Visualisation et quantification de l’appariement intermoléculaire de bases d’ARN dans des clusters d’ARN in vitro à l’aide de reporters d’ARN brocoli fendu

Summary

Ce protocole décrit un test visuel utilisant des reporters d’ARN brocoli divisés pour détecter et quantifier les appariements intermoléculaires de bases dans des amas d’ARN in vitro.

Abstract

Le regroupement ARN, provoqué par des interactions intermoléculaires multivalentes ARN–ARN, peut se produire in vitro en l’absence de protéines. Bien que les sondages chimiques et les simulations computationnelles aient été utilisés pour prédire ces interactions, les méthodes permettant d’évaluer directement l’appariement intermoléculaire de bases dans les amas d’ARN restent limitées. Cette étude présente un test visuel basé sur des rapports d’ARN brocoli fractionné conjugués à des ARN marqués fluorescentement d’intérêt. L’essai permet de détecter et de quantifier les appariements intermoléculaires de bases dans les amas d’ARN. Le système de brocoli scindé contient des séquences de rapporteurs complémentaires qui se dimérisent pour former l’aptamère d’ARN brocoli. La structure d’ARN dimérisé résultante se lie au DFHBI-1T, un fluorophore qui émet une fluorescence verte lors de la liaison. Lors du regroupement de l’ARN, l’apparition de fluorescence verte rapporte un appariement de bases médié par les séquences de rapporteurs complémentaires parmi les ARN d’intérêt. La mesure de la fluorescence DFHBI-1T permet d’évaluer quantitativement comment les conditions de regroupement d’ARN in vitro influencent l’appariement intermoléculaire de bases entre ces séquences rapporteures.

Introduction

Les ARN transcrits in vitro peuvent s’auto-assembler en amas visibles grâce à l’ajout de sels et de réactifs de regroupement^moléculaire 1,2,3,4,5. Notamment, ces groupes d’ARN peuvent se former en l’absence d’autres composants cellulaires, y compris des protéines, ce qui indique que, dans certaines conditions, les interactions intermoléculaires ARN–ARN suffisent à provoquer la condensation d’ARN in vitro.

Parmi les différents types d’interactions ARN-ARN intermoléculaires, l’appariement de bases intermoléculaires a reçu une attention considérable dans le champ^{de condensat} 1,2,4,6,7,8,9,10. Ces interactions peuvent être provoquées par des séquences complémentaires exposées (« codes postaux ») entre des transcriptes, comme le démontre le co-agrégation des ARNm BNI1 et SPA2 dans le champignon filamenteux Ashbya gossypii² ou l’oligomérisation de l’ARNm d’oskar chez Drosophila melanogaster ^6,7. Alternativement, l’appariement intermoléculaire des bases peut être favorisé par le remodelage des structures secondaires de l’ARN, exposant des séquences complémentaires qui seraient autrement intégrées structurellement. Ce mécanisme a été observé dans des ARN répétés in^silico-9 et des riboswitches guanidine in vitro¹⁰. Les séquences complémentaires exposées et le remodelage structural de l’ARN peuvent être mesurés à l’aide de sondages chimiques^11,12 ou de simulation ^4,9,13,14. Cependant, les méthodes qui visualisent directement l’appariement intermoléculaire des bases dans les tests de regroupement ARN in vitro restent limitées.

Les tests par pull-down d’ARN utilisant les réticulants de base 15,16,17 et l’électrophorèse ^{en gel 4,6,7} sont couramment utilisés pour étudier l’appariement intermoléculaire de bases d’ARN in vitro. Cependant, ces méthodes manquent de résolution spatiale pour distinguer les paires de bases au sein des clusters de celles extérieures à celles-ci. De plus, isoler les clusters d’ARN pour l’analyse en aval est techniquement complexe, car cela nécessite de préserver la stabilité du cluster tout en assurant la compatibilité des tampons avec les tests ultérieurs.

Un test visuel basé sur des rapporteurs d’ARN brocoli¹⁸ conjugués à des ARN marqués fluorescentement d’intérêt a déjà été utilisé pour permettre la détection directe de l’appariement intermoléculaire des bases lors de la condensation d’ARN in vitro⁴. Dans ce contexte, le système de brocoli divisé rapporte la probabilité d’interactions intermoléculaires entre les rapporteurs ou entre les ARN qui les transportent sous des conditions définies de regroupement in vitro . Ainsi, l’essai explore comment le contexte de la séquence et les facteurs environnementaux influencent la propension à l’appariement intermoléculaire de bases dans un environnement de type cluster d’ARN.

Le système de brocoli divisé se compose de deux séquences d’ARN complémentaires, en haut et en bas, qui se dimérisent pour reconstituer l’aptamère de l’ARN brocoli (Figures 1A–C)¹⁸. Lors de la dimérisation, l’aptamère se lie au fluorophore DFHBI-1T, ce qui donne une fluorescence verte (Figures 1A–C)¹⁸. Grâce à ce système, il est démontré que l’étendue de l’appariement intermoléculaire des bases entre séquences complémentaires de rapporteurs au sein des clusters d’ARN dépend du repliement de l’ARN. En comparant le rapport de fluorescence DFHBI-1T aux niveaux d’ARN dans différentes conditions expérimentales, l’influence des conditions in vitro sur l’appariement intermoléculaire de bases médié par rapporteur au sein des amas d’ARN peut être évaluée quantitativement.

Cet essai complète les approches de tirage vers le bas de l’ARN et d’électrophorèse sur gel pour étudier le jumelage intermoléculaire de bases dans les amas d’ARN. Cependant, une détection robuste du signal peut nécessiter des réactifs de regroupement moléculaire, et la sensibilité est limitée par l’efficacité de la dimérisation et du repliement des ARN de brocoli divisés en haut et en bas .

