Modèle murin pour la transection sélective des nerfs autonomes intestinaux

Résumé

Ce protocole vise à permettre une transection précise et sélective des nerfs sympathiques et parasympathiques innervant l’intestin chez la souris, utilisant l’artère mésentérique supérieure comme repère anatomique cohérent, fournissant un modèle ciblé et reproductible pour étudier la régulation autonome de la physiologie intestinale et des maladies.

Résumé

Les nerfs autonomes comprennent les systèmes sympathique et parasympathique, qui agissent de manière largement antagoniste pour réguler diverses fonctions physiologiques. Avec l’intérêt croissant pour les rôles de l’innervation autonome en physiologie et pathologie intestinales, le besoin de modèles expérimentaux permettant une manipulation précise des entrées sympathiques et parasympathiques dirigées par l’intestin s’épaissit. Ici, nous présentons un protocole chirurgical pour sectionner sélectivement les nerfs sympathiques et parasympathiques innervant l’intestin. En utilisant l’artère mésentérique supérieure (SMA) comme repère anatomique reproductible, cette approche permet d’identifier de manière fiable les faisceaux nerveux autonomes intestinaux et la transection ciblée qui en a suivi. Contrairement aux approches de dénervation plus larges telles que la ganglionectomie ou la vagotomie subdiaphragmatique, cette approche vise à obtenir une transection plus anatomiquement localisée des faisceaux autonomes dirigés vers l’intestin, ce qui peut aider à réduire les interférences extra-intestinales. La blessure est contrôlable et est généralement associée à un saignement minimal, favorisant la cohérence de la procédure et la récupération postopératoire. Bien que la chirurgie nécessite une formation microchirurgicale appropriée, le protocole est adaptable, permettant aux utilisateurs d’adapter les paramètres clés à des objectifs expérimentaux spécifiques. Il est important de noter que ce modèle offre une plateforme pratique pour étudier les rôles des nerfs sympathiques et parasympathiques dans la régulation de la fonction intestinale, tant dans des conditions physiologiques que pathologiques. Cet article vise à décrire en détail la procédure afin de faciliter son adoption par de nouveaux utilisateurs dans leurs recherches.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal est sous un contrôle continu du système nerveux autonome (SNA), avec des voies sympathique et parasympathique coordonnant des aspects fondamentaux de la physiologie intestinale, notamment la motilité, la sécrétion, la fonction de la barrière épithéliale et l’homéostasie^{immunitaire 1,2}. Dans le côlon, les entrées sympathiques extrinsèques peuvent exercer des effets dépendants de la région à travers plusieurs compartiments cellulaires, soulignant que de larges perturbations du SNA peuvent masquer les phénotypes intestinaux^{spécifiques au site 1}. Inversement, les circuits parasympathiques, traditionnellement médiés par la signalisation vage et les mécanismes cholinergiques en aval, sont de plus en plus reconnus comme essentiels au maintien de l’équilibre immunitaire intestinal et à la formation des réponses muqueuses, motivant ainsi des stratégies expérimentales capables de distinguer les contributions sympathique et parasympathiques avec une précision^{anatomique 2}.

Au-delà de la régulation physiologique, l’activité autonome est devenue un modificateur pertinent de la biologie des maladies intestinales, y compris le cancer colorectal (CCR). Des travaux récents sur la CRC démontrent un programme bidirectionnel nerf sympathique–mésenchymateux, dans lequel la signalisation β2-adrénergique et les fibroblastes associés au cancer exprimant NGF renforcent les interactions neural-stromales et favorisent la progression tumorale, fournissant des preuves directes que les circuits sympathiques peuvent être fonctionnellement couplés à la pathogenèse³ de la CRC. Parallèlement, la signalisation cholinergique a été liée à la croissance du CRC et aux caractéristiques immunitaires associées à la tumeur, comme le montre l’inhibition pharmacologique du récepteur muscarinique 3 dans un modèle murin orthotopique et le lien entre la signalisation cholinergique et l’expression des points de contrôle immunitaires et d’autres caractéristiques^{malignes 4,5}. Il est important de noter que les influences autonomes sur les maladies intestinales peuvent également converger avec d’autres modulateurs, tels que le stress psychologique et le microbiote digestif. Le système nerveux entérique peut transmettre des signaux de stress à l’inflammation^{intestinale 6}, et les signaux microbiens peuvent engager les circuits intestin-cerveau qui accordent les neurones sympathiques intestin-extrinsèques, soutenant collectivement un cadre multifactoriel dans lequel la régulation neuronale croise l’écologie immunitaire^{et microbienne 6,7}.

