Effets de la régulation de l’expression de SPRY2 et miR-590-5p sur l’autophagie chez les chondrocytes modèles d’arthrose humaine

Résumé

Le stress inflammatoire dans un modèle de chondrocytes C28/I2 induit par l’IL-1β a augmenté le miR-590-5p et réduit l’expression de SPRY2. La modulation de cet axe a modifié l’expression de Beclin-1, LC3-II et Bcl-2, suggérant une voie de régulation putative miR-590-5p/SPRY2 qui pourrait influencer les réponses associées à l’autophagie et la survie des chondrocytes dans l’arthrose.

Résumé

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative articulaire répandue caractérisée par une destruction progressive du cartilage et une perte de l’homéostasie des chondrocytes. Bien qu’une autophagie dysrégulée contribue à la pathogenèse de l’arthrosite, les mécanismes moléculaires régissant les réponses associées à l’autophagie chez les chondrocytes restent incomplètement comprises. Cette étude a examiné le rôle de l’axe régulateur miR-590-5p/SPRY2 dans un microenvironnement inflammatoire OA en utilisant des chondrocytes humains C28/I2 induits par l’IL-1β. Un modèle d’OA in vitro a été établi en traitant les cellules C28/I2 avec IL-1β. L’expression de miR-590-5p et SPRY2 a été évaluée à l’aide de la PCR quantitative et du Western blotting. Des approches de gain et de perte de fonction ont été employées pour évaluer les effets de SPRY2 et miR-590-5p sur les marqueurs associés à l’autophagie Beclin-1 et LC3-II, ainsi que sur la protéine liée à la survie Bcl-2. Des analyses bioinformatiques et des expériences de sauvetage ont été utilisées pour étudier la relation régulatrice entre miR-590-5p et SPRY2. Le traitement par IL-1β a significativement augmenté l’expression de miR-590-5p tout en réduisant les niveaux d’ARNm et de protéines SPRY2 (P < 0,05). La surexpression de SPRY2 a nettement diminué l’expression de Beclin-1 et LC3-II, avec des réductions d’environ 65 % et 77 % respectivement (P < 0,05). En revanche, la surexpression de miR-590-5p a augmenté l’expression de Beclin-1, LC3-II et Bcl-2, tandis que l’inhibition de miR-590-5p a inversé ces effets et rétabli l’expression de SPRY2. Les analyses fonctionnelles ont soutenu SPRY2 comme cible réglementaire potentielle en aval du miR-590-5p. Ces résultats identifient l’axe miR-590-5p/SPRY2 comme un régulateur important de l’expression des marqueurs associés à l’autophagie et de la survie des chondrocytes dans des conditions inflammatoires, et suggèrent sa pertinence potentielle en tant que cible thérapeutique dans l’arthrose.

Introduction

En tant que forme d’arthrite la plus répandue dans le monde, l’arthrose (OA) est une cause majeure de douleur, de troubles de la mobilité et d’incapacité physique, imposant un fardeau important aux systèmes de santé et à la^{société 1}. Pathologiquement, l’arthrose se caractérise par une dégénérescence progressive du cartilage articulaire, une inflammation synoviale et un remodelage pathologique de l’os^{sous-chondral 1}. Les estimations épidémiologiques indiquent qu’environ 303 millions de personnes dans le monde sont touchées par l’arthrose, et ce chiffre devrait augmenter avec le vieillissement de la population et l’augmentation des taux^{d’obésité 2}. En Chine, la prévalence de l’arthrose symptomatique du genou est estimée à 8,1 %, avec une prévalence disproportionnément plus élevée chez les femmes et les populations^{rurales 3}. Malgré sa forte prévalence, les options de traitement actuelles restent largement limitées à la gestion des symptômes par des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et à une intervention chirurgicale pour la maladie^{avancée 4}. L’absence de médicaments modificateurs de la maladie contre l’arthrose (DMOAD) reflète une compréhension incomplète des mécanismes moléculaires régissant l’homéostasie et la survie des^{chondrocytes 5}.

L’intégrité structurelle et fonctionnelle du cartilage articulaire dépend des chondrocytes résidents, qui maintiennent le renouvellement de la matrice extracellulaire (ECM) grâce à un équilibre entre les activités anaboliques et^{cataboliques 6}. Au cours de la progression de l’OA, les chondrocytes sont exposés à un stress mécanique anormal et à des médiateurs pro-inflammatoires, en particulier l’interleukine-1β (IL-1 β) et le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), qui favorisent un passage de la synthèse matricielle à la dégradation^{de la matrice 6}. L’IL-1 β contribue à la destruction du cartilage en stimulant la production de métalloprotéinases matricielles (MMP) et d’aggrécanases tout en supprimant la synthèse du collagène de type II et des protéoglycanes⁷. De plus, l’IL-1β induit un stress oxydatif et un dysfonctionnement mitochondrial, conduisant à l’apoptose des chondrocytes et à la^{sénescence 8}. Par conséquent, l’identification des voies de signalisation intracellulaires qui régulent la survie des chondrocytes dans des conditions inflammatoires reste une priorité pour la recherche sur l’OA.