Protocol

Ce protocole fournit une méthode étape par étape pour mettre en œuvre ce test et discute de ses applications. Les réactifs et équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de modèles d’ADN pour la transcription d’ARN in vitro

1. Ajouter une séquence promoteur T7 à l’extrémité 5′ de chaque gabarit d’ADN contenant les séquences d’aptamer brocoli séparées pour la transcription in vitro d’ARN. Utilisez uniquement les séquences d’aptamers de brocoli séparées (haut et bas) ou insérez-les à n’importe quelle position en aval du promoteur T7, avec ou sans séquence d’ARN supplémentaire d’intérêt.
   REMARQUE : Les séquences pour le promoteur T7, les rapporteurs brocoli divisés et les amorces utilisées pour amplifier les modèles d’ADN sont listées dans le Tableau 1.
   REMARQUE : L’ARN polymérase T7 préfère fortement initier la transcription avec un « G » à la position +1. La présence de G supplémentaires immédiatement en aval aux positions +2 et +3 peut augmenter le rendement de^{transcription 19}. Cependant, lorsque la séquence en aval commence par G, comme dans les constructions supérieure et inférieure qui commencent par deux G, la transcription peut s’initier à des positions^{différentes 20}. En conséquence, les transcriptions peuvent contenir un, deux ou trois G à l’extrémité 5′ (par exemple, GATCC, GGATCC ou GGGATCC), ce qui peut influencer l’interprétation de l’appariement de bases dans les constructions conçues.
2. Utilisez des blocs géniques, plasmides ou fragments d’ADN synthétisés commercialement comme modèles pour la PCR. Si le gabarit d’origine ne contient pas de promoteur T7, utilisez un amorce avant avec un surplomb de 5′ T7 ainsi que l’amorce inversé approprié.
3. Préparez une réaction PCR de 50 μL dans un tube PCR de 200 μL contenant 2,5 μL chacun de 10 μM d’amorces avant et arrière, un gabarit d’ADN de 20 ng, un mélange maître haute fidélité 25 μL 2× et de l’eau sans nucléase. Mélangez soigneusement en pipettant de haut en bas et centrifugez à 2 000 × g pendant 2 secondes.
4. Exécutez la réaction PCR dans un thermocycleur en utilisant le programme suivant : 98 °C pendant 30 s (1 cycle) ; 98 °C pendant 10 s, température de recuit optimisée pour 30 s, et 72 °C pour 30 s par kilobase (35 cycles) ; 72 °C pendant 2 minutes (1 cycle).
   REMARQUE : Déterminez la température de recuit optimisée à l’aide d’un outil en ligne tel qu’une calculatrice de Tm. Les produits PCR peuvent être stockés à 4 °C après leur achèvement.
5. Mélangez 2 μL de produit PCR avec 8 μL d’eau sans nucléase et 2 μL de 6× de colorant de charge. Chargez le mélange sur un gel d’agarose à 1 % pour l’électrophorèse.
   REMARQUE : Le produit PCR doit apparaître en bande unique. Si plusieurs bandes sont observées, retirez la bande correcte et purifiez-la à l’aide d’un kit d’extraction gel avant de procéder.
6. Purifiez le produit PCR ou l’ADN extrait du gel à l’aide d’un kit de purification de l’ADN et éluez dans de l’eau sans nucléase de 20 à 30 μL dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
7. Mesurez la concentration et la pureté de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume. Assurez-vous que A260/A280 est d’environ 1,8 et que A260/A230 est supérieur à 2,0.
   REMARQUE : Si A260/A230 est inférieur à 2,0, effectuez une étape de purification supplémentaire.
8. Conservez le gabarit d’ADN à −20 °C jusqu’à utilisation.

2. Préparation de la réaction transcriptionnelle d’ARN in vitro

1. Essuyez la surface de travail, les supports à tubes et les pipettes avec une solution de décontamination RNase. Utilisez des pointes sans RNase, filtrées.
2. Tampon de réaction de dégel et solutions nucléotidiques (ATP, CTP, GTP, UTP) fournis avec le kit de transcription T7, ainsi que UTP-Cy5, sur glace. Centrifugez tous les tubes à 2 000 × g pendant 2 secondes avant utilisation.
   REMARQUE : Protégez UTP-Cy5 de la lumière.
3. Calculez le nombre de bases thymine dans le modèle d’ADN (à l’exclusion du promoteur T7) et déterminez les volumes requis d’UTP et UTP-Cy5 pour une réaction de transcription de 20 μL. Maintenir une densité d’affichage constante entre les espèces d’ARN.
   REMARQUE : Par exemple, pour marquer un ARN contenant 100 bases d’uraciles avec environ trois uraciles marqués en Cy5, ajoutez 4,5 μL de 1 mM UTP-Cy5 et 1,9 μL de 75 mM UTP.
4. Préparez une réaction transcriptionnelle de 20 μL en combinant 2 μL chacun d’ATP, CTP et GTP, des volumes calculés de UTP (tous fournis avec le kit) et d’UTP-Cy5, 2 μL 10× tampon de réaction, un mélange enzymatique de 2 μL, un gabarit d’ADN de 200 ng et de l’eau sans nucléase. Mélangez soigneusement en pipettant de haut en bas et centrifugez à 2 000 × g pendant 2 secondes.
5. Incubez la réaction à 37 °C pendant 6 heures.
6. Ajoutez 1 μL de DNase fournie avec le kit. Mélangez soigneusement en pipettant de haut en bas et centrifugez à 2 000 × g pendant 2 secondes.
7. Écouver à 37 °C pendant 15 minutes supplémentaires.
8. Transférez la réaction (~20 μL) dans un tube de 1,5 mL. Ajoutez 115 μL d’eau sans nucléase et 15 μL de solution d’arrêt d’acacetate d’ammonium fournie avec le kit. Mélangez soigneusement en pipettant de haut en bas et centrifugez à 2 000 × g pendant 2 secondes.
   REMARQUE : Un kit commercial de purification ARN peut être utilisé à la place des étapes 2.9 à 3.7.
9. Ajoutez 150 μL de phénol/chloroforme et mélangez doucement.
   ATTENTION : Manipulez le phénol/chloroforme dans une hotte chimique.
10. Centrifugez à 16 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C.
11. Transférez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube.
    REMARQUE : Éviter de perturber l’interphase ; La couche inférieure peut paraître bleue en raison de la teinture non incorporée.
12. Ajoutez un volume égal de chloroforme et mélangez soigneusement.
    ATTENTION : Manipulez le chloroforme dans une hotte chimique.
13. Centrifugez à 16 000 × g pendant 2 minutes à 4 °C.
14. Répétez les étapes 2.11–2.13.
15. Transférer la couche aqueuse (~100–150 μL) dans un nouveau tube. Ajoutez 900 μL d’isopropanol et mélangez soigneusement.
16. Aliquot en trois volumes égaux dans des tubes séparés.
    REMARQUE : Chaque aliquote est suffisante pour plusieurs réactions de regroupement d’ARN.
17. Conserver à −20 °C pendant la nuit ou jusqu’à un mois.

