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Toutes les expériences impliquant Caenorhabditis elegans ont été menées conformément aux directives institutionnelles pour le soin et l’utilisation des organismes de laboratoire à l’Université normale de Pékin.
Figure 1 : Aperçu du marquage endogène fluorescent médié par CRISPR/Cas9 chez C. elegans. Flux de travail schématique illustrant les principales étapes de la génération et de la validation par knock-in fluorescent endogène. À l’étape de conception et de construction, un gène cible enrichi par la lignée germinale et un site d’insertion sont sélectionnés, pDD162 est utilisé comme plasmide CRISPR/Cas9 pour l’expression de Cas9 et guide de l’ARN, et pPD95.75 est utilisé comme colonne dorsale du donneur dans lequel le label fluorescent (par exemple, GFP) et les bras d’homologie gauche et droit sont sous-clonés. Au stade de microinjection, le mélange d’injection CRISPR/Cas9 (incluant le plasmide gRNA/Cas9, le gabarit donneur et les marqueurs de co-injection) est injecté dans la gonade des jeunes hermaphrodites, suivi d’une récupération sur des plaques ensemencées. Lors de la phase de validation, les progéniture positives au marqueur sont sélectionnées pour le génotypage en aval, incluant l’identification par PCR des événements knock-in et la confirmation par séquençage ADN, et les lignées knock-in réussies sont ensuite examinées par microscopie à fluorescence pour évaluer l’expression germinale et la localisation subcellulaire de la protéine marquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
1. Sélectionner un gène cible enrichi en lignée germinale
- Identifier les gènes candidats ayant une expression prédominante dans les gonades ou les cellules germinales à l’aide de bases de données publiques et de la littérature publiée.
- Sélectionnez un site de marquage approprié en fonction des caractéristiques protéiques. Enregistrez l’isoforme sélectionnée et la position d’insertion de l’étiquette pour la conception en aval de l’ARN guide et du gabarit donneur (Figure 1).
2. Concevoir le modèle d’ARN guide et de donneur
- Identifier une séquence d’ARN-guide (gRNA) de 20 nt en amont d’un motif adjacent au proto-espaceur (PAM ; NGG), la séquence requise pour la reconnaissance Cas9, et la positionner aussi près que possible du site d’insertion du tag prévu.
- Évaluer les gRNA candidats à l’aide d’un outil de conception en ligne (par exemple, l’outil IDT CRISPR) avec le génome de C. elegans sélectionné. Sélectionnez un guide avec une forte efficacité de coupe prédite dans la cible et sans sites prédit à haut risque hors cible.
- Clonez la séquence d’ARNg dans la région entre le promoteur U6 et l’échafaudage d’ARNg au sein de la colonne vertébrale plasmidique d’expression CRISPR.
REMARQUE : Amorces de conception incorporant la séquence d’ARNg comme surplombs. Effectuer une amplification PCR suivie d’un assemblage basé sur la recombinaison homologue, une méthode de clonage indépendante de la ligation qui élimine la digestion enzymatique de restriction et permet un clonage en une étape directement dans le vecteurd’expression 15.
- Confirmez l’insertion correcte par séquençage Sanger.
- Construire le plasmide donneur à l’aide d’une marque fluorescente flanquée d’environ 1 000 pb de bras d’homologie gauche et 1 000 pb droit, dérivés du locus cible.
REMARQUE : Amplifier les bras d’homologie à partir de l’ADN génomique N2 préparé sous forme de lysat de ver en utilisant la digestion de la protéinase K. Les amorces de conception avec 15–20 pb chevauchent le vecteur linéarisé et le balisage fluorescent. Assembler les bras d’homologie et marquer dans la colonne vertébrale via la recombinaison homologue en une seule réaction. Insérez le codon fluorescent immédiatement après le codon de départ ATG pour le marquage N-terminal ou avant le codon d’arrêt pour le marquage C-terminal. Inclure une séquence de liaison entre le gène cible et la marque fluorescente afin de maintenir un bon repliement et une bonne fonction des protéines. Utilisez le lieur pour réduire les interférences stériques entre les partenaires de fusion, et assurez-vous que le lieur et l’étiquette soient insérés dans l’image avec la séquence de codage. Sélectionnez soigneusement le site d’insertion pour éviter de perturber les domaines fonctionnels connus ou prédits, les peptides signaux ou les régions transmembranaires (Fichier supplémentaire 1).
- Introduire des substitutions silencieuses dans la séquence homologue du donneur pour perturber la séquence de liaison PAM ou guide sans modifier la séquence protéique et empêcher la recoupe de Cas9 après intégration.
