Dispositif universel de charge de pression pour l’imagerie de cellules vivantes sous contrainte physiologique mécanique soutenue

Summary

Le dispositif de charge de pression décrit ici permet l’imagerie optique en accéléré des cellules cultivées et est compatible avec les antennes de culture cellulaire standard et les microscopes inversés. Grâce à cet appareil, il est confirmé que le microenvironnement à pression hydrostatique tumorale améliore la transduction du signal calcique, offrant une plateforme réalisable pour étudier la transduction mécanique du signal dans le microenvironnement tumoral.

Abstract

Ce protocole décrit un dispositif de charge de pression hydrostatique qui facilite l’observation microscopique en temps réel des cellules adhérentes lors d’une stimulation hydrostatique soutenue par pression, et est compatible avec des antennes de culture cellulaire commerciales de 3,5 cm. L’appareil se compose d’une chambre de culture hermétique fabriquée à partir d’une base en aluminium, d’un couvercle optiquement transparent en poly(méthacrylate de méthyle), d’orifices d’entrée/sortie de gaz intégrés dans le couvercle, et d’une fenêtre d’observation scellée. En se connectant à une source de gaz régulée, l’appareil maintient une pression hydrostatique stable (0–200 kPa, réglable) tout en permettant un contraste de phase continu ou l’imagerie à fluorescence. Grâce à ce dispositif de charge de pression, les effets dépendants de la dose induits par la pression sur le phénotype et les comportements cellulaires, tels que la morphologie, la prolifération et la migration, peuvent être enregistrés. De plus, les signaux fluorescents peuvent également être enregistrés en temps réel. Ici, l’hétérogénéité et la dynamique de la signalisation Ca^2⁺ déclenchées par la pression dans les cellules MDA-MB-231 et HeLa du cancer du col de l’utérus ont été observées et quantifiées par microscopie à fluorescence inversée à l’aide d’imagerie en accéléré. Cette plateforme intègre la charge mécanique à l’imagerie de cellules vivantes pour surmonter les limites des systèmes d’extrémité conventionnels, offrant un outil universel pour les études mécanobiologiques.

Introduction

De nombreuses cellules, tissus et organes subissent des forces de compression soutenues ou intermittentes dans le cadre de leur^{physiologie 1}. Par exemple, les cellules alvéolaires sont soumises à une pressurisation cyclique lors de la^{respiration 2}, tandis que les cellules épithéliales de la vessie subissent des charges mécaniques lors de la rétention^{urinaire 3}. Dans des contextes pathologiques tels que les tumeurs solides, les cellules cancéreuses sont continuellement exposées à des forces de compression issues de la confinement spatial et d’une pression élevée du liquide^{interstitiel 4}. De même, dans d’autres maladies comme la dégénérescence du ménisque et la fibrose pulmonaire, les cellules ménisques⁵ et les cellules épithéliales alvéolaires⁶ subissent également des contraintes mécaniques soutenues dues à la tension et à la pression due à la rigidité matricielle.

De plus en plus de preuves confirment que la pression mécanique agit comme un puissant régulateur du phénotype et du comportement cellulaire ^7,8. Dans les cellules non malignes, le stress compressif favorise la prolifération des cellules souches parodontales et induit la fusion des ostéoclastes par des protubérances^{invasives 9}. Inversement, dans les modèles cancéreux, la compression présente des effets janus : elle supprime la prolifération et la migration des cellules du mélanome tout en activant simultanément la reprogrammation transcriptomique qui favorise la chimiorésistance^10,11. De plus, la compression volumétrique causée par la pression hyperosmotique peut induire un engouillage intracellulaire et stimuler la redistribution de la concentration de protéines et de la force ionique via la séparation en phase liquide-liquide (LLPS), ce qui modifie profondément les comportements et le destin cellulaire. Cette perturbation physique favorise l’expansion des organoïdes intestinaux grâce à la signalisation activée Wnt/β-caténine et à un renouvellement accru des cellules souches^{intestinales 12}. De plus, dans le noyau cellulaire, LLPS induit par des changements de volume est impliqué dans le contrôle transcriptionnel des gènes par la coordination de l’initiation, de l’allongement et de la terminaison de la^{transcription 13,14}.

