Un flux de travail de microinjection CRISPR/Cas9 pour le marquage fluorescent endogène dans la lignée germinale de Caenorhabditis elegans afin d’obtenir des lignées de knock-in homozygotes pour une analyse in vivo de la localisation des protéines.
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Article de méthode
Marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 des gènes spécifiques à la lignée germinale chez Caenorhabditis elegans
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La localisation des protéines dans la lignée germinale de Caenorhabditis elegans (C. elegans) est centrale pour interpréter la fonction génique lors de la gamétogenèse, mais les approches transgéniques conventionnelles produisent souvent une expression variable et peuvent être réduites au silence dans les cellules germinales. Ici, un flux de travail pratique CRISPR/Cas9 insérant une étiquette fluorescente dans un locus endogène est décrit, permettant la génération d’allèles knock-in stables qui rapportent la distribution des protéines sous régulation native. Le protocole couvre les étapes clés de la procédure : choisir une stratégie de marquage adaptée à la protéine cible, délivrer des réactifs CRISPR par microinjection gonadiale dans de jeunes hermaphrodites adultes, et récupérer les animaux injectés pour le dépistage. Les candidats knock-in sont identifiés par génotypage basé sur PCR sur deux générations afin d’isoler les vers homozygotes et de vérifier l’allèle modifié. Enfin, la microscopie confocale est utilisée pour vérifier la fluorescence germinale et évaluer la localisation subcellulaire in vivo. Le flux de travail est conçu pour être reproductible et largement applicable aux gènes enrichis en lignées germinales, offrant une voie simple pour établir des souches homozygotes marquées pour des analyses développementales et biologiques cellulaires.
Introduction
Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un modèle bien établi pour étudier le développement reproductif et la gamétogenèse, en raison de son cycle de vie court, de son corps transparent et de sa grande facilité génétique1. C. elegans existe principalement sous forme d’hermaphrodites autofécondants, dont la gonade subit d’abord la spermatogenèse, puis passe à l’oogenèse. Ce mode reproducteur simplifie le maintien de la souche et facilite l’obtention de lignéeshomozygotes 2. La transcriptomique spatiale récente a considérablement élargi la liste des gènes enrichis dans la gonade et a révélé des schémas d’expression spécifiques au sexe prononcés dans le système reproducteur chez C. elegans3. Plus récemment, le séquençage à ARN unicellulaire a permis la reconstruction des trajectoires de développement des cellules germinales et l’inférence des réseaux régulateurs des gènes régissant laspermatogenèse 4. Ensemble, ces ensembles de données génèrent des listes riches de candidats, mais l’interprétation fonctionnelle nécessite souvent d’observer le comportement des protéines in vivo — spécifiquement, définir quand et où les protéines correspondantes se localisent et comment leurs schémas évoluent au cours du développement de la lignée germinale.
La transgenèse conventionnelle chez C. elegans repose souvent sur la microinjection gonadale d’ADN plasmidique, ce qui génère facilement des réseaux extrachromosomiquesmulti-copies 5. Cependant, dans la lignée germinale, ces réseaux sont souvent fortement réduits au silence, un mécanisme qui est censé aider à maintenir l’intégrité germinale en restreignant l’expression de l’ADN répétitif, préservant ainsi la fonction germinale et la stabilité de l’information génétique à travers lesgénérations 6, 7. En conséquence, les constructions d’expression des transgènes facilement exprimées dans les tissus somatiques peuvent être faibles ou incohérentes dans la lignée germinale. Même lorsque l’expression est détectable, les effets du nombre de copies et les éléments régulateurs modifiés peuvent modifier la dose et le timing des protéines, pouvant potentiellement dérouter les conclusions sur la localisation et la dynamique natives. Pour répondre à ces limitations, le bombardement de microparticules et l’insertion à une seule copie médiée par Mos1 (MosSCI) sont largement utilisés pour générer des raies transgéniques intégrées à faible ou simplecopie 8,9,10. Ces approches peuvent améliorer l’expression dans la lignée germinale, mais elles diffèrent en coût, en capacité et en leur capacité à reproduire la régulation endogène. L’édition du génome CRISPR/Cas9 offre une voie plus directe en insérant une balise fluorescente au niveau du locus endogène via une réparation dirigée par l’homologie, générant ainsi des allèles knock-in stables qui rapportent la localisation et la dynamique des protéines sous contrôle régulateurnatif 11,12,13,14.
