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Article de recherche

Effets de la régulation de l’expression de SPRY2 et miR-590-5p sur l’autophagie chez les chondrocytes modèles d’arthrose humaine

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DOI :

10.3791/70883

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31 juillet 2026

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1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le stress inflammatoire dans un modèle de chondrocytes C28/I2 induit par l’IL-1β a augmenté le miR-590-5p et réduit l’expression de SPRY2. La modulation de cet axe a modifié l’expression de Beclin-1, LC3-II et Bcl-2, suggérant une voie de régulation putative miR-590-5p/SPRY2 qui pourrait influencer les réponses associées à l’autophagie et la survie des chondrocytes dans l’arthrose.

Résumé

L’arthrose (OA) est une maladie dégénérative articulaire répandue caractérisée par une destruction progressive du cartilage et une perte de l’homéostasie des chondrocytes. Bien qu’une autophagie dysrégulée contribue à la pathogenèse de l’arthrosite, les mécanismes moléculaires régissant les réponses associées à l’autophagie chez les chondrocytes restent incomplètement comprises. Cette étude a examiné le rôle de l’axe régulateur miR-590-5p/SPRY2 dans un microenvironnement inflammatoire OA en utilisant des chondrocytes humains C28/I2 induits par l’IL-1β. Un modèle d’OA in vitro a été établi en traitant les cellules C28/I2 avec IL-1β. L’expression de miR-590-5p et SPRY2 a été évaluée à l’aide de la PCR quantitative et du Western blotting. Des approches de gain et de perte de fonction ont été employées pour évaluer les effets de SPRY2 et miR-590-5p sur les marqueurs associés à l’autophagie Beclin-1 et LC3-II, ainsi que sur la protéine liée à la survie Bcl-2. Des analyses bioinformatiques et des expériences de sauvetage ont été utilisées pour étudier la relation régulatrice entre miR-590-5p et SPRY2. Le traitement par IL-1β a significativement augmenté l’expression de miR-590-5p tout en réduisant les niveaux d’ARNm et de protéines SPRY2 (P < 0,05). La surexpression de SPRY2 a nettement diminué l’expression de Beclin-1 et LC3-II, avec des réductions d’environ 65 % et 77 % respectivement (P < 0,05). En revanche, la surexpression de miR-590-5p a augmenté l’expression de Beclin-1, LC3-II et Bcl-2, tandis que l’inhibition de miR-590-5p a inversé ces effets et rétabli l’expression de SPRY2. Les analyses fonctionnelles ont soutenu SPRY2 comme cible réglementaire potentielle en aval du miR-590-5p. Ces résultats identifient l’axe miR-590-5p/SPRY2 comme un régulateur important de l’expression des marqueurs associés à l’autophagie et de la survie des chondrocytes dans des conditions inflammatoires, et suggèrent sa pertinence potentielle en tant que cible thérapeutique dans l’arthrose.

Introduction

En tant que forme d’arthrite la plus répandue dans le monde, l’arthrose (OA) est une cause majeure de douleur, de troubles de la mobilité et d’incapacité physique, imposant un fardeau important aux systèmes de santé et à lasociété 1. Pathologiquement, l’arthrose se caractérise par une dégénérescence progressive du cartilage articulaire, une inflammation synoviale et un remodelage pathologique de l’ossous-chondral 1. Les estimations épidémiologiques indiquent qu’environ 303 millions de personnes dans le monde sont touchées par l’arthrose, et ce chiffre devrait augmenter avec le vieillissement de la population et l’augmentation des tauxd’obésité 2. En Chine, la prévalence de l’arthrose symptomatique du genou est estimée à 8,1 %, avec une prévalence disproportionnément plus élevée chez les femmes et les populationsrurales 3. Malgré sa forte prévalence, les options de traitement actuelles restent largement limitées à la gestion des symptômes par des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et à une intervention chirurgicale pour la maladieavancée 4. L’absence de médicaments modificateurs de la maladie contre l’arthrose (DMOAD) reflète une compréhension incomplète des mécanismes moléculaires régissant l’homéostasie et la survie deschondrocytes 5.