Pour étudier quantitativement ces effets biologiques induits par la pression, des systèmes expérimentaux capables d’appliquer des stimuli compressifs bien définis et homogènes sont essentiels. Pour les cellules cultivées in vitro, entourées d’un milieu aqueux, la pression hydrostatique constitue un moyen principal et physiologiquement pertinent d’appliquer ces forces de compression, largement adoptées pour étudier la mécanotransduction cellulaire¹⁵. La pression hydrostatique peut augmenter l’activité des phosphatases alcalines et accélérer l’ostéogenèse des cellules souches mésenchymatières humaines dérivées de l’adip sans supplémentation en facteurs^{ostéoinductifs 16}. Dans la stéatose hépatique non alcoolique, des forces mécaniques comme la pression hydrostatique peuvent contribuer à l’hypertension portale sans mucovisse significative, soulignant son rôle dans la diversité^{tissulaire 17}. Bien que la pression hydrostatique joue un rôle important dans la régulation physiopathologique, les études mécanistes de la pression hydrostatique sont confrontées à une limitation cruciale : les chambres de pression conventionnelles empêchent l’observation en temps réel des cellules vivantes lors de la stimulation. La plupart des systèmes expérimentaux ne permettent que l’analyse des points d’extrémité, en masquant la dynamique spatiale et temporelle des événements de mécanotransduction, tels que l’activation mécano-activée de Piezo1, l’hétérogénéité du flux Ca²⁺ et la réorganisation du cytosquelette. Cette lacune a limité la compréhension de la manière dont la pression hydrostatique influence la diversité des phénotypes dans les tumeurs ou autres tissus.

Pour combler ce manque technologique, une nouvelle plateforme expérimentale a été développée permettant l’observation en temps réel des réponses cellulaires à une pression hydrostatique précisément contrôlée grâce à l’imagerie optique. Ce système intègre trois capacités clés : (1) application d’une pression hydrostatique soutenue dans une plage de 0 à 100 kPa via un contrôleur de pression de gaz réglable (Le manomètre a une plage de 0 à 200 kPa, et les pressions appliquées peuvent être sélectionnées en fonction des paramètres physiologiques. Par exemple, sur la base des contraintes compressives rapportées de divers types cellulaires : 8-16 kPa pour les cellules stromales de la moelle osseuse^{humaine 18}, 12–24 kPa pour les cellules musculaires lisses^{vasculaires 19}, et 0–15 kPa pour les cellules épithéliales mammaires^{humaines 20}. ; (2) imagerie continue en cellules vivantes avec une haute résolution temporelle lors de l’application de pression hydrostatique ; et (3) le maintien des conditions de culture physiologique tout au long des expériences prolongées. Cette approche permet la visualisation directe de processus dynamiques, notamment le recrutement et l’activation des canaux Piezo1, les ondes de signalisation calcique et le remodelage du cytosquelette qui se produisent en réponse à une stimulation mécanique. De plus, cet appareil est compatible avec la plupart des boîtes de culture et microscopes inversés disponibles dans le commerce, ce qui le rend très pratique à utiliser en laboratoire. La capacité à surveiller ces événements biochimiques intracellulaires en temps réel offre des informations sans précédent sur la manière dont les cellules détectent et s’adaptent à la pression hydrostatique. En capturant la séquence temporelle des événements mécanotransduction, qui incluent la détection initiale de la force, la signalisation en aval et les changements phénotypiques, cette plateforme offre un outil puissant pour étudier les mécanismes fondamentaux par lesquels la pression hydrostatique influence le comportement cellulaire dans des contextes physiologiques et pathologiques.

Protocol

1. Matériaux

1. Spécifications des dispositifs (voir Figure 1)
   1. Préparez les composants selon les spécifications mentionnées ci-dessous :
      Base : aluminium (Ø 56 mm, hauteur 15 mm), fenêtre centrale Ø 40 mm.
      Couvercle : PMMA (Ø 56 mm) avec : 6 × trous filetés M3, orifice de gaz Luer-lock, joint en silicone (diamètre intérieur 25 mm, diamètre extérieur 32 mm, épaisseur 0,8 mm)
      Régulateur de pression : (plage 0–200 kPa)
2. Cellules et réactifs
   1. Utilisez les cellules MDA-MB-231 et HeLa dans cette étude. Utilisez un milieu L-15, un médium RPMI 1640, un sérum pour veaux nouveau-nés (NCS), une solution antibiotique-antimycotique à 1 %, ainsi qu’une sonde d’imagerie calcique pour la culture cellulaire et le marquage de Ca²⁺.