L’autophagie est une voie de dégradation lysosomale conservée évolutivement qui maintient l’homéostasie cellulaire par l’élimination et le recyclage des organites et des agrégats protéiques^{endommagés 9}. L’autophagie basale est essentielle à la survie cellulaire et à l’équilibre énergétique ; Cependant, une autophagie déréglée peut contribuer à la progression de la maladie⁹. Dans l’arthrose, l’autophagie est généralement considérée comme une réponse protectrice qui aide les chondrocytes à s’adapter au stress cellulaire et à résister à^{l’apoptose.} Des études antérieures ont suggéré que l’activité autophagique diminue au cours de la progression de l’arthrose, en particulier dans les maladies à un stade avancé, entraînant un contrôle de qualité cellulaire altéré et une perte accrue^{des chondrocytes.} Plusieurs protéines sont couramment utilisées comme indicateurs de l’activité associée à l’autophagie. Beclin-1 participe à l’initiation de l’autophagosome, tandis que la conversion de la chaîne légère 3 de la protéine 1 associée aux microtubules (LC3-I en LC3-II) est largement utilisée comme marqueur de la formation de l’autophagosome¹². En revanche, le lymphome à cellules B 2 (Bcl-2) inhibe l’autophagie dépendante de Beclin-1 tout en exerçant des effets anti-apoptotiques¹³. Néanmoins, l’interprétation des marqueurs associés à l’autophagie nécessite une prudence car les mesures statiques de LC3-II et Beclin-1 ne peuvent pas distinguer de manière indépendante la formation accrue d’autophagosomes de la dégradation lysosomale altérée. Malgré ces limitations, la modulation des voies liées à l’autophagie reste une stratégie thérapeutique prometteuse pour l’arthrose.

Les microARN (miARN) sont de courts ARN non codants qui régulent l’expression génique post-transcriptionnelle en se liant à des séquences complémentaires dans les régions 3′-non traduites (3′-UTR) des ARN messagers cibles, entraînant une dégradation ou une répression^{translationnelle de l’ARNm 14}. Une expression aberrante de miARN a été impliquée dans la pathogenèse de l’OA par des effets sur l’inflammation, l’apoptose et le remodelage de la^{MCE 15}. Parmi ces molécules, le miR-590-5p a attiré l’attention en raison de ses rôles régulateurs dans le métabolisme osseux et d’autres processus pathologiques. Des études antérieures ont montré que miR-590-5p favorise la différenciation ostéogénique et supprime l’adipogenèse dans les cellules souches mésenchymateuses¹⁶. Dans les modèles cancéreux, miR-590-5p présente des fonctions dépendantes du contexte, soit en tant que régulateur oncogénique soit en tant que régulateur suppresseur^{tumoral 17}. De plus, des profils d’expression de microARN modifiés, y compris des membres de la famille miR-590, ont été impliqués dans le remodelage pathologique des tissus articulaires lors de^{l’OA 18}. Cependant, les preuves obtenues à partir de modèles de cellules souches ou de cancer ne peuvent pas être directement extrapolées aux chondrocytes articulaires matures. Par conséquent, le rôle du miR-590-5p dans la régulation des réponses des chondrocytes au sein du microenvironnement inflammatoire de l’OA reste incomplètement compris.

Pour étudier les mécanismes potentiels en aval de miR-590-5p dans l’OA, des analyses de prédiction de cible in silico ont été réalisées, identifiant Sprouty2 (SPRY2) comme cible potentielle en aval. SPRY2 appartient à la famille des protéines Sprouty, qui régulent négativement la signalisation des récepteurs tyrosine kinase et suppriment l’activation de la voie RAS/MAPK/^{ERK 19}. Parce que la signalisation MAPK influence la différenciation des chondrocytes, les réponses inflammatoires et l’autophagie, SPRY2 pourrait représenter un nœud régulateur important dans la physiopathologie^{de l’arthrose 20}. Des études antérieures indiquent que SPRY2 peut supprimer les réponses inflammatoires^{dans les modèles} 21 de polyarthrite rhumatoïde, participer à la régulation liée à l’apoptose dans les systèmes épithéliaux²², et être associé à des réponses liées à l’autophagie dans les modèles de lésions ischémiques²³. Bien que ces observations suggèrent que SPRY2 participe à la régulation à la fois de l’apoptose et de l’autophagie, son rôle dans les chondrocytes articulaires reste peu caractérisé. Il a donc été émis l’hypothèse que miR-590-5p et SPRY2 forment un axe régulateur qui influence la survie des chondrocytes sous stress inflammatoire.