REMARQUE : Incorporer des mutations ponctuelles synonymes dans des amorces utilisées pour l’amplification du bras d’homologie, ciblant les codons dans la région PAM.
- Confirmer l’intégrité des séquences donneuses à travers les deux bras d’homologie et les jonctions de balises par séquençage de Sanger.
REMARQUE : Conserver les plasmides vérifiés à −20 °C pour un stockage à court terme ou à −80 °C pour un stockage à long terme.
3. Préparez le mélange d’injection
- Assemblez le mélange d’injection en combinant le plasmide d’expression CRISPR, le plasmide donneur (construit sur la base de pPD95,75) et les marqueurs de co-injection dans des ddH₂O stériles pour obtenir un volume final de 10 μL aux concentrations listées dans le Tableau 1.
REMARQUE : Optimiser empiriquement les concentrations afin d’équilibrer la lisibilité des marqueurs, la récupération des candidats et la survie post-injection.
- Centrifugez le mélange d’injection à 10 000 × g pendant 10 à 20 minutes pour pelleter les particules et éviter l’obstruction du capillaire de microinjection.
| Composant | Fonction | Concentration de travail (ng/μL) |
| pDD162 | Plasmide CRISPR/Cas9 (expression de Cas9 et gRNA) | 50-100 |
| Plasmide donneur (dorsale pPD95.75) | Modèle donneur HDR portant une étiquette fluorescente flanquée de bras d’homologie de ~1 kb | 50-100 |
| pRF4 | Marceur de co-injection (phénotype du rouleau) | 50-100 |
| pPD122.11 | Marqueur de co-injection (expression GFP) | 5-10 |
| Stérile ddH2O | Passer au dernier volume | – |
Tableau 1 : Composition du mélange d’injection et fonctions plasmidiques. Le mélange d’injection contient le plasmide d’expression CRISPR, le plasmide donneur, pRF4 et pPD122.11 aux concentrations indiquées, pour un volume total de 10 μL.
4. Chargez et préparez l’aiguille d’injection
- Tirez les capillaires en verre dans des aiguilles de microinjection à l’aide d’un extracteur d’aiguilles configuré pour produire un long conic avec une pointe tranchante adaptée à l’injection gonadique.
REMARQUE : Optimisez empiriquement les paramètres du puller. Exemples de paramètres de départ : chaleur = 540, traction = 20, vitesse = 100.
ATTENTION : Manipulez soigneusement les aiguilles tirées pour éviter les blessures par perforation. Utilisez des pinces lors de la manipulation des aiguilles et jetez les aiguilles usagées dans un contenant à objets tranchants.
- Chauffez une pipette microcapillaire et cassez-la en deux parties pour créer un outil de chargement.
REMARQUE : Des embouts de chargement commerciaux peuvent être utilisés comme alternative.
- Fixez une ampoule aspiratrice en caoutchouc à l’extrémité large de la pipette microcapillaire raccourcie.
- Aspirez environ 1 μL de mélange d’injection clarifiée en surnageant dans le chargeur.
REMARQUE : Le volume exact n’est pas critique. Assurez-vous que la solution remplit bien la pointe de l’aiguille.
- Insérez le chargeur à l’arrière de l’aiguille d’injection et distribuez doucement le mélange d’injection.
- Placez l’aiguille chargée à l’horizontale pendant 10 minutes pour permettre à la solution de se déposer vers la pointe et confirmez une colonne continue.
- Montez l’aiguille sur le microscope d’injection et mettez la pointe au point à l’aide d’optiques à champ clair.
- Ouvrez la pointe de l’aiguille en la touchant doucement avec le bord d’une toile de couverture dans de l’huile d’halocarbone et testez le flot.
REMARQUE : Ajustez la pression d’injection (30–80 psi) pour générer une bulle approximativement égale au diamètre de la gonade dans un délai de 1 s16.
5. Préparer les vers pour l’injection
REMARQUE : Préparez les plaques de milieu de croissance nématode (NGM) et le tampon M9 comme décritprécédemment 17. Maintenir les vers sur des plaques ensemées d’Escherichia coli OP50 (dorénavant OP50) et effectuer des injections en arrière-plan N2.
- Sélectionnez des hermaphrodites L4 dans une plaque saine et incubez à 20 °C pendant 10 heures pour obtenir de jeunes adultes aux lignées germinales bien développées.
- Transférez les vers dans une assiette non semée pour réduire la transmission bactérienne.