2. Préparation de l’appareil

1. Fabrication
   1. La conception sur mesure est l’élément central de cette étude. Usinez avec précision la base en aluminium et le revêtement en PMMA selon les spécifications (voir Figure 1 et Figure supplémentaire 1).
   2. Découpez le joint en silicone et traitez-le à la taille requise.
      REMARQUE : La transmettance optique du matériau PMMA est suffisante pour l’imagerie standard de la lumière transmise. Tous les composants étaient stérilisables et biocompatibles pour les expériences ultérieures de culture cellulaire. Aucune exigence particulière n’est imposée concernant les tolérances de fabrication de cette chambre (une tolérance de ±0,1 mm a été adoptée dans cette étude).
2. Stérilisation
   1. Pour stériliser la base (aluminium), autoclave-la à 121 °C pendant 20 minutes.
   2. Pour stériliser la couverture (PMMA), essuyez-la avec de l’éthanol à 75 %, puis stérilisez par UV pendant 30 minutes.
   3. Stérilisez le joint en silicone en autoclavant à 121 °C pendant 20 minutes.

3. Traitement cellulaire

1. Culture cellulaire
   1. Cellules de graines dans des plats de 35 mm à une confluence de 30 % à 70 %. Cultivez les cellules pendant 24 heures dans un milieu RPMI-1640 ou L15 (complété avec 10 % de SNC) dans un incubateur de_CO-2 à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   2. Pour le passage cellulaire, dissociez les cellules contenant 0,25 % de trypsine et terminez la digestion avec un milieu complet. Utilisez les cellules pour le re-semis une fois qu’elles atteignent 70 % à 80 % de confluence.
2. Coloration Ca²⁺
   1. Retirez le milieu, puis lavez les cellules deux fois avec de la solution salée équilibrée Hank’s (HBSS) pré-chauffée dans un placard de biosécurité.
   2. Colorez le Ca²⁺ intercellulaire avec une sonde d’imagerie calcique à 5 μM dans un milieu sans sérum. Incubez les cellules pendant 20 minutes à 37 °C dans un environnement protégé par la lumière.
   3. Retirez le colorant, lavez les cellules trois fois avec du HBSS, puis dé-esterifiez pendant 30 minutes dans un milieu sans sérum.

4. Assemblage du dispositif (Figure 2)

1. Transférez la plaque de culture à la fenêtre centrale de la chambre de pression, puis retirez le milieu de culture.
2. Placez le joint stérilisé dans la boîte de culture.
3. Alignez le couvercle sur la cheminée de joints de vaisselle.
4. Serrez les vis en diagonale en les serrant d’abord à la main jusqu’à sentir la résistance, puis en ajoutant 1,5 tour supplémentaire à l’aide d’un transducteur à couple contrôlé.
5. Connectez le tube de gaz en silicone au port Luer-lock et injectez du gaz mélangé dans l’appareil pour vérifier les fuites.
6. Déconnectez le tube de gaz en silicone et injectez un milieu frais dans la plaque de culture cellulaire via le port Luer-lock à l’aide d’une seringue stérile de 5 mL.

5. Charge de pression et imagerie

1. Reliez le tube de gaz en silicone (diamètre intérieur de 4 mm) depuis le port Luer-lock sur le joint en silicone au manomètre numérique et au réservoir d’essence.
2. Montez l’appareil assemblé sur l’étage du microscope.
3. Calibre la pression.
   1. Validez la stabilité de la plage de 0–200 kPa à l’aide de l’ampuyard.
      REMARQUE : Un gaz mixte contenant 75 % d’azote, 20 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone est utilisé pour la culture cellulaire HeLa. Un gaz mixte contenant 80 % d’azote et 20 % d’oxygène est utilisé pour la culture cellulaire MDA-MB-231. Le type de gaz utilisé dans l’expérience de charge sous pression peut être remplacé selon le type de cellule, le type de milieu ou les exigences expérimentales spécifiques. Aucun composant n’est spécifique au modèle, et les dimensions du module de détection de pression et de sa tubulure d’admission peuvent être sélectionnées selon les besoins.
4. Réglez la pression cible (par exemple, 100 kPa) via le régulateur de pression numérique.
5. Commencez l’imagerie dès que la pression cible est atteinte.
6. Imagerie
   1. Ajustez la scène, confirmez la zone d’imagerie et assurez-vous que les cellules sont nettes.
   2. Acquérir des images de fluorescence des cellules colorées à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’un objectif de 20×, avec les paramètres suivants : temps d’exposition de 400 ms, intervalles en accéléré de 5 s, et durée totale d’imagerie de 10 min (filtre FITC : Ex/Em = 490/525 nm, seuil = 515 nm).
   3. Image en conditions non pressurisées pendant 10 minutes afin d’assurer le bon fonctionnement du système et d’obtenir les données de base du signal.
   4. Après avoir ouvert la valve à gaz pour la pression de charge, réajustez la hauteur de l’étage pour vous assurer que les cellules sont nettes, puis commencez à imager les signaux dynamiques de calcium.
   5. Sélectionnez la lentille d’objectif en fonction de l’épaisseur inférieure de la plaque de culture et de la distance de travail de l’objectif. Choisissez le temps d’exposition utilisé pour permettre la surveillance des oscillations du signal calcique tout en évitant un photoblanchiment excessif et des photodommages.
   6. Ajustez les paramètres selon le type de sonde et les exigences expérimentales lors de l’observation d’autres signaux dynamiques.