3. Purification de l’ARN transcrit in vitro

1. Centrifugez l’échantillon d’ARN dans de l’isopropanol à 16 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C.
2. Retirez soigneusement l’isopropanol sans déranger la pelote d’ARN.
3. Ajoutez 1 mL d’éthanol à 70 % préparé dans de l’eau sans nucléase.
4. Centrifugez à 16 000 × g pendant 2 minutes à 4 °C.
5. Retirez l’éthanol et répétez les étapes 3.3–3.4.
6. Lors du lavage final à l’éthanol, retirez la majeure partie de l’éthanol à l’aide d’une pipette de 1000 μL. Centrifugez brièvement à 2 000 × g pendant 2 secondes dans une minicentrifugeuse de paillasse et retirez tout reste d’éthanol à l’aide d’une pipette de 20 μL.
7. Laissez sécher la pelote d’ARN à l’air libre pendant 1 à 2 minutes à température ambiante (RT).
8. Resuspendez la pelote d’ARN dans de l’eau sans nucléase de 20 μL. Gardez l’échantillon sur la glace et protégez-le de la lumière.
9. Mesurez la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume. Assurez-vous que A260/A280 est d’environ 2,0 et que A260/A230 est supérieur à 2,0.

4. Préparation de la réaction de regroupement d’ARN in vitro

REMARQUE : Dans ce protocole, l’induction du regroupement d’ARN nécessite de la spermine et du PEG 8000, selon des études^{antérieures 2,4,5}. Plus précisément, une solution de tétrahydrochlorure de spermine de 100 mM préparée dans de l’eau sans nucléase a été alicotée dans plusieurs tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et stockée à −20 °C.

1. Décongelez un tube de 100 mM de spermine et 50 % de PEG 8000 sur glace.
   REMARQUE : Après ouverture, le PEG 8000 à 50 % doit être utilisé au maximum deux mois en raison d’une possible dégradation.
2. Pour préparer 500 μL de tampon de repliement d’ARN fraîchement fabriqué à 10×, combinez 50 μL de 2M KCl, 50 μL de 1M_{MgCl 2}, 50 μL de 1M Tris (pH 7,0) et 350 μL d’eau sans nucléase. Mélangez soigneusement en pipettant de haut en bas. Centrifugeuse à 2 000 × g pendant 2 s dans une minicentrifugeuse de paillard.
   REMARQUE : Le tampon de repliement doit être préparé le jour de l’expérience de regroupement de l’ARN.
   REMARQUE : Les étapes 4.3 à 4.4 dépendent des conditions expérimentales et peuvent être ajustées selon les besoins. Deux exemples de conditions de regroupement ARN utilisées dans cette étude sont décrites ci-dessous. La condition de co-repliement est adaptée d’une méthode utilisée pour recuit les oligonucléotides antisens en^{ARN 2}. Dans cette méthode, les ARN sont mélangés dans un tampon de sel et chauffés ensemble pour favoriser l’appariement intermoléculaire des bases entre ARN porteurs de séquences complémentaires. En revanche, pour la condition de repliement séparé, chaque ARN est repliqué individuellement avant le mélange. Cette condition vise à représenter un scénario cellulaire dans lequel les ARN sont repliés avant d’interagir.
3. Co-repliage
   REMARQUE : Cette condition favorise l’appariement intermoléculaire des bases entre les ARN contenant les séquences supérieures et inférieures . Il sert de contrôle positif pour l’appariement intermoléculaire de bases piloté par rapporteurs sous la condition de regroupement ARN.
   1. Dans un tube PCR de 200 μL, combinez 16 pmol de chaque ARN transcrit in vitro transportant soit la séquence supérieure , soit la séquence inférieure , 2 μL de tampon d’ARN replié de 10× et de l’eau sans nucléase pour un volume final de 14 μL. Mélangez soigneusement en pipettant de haut en bas. Centrifugeuse à 2 000 × g pendant 2 secondes dans une minicentrifugeuse de paillas.
      REMARQUE : Pour calculer la masse d’ARN correspondant à 16 pmol.
   2. Chauffez l’échantillon d’ARN à 90 °C pendant 2 minutes.
   3. Transférez immédiatement l’échantillon en RT et protégez-le de la lumière. Incubez la réaction à la RT pendant 1 heure.
4. Pliage séparé
   1. Chauffez l’échantillon d’ARN à 90 °C pendant 2 minutes, puis placez-le immédiatement sur de la glace pendant au moins 15 minutes.
   2. Dans un tube PCR de 200 μL, combinez 16 pmol d’ARN transcrit in vitro transportant soit la séquence supérieure , soit la séquence inférieure , 1 μL de tampon ARN repliable de 10× et de l’eau sans nucléase pour un volume final de 7 μL.
      REMARQUE : Pour calculer la masse d’ARN correspondant à 16 pmol.
   3. Incubez la réaction à la RT pendant 30 minutes, protégée de la lumière.
   4. Combinez les échantillons d’ARN contenant les séquences supérieures et inférieures dans un seul tube PCR. Mélangez soigneusement en pipettant de haut en bas. Centrifugeuse à 2 000 × g pendant 2 secondes dans une minicentrifugeuse de paillas. Incuber en RT pendant 30 minutes.
5. Ajoutez 6 μL d’un prémix 1:2 (v/v) de 100 mM de spermine et 50 % de PEG 8000. Mélangez soigneusement en pipettant de haut en bas. Centrifugeuse à 2 000 × g pendant 2 s dans une minicentrifugeuse de paillard.
   REMARQUE : Le PEG 8000 à 50 % est très visqueux. Piette lentement et prudemment.
6. Ajoutez 2 μL de 1 mM de DFHBI-1T à la réaction. Mélangez soigneusement en pipettant de haut en bas. Centrifugeuse à 2 000 × g pendant 2 s dans une minicentrifugeuse de paillard. La réaction doit apparaître jaune-vert.
   REMARQUE : Pour préparer une solution de 20 mM DFHBI-1T à partir de 1 mg de colorant lyophilisé DFHBI-1T (MW : 320,21), ajoutez 156 μL de DMSO anhydre de qualité biologie moléculaire. Alyquote la part en petites quantités dans plusieurs tubes microcentrifugeuses et stockée à -20 °C. Évitez les cycles répétitifs de gel-dégel pour la teinture. Préparez une solution de travail DFHBI-1T fraîchement diluée de 1 mM en diluant le stock de 20 mM dans de l’eau sans nucléase et en le conservant sur de la glace.
7. Chargez la réaction dans un verre de verre à chambre.
8. Incubez la chambre à RT pendant 4 heures dans le noir, avec le couvercle posé, pour minimiser l’évaporation.