Sur la base de ces observations, il a été proposé que miR-590-5p module les réponses associées à l’autophagie dans les chondrocytes en régulant l’expression de SPRY2. Bien que miR-590-5p et SPRY2 aient chacun été étudiés individuellement dans d’autres contextes biologiques, leur relation fonctionnelle dans les chondrocytes OA n’a pas été établie. Dans la présente étude, un modèle d’OA induit par IL-1β chez des chondrocytes humains C28/I2 a été utilisé pour examiner les schémas d’expression de miR-590-5p et SPRY2 et pour évaluer leurs effets sur l’expression de Beclin-1, LC3-II et Bcl-2. En étudiant l’axe régulateur miR-590-5p/SPRY2, cette étude fournit un éclairage sur les mécanismes épigénétiques sous-jacents à la survie des chondrocytes et identifie une cible thérapeutique potentielle pour l’arthrose.

Protocole

Cette étude a été menée exclusivement avec la lignée cellulaire de chondrocytes humains C28/I2, disponible commercialement. Aucun participant humain, échantillon de tissus humain, matériel dérivé des patients ou animal vivant n’a participé à cette recherche. Par conséquent, l’approbation du Conseil d’Éthique Institutionnelle (IRB) et celle du Comité de Soins et d’Utilisation des Animaux Institutionnels (IACUC) n’étaient pas requises conformément aux directives institutionnelles et nationales. Les outils, produits chimiques, kits et réactifs utilisés dans le protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Culture cellulaire et construction de modèles d’OA

La lignée cellulaire de chondrocytes humains C28/I2 (détails fournis dans le tableau des matériaux) a été obtenue auprès d’un fournisseur commercial. Pour garantir la reproductibilité expérimentale, les cellules ont été authentifiées par profilage en tandem court (STR) et testées régulièrement pour confirmer l’absence de contamination par mycoplasme. Des cellules entre les passages 3 et 8 ont été utilisées pour toutes les expériences. Les cellules ont été maintenues dans le DMEM complétées avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (tous les réactifs de culture sont détaillés dans le Tableau des matériaux) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.

Pour établir le modèle d’arthrose in vitro (OA), les cellules C28/I2 ont été stimulées avec de l’IL-1β humain recombinant. Sur la base de la littérature^{établie 6,7}, des expériences préliminaires d’optimisation dose-réponse conçues pour induire un état catabolique robuste sans cytotoxicité immédiate excessive, les cellules ont été traitées avec 20 ng/mL d’IL-1β pendant 24 heures.

2. Regroupement expérimental et transfection

Pour élucider les voies mécanistiques, l’étude a été divisée en trois modules expérimentaux principaux, chacun comportant au moins trois réplications biologiques indépendantes :

1. Gain / perte de fonction SPRY2 :
   Les cellules ont été assignées au Contrôle, modèle OA, OA + vecteur vide (NC), plasmide de surexpression OA + SPRY2 (OE-SPRY2), ainsi qu’aux petits groupes d’ARN interférents correspondants (si-NC et trois constructions spécifiques si-SPRY2 : si-695, si-800, si-896) pour évaluer l’efficacité des interférences.
2. Modulation miR-590-5p :
   Les cellules ont été divisées en groupes témoins, modèle OA, OA + mimimique NC, OA + miR-590-5p mimique, OA + inhibiteur NC, et OA + miR-590-5p inhibiteurs.
3. Validation fonctionnelle de la relation réglementaire miR-590-5p/SPRY2 :
   Pour évaluer davantage la relation régulatrice proposée entre miR-590-5p et SPRY2, des cellules ont été soumises à des conditions miMétiques et inhibitrices de miR-590-5p afin de déterminer si la modulation miR-590-5p modifiait l’expression de SPRY2 dans le modèle OA.
   Pour la transfection, les cellules C28/I2 ont été ensemencées en plaques à 6 puits à 2 × 10 cellules⁵ par puits. À une confluence de 70 % à 80 %, les transfections ont été effectuées à l’aide d’un réactif commercial à base de lipides selon le protocole du fabricant et les procédures établies pour la délivrance de petits ARN dans les^{chondrocytes 24}. En résumé, les plasmides (OE-SPRY2 et NC ; 2 μg/puits) et les oligonucléotides (miR-590-5p mimic/inhibiteur et siARN ; 50 nM) ont été dilués dans un milieu sérique réduit. Les complexes ADN-lipid/ARN ont été incubés à température ambiante pendant 15 minutes avant d’être ajoutés goutte à goutte aux cellules dans le DMEM sans sérum. 6 h après la transfection, le milieu a été remplacé par un DMEM complet contenant 10 % de FBS, et les cellules ont été cultivées pendant 48 heures supplémentaires avant l’extraction de l’ARN et des protéines.