Ces lignes convergentes de preuves soulignent la nécessité d’approches expérimentales capables d’isoler les effets autonomes dirigés par l’intestin avec une précision anatomique suffisante pour soutenir l’inférence causale tant dans les contextes physiologiques que pathologiques. Malgré des progrès rapides dans la cartographie des circuits et la neuromodulation, de nombreuses interventions couramment utilisées restent limitées en spécificité d’organe. La manipulation pharmacologique systémique, la sympathectomie chimique et la vagotomie sous-diaphragmatique peuvent influencer les sorties autonomes larges et ainsi modifier les points de réglage immunitaires et métaboliques au-delà de l’intestin, compliquant l’attribution causale aux entrées neuronales spécifiques au^{côlon 8}. Par exemple, les circuits vagaux peuvent supprimer la production de cytokines^{inflammatoires 9}, et la stimulation vague peut moduler la fonction endocrinienne pancréatique et la dynamique β des cellules, illustrant que des interventions en amont ou non sélectives peuvent introduire des effets extra-intestinaux qui perturbent l’interprétation des phénotypes^{intestinaux 10}. Ces limitations sont particulièrement importantes pour les études visant à isoler les mécanismes autonomes restreints par le côlon en physiologie et en pathologie. L’objectif global de la méthode est donc de permettre une transection anatomiquement guidée et sélective des fibres sympathiques et parasympathiques dirigées par l’intestin chez la souris, fournissant un modèle pratique pour interroger la régulation autonome intestinale avec un impact hors cible réduit.

En résumé, ce protocole rapporte une approche plus précise de la dénervation autonome intestinale murine, avec un minimum de perturbation de l’innervation autonome d’autres organes abdominaux, améliorant ainsi l’interprétabilité en réduisant les biais potentiels liés aux effets extra-intestinaux.

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Hôpital de l’Amitié de Pékin, Université médicale de la capitale (n° 24-2026). Des mâles adultes sauvages C57BL/6J ont été utilisés dans cette étude (8 à 10 semaines, 20 à 30 g). Des informations détaillées sur les réactifs et équipements sont fournies dans le tableau des matériaux.

Critères d’inclusion : Des souris de la même lignée, sexe et tranche d’âge ont été utilisées dans chaque expérience afin de minimiser la variabilité biologique. Seuls les animaux en bonne santé montrant une activité normale, un comportement de toilettage, une consommation alimentaire et d’eau, ainsi que la production de selles pendant la période d’acclimatation ont été inclus. De plus, les souris ont été acclimatées à l’établissement animalier pendant au moins 7 jours avant l’opération.

Critères d’exclusion : Les souris ont été exclues en cas de saignement incontrôlé ou de lésion vasculaire majeure lors d’une chirurgie, d’une perforation intestinale ou de lésions tissulaires significatives incompatibles avec la survie. Les animaux qui n’ont pas réussi à se remettre de l’anesthésie, définis comme ne devenant pas ambulatoires dans les 2 heures suivant l’opération, ont également été exclus. D’autres critères d’exclusion incluaient des complications postopératoires telles que la déhiscence persistante de la plaie, une infection sévère ou une perte de poids dépassant 15 % en 48 heures, soit 20 % sur une période de 72 heures. Les souris présentant une erreur chirurgicale d’identification de la branche nerveuse, confirmée par une évaluation histologique post-hoc, ont également été exclues de l’étude.