5. Préparation à l’imagerie

1. Acquérir des images tridimensionnelles à l’aide d’un microscope à éclairage structuré ou confocal équipé de lasers et d’objectifs appropriés.
   REMARQUE : La microscopie confocale est nécessaire pour minimiser la lumière floue.
2. Configurez le microscope pour imager chaque région d’intérêt (ROI) avec le canal Cy5 d’abord à chaque plan z, puis imager le même ROI à l’aide du canal GFP.
3. Réglez le temps d’exposition à 500 ms pour tous les canaux. Réglez la puissance du laser à 80 % pour la GFP et à 40 % pour le Cy5.
4. Imagez une région de couverture en dehors de la gouttelette de réaction à RT en utilisant une taille de pas z de 150 nm.

6. Quantification de l’appariement intermoléculaire des bases

1. Importez des images dans un logiciel d’analyse^{d’images 21}. Identifier les canaux GFP (DFHBI-1T) et Cy5 (ARN).
2. Dessinez un ROI de 5 × 5 pixels au sein d’un cluster d’ARN et mesurez la densité intégrée des deux canaux au même plan z. Sélectionnez 5 à 8 ROI issus de différents groupes d’ARN dans chaque image.
   REMARQUE : Ajustez la taille du ROI selon la configuration de la caméra, mais maintenez la cohérence entre les expériences.
3. Sélectionnez 5 à 8 ROI en dehors de la gouttelette de réaction pour la mesure de fond et calculez la densité intégrée moyenne pour les deux canaux.
4. Calculez l’intensité normalisée de DFHBI-1T pour chaque ROI en utilisant :
   

7. Problèmes courants et dépannage

1. Si aucun pellet d’ARN n’est observé après centrifugation, il faut considérer la dégradation de l’ARN, un temps de transcription insuffisant, une polymérase inactive, des sels résiduels ou une faible concentration d’ARN. Utilisez des réactifs sans RNase, prolongez le temps de transcription, utilisez des enzymes fraîches et purifiez les gabarits.
2. Si aucun groupe d’ARN marqué par Cy5 n’est observé, il faut envisager la dégradation de l’ARN ou la dégradation de PEG 8000 ou UTP-Cy5. Utilisez des réactifs frais et des conditions sans RNase.
3. Si aucun signal DFHBI-1T n’est observé en conditions de co-repliage, il faut considérer une mauvaise qualité de colorant, l’absence de formation de structures brocoli ou des transcrits tronqués. Utilisez un colorant frais, assurez-vous d’une composition tampon correcte et vérifiez la taille du transcript par analyse sur gel.
4. Si le signal de fluorescence blanchit, réduisez la puissance du laser et le temps d’exposition, minimisez les étapes d’imagerie et protégez les échantillons de la lumière pendant l’incubation.

Results

Dans cette expérience de démonstration, la capacité des seuls rapporteurs d’ARN supérieur et inférieur à se regrouper par paires de bases et à former la structure du brocoli a d’abord été évaluée en utilisant^{le protocole} 4 de regroupement ARN in vitro décrit précédemment. L’appariement de bases entre le haut et le bas génère deux bras de brocoli, chacun capable d’intercaler une molécule DFHBI-1T (Figures 1A–C)^18,22.

Lors de l’induction du regroupement d’ARN avec la spermine et le PEG 8000, les deux ARN formaient des grappes individuellement ou ensemble (Figures 1D–Eii). Lorsque les ARN supérieur ou inférieur ont été examinés isolément, la fluorescence de DFHBI-1T au sein des amas d’ARN était nettement inférieure à celle de la condition de co-repliage, où les deux ARN étaient combinés avant la dénaturation thermique et le repliage (Figure 1F). Dans la condition de co-repliement, le rapport molaire de DFHBI-1T (0,1 mM) à la partie supérieure (0,8 μM) et au bas (0,8 μM) a été estimé à 125:1:1. Cela correspond à un excès d’environ 62,5 fois plus grand de DFHBI-1T par rapport au nombre maximal de structures brocoliques potentielles.

Le signal DFHBI-1T faible mais non nul observé uniquement pour le haut et le bas est cohérent avec les rapports précédents montrant une fluorescence minimale de DFHBI-1T lorsque chaque rapporteur est exprimé^{individuellement à 18}. DFHBI-1T a également présenté une fluorescence de fond très faible mais détectable en l’absence d’ARN (Figure 1F). Ensemble, ces résultats démontrent que DFHBI-1T est compatible avec le test de regroupement d’ARN in vitro et que le co-repliement améliore l’appariement intermoléculaire des bases entre les ARN supérieur et inférieur .

Après normalisation en intensité ARN, l’intensité de fluorescence normalisée de DFHBI-1T dans la condition de co-repliement a atteint 1,03, ce qui était nettement supérieur à celui du haut et du bas seuls (0,054 et 0,023, respectivement) (Figure 1D, Figure1E i et Figure 1F). Les grappes d’ARN formées par le mélange des ARN supérieur et inférieur repliés séparément avant le regroupement ont ensuite été examinées (Figure 1D, Figure1E ii et Figure 1F). Dans cette condition de repliement séparée, le signal normalisé DFHBI-1T était de 0,031, comparable aux niveaux de référence observés dans les témoins négatifs (en haut ou en bas seul) (Figure 1F). Ces résultats indiquent que le co-repliage favorise l’appariement intermoléculaire des bases entre les ARN supérieur et inférieur , tandis que le repliement séparé restreint de telles interactions.