3. détection qPCR

L’ARN total et le miARN ont été isolés à l’aide d’un kit d’extraction dédié selon le protocole du fabricant. La pureté et la concentration de l’ARN ont été évaluées à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis, et des échantillons avec des rapports A260/A280 de 1,8–2,0 ont été utilisés pour des analyses en aval. Des réactifs commerciaux à transcription inverse ont été utilisés pour synthétiser l’ADNc. La procédure de cycle qPCR était la suivante : 95 °C pendant 10 minutes ; 40 cycles de 95 °C pendant 10 s, 58 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ; suivie d’une analyse de la courbe de fusion pour vérifier la spécificité de l’amorce et l’absence de dimers d’amorce. β-actine et U6 servaient respectivement de contrôles internes pour l’ARNm et le miARN. L’expression relative des gènes a été calculée à l’aide de la méthode ^{2-ΔΔCt 25}. Toutes les séquences d’amorce, y compris celles de Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p et gènes de référence, sont listées dans le Tableau 1.

Nom d’introduction	Amorce avant (5′-3′)	Amorce inversée (5′-3′)
U6	ATTGGAACGATACAGAAGATT	GGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5p	GCGTAAGGCACGCGGTG	AGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actine	TGGCACCCAGCACAATGAA	CTAAGTCATAGTCCCCCCTAGAAGCA
SPRY2	TAAGCCACTGAGCAAGGAAGAT	TGGAAGGTAACACCATAAAAAGG
BCL-2	TGGGATTCCTGCGGATTGAC	TCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1	TCCCGTGGAATGGAATGAATGAGA	GTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTCTG
LC3-II	CATCCAACCAAAATCCCGGT	GAGCTGTAAGCGCCTTTTTTAA

Tableau 1 : Séquences d’amorces utilisées pour l’analyse quantitative PCR (qPCR). Séquences d’amorces avant et arrière utilisées pour l’amplification et la quantification des transcripts cibles et les contrôles internes de référence par qPCR.

Sauf indication contraire, les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (DE). La signification statistique a été déterminée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc S-N-K. Les symboles indiquent : *P < 0,05 vs. Control ; #P < 0,05 vs. le modèle indiqué ou le groupe témoin négatif ; &P < 0,05 vs. OA+Inhibiteur-NC.

4. Détection des taches occidentales

Les cellules ont été prélevées et lysées à l’aide d’un tampon RIPA complété par des cocktails d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase, suivant des procédures établies d’extraction protéique et d’immunoblotting. Après centrifugation à 14 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires, le surnageant a été collecté, et les concentrations de protéines quantifiées à l’aide d’un kit de test protéique BCA. Des quantités égales de lysat protéique (30 μg) ont été dénaturées, résolues par SDS-PAGE pendant 1,5 heure, puis transférées sur les membranes PVDF à 300 mA pendant 1,5^{h 26}. Les membranes ont été obstruées avec 5 % de lait écrémé dans une solution séline Tween 20 (TBST) contenant 0,1 % de Tween 20 (TBST) pendant 1 heure à température ambiante, suivie d’une incubation à 4 °C pendant 16 heures avec des anticorps primaires spécifiques (par exemple, anti-SPRY2, dilution 1:1000). Après trois lavages dans le TBST, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués au HRP appropriés à température ambiante pendant 2 heures. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un système de détection ECL et quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ.

5. Analyse statistique

Les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Toutes les expériences ont été réalisées avec au moins trois réplications biologiques indépendantes (n ≥ 3), et les données quantitatives sont présentées comme la moyenne ± l’écart type (DE). Avant les tests paramétriques, la normalité des données était évaluée à l’aide du test de Shapiro-Wilk, et l’homogénéité de la variance était évaluée. La signification statistique entre plusieurs groupes a été évaluée à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivie du test Student-Newman-Keuls (S-N-K) à posteriori pour les comparaisons multiples. P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Établissement du modèle inflammatoire des chondrocytes in vitro

Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la pathologie de l’arthrose, un modèle inflammatoire in vitro a été établi à partir de chondrocytes humains C28/I2 stimulés avec IL-1β. La validité de ce modèle a été confirmée par l’évaluation de l’expression de la chaîne alpha-1 de type II (Col-II), un composant principal de la matrice extracellulaire du cartilage hyalin et une caractéristique des chondrocytes sains. L’analyse quantitative a révélé que l’exposition à l’IL-1β a conduit à une réduction statistiquement significative de l’expression de l’ARNm du Col-II par rapport au groupe témoin. Cette altération phénotypique indique un passage initial vers un état catabolique ressemblant au microenvironnement ostéoarthritique, fournissant ainsi un modèle fondamental pour les études mécanistiques ultérieures (Figure 1).