1. Préparation préopératoire

1. Stérilisez tous les instruments chirurgicaux.
2. Administrez des analgésiques préventifs à toutes les souris 30 minutes avant l’opération afin d’éviter la sensibilisation à la douleur. Administrez du méloxicam (5 mg/kg de poids corporel) par injection sous-cutanée.
3. Préchauffez la bouillotte à 37 °C et placez-la sous la plateforme chirurgicale.
4. Vaporisez la zone chirurgicale (y compris la chambre d’induction de l’anesthésie) avec 75 % d’éthanol, puis essuyez soigneusement avec des essuie-tout. Placez suffisamment d’essuie-tout au fond de la chambre d’induction.
5. Inspectez la chambre d’induction de l’anesthésie et les tubes pour vérifier qu’il n’y a pas de fuites. Remplissez et assurez-vous d’un approvisionnement adéquat en isoflurane. Induire une anesthésie avec 3 % à 3,5 % d’isoflurane administré dans 1 L/min d’oxygène. Surveillez la souris en continu ; un plan chirurgical est généralement atteint en 1 à 2 minutes.
6. Placez la souris en position couchée avec les quatre membres complètement étendus, et maintenez-la avec du ruban adhésif hypoallergénique. Ajustez et sécurisez le cône de nez. Réduisez l’isoflurane à 1,5 % à 2,5 % pour l’entretien. Évaluez la profondeur anesthésique en l’absence de réponse de retrait pédale (pas de réaction à la pincée des orteils) et d’une respiration régulière (55–65 respirations/min).
   REMARQUE : Lors de procédures microchirurgicales prolongées, la profondeur anesthésique est continuellement surveillée au-delà du plan chirurgical initial. En plus d’évaluer le réflexe de retrait des pédales et la fréquence respiratoire toutes les 5 à 10 minutes, nous surveillons le schéma respiratoire (par exemple, régularité et profondeur) ainsi que la fréquence cardiaque par observation visuelle ou contact avec la paroi thoracique. La couleur des muqueuses (évaluée à partir des pattes ou des lèvres) est également vérifiée périodiquement pour garantir une oxygénation adéquate. Si la souris présente des signes d’anesthésie légère, tels qu’une augmentation de la fréquence respiratoire (>80 respirations/min), des mouvements spontanés ou un retour du réflexe pédalier, la concentration d’isoflurane est augmentée par incréments de 0,25 % à 0,5 % jusqu’à ce qu’un plan chirurgical adéquat soit rétabli. Inversement, si la respiration devient superficielle ou irrégulière, ou si le rythme cardiaque chute de façon marquée, l’isoflurane est réduit de 0,25 % à 0,5 % jusqu’à ce que la fonction cardiorespiratoire stable revienne. Cet ajustement dynamique garantit que la souris reste à une profondeur anesthésique appropriée tout au long de la procédure tout en minimisant la dépression cardiorespiratoire.
7. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement cornéen et les blessures sous anesthésie.
8. Rasez les poils abdominaux du niveau de la symphyse pubienne jusqu’à la zone située sous la marge costale à l’aide d’un rasoir électrique. Ensuite, déplacez la plateforme chirurgicale sous un stéréomicroscope.
9. Désinfectez le site chirurgical à l’aide d’écouvillons povidone-iode en mode concentrique vers l’extérieur (du centre à la périphérie), couvrant la zone de sous le xiphoïde à la symphyse pubienne et latéralement sur les deux flancs. Répétez 3 fois. Ensuite, essuyez avec de l’éthanol à 70 % de la même manière. Assurez-vous que le champ est exempt de poils lâches.
10. Enfilez un masque chirurgical et une casquette jetable, une blouse chirurgicale stérile et des gants stériles.
11. Couvrez la souris d’un drap fenestré stérile. Ajustez la fenestration à environ 2 × 3 cm et alignez-la avec la ligne médiane abdominale pour exposer complètement le champ opératoire. Sécurisez les quatre coins du rideau.