L’intégrité structurelle et fonctionnelle du cartilage articulaire dépend des chondrocytes résidents, qui maintiennent le renouvellement de la matrice extracellulaire (ECM) grâce à un équilibre entre les activités anaboliques etcataboliques 6. Au cours de la progression de l’OA, les chondrocytes sont exposés à un stress mécanique anormal et à des médiateurs pro-inflammatoires, en particulier l’interleukine-1β (IL-1 β) et le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), qui favorisent un passage de la synthèse matricielle à la dégradationde la matrice 6. L’IL-1 β contribue à la destruction du cartilage en stimulant la production de métalloprotéinases matricielles (MMP) et d’aggrécanases tout en supprimant la synthèse du collagène de type II et des protéoglycanes7. De plus, l’IL-1β induit un stress oxydatif et un dysfonctionnement mitochondrial, conduisant à l’apoptose des chondrocytes et à lasénescence 8. Par conséquent, l’identification des voies de signalisation intracellulaires qui régulent la survie des chondrocytes dans des conditions inflammatoires reste une priorité pour la recherche sur l’OA.

L’autophagie est une voie de dégradation lysosomale conservée évolutivement qui maintient l’homéostasie cellulaire par l’élimination et le recyclage des organites et des agrégats protéiquesendommagés 9. L’autophagie basale est essentielle à la survie cellulaire et à l’équilibre énergétique ; Cependant, une autophagie déréglée peut contribuer à la progression de la maladie9. Dans l’arthrose, l’autophagie est généralement considérée comme une réponse protectrice qui aide les chondrocytes à s’adapter au stress cellulaire et à résister àl’apoptose. Des études antérieures ont suggéré que l’activité autophagique diminue au cours de la progression de l’arthrose, en particulier dans les maladies à un stade avancé, entraînant un contrôle de qualité cellulaire altéré et une perte accruedes chondrocytes. Plusieurs protéines sont couramment utilisées comme indicateurs de l’activité associée à l’autophagie. Beclin-1 participe à l’initiation de l’autophagosome, tandis que la conversion de la chaîne légère 3 de la protéine 1 associée aux microtubules (LC3-I en LC3-II) est largement utilisée comme marqueur de la formation de l’autophagosome12. En revanche, le lymphome à cellules B 2 (Bcl-2) inhibe l’autophagie dépendante de Beclin-1 tout en exerçant des effets anti-apoptotiques13. Néanmoins, l’interprétation des marqueurs associés à l’autophagie nécessite une prudence car les mesures statiques de LC3-II et Beclin-1 ne peuvent pas distinguer de manière indépendante la formation accrue d’autophagosomes de la dégradation lysosomale altérée. Malgré ces limitations, la modulation des voies liées à l’autophagie reste une stratégie thérapeutique prometteuse pour l’arthrose.

Les microARN (miARN) sont de courts ARN non codants qui régulent l’expression génique post-transcriptionnelle en se liant à des séquences complémentaires dans les régions 3′-non traduites (3′-UTR) des ARN messagers cibles, entraînant une dégradation ou une répressiontranslationnelle de l’ARNm 14. Une expression aberrante de miARN a été impliquée dans la pathogenèse de l’OA par des effets sur l’inflammation, l’apoptose et le remodelage de laMCE 15. Parmi ces molécules, le miR-590-5p a attiré l’attention en raison de ses rôles régulateurs dans le métabolisme osseux et d’autres processus pathologiques. Des études antérieures ont montré que miR-590-5p favorise la différenciation ostéogénique et supprime l’adipogenèse dans les cellules souches mésenchymateuses16. Dans les modèles cancéreux, miR-590-5p présente des fonctions dépendantes du contexte, soit en tant que régulateur oncogénique soit en tant que régulateur suppresseurtumoral 17. De plus, des profils d’expression de microARN modifiés, y compris des membres de la famille miR-590, ont été impliqués dans le remodelage pathologique des tissus articulaires lors del’OA 18. Cependant, les preuves obtenues à partir de modèles de cellules souches ou de cancer ne peuvent pas être directement extrapolées aux chondrocytes articulaires matures. Par conséquent, le rôle du miR-590-5p dans la régulation des réponses des chondrocytes au sein du microenvironnement inflammatoire de l’OA reste incomplètement compris.