Ici, un flux de travail pratique pour le marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 chez C. elegans est décrit, appliqué à des gènes sélectionnés sur la base de schémas d’expression enrichis par la lignée germinale rapportés. Le protocole décrit la sélection de cibles, la conception d’ARN de type et guide du donneur, la microinjection gonadique et le dépistage en aval pour isoler les lignées knock-in homozygotes, suivies d’une validation par génotypage. Cette approche est largement applicable aux gènes exprimés par la lignée germinale à travers les stades de développement et permet des analyses quantitatives de la localisation et de la dynamique des protéines in vivo. Ce flux de travail offre une stratégie pratique pour le marquage des gènes exprimés dans la lignée germinale et pour analyser la localisation et la dynamique des protéines in vivo sous contrôle réglementaire natif.
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Protocole
Toutes les expériences impliquant Caenorhabditis elegans ont été menées conformément aux directives institutionnelles pour le soin et l’utilisation des organismes de laboratoire à l’Université normale de Pékin.
Figure 1 : Aperçu du marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 chez C. elegans. Flux de travail schématique illustrant les principales étapes de la génération et de la validation par knock-in fluorescent endogène. À l’étape de conception et de construction, un gène cible enrichi par la lignée germinale et un site d’insertion sont sélectionnés, pDD162 est utilisé comme plasmide CRISPR/Cas9 pour l’expression de Cas9 et guide de l’ARN, et pPD95.75 est utilisé comme colonne dorsale du donneur dans lequel le label fluorescent (par exemple, GFP) et les bras d’homologie gauche et droit sont sous-clonés. Au stade de microinjection, le mélange d’injection CRISPR/Cas9 (incluant le plasmide gRNA/Cas9, le gabarit donneur et les marqueurs de co-injection) est injecté dans la gonade des jeunes hermaphrodites, suivi d’une récupération sur des plaques ensemencées. Lors de la phase de validation, les progéniture positives au marqueur sont sélectionnées pour le génotypage en aval, incluant l’identification par PCR des événements knock-in et la confirmation par séquençage ADN, et les lignées knock-in réussies sont ensuite examinées par microscopie à fluorescence pour évaluer l’expression germinale et la localisation subcellulaire de la protéine marquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
1. Sélectionner un gène cible enrichi en lignée germinale
- Identifier les gènes candidats ayant une expression prédominante dans les gonades ou les cellules germinales à l’aide de bases de données publiques et de la littérature publiée.
- Sélectionnez un site de marquage approprié en fonction des caractéristiques protéiques. Enregistrez l’isoforme sélectionnée et la position d’insertion de l’étiquette pour la conception en aval de l’ARN guide et du gabarit donneur (Figure 1).
2. Concevoir le modèle d’ARN guide et de donneur
- Identifier une séquence d’ARN-guide (gRNA) de 20 nt en amont d’un motif adjacent au proto-espaceur (PAM ; NGG), la séquence requise pour la reconnaissance Cas9, et la positionner aussi près que possible du site d’insertion du tag prévu.
- Évaluer les gRNA candidats à l’aide d’un outil de conception en ligne (par exemple, l’outil IDT CRISPR) avec le génome de C. elegans sélectionné. Sélectionnez un guide avec une forte efficacité de coupe prédite dans la cible et sans sites prédit à haut risque hors cible.
- Clonez la séquence d’ARNg dans la région entre le promoteur U6 et l’échafaudage d’ARNg au sein de la colonne vertébrale plasmidique d’expression CRISPR.
REMARQUE : Amorces de conception incorporant la séquence d’ARNg comme surplombs. Effectuer une amplification PCR suivie d’un assemblage basé sur la recombinaison homologue, une méthode de clonage indépendante de la ligation qui élimine la digestion enzymatique de restriction et permet un clonage en une étape directement dans le vecteurd’expression 15. - Confirmez l’insertion correcte par séquençage Sanger.
