilisation des Animaux conformément aux directives de l’Université Wayne State. Les poissons étaient maintenus dans des conditions standard sur des racks à haute densité (température 27,5 ± 0,5 °C, conductivité de l’eau 500 μS ± 10 μS, et pH 7,5 ± 0,2) avec un cycle lumineux :sombre de 14 h : 10 h (lumières allumées à 08h00). Les poissons étaient nourris deux fois par jour avec une nourriture sèche le matin et des crevettes de saumure fraîchement écloses l’après-midi. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.
1. Pesée des poissons et calcul du volume d’alimentation
- Remplissez un bécher en verre de 100 mL d’environ 50 mL d’eau du système et placez-le sur une balance numérique. Compte sur la balance.
- Filetiez doucement un poisson dans leur aquarium à l’aide d’un filet à fin. Touchez brièvement le filet à un essuie-tout sec pour enlever l’excès d’eau.
- Transférez soigneusement le poisson dans le bécher, en veillant à ce qu’aucune eau ne se renverse sur la balance.
- Notez le poids et utilisez ce poids mesuré pour calculer le volume d’alimentation requis basé sur 1 % de volume par poids corporel (V/BW) pour chaque poisson individuel.
2. Préparation de l’extrait de crevettes saumurées
- Suspendre la saumure en poudre de crevettes dans de l’eau distillée jusqu’à une concentration finale de 250 mg/mL. Remuez pendant 1 h à température ambiante. Centrifugez la suspension à 12 500 × g pendant 10 minutes à température ambiante et conservez le surnageant.
- Répétez la centrifugation une fois de plus et récupérez à nouveau le surnageant.
- Conservez l’extrait de crevettes saumurées à −20 °C jusqu’à 6 mois.
3. Préparation d’aliments à base de gélatine
- Décongelez l’extrait de crevettes saumurées avant la préparation et calculez les masses cibles de gélatine (12 % en mousse/v), de spiruline (4 % en mousse/v) et, le cas échéant, des composés pharmacologiques nécessaires au volume souhaité d’alimentation gélatineuse.
- Pèser la spiruline et la poudre de gélatine (d’origine porcine ; Bloomez ≈ 300 g) dans des tubes microcentrifuge séparés de 1,5 mL et enregistrez la masse réelle dans chaque tube. Assurez-vous que la masse mesurée est égal ou supérieure à la masse cible pour le volume final prévu.
- Ajoutez les volumes appropriés d’extrait de crevettes saumure, de composé médicamenteux et d’eau dans le tube contenant la spiruline pour obtenir des concentrations finales de 4 % de p/v de spiruline et 80 mg/mL d’extrait de crevettes saumurées.
- Vortex complètement pour homogénéiser. Transférez le volume requis du mélange de l’étape précédente vers le tube contenant de la gélatine pour obtenir une concentration finale de gélatine de 12 % en mousse/v.
- Placez le tube sur un bloc chauffant préchauffé à 45 °C pendant 5 minutes, en faisant des vortex intermittents jusqu’à ce que la gélatine soit complètement dissoute. Si la dissolution est incomplète, remuez doucement à l’aide d’un bâtonnet stérile en bois ou en métal pour faciliter l’homogénéisation.
- Aliquote le mélange entièrement homogénéisé (jusqu’à 100 μL par tube) dans des tubes microcentrifugeuses marqués de 1,5 mL.
- Conserver les aliquotes à −20 °C toute la nuit pour permettre une solidification complète et faciliter la manipulation lors de l’alimentation.
4. Formation de morceaux d’alimentation individuels
- Réchauffez le mélange de gélatine allicité à 45 °C jusqu’à ce qu’il soit complètement liquéfié avant l’alimentation.
- Manipulez soigneusement le mélange de gélatine liquéfiée.
- Pipettez le volume correspondant à 1 % de la masse corporelle du poisson sur une feuille de film de paraffine pour former des morceaux individuels (Figure 1).