- Préparez un tampon sec d’agarose à 2 % sur une lame en verre et appliquez une goutte d’huile d’halocarbone.
- Transférez un ver sur le coussinet d’agarose à l’aide d’un cueillette à cils.
- Immobilisez le ver et orientez la gonade pour l’injection.
ATTENTION : Effectuez les injections dans les 20 à 30 minutes pour éviter la dessiccation.
6. Effectuer une microinjection gonadiale
Figure 2 : Localisation du syncytium gonade distal pour microinjection chez le jeune adulte C. eleganshermaphrodites. (A) Image en champ clair à faible grossissement d’un jeune adulte hermaphrodite monté. Les deux bras gonades sont visibles ; Le site d’injection est indiqué pour un bras (flèche) comme exemple représentatif. La région encapsulée marque la zone représentée à un grossissement plus élevé dans le panneau B. (B) Vue DIC à plus grand grossissement de la gonade distale correspondant à la région encapsulée du panneau A. La flèche indique la position d’injection dans le syncytium gonadique distal, où le mélange d’injection est délivré. Barres d’échelle : 100 μm (A) et 20 μm (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
- Localiser un ver immobilisé et identifier la gonade à l’aide d’un objectif à faible grossissement.
- Positionnez l’aiguille à l’aide de contrôles micromanipulateurs.
- Orientez le ver à un angle de 20 à 40° par rapport à l’aiguille.
- Concentrez-vous sur la lignée germinale distale en utilisant un grossissement plus élevé.
- Avancez le ver vers l’aiguille et positionnez la pointe dans le syncytium gonadal (Figure 2).
- Injectez la solution et confirmez l’administration par gonade visible et gonade.
REMARQUE : Optimisez la pression d’injection (30–80 psi), la pression de compensation (0,1–0,5 psi) et la durée d’injection (0,1–0,3 s).
ATTENTION : Une pression ou un volume excessifs peuvent provoquer la rupture des vers.
- Retirez l’aiguille et repositionnez-la pour les injections suivantes.
REMARQUE : Effectuer une injection unilatérale pour maximiser la survie, ou une injection bilatérale pour augmenter l’efficacité du montage.
- Ajoutez un tampon M9 pour libérer les vers et transférez chaque vers sur une plaque de récupération individuelle.
- Répétez les injections pour 20 à 25 vers.
REMARQUE : Remplacez l’aiguille si elle se bouche ou s’abîme.
- Incubez les vers injectés à 20 °C pendant 2 à 3 jours pour permettre la récupération.
7. Filtrer les candidats F1 pour identifier les lignes knock-in-positives
- Criblez la progéniture F1 pour détecter des marqueurs de co-injection et sélectionnez des animaux positifs au marqueur.
REMARQUE : Des exemples de marqueurs alternatifs de co-injection fluorescente présentant une spécificité tissulaire et des propriétés spectrales différentes sont fournis dans le Tableau Supplémentaire 1.
REMARQUE : Sélectionnez des animaux exprimant les deux marqueurs pour une meilleure fiabilité. Priorisez les couvées à haute fréquence de marqueurs (« progénitules jackpot »).
- Transférez chaque ver F1 sur une plaque individuelle et laissez pondre des œufs pendant 1 à 2 jours.
- Lysez chaque ver F1 dans un tampon de protéinase K pour préparer des modèles PCR.
REMARQUE : Conserver les lysats à −80 °C si ce n’est pas traité immédiatement.
- Effectuez la PCR par jonction en utilisant une amorce génomique en dehors du bras d’homologie et une amorce interne de la marque.
REMARQUE : Conserver les plaques correspondantes des animaux F1 positifs à la PCR.
8. Criblage de la progéniture F2 pour isoler les lignées de knock-in homozygotes et confirmer l’intégration
- Isoler la progéniture F2 des lignées F1 PCR positives sur des plaques individuelles.
- Permettre aux vers F2 de produire des descendants et de lyser les adultes pour le génottypage.
REMARQUE : Conserver les lysats à −20 °C si nécessaire.
- Effectuer la PCR à l’aide d’amorces flanquant les bras d’homologie pour distinguer les allèles de type sauvage et les allèles knock-in par la taille du produit.
- Confirmez l’intégration correcte par séquençage de Sanger à travers les deux jonctions d’insertion.
- Vérifiez l’expression et la localisation de la fluorescence germinale à l’aide de la microscopie à fluorescence.
- Élargissez les lignées homozygotes confirmées et maintenez les stocks.
REMARQUE : Cryopreserve validait les lignes pour un stockage à long terme.