Les séquences supérieure et inférieure ont ensuite été insérées dans la région non traduite (UTR) 3′ de l’arrêt de Drosophila melanogaster (shu), un granule germinal^{ARNm 4,23,24}, et son homologue antisens (shu^anti). Le shu 3′ UTR a été choisi car des travaux antérieurs ont démontré que cet ARN existe principalement comme monomère chez Drosophila melanogaster et ne dimérise pas même à de fortes concentrations molaires dans les tests de gel d’ARN ^4,24. De plus, shu-top et shu-bottom ne forment pas d’homodimères dans les gels d’ARN⁴, permettant une évaluation plus directe des interactions intermoléculaires entre top et bottom ainsi que de l’influence des séquences flancantes dérivées du shu.
Les modèles ADN pour shu-top, shu-bottom, shu^anti-top et shu^anti-bottom sont listés dans le Tableau 2. Les séquences supérieure et inférieure ont été insérées au centre de la SHU ou ^{shu anti-3}′ UTR, nécessitant un remodelage structurel pour faciliter l’interaction et mieux imiter les interactions physiologiques ARN–ARN, dans lesquelles les régions interagissantes sont généralement intégrées dans les transcrits⁴.

Lors de l’induction du regroupement ARN, shu-top, shu-bottom, ^{shu anti-top} et ^{shu anti-bottom} ont individuellement montré une fluorescence minimale de DFHBI-1T, similaire à la seule fluorescence top et bottom (Figures 2A et 2B). De manière constante, le co-repliement de shu-top avec shu-bottom ou shu^anti-top avec shu^anti-bottom produisait un signal DFHBI-1T plus élevé que le pliage séparé (Figures 2Ci et Cii). Après normalisation en contrôles d’intensité et de négatif de l’ARN (définis comme le signal moyen normalisé de DFHBI-1T provenant de chaque ARN seul), le co-repliage de shu-top et shu-bottom a entraîné une augmentation de 5,63 fois de la fluorescence normalisée de DFHBI-1T (Figures 2Di et 2Dii). En revanche, le repliement séparé n’a montré qu’une augmentation de 1,04 fois, comparable aux niveaux de base observés individuellement pour le shu-top et le shu-bottom. Des tendances similaires ont été observées pour shu^anti-top et ^{shu anti-bottom} sous des conditions de co-pliage et de pliage séparé (Figures 2Di et 2Dii). Ces résultats indiquent que le repliement séparé ne favorise pas l’appariement intermoléculaire de bases entre shu-top et shu-bottom ni shu^anti-top et shu^anti-bottom, tandis que le co-repliement renforce ces interactions, probablement en raison des séquences de reporters insérées.

Pour tester la paire de base shu ^{et shu anti-can}, shu-top était mélangé avec shu^anti-bottom, et shu^anti-top avec shu-bottom. Les deux combinaisons présentaient une fluorescence DFHBI-1T plus élevée sous des conditions de co-repliement et de pliage séparé comparées à shu-top avec shu-bottom ou shu^anti-top avec ^{shu anti-bottom} (Figures 2Ci et 2Cii). Après normalisation, le co-repliage de shu-top avec shu^anti-bottom et shu^anti-top avec shu-bottom a entraîné des augmentations de fluorescence DFHBI-1T de 61,86 et 82,60 fois respectivement (Figures 2Di et 2Dii). En revanche, le pliage séparé n’a donné que des augmentations de 2,69 et 4,94 fois respectivement (Figures 2Di et 2Dii). Bien que bien inférieures à celles en conditions de co-repliage, ces valeurs étaient plus élevées que celles observées pour shu-top avec shu-bottom ou shu^anti-top avec shu^anti-bottom (1,04 et 1,16, respectivement).

Ensemble, ces résultats indiquent que les rapporteurs porteurs de séquences complémentaires supplémentaires ont une plus grande capacité de paire de bases que ceux qui n’en ont pas. Cet effet est encore renforcé sous la condition de co-repliage, qui favorise les interactions intermoléculaires.