Pour étudier les mécanismes potentiels en aval de miR-590-5p dans l’OA, des analyses de prédiction de cible in silico ont été réalisées, identifiant Sprouty2 (SPRY2) comme cible potentielle en aval. SPRY2 appartient à la famille des protéines Sprouty, qui régulent négativement la signalisation des récepteurs tyrosine kinase et suppriment l’activation de la voie RAS/MAPK/ERK 19. Parce que la signalisation MAPK influence la différenciation des chondrocytes, les réponses inflammatoires et l’autophagie, SPRY2 pourrait représenter un nœud régulateur important dans la physiopathologiede l’arthrose 20. Des études antérieures indiquent que SPRY2 peut supprimer les réponses inflammatoiresdans les modèles 21 de polyarthrite rhumatoïde, participer à la régulation liée à l’apoptose dans les systèmes épithéliaux22, et être associé à des réponses liées à l’autophagie dans les modèles de lésions ischémiques23. Bien que ces observations suggèrent que SPRY2 participe à la régulation à la fois de l’apoptose et de l’autophagie, son rôle dans les chondrocytes articulaires reste peu caractérisé. Il a donc été émis l’hypothèse que miR-590-5p et SPRY2 forment un axe régulateur qui influence la survie des chondrocytes sous stress inflammatoire.

Sur la base de ces observations, il a été proposé que miR-590-5p module les réponses associées à l’autophagie dans les chondrocytes en régulant l’expression de SPRY2. Bien que miR-590-5p et SPRY2 aient chacun été étudiés individuellement dans d’autres contextes biologiques, leur relation fonctionnelle dans les chondrocytes OA n’a pas été établie. Dans la présente étude, un modèle d’OA induit par IL-1β chez des chondrocytes humains C28/I2 a été utilisé pour examiner les schémas d’expression de miR-590-5p et SPRY2 et pour évaluer leurs effets sur l’expression de Beclin-1, LC3-II et Bcl-2. En étudiant l’axe régulateur miR-590-5p/SPRY2, cette étude fournit un éclairage sur les mécanismes épigénétiques sous-jacents à la survie des chondrocytes et identifie une cible thérapeutique potentielle pour l’arthrose.

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Protocole

Cette étude a été menée exclusivement avec la lignée cellulaire de chondrocytes humains C28/I2, disponible commercialement. Aucun participant humain, échantillon de tissus humain, matériel dérivé des patients ou animal vivant n’a participé à cette recherche. Par conséquent, l’approbation du Conseil d’Éthique Institutionnelle (IRB) et celle du Comité de Soins et d’Utilisation des Animaux Institutionnels (IACUC) n’étaient pas requises conformément aux directives institutionnelles et nationales. Les outils, produits chimiques, kits et réactifs utilisés dans le protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Culture cellulaire et construction de modèles d’OA

La lignée cellulaire de chondrocytes humains C28/I2 (détails fournis dans le tableau des matériaux) a été obtenue auprès d’un fournisseur commercial. Pour garantir la reproductibilité expérimentale, les cellules ont été authentifiées par profilage en tandem court (STR) et testées régulièrement pour confirmer l’absence de contamination par mycoplasme. Des cellules entre les passages 3 et 8 ont été utilisées pour toutes les expériences. Les cellules ont été maintenues dans le DMEM complétées avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (tous les réactifs de culture sont détaillés dans le Tableau des matériaux) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2.

Pour établir le modèle d’arthrose in vitro (OA), les cellules C28/I2 ont été stimulées avec de l’IL-1β humain recombinant. Sur la base de la littératureétablie 6,7, des expériences préliminaires d’optimisation dose-réponse conçues pour induire un état catabolique robuste sans cytotoxicité immédiate excessive, les cellules ont été traitées avec 20 ng/mL d’IL-1β pendant 24 heures.

2. Regroupement expérimental et transfection

Pour élucider les voies mécanistiques, l’étude a été divisée en trois modules expérimentaux principaux, chacun comportant au moins trois réplications biologiques indépendantes :

  1. Gain / perte de fonction SPRY2 :
    Les cellules ont été assignées au Contrôle, modèle OA, OA + vecteur vide (NC), plasmide de surexpression OA + SPRY2 (OE-SPRY2), ainsi qu’aux petits groupes d’ARN interférents correspondants (si-NC et trois constructions spécifiques si-SPRY2 : si-695, si-800, si-896) pour évaluer l’efficacité des interférences.
  2. Modulation miR-590-5p :
    Les cellules ont été divisées en groupes témoins, modèle OA, OA + mimimique NC, OA + miR-590-5p mimique, OA + inhibiteur NC, et OA + miR-590-5p inhibiteurs.
  3. Validation fonctionnelle de la relation réglementaire miR-590-5p/SPRY2 :
    Pour évaluer davantage la relation régulatrice proposée entre miR-590-5p et SPRY2, des cellules ont été soumises à des conditions miMétiques et inhibitrices de miR-590-5p afin de déterminer si la modulation miR-590-5p modifiait l’expression de SPRY2 dans le modèle OA.
    Pour la transfection, les cellules C28/I2 ont été ensemencées en plaques à 6 puits à 2 × 10 cellules5 par puits. À une confluence de 70 % à 80 %, les transfections ont été effectuées à l’aide d’un réactif commercial à base de lipides selon le protocole du fabricant et les procédures établies pour la délivrance de petits ARN dans leschondrocytes 24. En résumé, les plasmides (OE-SPRY2 et NC ; 2 μg/puits) et les oligonucléotides (miR-590-5p mimic/inhibiteur et siARN ; 50 nM) ont été dilués dans un milieu sérique réduit. Les complexes ADN-lipid/ARN ont été incubés à température ambiante pendant 15 minutes avant d’être ajoutés goutte à goutte aux cellules dans le DMEM sans sérum. 6 h après la transfection, le milieu a été remplacé par un DMEM complet contenant 10 % de FBS, et les cellules ont été cultivées pendant 48 heures supplémentaires avant l’extraction de l’ARN et des protéines.