- Construire le plasmide donneur à l’aide d’une marque fluorescente flanquée d’environ 1 000 pb de bras d’homologie gauche et 1 000 pb droit, dérivés du locus cible.
REMARQUE : Amplifier les bras d’homologie à partir de l’ADN génomique N2 préparé sous forme de lysat de ver en utilisant la digestion de la protéinase K. Les amorces de conception avec 15–20 pb chevauchent le vecteur linéarisé et le balisage fluorescent. Assembler les bras d’homologie et marquer dans la colonne vertébrale via la recombinaison homologue en une seule réaction. Insérez le codon fluorescent immédiatement après le codon de départ ATG pour le marquage N-terminal ou avant le codon d’arrêt pour le marquage C-terminal. Inclure une séquence de liaison entre le gène cible et la marque fluorescente afin de maintenir un bon repliement et une bonne fonction des protéines. Utilisez le lieur pour réduire les interférences stériques entre les partenaires de fusion, et assurez-vous que le lieur et l’étiquette soient insérés dans l’image avec la séquence de codage. Sélectionnez soigneusement le site d’insertion pour éviter de perturber les domaines fonctionnels connus ou prédits, les peptides signaux ou les régions transmembranaires (Fichier supplémentaire 1). - Introduire des substitutions silencieuses dans la séquence homologue du donneur pour perturber la séquence de liaison PAM ou guide sans modifier la séquence protéique et empêcher la recoupe de Cas9 après intégration.
REMARQUE : Incorporer des mutations ponctuelles synonymes dans des amorces utilisées pour l’amplification du bras d’homologie, ciblant les codons dans la région PAM. - Confirmer l’intégrité des séquences donneuses à travers les deux bras d’homologie et les jonctions de balises par séquençage de Sanger.
REMARQUE : Conserver les plasmides vérifiés à −20 °C pour un stockage à court terme ou à −80 °C pour un stockage à long terme.
3. Préparez le mélange d’injection
- Assemblez le mélange d’injection en combinant le plasmide d’expression CRISPR, le plasmide donneur (construit sur la base de pPD95,75) et les marqueurs de co-injection dans des ddH₂O stériles pour obtenir un volume final de 10 μL aux concentrations listées dans le Tableau 1.
REMARQUE : Optimiser empiriquement les concentrations afin d’équilibrer la lisibilité des marqueurs, la récupération des candidats et la survie post-injection. - Centrifugez le mélange d’injection à 10 000 × g pendant 10 à 20 minutes pour pelleter les particules et éviter l’obstruction du capillaire de microinjection.
| Composant | Fonction | Concentration de travail (ng/μL) |
| pDD162 | Plasmide CRISPR/Cas9 (expression de Cas9 et gRNA) | 50-100 |
| Plasmide donneur (dorsale pPD95.75) | Modèle donneur HDR portant une étiquette fluorescente flanquée de bras d’homologie de ~1 kb | 50-100 |
| pRF4 | Marceur de co-injection (phénotype du rouleau) | 50-100 |
| pPD122.11 | Marqueur de co-injection (expression GFP) | 5-10 |
| Stérile ddH2O | Passer au dernier volume | – |
Tableau 1 : Composition du mélange d’injection et fonctions plasmidiques. Le mélange d’injection contient le plasmide d’expression CRISPR, le plasmide donneur, pRF4 et pPD122.11 aux concentrations indiquées, pour un volume total de 10 μL.
4. Chargez et préparez l’aiguille d’injection
- Tirez les capillaires en verre dans des aiguilles de microinjection à l’aide d’un extracteur d’aiguilles configuré pour produire un long conic avec une pointe tranchante adaptée à l’injection gonadique.
REMARQUE : Optimisez empiriquement les paramètres du puller. Exemples de paramètres de départ : chaleur = 540, traction = 20, vitesse = 100.
ATTENTION : Manipulez soigneusement les aiguilles tirées pour éviter les blessures par perforation. Utilisez des pinces lors de la manipulation des aiguilles et jetez les aiguilles usagées dans un contenant à objets tranchants. - Chauffez une pipette microcapillaire et cassez-la en deux parties pour créer un outil de chargement.