REMARQUE : Pour faciliter la manipulation et le stockage, placez une feuille de film de paraffine à l’intérieur d’une boîte de Petri avant de distribuer le volume. Cela permet au paraffine de rester plat et facilite le transfert des bouchées préparées à −20 °C pour le stockage. - Placez les bouchées à −20 °C pendant au moins 20 minutes pour permettre la re-solidification.
- Gardez les bouchées au vif jusqu’à ce qu’elles soient nourries.
5. Administration de l’alimentation par la gélatine
- Transférez les poissons du support de logement vers la salle de comportement et laissez-les s’habituer pendant 1 heure.
- Isoler temporairement chaque poisson dans l’aquarium à l’aide de barrières transparentes pendant 2 à 5 minutes avant l’alimentation.
- À l’aide de pinces, placez la bouchée individualisée de gélatine correspondant à 1 % du poids corporel du poisson sur la surface de l’eau devant chaque poisson isolé.
- Observez chaque poisson pour confirmer la consommation totale de la nourriture en moins de 5 minutes.
- Après que les poissons ont consommé la nourriture, retirez les barrières et ramenez les poissons dans leur aquarium d’origine ou procédez à des procédures expérimentales.
REMARQUE : Un exemple élaboré décrivant la préparation de l’alimentation et le calcul des quantités cibles et réelles de dosage est fourni dans le Fichier Supplémentaire 1, avec des valeurs d’exemple également présentées dans le Tableau 1.
Résultats
Palatabilité de la gélatine
Pour évaluer la palatabilité de l’aliment, les poissons-zèbres adultes AB et TL ont reçu un aliment à base de gélatine pendant cinq jours consécutifs en remplacement de leur alimentation matinale (Figure 2). Tous les poissons TL ont consommé l’alimentation en moins de 5 minutes lors de la première exposition, tandis que les poissons AB ont nécessité une exposition répétée, 15 individus sur 16 consommant constamment l’alimentation après quatre jours consécutifs d’acclimatation (Figure 2A). L’analyse du temps de consommation de l’alimentation à l’aide d’une ANOVA à trois voies (souche × sexe × jour) a révélé des effets principaux significatifs de la tension (F₁,₁₂₅ = 19,4, P < 0,0001) et du jour (F₄,₁₂₅ = 5,80, P < 0,001), mais aucun effet principal du sexe (F₁,₁₂₅ = 0,24, P = 0,63). Des interactions significatives ont été observées entre la souche et le jour (F₄,₁₂₅ = 3,35, P = 0,012) et entre la souche, le jour et le sexe (F₄,₁₂₅ = 2,55, P = 0,04). Les poissons de langue langue des deux sexes consommaient rapidement leur nourriture dès la première exposition (4–20 s), tandis que les poissons AB présentaient des temps de consommation initiale plus longs (7–144 s) qui diminuaient sur plusieurs jours (Figure 2B). Aux jours quatre et cinq, tous les poissons sauf un mâle AB consommaient la nourriture en moins de 10 s. Environ 95 % des poissons consomment l’alimentation gélatineuse dans les 30 secondes suivant la présentation, après 2 à 3 jours d’acclimatation, comme indiquéprécédemment 15,16.
Effet comportemental de MK-801 administré à l’aide d’aliments à la gélatine
Pour démontrer l’efficacité de l’administration de médicaments à base de gélatine, MK-801, un antagoniste du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDAR), a été administré à l’aide d’un aliment à la gélatine. La distance au fond lors de l’exploration d’un nouveau réservoir a été mesurée comme une lecture comportementale. On sait que MK-801 modifie la locomotion et les comportements anxieux ou d’évitement des prédateurs chez les poissons-zèbresadultes 17. Les poissons-zèbres adultes AB ont été acclimatés à la procédure d’alimentation en recevant des morceaux de gélatine sans le médicament pendant deux jours consécutifs afin d’assurer la familiarité et une consommation fiable. Le troisième jour, les poissons assignés au groupe traité ont reçu une dose unique de MK-801 (4 mg kg⁻1) incorporée à l’alimentation gélatineuse. Les poissons témoins ont reçu uniquement un morceau identique contenant un véhicule (eau). L’alimentation a été administrée 30 minutes avant l’évaluation comportementale dans le nouveau test en aquarium.