2. Laparotomie et exposition

1. À l’aide d’une pince stérile, soulevez doucement un petit pli de peau juste crânien par rapport à la symphyse pubienne. Avec des ciseaux à pointe acérée stériles, réalisez une petite incision initiale à l’apex (~0,3 cm), puis étendez l’incision cutanée de façon crânique le long de la ligne médiane sur 1,5 à 2,0 cm.
   REMARQUE : Après avoir inséré les pointes pointues des ciseaux dans l’ouverture initiale, inclinez-les vers le haut et effectuez une « coupe poussée » contrôlée le long de la surface inférieure de la peau afin d’éviter de couper trop profondément et de blesser la musculature abdominale ou les viscères. Utilisez des pinces et des ciseaux pour disséquer de façon brutale le tissu conjonctif sous-cutané lâche de la musculature de la paroi abdominale sous-jacente. Disséquez légèrement plus large que l’incision cutanée pour faciliter l’exposition ultérieure.
2. À environ 0,5 cm de caudal du processus xiphoïde, insérez soigneusement les pointes des pinces fines stériles dans la ligne alba et soulevez une petite tente de tissu.
3. À l’aide de ciseaux stériles à pointe tranchante, créez une petite ouverture (2 à 3 mm) au niveau du site surélevé. À ce stade, le péritoine lisse et/ou les organes sous-jacents (par exemple, un lobe hépatique) devraient être visibles.
4. Insérez une lame de ciseaux stériles à pointe émoussée dans la cavité péritonéale, en la maintenant près de la paroi abdominale. Sous visualisation directe, étendez l’incision le long de la ligne alba vers la direction crânienne jusqu’à ce que la longueur totale corresponde à l’incision cutanée.
   REMARQUE : Gardez la pointe des ciseaux inclinée vers le haut tout au long et ne procédez qu’en vision directe afin de vous assurer qu’aucune boucle intestinale ou vaisseau sanguin ne soit sous les ciseaux.

3. Identification de l’artère mésentérique supérieure et de la transection nerveuse

1. Rétractez doucement la paroi abdominale latéralement à l’aide de bandes stériles pour exposer la cavité péritonéale.
2. Appliquez une pression modérée avec un coton tige-coton sur la paroi abdominale pour permettre aux intestins de s’extérioriser. Déplacez doucement l’intestin grêle, le côlon et le cécum du côté gauche de la souris.
   REMARQUE : Couvrez l’intestin exposé avec un coton stérile ou une gaze humidifiée avec une solution stérile tiède (≈37 °C) pour éviter la sécheresse des tissus et la perte de chaleur.
3. Avec la main droite, déplacez doucement l’estomac, le duodénum et le côlon en bloc vers le quadrant supérieur gauche avec un tige de coton humidifié et stérile (ou une micro pince à bout émoussé). L’aorte abdominale, située en avant de la colonne vertébrale, devrait être clairement visible à ce stade, parfois partiellement recouverte d’une petite quantité de graisse rétropéritonéale.
4. Identifiez la veine rénale gauche et le tronc cœliaque. L’artère mésentérique supérieure (SMA) prend naissance sous forme d’une seule branche artérielle partant de la paroi antérieure de l’aorte abdominale, généralement à ~2–4 mm caudale jusqu’au tronc cœliaque et à ou légèrement au-dessus du niveau de la veine rénale gauche.
   REMARQUE : La veine rénale gauche est une veine sombre et épaisse qui traverse horizontalement la face antérieure de l’aorte abdominale avant de s’écouler dans la veine cave inférieure. Le tronc cœliaque est généralement la première branche artérielle majeure qui émerge de la paroi antérieure de l’aorte abdominale, située juste au niveau crânien (supérieur) de la veine rénale gauche, et se trifurque couramment en artères hépatique, splénique et gauche. En revanche, la SMA est un tronc unique sans branches hépatiques/spléniques. Elle pénètre à la racine du mésentère et alimente le jéjunum, l’iléon et le côlon proximal ; Retracer son cours jusqu’au mésentère peut aider à confirmer une identification correcte.
5. Identifiez les faisceaux laiteux, en forme de cordon, parallèles à l’AMS comme fibres nerveuses cibles. Le faisceau nerveux situé au-dessus de l’AME correspond aux fibres parasympathiques, tandis que le faisceau situé en dessous de l’AME correspond aux fibres sympathiques (Figure 1A).
6. À l’aide de micro pinces et de micro-ciseaux, séparez très délicatement le tissu adipeux et lymphatique entourant la SMA pour exposer complètement les fibres nerveuses. Soulevez doucement le faisceau nerveux sympathique ou parasympathique avec des micropinces pour le séparer de la SMA, puis transectez-le rapidement et soigneusement (Figure 1).
   REMARQUE : Lors de la dissection, gardez les extrémités des pinces et des ciseaux orientées vers la paroi latérale de l’artère et évitez de diriger les instruments verticalement vers des plans plus profonds. Si un saignement important survient (par exemple, une hémorragie due à l’AMS ou une aorte abdominale qui ne peut être contrôlée dans les 30 s en appliquant une pression avec un coton-tige stérile), la procédure est immédiatement interrompue. L’animal est euthanasié de manière humaine alors qu’il est encore sous anesthésie et exclu de toutes les analyses ultérieures. Ce critère est prédéfini conformément aux critères humains approuvés par l’IACUC afin d’éviter des souffrances inutiles. Des conseils supplémentaires pour le dépannage des complications intraopératoires courantes sont fournis dans le Fichier Supplémentaire 1.