3. détection qPCR

L’ARN total et le miARN ont été isolés à l’aide d’un kit d’extraction dédié selon le protocole du fabricant. La pureté et la concentration de l’ARN ont été évaluées à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis, et des échantillons avec des rapports A260/A280 de 1,8–2,0 ont été utilisés pour des analyses en aval. Des réactifs commerciaux à transcription inverse ont été utilisés pour synthétiser l’ADNc. La procédure de cycle qPCR était la suivante : 95 °C pendant 10 minutes ; 40 cycles de 95 °C pendant 10 s, 58 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s ; suivie d’une analyse de la courbe de fusion pour vérifier la spécificité de l’amorce et l’absence de dimers d’amorce. β-actine et U6 servaient respectivement de contrôles internes pour l’ARNm et le miARN. L’expression relative des gènes a été calculée à l’aide de la méthode 2-ΔΔCt 25. Toutes les séquences d’amorce, y compris celles de Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p et gènes de référence, sont listées dans le Tableau 1.

Nom d’introduction Amorce avant (5′-3′)Amorce inversée (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACGCGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-actineTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCCCCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACACCATAAAAAGG
BCL-2TGGGATTCCTGCGGATTGACTCAGTCTACTTCCTCTGTGATGTTG
Beclin-1TCCCGTGGAATGGAATGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTCTG
LC3-IICATCCAACCAAAATCCCGGTGAGCTGTAAGCGCCTTTTTTAA

Tableau 1 : Séquences d’amorces utilisées pour l’analyse quantitative PCR (qPCR). Séquences d’amorces avant et arrière utilisées pour l’amplification et la quantification des transcripts cibles et les contrôles internes de référence par qPCR.

Sauf indication contraire, les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (DE). La signification statistique a été déterminée à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc S-N-K. Les symboles indiquent : *P < 0,05 vs. Control ; #P < 0,05 vs. le modèle indiqué ou le groupe témoin négatif ; &P < 0,05 vs. OA+Inhibiteur-NC.

4. Détection des taches occidentales

Les cellules ont été prélevées et lysées à l’aide d’un tampon RIPA complété par des cocktails d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase, suivant des procédures établies d’extraction protéique et d’immunoblotting. Après centrifugation à 14 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C pour éliminer les débris cellulaires, le surnageant a été collecté, et les concentrations de protéines quantifiées à l’aide d’un kit de test protéique BCA. Des quantités égales de lysat protéique (30 μg) ont été dénaturées, résolues par SDS-PAGE pendant 1,5 heure, puis transférées sur les membranes PVDF à 300 mA pendant 1,5h 26. Les membranes ont été obstruées avec 5 % de lait écrémé dans une solution séline Tween 20 (TBST) contenant 0,1 % de Tween 20 (TBST) pendant 1 heure à température ambiante, suivie d’une incubation à 4 °C pendant 16 heures avec des anticorps primaires spécifiques (par exemple, anti-SPRY2, dilution 1:1000). Après trois lavages dans le TBST, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués au HRP appropriés à température ambiante pendant 2 heures. Les bandes protéiques ont été visualisées à l’aide d’un système de détection ECL et quantifiées à l’aide du logiciel ImageJ.