Un comportement anxieux ou d’évitement des prédateurs, mesuré par la distance depuis le fond, a été analysé à l’aide d’une ANOVA 2 × 2 (drogue × sexuelle), qui a révélé un effet principal significatif de MK-801 (Figure 3) (F₁,₆₉ = 24,5, P < 0,001). Les poissons traités sous médicament passaient plus de temps près du sommet de l’aquarium, un schéma généralement interprété comme un comportement anxieux réduit ou d’évitement des prédateurs. Il n’y avait pas d’effet principal sur le sexe (F1,69=2,52, P=0,12) ou sur l’interaction entre médicaments et sexe (F1,69=1,0, P=0,32). Les tests t par paires corrigés par FDR ont confirmé que MK-801 augmentait la distance de fond tant chez les femmes (P = 0,0076) que chez les hommes (P = 0,023).
Pris ensemble, ces résultats démontrent que l’alimentation à base de gélatine permet une administration orale efficace de composés pharmacologiques, produisant des changements attendus induits par le médicament dans le comportement de la zone de fond dans le nouveau test en cuve.
Figure 1 : Préparation de l’alimentation à la gélatine. L’alimentation en gélatine était pipetée sur un film de paraffine en morceaux individuellement adaptés correspondant à 1 % de la masse corporelle, puis laissée à fixer à −20 °C. Cette figure a été modifiée à partir d’Ochocki et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 2 : Consommation d’aliments à base de gélatine par les poissons-zèbres adultes. (A) Pourcentage de poissons AB et TL des deux sexes ayant consommé l’alimentation dans les 5 minutes suivant l’administration. (B) Temps de consommation alimentaire pour les poissons AB et TL selon le sexe. Les poissons qui n’ont pas consommé l’alimentation ont été exclus de l’analyse du temps de consommation. Les données sont indiquées en moyenne ± s.e.m. ; n = 8 poissons par souche et sexe. Cette figure a été modifiée à partir d’Ochocki et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 3 : Effets comportementaux de l’administration des antagonistes des récepteurs NMDA. Le MK-801 (4 mg/kg) a été administré 30 minutes avant le nouveau test en aquarium chez des poissons-zèbres adultes AB des deux sexes. La distance par rapport au fond de l’aquarium a été utilisée comme mesure du comportement anxieux ou d’évitement des prédateurs. Les données sont présentées sous forme de graphiques en boîte et moustache montrant la médiane (ligne centrale), l’intervalle interquartile (boîte) et ±1,5× l’intervalle interquartile (moustaches). *P < 0,05 basé sur le taux de fausses découvertes – tests t corrigés par paires. Tailles d’échantillons : véhicule femelle, n = 20 ; MK-801 femelle, n = 19 ; véhicule masculin, n = 19 ; MK-801 mâle, n = 15. Cinq animaux ont été exclus de l’analyse car ils n’ont pas consommé l’alimentation à la gélatine. Cette figure a été modifiée à partir d’Ochocki et al.11. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
| Composant | Stock Concentration | Concentration de cibles | Masse/Volume cible | Masse/Volume réel |
| Gélatine | - | 12 % (v/v) | 60 mg | 62 mg |
| Spiruline | - | 4 % (v/v) | 20 mg | 25 mg |
| Extrait de crevettes saumurées | 250 mg/mL | 80 mg/mL | 160 μL | 200 μL |
| Médicament | 10 mg/mL | 0,4 mg/μL (4 mg/kg à 1 % de poids corporel) | 20 μL | 25 μL |
| Eau | - | - | 320 μL | 400 μL |
| Volume total de l’alimentation liquide | - | - | 500 μL | 625 μL |
| Volume total de l’alimentation finie | - | - | 500 μL | 516,7 μL |
Tableau 1 : Exemple de préparation de l’alimentation à la gélatine. Concentrations de stock, cible et masses ou volumes réels hypothétiques utilisés pour préparer un aliment à base de gélatine pour une administration de médicaments de 4 mg/kg administrée à 1 % de poids corporel.