Figure 1 : Établissement du modèle in vitro de l’arthrose (OA) chez les chondrocytes humains C28/I2. Les cellules ont été traitées avec 20 ng/mL d’IL-1β pendant 24 heures. L’expression relative de l’ARNm de Col-II a été déterminée par qPCR, avec β-actine servant de contrôle de normalisation. Les données sont présentées comme la moyenne ± l’écart-type (DE) de trois réplications biologiques indépendantes (n = 3). L’analyse statistique a été réalisée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle. *P < 0,05 comparé au groupe de contrôle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Validation de l’efficacité de surexpression SPRY2 dans les cellules C28/I2

Avant d’évaluer le rôle fonctionnel de Sprouty2 (SPRY2) dans ce modèle, l’efficacité de transfection du vecteur de surexpression SPRY2 a été vérifiée. Les chondrocytes ont été transfectés soit avec le plasmide de surexpression (OE), soit avec un vecteur vide témoin négatif (NC). Les analyses qPCR et Western blot ont toutes deux montré une régulation à la hausse robuste de SPRY2 aux niveaux d’ARNm et de protéines dans le groupe OE, comparé aux groupes NC et non traités. Ces données, présentées à la Figure 2, confirment que le système expérimental a maintenu des niveaux élevés de SPRY2, permettant d’étudier ses effets biologiques spécifiques.

Figure 2 : Validation de la surexpression SPRY2 dans les chondrocytes C28/I2. Les cellules ont été transfectées soit avec un vecteur vide (NC), soit avec un plasmide de surexpression SPRY2 (OE). Les niveaux relatifs d’ARNm et de protéines de SPRY2 ont été évalués respectivement par qPCR et Western blot. β-actine était utilisée comme contrôle interne de charge. Les données sont exprimées en moyenne ± DE (n = 3). *P < 0,05 comparé au groupe NC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

La surexpression de SPRY2 atténue l’autophagie et module les marqueurs d’apoptose dans des conditions inflammatoires

Des expériences ultérieures ont cherché à déterminer si SPRY2 agit comme régulateur de l’autophagie et de l’apoptose dans le contexte inflammatoire. Après l’établissement du modèle d’OA, le traitement à IL-1β seul a induit une augmentation marquée des marqueurs d’autophagie Beclin-1 et LC3-II, suggérant une réponse autophagique compensatoire au stress inflammatoire. Parallèlement, l’expression de Bcl-2 était élevée dans le groupe modèle. Cependant, l’introduction du vecteur de surexpression SPRY2 a considérablement modifié ce profil. Comme illustré à la Figure 3, le groupe Model+OE-SPRY2 a montré une réduction significative des niveaux d’ARNm de Beclin-1 et LC3-II par rapport aux groupes Modèle et Modèle+NC. De plus, la surexpression de SPRY2 a atténué l’élévation de Bcl-2 induite par l’inflammation. Ces résultats suggèrent que SPRY2 régule négativement l’expression des marqueurs associés à l’autophagie dans les chondrocytes inflammatoires.

Figure 3 : La surexpression de SPRY2 atténue l’autophagie et module les marqueurs d’apoptose dans des conditions inflammatoires induites par l’IL-1β. Les niveaux relatifs d’expression d’ARNm de SPRY2, Bcl-2, Beclin-1 et LC3-II ont été quantifiés par qPCR dans les groupes témoin, modèle (traité par IL-1β), Modèle+NC et Modèl+OE-SPRY2. β-actine servait de contrôle interne. Les données sont présentées comme la moyenne ± DE (n = 3). La signification statistique a été déterminée par une ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc S-N-K. *P < 0,05 comparé au groupe de contrôle ; #P < 0,05 comparé au groupe Modèle+NC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

miR-590-5p augmente les marqueurs associés à l’autophagie et favorise la survie des chondrocytes

Ensuite, l’impact fonctionnel de miR-590-5p sur les marqueurs associés à l’autophagie et à la survie a été étudié. Comme montré à la Figure 4, la transfection avec un miR-590-5p mimétique dans le modèle OA a significativement augmenté l’expression de Bcl-2, Beclin-1 et LC3-II, contrairement aux effets inhibiteurs observés après la surexpression de SPRY2. Inversement, l’inhibition de miR-590-5p a nettement réduit l’expression de Bcl-2 et Beclin-1, tandis que la réduction de LC3-II n’a pas atteint la signification statistique. Ces résultats suggèrent que miR-590-5p augmente l’expression des marqueurs associés à l’autophagie et du Bcl-2 lié à la survie dans les chondrocytes, ce qui justifie une investigation approfondie de ses cibles régulatrices potentielles en aval.