6. Dépannage

1. Consultez le tableau 1 pour des conseils de dépannage.

7. Analyse statistique

1. Présentez toutes les données en moyenne ± écart-type (DS). Le logiciel GraphPad Prism (USA) a été utilisé pour comparer les résultats entre deux groupes à l’aide du test t de l’élève non apparié. Considérons les différences comme statistiquement significatives lorsque **p < 0,01, ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001.

Results

Pour vérifier la fonction d’imagerie en temps réel de ce dispositif de charge de pression hydrostatique, la dynamique des signaux calciques dans les cellules tumorales après l’application de la pression hydrostatique a été observée. Les cellules confluentes MDA-MB-231, HeLa et A549 ont été ensemencées dans des plaques de culture de 35 mm pour une utilisation ultérieure. Après coloration à l’aide d’une sonde d’imagerie calcique, les cellules cultivées sans sérum ont été soumises à une pre...

Discussion

Ce protocole montrait un dispositif de charge de pression universellement adaptable permettant l’observation en temps réel de la dynamique de la mécanotransduction sous une pression hydrostatique accordable. En intégrant un revêtement optiquement transparent en PMMA avec une base en aluminium usinée de précision, le système surmonte la limitation critique des chambres conventionnelles, qui ne peuvent effectuer qu’une analyse de points d’extrémité. Ce dispositif de chargement par pression...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotique-Antimycotique (100x)	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	15140122	Concentration de 1 % dans un milieu complet
Autoclave	Panasonic, Japon	MLS-3751-PC	Pour la stérilisation de la base en aluminium et du joint en silicone
Armoire de biosécurité	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	Armoires de sécurité biologique de la série 1300 A2 Classe II, Type A2	Offre un environnement stérile pour la manipulation cellulaire
Cal-520 AM, indicateur de calcium persémanatif cellulaire	AAT Bioquest, États-Unis	21131	Pour la détection dynamique de la concentration d’ions calcium dans les cellules vivantes
Plat de culture cellulaire (35 mm)	BIOFIL, Chine	TCD010035	Plat standard de 35 mm utilisé pour ensemencer les cellules
Base de chambre (aluminium)	Quanyi, Chine	/	Conception sur mesure & Oslash ; 56 mm, H 15 mm, fenêtre centrale et oslash ; 40 mm
Couvercle de chambre (PMMA)	Quanyi,  ; Chine	/	Conception sur mesure & Oslash ; 56 mm, avec 6 et fois ; Trous filetés M3, orifice de gaz Luer-lock
Incubateur CO2	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	HERAcell 3111	Maintient les conditions de culture à 37&de° ; C avec ou sans 5 % de CO2
HBSS (Solution saline équilibrée de Hanks)	Beyotime, Chine	C0219	Pour le lavage des cellules avant et après la teinture
Lignée cellulaire HeLa	Centre de ressources cellulaires, Institut des sciences médicales fondamentales, CAMS/PUMC, Chine	CRM-CCL-2	Cellules cancéreuses du col de l’utérus humain
Microscope à fluorescence inversée	Nikon, Japon	Eclipse Ti2	Pour l’imagerie à fluorescence
Le L-15 Medium de Leibovitz	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	41300039	Pour la culture cellulaire MDA-MB-231
Lignée cellulaire MDA-MB-231	Centre de ressources cellulaires, Institut des sciences médicales fondamentales, CAMS/PUMC, Chine	CRM-HTB-26	Cellules humaines du cancer du sein
Sérum pour veaux nouveau-nés (NCS)	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	16010142	Concentration de 10 % dans un milieu complet
Régulateur de pression	Hongrun, Chine	DP20	Plage : 0-200 kPa
RPMI 1640 Moyen	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	31800022	Pour la culture cellulaire MDA-MB-231
Seringue stérile (5 mL)	KDL, Chine	1101010198	Pour l’injection de milieu ou de réactifs via le port Luer-lock
Trypsine (0,25 %)	Thermo Fisher Scientific, États-Unis	2520056	Pour les cellules adhérentes dissociantes pour le passage