REMARQUE : Des embouts de chargement commerciaux peuvent être utilisés comme alternative. - Fixez une ampoule aspiratrice en caoutchouc à l’extrémité large de la pipette microcapillaire raccourcie.
- Aspirez environ 1 μL de mélange d’injection clarifiée en surnageant dans le chargeur.
REMARQUE : Le volume exact n’est pas critique. Assurez-vous que la solution remplit bien la pointe de l’aiguille. - Insérez le chargeur à l’arrière de l’aiguille d’injection et distribuez doucement le mélange d’injection.
- Placez l’aiguille chargée à l’horizontale pendant 10 minutes pour permettre à la solution de se déposer vers la pointe et confirmez une colonne continue.
- Montez l’aiguille sur le microscope d’injection et mettez la pointe au point à l’aide d’optiques à champ clair.
- Ouvrez la pointe de l’aiguille en la touchant doucement avec le bord d’une toile de couverture dans de l’huile d’halocarbone et testez le flot.
REMARQUE : Ajustez la pression d’injection (30–80 psi) pour générer une bulle approximativement égale au diamètre de la gonade dans un délai de 1 s16.
5. Préparer les vers pour l’injection
REMARQUE : Préparez les plaques de milieu de croissance nématode (NGM) et le tampon M9 comme décritprécédemment 17. Maintenir les vers sur des plaques ensemées d’Escherichia coli OP50 (dorénavant OP50) et effectuer des injections en arrière-plan N2.
- Sélectionnez des hermaphrodites L4 dans une plaque saine et incubez à 20 °C pendant 10 heures pour obtenir de jeunes adultes aux lignées germinales bien développées.
- Transférez les vers dans une assiette non semée pour réduire la transmission bactérienne.
- Préparez un tampon sec d’agarose à 2 % sur une lame en verre et appliquez une goutte d’huile d’halocarbone.
- Transférez un ver sur le coussinet d’agarose à l’aide d’un cueillette à cils.
- Immobilisez le ver et orientez la gonade pour l’injection.
ATTENTION : Effectuez les injections dans les 20 à 30 minutes pour éviter la dessiccation.
6. Effectuer une microinjection gonadiale
Figure 2 : Localisation du syncytium gonade distal pour microinjection chez le jeune adulte C. eleganshermaphrodites. (A) Image en champ clair à faible grossissement d’un jeune adulte hermaphrodite monté. Les deux bras gonades sont visibles ; Le site d’injection est indiqué pour un bras (flèche) comme exemple représentatif. La région encapsulée marque la zone représentée à un grossissement plus élevé dans le panneau B. (B) Vue DIC à plus grand grossissement de la gonade distale correspondant à la région encapsulée du panneau A. La flèche indique la position d’injection dans le syncytium gonadique distal, où le mélange d’injection est délivré. Barres d’échelle : 100 μm (A) et 20 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
- Localiser un ver immobilisé et identifier la gonade à l’aide d’un objectif à faible grossissement.
- Positionnez l’aiguille à l’aide de contrôles micromanipulateurs.
- Orientez le ver à un angle de 20 à 40° par rapport à l’aiguille.
- Concentrez-vous sur la lignée germinale distale en utilisant un grossissement plus élevé.
- Avancez le ver vers l’aiguille et positionnez la pointe dans le syncytium gonadal (Figure 2).
- Injectez la solution et confirmez l’administration par gonade visible et gonade.
REMARQUE : Optimisez la pression d’injection (30–80 psi), la pression de compensation (0,1–0,5 psi) et la durée d’injection (0,1–0,3 s).
ATTENTION : Une pression ou un volume excessifs peuvent provoquer la rupture des vers. - Retirez l’aiguille et repositionnez-la pour les injections suivantes.
REMARQUE : Effectuer une injection unilatérale pour maximiser la survie, ou une injection bilatérale pour augmenter l’efficacité du montage. - Ajoutez un tampon M9 pour libérer les vers et transférez chaque vers sur une plaque de récupération individuelle.
- Répétez les injections pour 20 à 25 vers.
REMARQUE : Remplacez l’aiguille si elle se bouche ou s’abîme. - Incubez les vers injectés à 20 °C pendant 2 à 3 jours pour permettre la récupération.