Figure 1 : Structures secondaires prédites des ARN supérieur et inférieur et quantification de leur appariement intermoléculaire de bases dans des amas d’ARN in vitro. (A–B) Exemples de structures secondaires de la partie supérieure (A) et inférieure (B) repliées individuellement, comme prédit par l’ARN²⁵. Lorsqu’ils sont repliés séparément, le haut et le bas ne reconstituent pas l’aptamère du brocoli, et DFHBI-1T (étoile grise) produit une fluorescence minimale. (C) Exemple de la structure secondaire des ARN supérieur et inférieur appariés par des bases, tel que prédit par RNAcofold²⁵. L’appariement intermoléculaire des bases entre les deux ARN reconstitue deux bras de^{brocoli 18}, permettant la liaison à DFHBI-1T et entraînant une forte fluorescence verte (étoiles vertes). (D) Images de DFHBI-1T seul (contrôle uniquement avec colorant) et de clusters d’ARN in vitro (magenta) formés par les ARN supérieur et inférieur en présence de DFHBI-1T (vert). (Ei, ii) Clusters d’ARN in vitro (magenta) formés par les ARN supérieur et inférieur sous des conditions de co-repliage (i) et de repliement séparé (ii) en présence de DFHBI-1T (vert). Pour les panels D et E, les ARN ont été marqués avec Cy5 de sorte qu’en moyenne, environ un tiers des ARN contiennent un seul uracil marqué en Cy5, tandis que les deux tiers restants ne sont pas marqués. Les images représentent des projections Z moyennes de 27 tranches acquises avec une taille de pas de 150 nm, utilisant la même exposition et la même puissance laser pour chaque canal dans toutes les conditions. La fluorescence DFHBI-1T a été normalisée à la même plage d’intensité selon les conditions. Barres d’échelle : 2 μm. (F) L’intensité de DFHBI-1T a été normalisée en abondance d’ARN, mesurée par la fluorescence Cy5. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. Valeurs p pour le test t à deux queues (**** vs. co-repliage) : 1,0 × 10⁻²² (colorant uniquement), 2,3 × 10⁻²² (haut), 4,9 × 10⁻²³ (bas), et 7,0 × 10⁻²³ (repliage séparé). n = 30 régions pour la condition de colorant uniquement et 30 à 31 groupes d’ARN pour toutes les autres conditions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Images représentatives et quantification de l’appariement intermoléculaire des bases pour les rapports supérieurs et ^{inférieurs anti-porteurs} shu et shu. (A) Images de DFHBI-1T seul (contrôle uniquement sous colorant) et de clusters d’ARN in vitro (magenta) formés par des ARN shu-top, shu-bottom, ^{shu anti-top} et shu anti-bottom en présence de DFHBI-1T (vert). Les ARN ont été marqués avec Cy5 de telle sorte qu’en moyenne, trois uracils UTP-Cy5 ont été incorporés lors de la transcription in vitro. Les images représentent des projections Z moyennes de 27 tranches acquises avec une taille de pas de 150 nm, utilisant la même exposition et la même puissance laser pour chaque canal dans toutes les conditions. La fluorescence DFHBI-1T a été normalisée à la même plage d’intensité selon les conditions. Barres d’échelle : 2 μm. (B) L’intensité de DFHBI-1T a été normalisée en abondance d’ARN, mesurée par la fluorescence de Cy5. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. n.s., non significative. Valeurs p pour le test t à deux queues (vs. colorant uniquement) : 3,1 × 10⁻³ (** ; shu-top), 1,7 × 10⁻¹ (N.S. ; shu-bottom), 2,9 × 10⁻³⁵ (*** ; Shu anti-top), et 2,2 × 10⁻² ( ; Shu^anti-bottom). n = 30 régions pour la condition de colorant uniquement et 30 à 32 grappes d’ARN pour toutes les autres conditions. (Ci, ii) Images de clusters d’ARN in vitro (magenta) formés par le mélange de shu-top avec shu-bottom, shu^anti-top avec shu^anti-bottom, shu-top avec shu^anti-bottom, et shu^anti-top avec shu-bottom en présence de DFHBI-1T (vert) sous co-repliage (i) et repliage séparé ( ii) conditions. Les images représentent des projections Z moyennes de 27 tranches acquises avec une taille de pas de 150 nm, utilisant la même exposition et la même puissance laser pour chaque canal dans toutes les conditions. Pour la basse plage, la fluorescence DFHBI-1T a été normalisée à la même plage d’intensité que la figure 1D–Eii et la figure 2A. Pour la plage élevée, la fluorescence DFHBI-1T a été normalisée à une plage d’intensité plus élevée mais constante dans toutes les conditions dans les panneaux Ci et Cii. Barres d’échelle : 2 μm. (Di, ii) L’intensité de DFHBI-1T a d’abord été normalisée en intensité ARN puis en témoins négatifs, définis comme le signal moyen normalisé de DFHBI-1T provenant de chaque ARN seul. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. n.s., non significative. (i) Valeurs p pour le test t à deux queues (**** vs. shu-top + shu-bottom) : 1,1 × 10⁻³¹ (shu^anti-top + shu^anti-bottom), 1,1 × 10⁻²² (shu-top + ^{shu anti-bottom}), et 4,3 × 10⁻²⁷ (^{shu anti-top} + shu-bottom). (ii) valeurs p pour le test t à deux queues (vs. shu-top + shu-bottom) : 2,2 × 10⁻¹ (n.s. ; shu anti-haut + shu anti-bas), 1,9 × 10⁻9 ( ; shu-top + ^{shu anti-bottom}), et 1,3 × 10⁻¹⁵ ( ; Shu^anti-top + shu-bottom). n = 29–32 groupes d’ARN pour toutes les conditions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Nom	Séquences (5′-3′)
Promoteur T7	TAATACGACTCACTATAG
Haut	GGATGATGGAGACGGTCGGGTC CAGGATCATTCATGGCAAGAGAC GGTCGGGTCCAGATGATGCGGAT
Bottom	GGATCCCCCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGC TCCATCATCC
Attaquant top T7	TAATACGACTCACTATAG GGATGGAGACGGTCG
Sommet-Reverse	ATCCGCATCATCCCCCCCCC
Avant-bas T7	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCATCTGTCGA
Bas-Revers	GGATGATGGAGCCCACACT
Les amorces avant contiennent un surplomb de séquence promoteur T7 (en gras), suivi de séquences ciblant l’extrémité 5′ de l’ARN.

Tableau 1 : Séquences de promoteurs T7, de rapporteurs brocoli divisés et d’amorces utilisées pour amplifier les modèles d’ADN pour la transcription de T7. Les amorces listées ont été utilisées pour générer des modèles d’ADN pour la transcription in vitro des ARN supérieur et inférieur , qui ont ensuite été utilisés dans les tests de regroupement d’ARN décrits dans cette étude.

Nom	Séquences (5′-3′)
Shu-top	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATCATTACTCAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGTCCAGGATCATCATTGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGATGCGGA TAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAATTTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATT AGTTATTTTTCGATATTAGCAACATGAATCGTAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAAAAAACCACAATAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
Shu-bottom	GCTTACTAAGAAGCCCCCCCATTATTTCATATTTCATCATCATCTACTATACTAAAAGGATCCCCGCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGTGCTCTTGCCATGTGTGTGTGTCAACCCACATACTCTGATG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGTGGTCCATCATCATCCAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATTATTATTTTTTGATATTAGCAACATGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTATTTAGAGCAACGTAGACCCTTAAGTTTTTTTAA AAACCACAATAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
ShuAnti-Top	ATGTAGCTGCCGTGTGTCATTATTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTTTCATGTTTGGTATGTTTTTTTTTTTTTGGA TGATGGAGACGGTCGGGTCCCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGAT GCGGATTTTTTGAGTAAGATATGAAATATGAAATATGGGGCTTCTTAGTAAGC
ShuAnti-Bottom	ATGTAGCTGCCCGTGTGTTATTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTA AATAACAAAAAACGTTAACATTCGTCTCTGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAATTTTCATGTTTGGTATGTTTTTTTT GGATCCCCCATCATCTCTCGAGTAGTGTGTGGTCTTGCTGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTCAAC CCACATACTCTGATGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCCTTTTTGAGTAA GATATGAAAATATGAAATACTGGGGCTTCTTAGTAAGC
shu-top ou shu-bottom-avant, T7	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCCCAGT
Shu-top ou shu-bottom-Revers	ATGTAGCTGCGTGCATTAC
shuanti-top ou shu anti-bottom-T7 avant	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGCATTA
Shuanti-haut ou shuanti-bas-Revers	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
Les amorces avant contiennent un surplomb de séquence promoteur T7 (en gras), suivi de séquences ciblant l’extrémité 5′ de l’ARN. Un ou deux G supplémentaires étaient inclus entre le promoteur T7 et shu-top et shu-bottom oushu anti-top et shuanti-bottom, respectivement. Cela s’explique par le fait que la présence de G aux positions +2 et +3 peut augmenter significativement le rendement detranscription de 19. Cependant, ces G supplémentaires peuvent potentiellement influencer l’interprétation de l’appariement de bases dans les constructions conçues. Voir la note à l’étape 1.1.