5. Analyse statistique

Les données ont été analysées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Toutes les expériences ont été réalisées avec au moins trois réplications biologiques indépendantes (n ≥ 3), et les données quantitatives sont présentées comme la moyenne ± l’écart type (DE). Avant les tests paramétriques, la normalité des données était évaluée à l’aide du test de Shapiro-Wilk, et l’homogénéité de la variance était évaluée. La signification statistique entre plusieurs groupes a été évaluée à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivie du test Student-Newman-Keuls (S-N-K) à posteriori pour les comparaisons multiples. P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

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Résultats

Établissement du modèle inflammatoire des chondrocytes in vitro

Pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la pathologie de l’arthrose, un modèle inflammatoire in vitro a été établi à partir de chondrocytes humains C28/I2 stimulés avec IL-1β. La validité de ce modèle a été confirmée par l’évaluation de l’expression de la chaîne alpha-1 de type II (Col-II), un composant principal de la matrice extracellulaire du cartilage ...

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Discussion

Des études antérieures ont montré que les miARN régulent l’autophagie à plusieurs stades, notamment l’initiation, l’allongement vésiculaire etla maturation 27. L’implication des miARN dans la pathogenèse de l’AA a été de plus en plus documentée, notamment à travers les effets sur l’inflammation, l’apoptose, le remodelage de la matrice extracellulaire et les voies liées à l’autophagie. miR-590-5p a été associé à l’homéostasie cellulaire et aux processus associés

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Les auteurs remercient le département de gériatrie de l’hôpital Ruikang, Université de médecine chinoise du Guangxi, pour avoir fourni des installations expérimentales et un soutien technique à cette étude. Les auteurs remercient également le personnel du laboratoire et ses collègues pour leur aide dans la collecte et l’analyse des données. Ce travail a été soutenu par le projet de recherche en sciences naturelles de l’Université de médecine chinoise du Guangxi (Grant n° 2022MS039 ; LncRNA-GAS5 médie l’expression de SPRY2 pour inhiber l’autophagie chez les chondrocytes OA du genou de la souris : étude du mécanisme et effet de l’intervention précoce de la prescription Huayu Qushi) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (Fondation régionale) (Subvention n° 82160912 ; Discussion sur le mécanisme sur l’ubiquitination de Skp2, la dégradation de FoxO1, l’inhibition de l’autophagie de chondrocytes OA du genou et l’effet d’intervention précoce de la prescription de Huayu Qushi).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-β-actin antibodyProteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Contrôle interne de charge pour l'analyse Western blot
Anti-SPRY2 antibodyProteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324Détection de l'expression de la protéine SPRY2
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific23225Détermination de la concentration totale des protéines
Ligne cellulaire de chondrocytes humains C28/I2PunocelCP-H107Modèle de chondrocyte in vitro pour les études sur l'arthrose
DMEM completKeyGen BiotecKGM12800SMilieu de base pour la culture cellulaire de routine
Kit d'extraction d'ARN ultrapur CWBIOCWBIOCW0627SIsolation de l'ARN total et du miRNA
Système de détection ECLThermo Fisher Scientific32106Visualisation par chimiluminescence des bandes protéiques
Sérum bovin fœtal (FBS)Gibco1891605Supplément de croissance pour la culture cellulaire
GraphPad Prism version 9.0GraphPad SoftwareN/AAnalyse statistique et génération de graphiques
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01Rétrotranscription de l'ARNm en ADNc
Logiciel ImageJNational Institutes of HealthN/AQuantification de l'intensité des bandes Western blot
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015Transfection de plasmides et d'oligonucléotides
miR-590-5p mimic, inhibiteur et NCRiboBioSynthétisé sur mesureModulation de l'expression du miR-590-5p
Kit de synthèse d'ADNc de 1ère chaîne pour miRNAVazymeMR101-02Rétrotranscription du miRNA en ADNc
Milieu Opti-MEMGibco31985-062Préparation des complexes de transfection
Pénicilline-streptomycineGibco15140122Prévention de la contamination bactérienne en culture cellulaire
Cocktails d'inhibiteurs de protéases et de phosphatasesMedChemExpressHY-K0010Protection des protéines pendant l'extraction
Membranes PVDFMillipore SigmaISEQ00010Membrane de transfert de protéines pour l'immunoblotting
IL-1β humaine recombinanteMedChemExpressHY-P78459Induction de conditions inflammatoires de type OA
Tampon RIPABeyotimeP0013BLyse cellulaire et extraction des protéines
Constructs si-SPRY2 et si-NCGenePharmaSynthétisé sur mesureKnockdown de l'expression de SPRY2
Plasmid d'overexpression SPRY2 (OE) et vecteur vide (NC)GeneChemConstruit sur mesureÉvaluation des effets de l'overexpression de SPRY2
Spectrophotomètre UV-VIS (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000Mesure de la concentration et de la pureté de l'ARN

Références

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