Fichier supplémentaire 1 : Exemple de préparation d’aliments à base de gélatine pour plusieurs poissons. Exemple résolu démontrant la formulation de l’alimentation contenant un médicament et le calcul des volumes de dosage individualisés en fonction du poids corporel individuel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
La méthode d’alimentation à base de gélatine présentée ici surmonte les principales limites des approches de délivrance de médicaments couramment utilisées chez le poisson-zèbre en permettant un dosage individualisé basé sur la masse corporelle avec une manipulation minimale. Cela améliore la précision et la reproductibilité expérimentales. La nature malléable à la chaleur de la gélatine permet à une préparation homogène unique d’être liquéfiée, portionnée avec précision, puis re-solidifiée en bouchées individualisées, assurant une distribution uniforme du médicament tout en tenant compte de la variabilité de taille entre les individus. De plus, l’administration orale via l’alimentation à la gélatine évite le stress et les lésions potentielles associés aux méthodes par injection, ce qui représente un raffinement important dans le cadre des 3R4.
Les avantages de cette approche dépendent d’une exécution précise. Plusieurs facteurs procéduraux sont essentiels pour une mise en œuvre réussie. Une mesure précise de la masse corporelle individuelle est essentielle, car les poissons-zèbres adultes peuvent présenter une hétérogénéité de taille importante même au sein des groupes selon l’âge, le sexe et la souche, la masse corporelle variant presque trois fois chezles individus 11, 18, 19. Une homogénéisation complète du composé dans la matrice gélatineuse est tout aussi importante pour garantir un dosage cohérent sur les portions alimentaires. Enfin, l’acclimatation des poissons à la nourriture gélatineuse avant l’administration du médicament réduit le refus de nourriture ; Il est recommandé de confirmer visuellement l’ingestion de l’alimentation afin d’assurer une administration de dose précise.
Même avec une exécution correcte, il existe cependant certains défis pratiques liés à la délivrance de médicaments par alimentation. Un problème potentiel est le mauvais encastrement des bouchées d’aliment, ce qui peut entraîner une désintégration rapide de l’alimentation après l’introduction dans l’eau. Cela résulte généralement d’un contrôle et/ou d’un mélange insuffisant de la température pendant la préparation, d’un chauffage prolongé ou de cycles répétés de gel-dégel des matières premières. Pour éviter cela, la dissolution complète de la gélatine doit être assurée par un chauffage/mélange approprié, et les stocks préparés doivent être aliquotés en portions à usage unique, décongelées une seule fois et utilisées rapidement. Pour les préparations sensibles, il est recommandé de préparer un bouchon supplémentaire pour l’aliment, qui peut être ajouté à un bécher d’eau, confirmant ainsi un bon encastrement avant l’expérimentation. Pour les composés qui réduisent la palatabilité de l’alimentation, l’acceptation peut être améliorée en incorporant des attractants tels que le jus de palourdes12˒13 ou les attractifs commerciauxde poissons 20. Dans la présente étude, l’extrait de crevette saumurée a été utilisé pour améliorer la palatabilité et s’est avéré efficace. Alternativement, administrer plusieurs doses plus petites peut améliorer la consommation tout en atteignant l’exposition cumulative souhaitée. Au-delà de ces considérations pratiques, la livraison par alimentation présente également des limites pharmacocinétiques inhérentes. Comme pour toutes les méthodes d’administration orale, l’absorption gastro-intestinale peut retarder ou réduire la biodisponibilité par rapport aux approches par injection, et la stabilité du composé au sein de la matrice alimentaire peut varier.