Figure 4 : miR-590-5p augmente l’expression des marqueurs associés à l’autophagie et l’expression de Bcl-2 liée à la survie. Les niveaux relatifs d’expression d’ARNm de Bcl-2, Beclin-1 et LC3-II ont été mesurés par qPCR dans le modèle OA après transfection avec un miMique, un inhibiteur ou leurs contrôles négatifs (NC) respectifs. β-actine servait de contrôle de la normalisation. Les données sont indiquées par la moyenne ± DS (n = 3). *P < 0,05 comparé au groupe Modèle+Mimic-NC ; #P < 0,05 comparé au groupe Modèle+Inhibiteur-NC (pour Bcl-2 et Beclin-1). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

IL-1β module l’expression de l’axe miR-590-5p/SPRY2 et du marqueur associé à l’autophagie

Pour élucider les mécanismes régulateurs en amont contrôlant SPRY2 et sa relation avec miR-590-5p, leurs profils d’expression ont été examinés dans des conditions inflammatoires. Après observation morphologique du modèle cellulaire C28/I2 induit par l’IL-1β (Figure 5A), les efficacités de transfection pour la manipulation génétique SPRY2 ont été vérifiées. Les analyses qPCR et Western blot ont toutes deux confirmé une régulation à la hausse robuste de SPRY2 dans le groupe de surexpression (OE) et un knockdown réussi chez les petits groupes d’ARN interférant (siRNA) par rapport à leurs témoins respectifs (Figures 5B et 5C). Inversement, les niveaux de miR-590-5p ont été significativement augmentés après le traitement à l’IL-1β.

Figure 5 : Observation morphologique et validation des efficacités de transfection SPRY2. (A) Observation morphologique des cellules C28/I2 après traitement à IL-1β (20×, micrographie par contraste de phase). (B) Niveaux relatifs d’expression d’ARNm et de protéines de SPRY2 dans les groupes témoins, NC et SPRY2 de surexpression (OE). (C) Images Western blot représentatives confirmant la surexpression de SPRY2 (à gauche) et le knockdown de SPRY2 par des siRNA spécifiques (si-896, si-800, si-695) par rapport aux témoins (à droite). β-actine servait de contrôle interne de charge. Les données sont exprimées en moyenne ± DE (n = 3). *P < 0,05 comparé au groupe de contrôle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Pour déterminer si ce schéma d’expression inverse reflétait une relation régulatrice potentielle, TargetScan Human 7.1 a été utilisé pour identifier un site de liaison putatif de 8 mers pour has-miR-590-5p dans le 3′-UTR de SPRY2 humain (nucléotides 236–243). L’alignement des séquences à la Figure 6 illustre la complémentarité prédite entre la région graine et la région. Des expériences de sauvetage ont ensuite été réalisées pour examiner fonctionnellement si la modulation miR-590-5p modifiait l’expression de SPRY2 dans le modèle OA. Après confirmation des efficacités de transfection du mimique et inhibiteur de miR-590-5p (Figures 7A, B), les tests de sauvetage ont montré que l’inhibition de miR-590-5p inversait la suppression associée à l’OA de l’expression de l’ARNm SPRY2 (Figure 7C). Le miMétique miR-590-5p n’a pas davantage réduit l’expression de SPRY2 au-delà de la suppression marquée induite par IL-1β, tandis que l’inhibition de miR-590-5p a significativement augmenté l’expression de SPRY2 par rapport au contrôle inhibiteur négatif. Ces résultats soutiennent une relation régulatrice inverse et présumée entre miR-590-5p et SPRY2 dans les chondrocytes inflammatoires.

Figure 6 : Prédiction in silico de l’interaction réglementaire supposée miR-590-5p/SPRY2. Une analyse bioinformatique a été réalisée à l’aide de TargetScan Human 7.1^31,32 pour identifier les sites de liaison présumés aux miARN. Le schéma illustre l’alignement prédit des séquences et la complémentarité des régions graines entre has-miR-590-5p et le 3′-UTR de SPRY2 humain (nucléotides 236–243). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : Effets de la modulation de miR-590-5p sur l’expression de SPRY2 dans les chondrocytes. Les efficacités de transfection ont été confirmées par qPCR pour le miMique (A) et l’inhibiteur (B) de miR-590-5p par rapport à leurs témoins respectifs. (C) L’expression relative de l’ARNm SPRY2 a été mesurée parmi les groupes expérimentaux indiqués après la modulation miR-590-5p dans le modèle OA. L’U6 et la β-actine ont été utilisés comme contrôles internes pour la quantification des miARN et des ARNm, respectivement. Les données sont présentées en moyenne ± DE (n = 3). *P < 0,05 comparé au groupe de contrôle ; #P < 0,05 par rapport au groupe Mimic-NC ou inhibiteur correspondant ; &P < 0,05 comparé au groupe OA+Inhibiteur-NC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Conformément aux résultats de la Figure 4, les changements des marqueurs associés à l’autophagie ont été parallèles aux effets attendus d’une diminution de l’expression de SPRY2, suggérant que miR-590-5p pourrait améliorer leur expression en soulageant l’inhibition médiée par SPRY2. Pris ensemble, ces résultats soutiennent un axe de signalisation présumé dans lequel IL-1β augmente la miR-590-5p, miR-590-5p supprime l’expression de SPRY2, et une réduction de SPRY2 est associée à une expression accrue des marqueurs Beclin-1 et LC3-II.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :

Les données de cette étude sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 1.

Fichier supplémentaire 1 : Les ensembles de données utilisés pour cette étude, y compris les données sources qPCR, les images sources de Western blot et les résultats d’analyses statistiques.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Des études antérieures ont montré que les miARN régulent l’autophagie à plusieurs stades, notamment l’initiation, l’allongement vésiculaire et^{la maturation 27}. L’implication des miARN dans la pathogenèse de l’AA a été de plus en plus documentée, notamment à travers les effets sur l’inflammation, l’apoptose, le remodelage de la matrice extracellulaire et les voies liées à l’autophagie. miR-590-5p a été associé à l’homéostasie cellulaire et aux processus associés^{au cancer 28,29,30}. Dans les contextes squelettiques et liés au cartilage, miR-590-5p a été rapporté comme favorisant la différenciation chondrogénique des cellules souches mésenchymateuses humaines 16, tandis que dans les modèles de chondrocytes OA, il peut réguler la prolifération, l’apoptose et les réponses inflammatoires en ciblant^{FGF 18,24}. Cependant, il reste incertain si le miR-590-5p affecte les réponses liées à l’autophagie chez les chondrocytes d’OA.

Par conséquent, RNAInter et TargetScan ont été utilisés pour explorer des médiateurs potentiels en aval, et les deux analyses ont suggéré que SPRY2 serait une cible associée à miR-590-5p présumée. TargetScan Human 7.1^31,32 a identifié un site de liaison prédit de 8 mécimères à la région graine aux nucléotides 236–243 du SPRY2 3′-UTR (Figure 6). SPRY2 est un régulateur négatif de la signalisation réceptrice tyrosine kinase/MAPK et s’exprime dans plusieurs^{tissus 19}. Le transfert de gènes intraarticulaire SPRY2 a été rapporté pour atténuer l’arthrite induite par adjuvant chez^{les rats 21}. La surexpression de SPRY2 peut inhiber la croissance, l’invasion, la migration et la cytokinèse cellulaires médiées par HGF/^{SF (33}), tandis que la perte de la fonction Spry2 a été associée à l’hyperactivation de MAPK-ERK et à une prolifération accrue des cellules^{B 34}. SPRY2 a également été impliqué dans la régulation²² liée à l’apoptose, le contrôle de la migration associé aux^{miARN 35}, et les réponses liées à l’autophagie dans les modèles^{ischémiques 23}. Ensemble, ces études soutiennent SPRY2 comme un nœud régulateur reliant la signalisation inflammatoire, les voies liées à la survie et les réponses associées à l’autophagie.

Compte tenu de la relation jusque-là non rapportée entre miR-590-5p et SPRY2 dans les chondrocytes OA, la prédiction bioinformatique de leur interaction potentielle a incité à poursuivre les investigations expérimentales. Les résultats présents ont montré que SPRY2 était significativement régulé à la baisse tandis que miR-590-5p était surélevé dans les chondrocytes C28/I2 stimulés par IL-1β, ce qui implique cet axe dans les réponses inflammatoires des chondrocytes. Sur le plan fonctionnel, la surexpression de SPRY2 a diminué l’expression de Beclin-1 et LC3-II, soutenant un effet inhibiteur sur l’expression des marqueurs associés à l’autophagie. Inversement, l’inhibition de miR-590-5p a réduit l’expression de Beclin-1 et Bcl-2 et rétabli l’expression de SPRY2, conformément à une relation de régulation inverse supposée. Parce que Bcl-2 peut inhiber l’autophagie dépendante de Beclin-1 tout en exerçant des effets anti-apoptotiques13, l’élévation simultanée de Bcl-2 avec Beclin-1 et LC3-II doit être interprétée de manière spécifique au contexte. Dans ce modèle inflammatoire d’OA, la régulation à la hausse de Bcl-2 peut principalement refléter une réponse anti-apoptotique liée à la survie, tandis qu’une expression accrue de Beclin-1 et LC3-II peut refléter un soulagement de la suppression associée à SPRY2. Ces résultats suggèrent un modèle dans lequel miR-590-5p coordonne la signalisation liée à la survie des chondrocytes et l’expression des marqueurs d’autophagie en supprimant SPRY2 sous stress inflammatoire.