7. Filtrer les candidats F1 pour identifier les lignes knock-in-positives
- Criblez la progéniture F1 pour détecter des marqueurs de co-injection et sélectionnez des animaux positifs au marqueur.
REMARQUE : Des exemples de marqueurs alternatifs de co-injection fluorescente présentant une spécificité tissulaire et des propriétés spectrales différentes sont fournis dans le Tableau Supplémentaire 1.
REMARQUE : Sélectionnez des animaux exprimant les deux marqueurs pour une meilleure fiabilité. Priorisez les couvées à haute fréquence de marqueurs (« progénitules jackpot »). - Transférez chaque ver F1 sur une plaque individuelle et laissez pondre des œufs pendant 1 à 2 jours.
- Lysez chaque ver F1 dans un tampon de protéinase K pour préparer des modèles PCR.
REMARQUE : Conserver les lysats à −80 °C si ce n’est pas traité immédiatement. - Effectuez la PCR par jonction en utilisant une amorce génomique en dehors du bras d’homologie et une amorce interne de la marque.
REMARQUE : Conserver les plaques correspondantes des animaux F1 positifs à la PCR.
8. Criblage de la progéniture F2 pour isoler les lignées de knock-in homozygotes et confirmer l’intégration
- Isoler la progéniture F2 des lignées F1 PCR positives sur des plaques individuelles.
- Permettre aux vers F2 de produire des descendants et de lyser les adultes pour le génottypage.
REMARQUE : Conserver les lysats à −20 °C si nécessaire. - Effectuer la PCR à l’aide d’amorces flanquant les bras d’homologie pour distinguer les allèles de type sauvage et les allèles knock-in par la taille du produit.
- Confirmez l’intégration correcte par séquençage de Sanger à travers les deux jonctions d’insertion.
- Vérifiez l’expression et la localisation de la fluorescence germinale à l’aide de la microscopie à fluorescence.
- Élargissez les lignées homozygotes confirmées et maintenez les stocks.
REMARQUE : Cryopreserve validait les lignes pour un stockage à long terme.
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Résultats
Suivant le protocole, les jeunes hermaphrodites adultes ont été microinjectés gonadalement avec un plasmide CRISPR/Cas9 (pDD162), un donneur de plasmides codant pour une étiquette knock-in GFP flanquée d’environ 1 ko de bras d’homologie (pPD95.75), et des marqueurs de co-injection (pRF4 et pPD122.11). Un gène cible enrichi en lignée germinale a été utilisé comme exemple représentatif pour générer un allèle knock-in homozygote stable qui rapporte la localisation des protéines sous contrôl...
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Discussion
Ce flux de travail est conçu pour générer des lignées d’entrée stables, homozygotes, dans lesquelles une marque fluorescente est insérée au lieu endogène pour signaler la localisation des protéines sous contrôle réglementairenatif 5,6,7,8,9,10. En pratique, le succès est mieux jugé par une ch...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme national clé de recherche et développement de Chine (2023YFA1801100 à L.M.), de la Natural Science Foundation of China (32400698 à P.W., 32270774 à L.M.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agar | Beijing Lablead Biotech Co., Ltd. | QZ02 | Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM |
| Agarose | NOVON | ZZ14011 | Préparation de tampons d'agarose à 2% |
| Souche Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Souche de fond pour l'injection | |
| Centrifugeuse | Eppendorf | 5425 | Clarifier le mélange d'injection |
| Cholesterol | Beijing Chemical Reagents Company | 57-88-5 | Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM |
| Plasmid de marqueur de co-injection rol-6 (su1006) (pRF4) | Guangshuo Ou Lab | Marqueur roller pour enrichir les candidats | |
| Microscope confocal | ZEISS | LSM880 + Airyscan | Valider l'expression/localisation GFP |
| Di-Potassium hydrogen phosphate (K2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7758-11-4 | Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM |
| Di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7558-79-4 | Composant pour la préparation du tampon M9 |
| Ladder d'ADN | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF288-01 | Référence de taille pour les gels d'agarose |
| Armature de plasmide donneuse (pPD95.75) | Addgene | 1494 | Armature pour la construction du donneur HDR |
| Système d'électrophorèse | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | 112-0630 | Séparation des amplicons PCR sur les gels d'agarose pour le criblage des jonctions et le génotypage de zygosité |
| Souche Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Source de nourriture pour les vers | |