Malgré l’acclimatation, une petite proportion d’animaux peut ne pas consommer l’alimentation gélatineuse et doit être exclue de l’analyse, car ils peuvent ne pas recevoir la dose attendue de médicament. Les taux de refus varient généralement de 2,4 % à 6,4 % 15,16, et ne représentent donc pas un obstacle méthodologique majeur. La consommation d’aliments peut également varier selon les souches. Cet effet de souche est cohérent avec des rapports antérieurs indiquant que le fond génétique peut influencer la latence pour approcher l’aliment20. Ces facteurs doivent être pris en compte lors de la conception des expériences. Il est recommandé de rapporter la conformité alimentaire en parallèle de l’identité des souches afin d’améliorer la transparence et la reproductibilité.
Une autre limitation importante de la présente étude est que le protocole a été développé et validé exclusivement chez le poisson-zèbre adulte et n’est donc pas directement transférable au stade larvaire. Cette méthode repose sur un dosage individualisé basé sur la masse corporelle et l’ingestion de bouchées de gélatine distinctes. Cela est réalisable chez les adultes mais peu pratique chez les larves en raison de leur petite taille de la bouche, de leur comportement alimentaire basé sur la suspension et de la difficulté à obtenir des mesures fiables de la masse corporelle individuelle. Par conséquent, l’adaptation aux applications larvaires nécessiterait des modifications substantielles. Ces modifications pourraient inclure le développement de particules à micro-échelle et des stratégies de livraison alternatives.
Comparée aux méthodes décrites précédemment à base d’aliments, cette approche offre une précision de dosage supérieure et une facilité d’utilisation. Les aliments commerciaux à la gélatine nécessitent une portion de matière hétérogène, limitant la précisionde dose 12, tandis que d’autres méthodes administrent des quantités uniformes à tous les animaux et supposent une masse corporelleidentique 14,21. En permettant une dosage individualisée, la méthode d’alimentation à base de gélatine décrite ici évite les sous-doses ou surdoses et améliore le contrôle expérimental ; Cela amène également le dosage de médicaments chez les poissons-zèbres adultes conforme aux bonnes pratiques chez les rongeurs, qui dosent généralement en fonction du poids. Cette méthode est également très adaptée aux études nécessitant une manipulation pharmacologique précise et répétée, car elle entraîne un stress minimal. Cela inclut des applications en neurosciences comportementales, neuropharmacologie et recherche sur le vieillissement. Il est également avantageux pour les composés qui interagissent avec les anesthésiques ou présentent une faible stabilité en milieu aqueux. Bien que démontrée ici chez les poissons-zèbres adultes, cette approche est facilement adaptable à d’autres organismes modèles aquatiques. Dans l’ensemble, cette technique améliore la précision des doses, le bien-être animal et la flexibilité méthodologique, élargissant l’utilité des modèles de poissons dans la recherche biomédicale.
Déclarations de divulgation
Ce protocole est basé sur des travaux précédemment publiés dans le Journal of Experimental Biology, Ochocki AJ, Kenney JW, 202311. Le présent article fournit une orientation méthodologique détaillée et élargie pour la reproductibilité.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R35GM142566) à J.W.K.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| (+) MK-801 hydrogen maleate powder | SIGMA-ALDRICH | M107-5MG | |
| Gelatin From porcine skin powder | SIGMA-ALDRICH | G1890-100G | Force de gelée ~300 g Bloom, Type A, Bioréactif |
| Mikro Fine Dried Brine shrimp | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/mikro-fine-dried-brine-shrimp-16-ounce | Fine < 400 micron |
| Spirulina powder | Brine Shrimp Direct | https://www.brineshrimpdirect.com/spirulina-powder-spirulina-powder-2-oz | 99% Pure blue green algae |
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