4. Fermeture de la cavité abdominale

1. Retirez toutes les compresses de coton intra-abdominales. Inspectez attentivement la cavité abdominale pour détecter tout saignement actif, en portant une attention particulière au champ de dissection de l’AMS, au site de transection nerveuse et aux bords de la paroi abdominale.
2. Irriguez doucement la cavité péritonéale avec un petit volume de solution séline stérile tiède (0,5–1,0 mL), puis évacuez soigneusement l’excès de liquide à l’aide d’un coton-tige sec stérile.
3. Effectuez un calcul avec instruments et un comptage de gazes/coton pour s’assurer qu’aucune matière étrangère ne soit retenue dans la cavité abdominale.
4. À l’aide d’une suture absorbable 6-0, fermez la couche péritoine et musculaire avec un point de suture continu partant d’une extrémité de l’incision. Chaque morsure doit incorporer le péritoine et la musculature de la paroi abdominale de chaque côté.
   REMARQUE : Relever les bords de la plaie avec une pince et placer chaque point de suture en visualisation directe pour éviter de prendre un coin ou un omentum sous-jacent. Si nécessaire, déplacez doucement les intestins loin de l’incision à l’aide d’un coton-tige humidifié.
5. Fermez la peau avec des points interrompus à l’aide de suture 5-0 tressée en soie non absorbable. Placez les points de suture à intervalles de ~2 mm et nouez les nœuds avec une tension modérée, en approchant (sans étrangler) les bords de la peau pour éviter l’ischémie.
   REMARQUE : Une mauvaise position de la plaie peut entraîner une hernie incisionnelle. Assurez-vous que la couche musculaire est bien scellée et que les bords de la peau sont bien alignés.
6. Nettoyez doucement l’incision cutanée fermée à nouveau avec un écouvillon povidone-iode.
7. Marquez la souris (oreille ou queue) avec la date de l’opération.
8. Retirez le cône du nez et transférez la souris dans une cage de récupération propre et douce, placée sur un tapis chauffant à 37 °C (boîtier simple). Maintenez l’animal en position couchée latérale pour réduire le risque d’aspiration.
   REMARQUE : Confirmez que la plateforme de chauffage reste stable à 37 °C pour éviter l’hypothermie. Si nécessaire, administrez 1 mL de solution sériculaire stérile tiède par voie sous-cutanée pour un soutien de volume.
9. Surveillez continuellement la souris jusqu’à ce qu’elle ait complètement repris conscience et puisse rester en position couchée de manière autonome.
   REMARQUE : L’analgésie postopératoire a été poursuivie avec du méloxicam (5 mg/kg, sous-cutanée, une fois toutes les 24 heures pendant jusqu’à 48 heures après l’opération), avec une évaluation vétérinaire supplémentaire si des signes de douleur persistante ou de détresse étaient observés.