Tableau 2 : Séquences de shu-top, shu-bottom, ^shu anti-top, shu^anti-bottom et amorces utilisées pour amplifier les modèles d’ADN pour la transcription T7. Les amorces listées ont été utilisées pour générer des modèles d’ADN pour la transcription in vitro des ^anti-ARN shu et shu portant les rapports supérieur et inférieur, qui ont ensuite été utilisés dans les tests de regroupement d’ARN décrits dans cette étude.

Discussion

Dans cette étude, le système de brocoli aptamer¹⁸ a été adapté pour la visualisation directe et la quantification de l’appariement intermoléculaire de bases sous des conditions de regroupement d’ARN in vitro. Cette approche permet d’évaluer l’appariement intermoléculaire des bases à travers différentes conditions in vitro et complète les tests biochimiques en aval, tels que les expériences de tirage d’ARN utilisant les réticulateurs de base 15,16,17 et l’électrophorèse ^{en gel 4,6,7}. Contrairement à ces méthodes biochimiques, qui manquent de résolution spatiale pour distinguer les paires de bases au sein des clusters d’ARN de celles qui se produisent à l’extérieur, cette approche permet une visualisation spatiale directe de ces interactions au sein des clusters. Plus précisément, il permet de surveiller l’appariement de bases entre les ARN supérieur et inférieur, ou ARN porteurs de ces rapporteurs, dans des conditions définies de regroupement d’ARN. De plus, il fournit une lecture quantitative en temps réel de l’appariement de bases entre ARN rapporteurs sans nécessiter de réticulation ni d’extraction d’ARN, minimisant ainsi la perte d’échantillons et l’incompatibilité du tampon.

À l’aide de la microscopie à fluorescence, l’appariement intermoléculaire de bases entre les séquences d’aptamère brocoli divisé a été mesuré quantitativement via le signal DFHBI-1T, démontrant la compatibilité de DFHBI-1T avec le protocole de regroupement ARN in vitro . L’étendue de l’appariement intermoléculaire des bases variait selon les conditions de repliement de l’ARN, comme observé sous les conditions de co-repliement et de repliement séparé (Figure 1F et Figure 2Di–2Dii). Ces résultats indiquent que les conditions de repliement de l’ARN influencent de manière critique les interactions intermoléculaires et doivent être soigneusement prises en compte lors de l’interprétation des résultats expérimentaux.

Cet essai offre également une plateforme pour évaluer si les séquences flanquant les rapports supérieur et inférieur améliorent les paires intermoléculaires de bases, comme démontré avec le shu. La fluorescence du DFHBI-1T était plus élevée pour le shu-top avec shu^anti-bottom et shu^anti-top avec le shu-bottom que pour le shu-top avec shu-bottom ou shu^anti-top avec ^{shu anti-bottom}, indiquant des interactions intermoléculaires impliquant shu et ^{shu anti} renforce encore le signal de Broccoli. Ces observations suggèrent que le signal de fluorescence DFHBI-1T obtenu à partir du co-repliage des rapporteurs supérieur et inférieur ne représente pas la limite supérieure de l’analyse.

La fluorescence de DFHBI-1T mesurée dans ces expériences couvrait une large plage dynamique, allant d’une augmentation de 1,04 fois (shu-top avec shu-bottom sous pliage séparé) à une augmentation de 82,60 fois (^{shu anti-top} avec shu-bottom sous co-repliage). Cette plage dynamique permet de détecter les différences dans les interactions intermoléculaires entre les ARN porteurs de ces rapporteurs.

Plusieurs étapes de ce protocole sont cruciales pour la détection réussie de l’appariement intermoléculaire de bases d’ARN entre les ARN supérieur et inférieur du brocoli divisés dans les amas d’ARN. Des aliquotes fraîches de PEG 8000 doivent être utilisées pour induire de manière fiable le regroupement de l’ARN, et les cycles répétés de congélation-dégel doivent être minimisés en raison de l’instabilité des réactifs. DFHBI-1T doit être aliquoté et stocké à −20 °C afin de préserver les propriétés de fluorescence. Les produits de transcription in vitro doivent être analysés sur un gel d’ARN dénaturant avant le regroupement afin de confirmer la taille correcte du transcrit. De plus, maintenir des conditions sans RNase, y compris un environnement de travail propre et une chambre d’imagerie, est essentiel car les gouttelettes d’ARN sont incubées à température ambiante pendant de longues périodes avant l’imagerie.

Une limitation de ce test est que DFHBI-1T rapporte spécifiquement un appariement intermoléculaire de bases médié par les séquences supérieures et inférieures. D’autres événements de paires de bases intermoléculaires survenant dans différentes régions d’ARN ne peuvent pas être détectés. De plus, la structure brocoli formée par l’appariement de bases entre les brins supérieur et inférieur est thermodynamiquement^{stable 26} et peut ne pas refléter entièrement les interactions plus faibles ou transitoires, telles que celles formées par des bases dispersées exposées à la surface, comme observé^{dans les} clusters 4 d’ARNm de granules germinaux de Drosophila.