Bien que cette étude apporte des informations mécanistiques précieuses sur l’axe miR-590-5p/SPRY2, plusieurs limites doivent être reconnues. Premièrement, toutes les expériences ont été menées dans un système in vitro 2D utilisant la lignée cellulaire C28/I2 immortalisée. Ce modèle simplifié ne peut pas reproduire pleinement le stress biomécanique, les interactions multicellulaires et le microenvironnement inflammatoire du cartilage articulaire in vivo, limitant ainsi l’applicabilité translationnelle immédiate des résultats. Deuxièmement, bien que les prédictions bioinformatiques et les essais de sauvetage soutiennent une relation de régulation supposée entre miR-590-5p et SPRY2, l’absence d’un test de double luciférase à signaleur empêche une confirmation définitive d’une liaison physique directe entre miR-590-5p et le SPRY2 3′-UTR. Troisièmement, les mesures statiques de Beclin-1 et LC3-II ne peuvent pas distinguer l’augmentation de la formation d’autophagosomes d’une dégradation autolysosome altérée ; par conséquent, les futures études devraient évaluer le flux autophagique en utilisant des approches telles que le traitement par bafilomycine A1 ou les tests de rapporteurs fluorescents en tandem. Les travaux futurs devraient également inclure un panel plus large de marqueurs phénotypiques de l’OA (par exemple, MMP13 et ADAMTS5), des chondrocytes humains primaires, des modèles d’explant cartilagineux 3D, et des modèles d’OA in vivo tels que la déstabilisation du ménisque médian afin d’évaluer les effets à long terme de la modulation de miR-590-5p et SPRY2.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anti-β-actin antibody	Proteintech	66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938	Contrôle interne de charge pour l'analyse Western blot
Anti-SPRY2 antibody	Proteintech	11383-1-AP ; RRID: AB_2196324	Détection de l'expression de la protéine SPRY2
BCA protein assay kit	Thermo Fisher Scientific	23225	Détermination de la concentration totale des protéines
Ligne cellulaire de chondrocytes humains C28/I2	Punocel	CP-H107	Modèle de chondrocyte in vitro pour les études sur l'arthrose
DMEM complet	KeyGen Biotec	KGM12800S	Milieu de base pour la culture cellulaire de routine
Kit d'extraction d'ARN ultrapur CWBIO	CWBIO	CW0627S	Isolation de l'ARN total et du miRNA
Système de détection ECL	Thermo Fisher Scientific	32106	Visualisation par chimiluminescence des bandes protéiques
Sérum bovin fœtal (FBS)	Gibco	1891605	Supplément de croissance pour la culture cellulaire
GraphPad Prism version 9.0	GraphPad Software	N/A	Analyse statistique et génération de graphiques
HiScript II Q RT SuperMix	Vazyme	R223-01	Rétrotranscription de l'ARNm en ADNc
Logiciel ImageJ	National Institutes of Health	N/A	Quantification de l'intensité des bandes Western blot
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015	Transfection de plasmides et d'oligonucléotides
miR-590-5p mimic, inhibiteur et NC	RiboBio	Synthétisé sur mesure	Modulation de l'expression du miR-590-5p
Kit de synthèse d'ADNc de 1ère chaîne pour miRNA	Vazyme	MR101-02	Rétrotranscription du miRNA en ADNc
Milieu Opti-MEM	Gibco	31985-062	Préparation des complexes de transfection
Pénicilline-streptomycine	Gibco	15140122	Prévention de la contamination bactérienne en culture cellulaire
Cocktails d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases	MedChemExpress	HY-K0010	Protection des protéines pendant l'extraction
Membranes PVDF	Millipore Sigma	ISEQ00010	Membrane de transfert de protéines pour l'immunoblotting
IL-1β humaine recombinante	MedChemExpress	HY-P78459	Induction de conditions inflammatoires de type OA
Tampon RIPA	Beyotime	P0013B	Lyse cellulaire et extraction des protéines
Constructs si-SPRY2 et si-NC	GenePharma	Synthétisé sur mesure	Knockdown de l'expression de SPRY2
Plasmid d'overexpression SPRY2 (OE) et vecteur vide (NC)	GeneChem	Construit sur mesure	Évaluation des effets de l'overexpression de SPRY2
Spectrophotomètre UV-VIS (NanoDrop 2000)	Thermo Fisher Scientific	ND-2000	Mesure de la concentration et de la pureté de l'ARN