5. Paramètres de surveillance postopératoire

REMARQUE : Le suivi postopératoire a été effectué deux fois par jour pendant les 72 premières heures, puis quotidiennement pendant toute la durée de l’étude. Les paramètres évalués comprenaient :

1. Surveillez l’apparence générale, y compris le toilettage, l’état du pelage, la posture et le niveau d’activité.
2. Mesurez le poids corporel quotidiennement ; Définissez une perte de plus de 15 % du poids corporel préopératoire dans les 48 heures ou 20 % sur toute période de 72 heures comme un critère humain.
3. Inspectez le site opéré pour détecter des signes d’infection, de déhiscence ou d’écoulement.
4. Surveillez le comportement, y compris les mouvements spontanés, la réponse à la manipulation et les signes de détresse (par exemple, vocalisation et agitation).
5. Évaluer tout animal présentant des signes persistants de douleur ou de détresse malgré les analgésiques par le personnel vétérinaire et, si nécessaire, euthanasier l’animal.

Résultats

En utilisant l’AMS comme repère anatomique cohérent, les faisceaux nerveux autonomes intestinaux peuvent être identifiés comme de fines structures blanches nacrées courant parallèlement au vaisseau. En fonction de leur position anatomique par rapport à la SMA, le faisceau supérieur était désigné comme le faisceau parasympathique présumé et le faisceau inférieur comme le faisceau sympathique présumé (Figure 1A,D). Un résultat positif intraopé...

Discussion

L’AMS murine provient de la paroi antérieure de l’aorte abdominale, inférieure au tronc cœliaque, et assure l’entrée artérielle vers les principales viscères abdominales, y compris^{l’intestin 14}. En avant de l’AMS se trouvent le côlon et son mésentère, tandis qu’en arrière, il est étroitement lié à la veine rénale gauche et à l’aorte abdominale ; La veine mésentérique supérieure suit généralement son côté droit. Chez la souris, l’AMS est extrêmement délicate et ent...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5-0 silk braided non-absorbable suture	Ethicon	W500
6-0 PGA Suture	Jinhuan	CR631
Anesthesia Induction Chambers	RWD Life Science	V100
Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science	R500IP
Anti-Choline Acetyltransferase antibody	Abcam	ab181023
Artificial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment	Akorn	59399-162-35
C57BL/6J Mice	Shanghai Model Organisms CenterTechnology	SM-001
Cholera Toxin Subunit B (CTB), Alexa FluorTM 555 Conjugate	Thermo Scientific	C34776
Compound Microscope	Yuyan Instruments	512
DAPI and Hoechst Nucleic Acid Stains	Invitrogen	D3571
Fast Green	Thermo Scientific	F7252
Fine Hemostatic Forceps	Jinzhong surgical instrument	JCG020
Hypoallergenic Surgical Tape	3M Blenderm	70200419342
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
Micro Forceps(Curved)	Jinzhong surgical instrument	WCC200
Micro Forceps(Straight)	Jinzhong surgical instrument	WCC190
Micro Needle holders	Jinzhong surgical instrument	WBA050
Micro scissors	Jinzhong surgical instrument	Y3F010
Micro syringe	Hamilton	7632-01
Ophthalmic Scissors(pointed tip)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Ophthalmic Scissors(rounded tip)	Jinzhong surgical instrument	JC2303
Povidone-Iodine Swabstick	Winner Medical	206
Tissue and Cell Fixative (4% Paraformaldehyde, PFA)	MedChemExpress	HY-DY3003
Tissue OCT-Freeze Medium	Sakura	C2077
Tyrosine Hydroxylase (E2L6M) Rabbit Monoclonal Antibody	Cell Signaling Technology	58844S