De plus, les interactions intermoléculaires ARN-ARN peuvent être décontractées et non spécifiques, et des séquences flanquant les rapporteurs supérieur et inférieur peuvent influencer la fluorescence du DFHBI-1T. Ces régions latérales peuvent interagir directement avec les séquences de rapporteurs, inhibant la formation de brocoli ou modifiant la structure de l’ARN, affectant ainsi les interactions entre les ARN porteurs des rapporteurs. En conséquence, le test reflète les effets combinés de la structure ARN, de l’appariement de bases haut-bas, des interactions entre les séquences de flancage et des interactions entre les séquences de flanc et les rapporteurs.

Cet essai offre des opportunités pour de futures investigations. Par exemple, modifier les séquences d’ARN flanquant les reporters, introduire des hélicases ou chaperons d’ARN, ou modifier les conditions salines peut influencer l’appariement intermoléculaire de bases dans les amas d’ARN. De tels effets peuvent être évalués en mesurant le signal DFHBI-1T sous conditions de co-repliement et de repliement séparé. Étant donné que des aptamères d’ARN similaires ont été utilisés dans des cellules, des bactéries et des^levures 26,27,28,29,30, cette approche peut être étendue aux systèmes cellulocellulaires ou aux organismes modèles pour examiner l’appariement intermoléculaire de bases dans les amas d’ARNm.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MgCl2	Millipore Sigma	M1028	Utilisé pour la préparation de 10 et plus : Tampon de repliement de l’ARN.
2M KCl	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	AM9640G	Utilisé pour la préparation de 10 et plus : Tampon de repliement de l’ARN.
50 % PEG 8000	NEB	M0204S	Composant du kit de ligase ARN T4 ; utilisé comme réactif de regroupement moléculaire pour induire le regroupement de l’ARN. & nbsp ;
Éthanol absolu, 200 proof	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	T038181000CS	Utilisé pour la préparation du tampon de lavage ARN.
Phénol acide :chloroforme, pH 4,5 (avec IAA, 125:24:1)	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	AM9722	Utilisé pour la purification de l’ARN.
Aminoallyl-UTP-Cy5	Jena Bioscience	NU-821-CY5	Utilisé pour le marquage de l’ARN lors de la transcription in vitro.
Verre de couverture à chambre	Thermo Fisher Scientific	155409PK	Chambre d’imagerie pour les réactions de regroupement ARN.
Chloroforme	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	C298-500	Utilisé pour la purification de l’ARN.
DFHBI-1T	Lucerne	410	Utilisé comme fluorophore pour la détection de l’aptamère d’ARN brocoli.
DMSO	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	D12345	Anhydre ; qualité en biologie moléculaire ; utilisé pour la préparation au DFHBI-1T. & nbsp ;
ADN propre & Kit de concentration	Zymo	D4014	Utilisé pour le nettoyage des produits ADN avant la transcription de T7.
Kit d’extraction de gel d’ADN	NEB	T1020L	Utilisé pour l’extraction par gel.
Bain sec	Benchmark Scientific	BSH1001	Utilisé pour chauffer des échantillons d’ARN dans des tubes de microcentrifuge.
FIJI/ImageJ	NIH (Instituts nationaux de la santé)	N/A	logiciels d’analyse d’images open source ; utilisé pour la quantification de l’intensité de fluorescence et l’analyse du ROI.
Système d’électrophorèse sur gel   ;	Thermo Fisher Scientific	B2-BP	Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’ADN.
Colorant de charge en gel, violet (6 fois)	NEB	B7024S	Utilisé comme colorant de charge pour l’électrophorèse sur gel d’ADN.
Microscope à illumination instantanée structurée	VisiTech international	VT-iSIM	Un microscope confocal capable d’imager la fluorescence GFP et Cy5.
Isopropanol	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	327272500	Utilisé pour la purification de l’ARN.
MEGAscript T7 Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	AM1334	Utilisé pour la transcription in vitro de la T7. Le kit comprend des solutions nucléotidiques (ATP, CTP, GTP, UTP) et de la DNase.
Tubes microcentrifuges	Genesee Scientific	22-284	Tube de 1,5 mL ; utilisé pour stocker des modèles d’ADN pour la transcription in vitro, les produits d’ARN, ainsi que les aliquotes de spermine et de DFHBI-1T. & nbsp ;   ;   ;
Mini-centrifugeuse	Benchmark Scientific	Z763845	Utilisé pour des centrifugations brèves.
Spectrophotomètre Nanodrop One	Thermo Fisher Scientific	13-400-518	Spectrophotomètre de microvolume pour mesurer la concentration et la qualité de l’ADN et de l’ARN.
Eau sans nucléase   ;	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	AM9937	Utilisé pour la resuspension de granulés d’ARN, la préparation de lavages d’ARN et de tampons de repliage, ainsi que la dilution de spermine et DFHBI-1T.
Calculateur de masse molaire en ligne	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre (NEB)	N/A	Outil en ligne utilisé pour calculer la masse d’ARN à partir de la quantité molaire (par exemple, pmol).
Tubes PCR en polypropylène	Corning	3745	200 & mu ; Les tubes L PCR utilisés pour la PCR, la transcription in vitro et les réactions de regroupement de l’ARN
Alimentation de base PowerPac	Bio-rad	1645050	Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’ADN.
Cycleur thermique PCR Proflex	Thermo Fisher Scientific	44-840-73	Utilisé pour la PCR, la transcription in vitro et le chauffage d’échantillons d’ARN dans des tubes PCR.
Q5 Haute fidélité 2 fois ; Master Mix	NEB	M0492S	Utilisé comme 2 fois ; Mix master haute fidélité.
Centrifugeuse réfrigérée   ;	Eppendorf	5424R	Utilisé pour la purification et la pelletation d’ARN. & nbsp ;
Solution de décontamination RNase	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	AM9782	Utilisé pour nettoyer les établis de laboratoire et les surfaces afin de minimiser la contamination par RNase.
Spermine & nbsp ; Tétrahydrochlorure	Sigma-Aldrich	S1141-1G	Utilisé pour induire le regroupement d’ARN.
Tris Base	Millipore Sigma	T1503-1KG	Utilisé pour la préparation du tampon Tris (pH 7,0).
Agarose ultrapure	Thermo Fisher Scientific & nbsp ;	16500500	Utilisé pour l’électrophorèse sur gel d’ADN.