| Plasmid de marqueur de co-injection fluorescent (pPD122.11) | Fire Lab | Co-marqueur GFP pour enrichir les candidats | |
| Stéréomicroscope fluorescent | SOPTOP | SZX12-HT | Détection des vers vivants pour les marqueurs de co-injection fluorescents |
| GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF079-plus-01 | Visualisation des bandes d'ADN |
| Capillaires en verre | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Utilisés avec un tireur de pointe pour fabriquer des aiguilles d'injection |
| Huile halocarbone 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | Prévenir la dessiccation pendant l'injection |
| Incubateur | Wuhan Ruihua Instrument & Equipment Co., Ltd. | HP400S | Maintenir les vers à une température standard |
| Sulfate de magnésium (MgSO4) | Sinapharm | CAS: 7487-88-9 | Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM et de tampon M9 |
| Pipettes microcapillaires | KIMBLE | 71900-50 | Chauffées et cassées pour créer un outil de chargement |
| Unité de microinjecteur | Eppendorf | FemtoJet 4i | Délivrer des impulsions de pression contrôlées du mélange d'injection dans la gonade distale via une aiguille de microinjection (commandée par pédale) |
| Verres de couverture de microscope | Fisherbrand | 12545A 22×30-1 | Préparation de tampons d'agarose à 2% pour le montage et l'immobilisation des vers pendant la microinjection; Ouvrir les pointes des aiguilles d'injection contre le bord du porte-objet |
| Microscope pour microinjection | ZEISS | Axio Observer.A1 | Microscope d'injection |
| Tireur de pointe | Sutter Instrument Company | Modèle P97 | Transformer les capillaires en verre en aiguilles d'injection |
| Thermocycleur PCR | Bio-Rad | C1000 Touch Thermal Cycler | Amplification PCR |
| pDD162 (Peft-3::Cas9 + Empty sgRNA) | Addgene | 47549 | Expression de Cas9 + sgRNA |
| Peptone | Gibco | 308723 | Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM |
| Diphosphate de potassium (KH2PO4) | Sinapharm | CAS: 7778-77-0 | Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM et de tampon M9 |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Sinapharm | CAS: 7647-14-5 | Composant pour la préparation de plaques d'agar NGM et de tampon M9 |
| Stéréomicroscope | Motic | K400L | Choisir et monter les vers sur des tampons d'agarose et effectuer les étapes de récupération post-injection |
Références
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 757, 1-16 (2013).
- Ebbing, A., et al. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Dev Cell. 47 (6), 801-813.e6 (2018).
- Li, L., et al. Spatiotemporal single-cell architecture of gene expression in Caenorhabditis elegans germ cells. Cell Discov. 11 (1), 26 (2025).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Fire, A. Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans. Development. 125 (13), 2451-2456 (1998).
- Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., Plasterk, R. H. A. Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences. Genes Dev. 19 (7), 782-787 (2005).
- Merritt, C., Seydoux, G. Transgenic solutions for the germline. WormBook. , 1-21 (2010).
- Frøkjær-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
- Vallin, E., et al. A genome-wide collection of Mos1 transposon insertion mutants for the C. elegans research community. PLoS One. 7 (2), e30482 (2012).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
- Wang, P., et al. Protocol for CRISPR-Cas9-mediated genome editing to study spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 4 (4), 102720 (2023).
- Khan, A. A., et al. A highly efficient ligation-independent cloning system for CRISPR/Cas9-based genome editing in plants. Plant Methods. 13, 86 (2017).
- Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 2 (3), 100748 (2021).
- Rieckher, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans microinjection. Bio Protoc. 7 (19), e2584 (2017).
- Medley, J. C., Hebbar, S., Sydzyik, J. T., Zinovyeva, A. Y. Single nucleotide substitutions effectively block Cas9 and allow for scarless genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 220 (1), iyab199 (2022).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), e833 (2008).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Sci Rep. 6, 20889 (2016).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (native and tissue-specific fluorescence): a strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121-122, 86-93 (2017).
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Réimpressions et autorisations
