L’émulsion lipidique à base d’huile d’olive atténue la myocardite induite par l’inhibiteur des points de contrôle immunitaires via l’inhibition de la voie NF-κB/NLRP3/IL-1β

Résumé

Les émulsions lipidiques à base d’huile d’olive atténuent la myocardite induite par un inhibiteur des points de contrôle immunitaires en ciblant la voie NF-κB/NLRP3/IL-1β, démontrant leur potentiel pour supprimer les cascades inflammatoires. Ces résultats soulignent son potentiel en tant que thérapie complémentaire pour les lésions cardiaques liées au système immunitaire.

Résumé

La présente étude visait à étudier l’efficacité thérapeutique et le mécanisme sous-jacent des émulsions lipidiques à base d’huile d’olive (OOLE) pour atténuer la myocardite induite par l’inhibiteur du point de contrôle immunitaire (ICI) déclenchée par l’ipilimumab (IPI) et le nivolumab (NIVO). Un modèle in vitro des cardiomyocytes inflammatoires a été établi en co-cultivant des cellules HL-1 avec des cellules T CD4⁺/CD8⁺ isolées de souris traitées par ICI. Les cellules ont été traitées avec 10 % d’OOLE, suivies d’une cytométrie en flux pour l’apoptose, ELISA pour le profilage des cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-6), et Western blot/qPCR pour l’analyse des voies (NF-κB, NLRP3, IL-1β). In vivo, la myocardite a été induite chez la souris par administration IPI/NIVO (IPI/NIVO ). La fonction cardiaque a été évaluée par échocardiographie, et les marqueurs inflammatoires ont été évalués dans le tissu sérique et le miocarde. Les résultats ont montré que l’OOLE réduisait significativement l’apoptose induite par les lymphocytes T et diminuait la production de cytokines inflammatoires dans les cellules HL-1, tandis que l’expression de NF-κB, NLRP3 et IL-1β était régulée à la baisse. In vivo, OOLE a amélioré les paramètres fonctionnels du ventricule gauche et atténué l’inflammation systémique. Des analyses moléculaires ont confirmé que ces effets protecteurs étaient médiés par l’inhibition de l’axe de signalisation NF-κB/NLRP3/IL-1β. En conclusion, OOLE atténue la myocardite aiguë induite par ICI en ciblant la voie NF-κB/NLRP3/IL-1β, démontrant son potentiel pour supprimer les cascades inflammatoires précoces et offrir une cardioprotection rapide. Ces résultats soulignent son potentiel en tant que thérapie complémentaire pour les lésions cardiaques liées au système immunitaire.

Introduction

Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI), tels que ceux ciblant la mort cellulaire programmée 1 (-1) et la protéine cytotoxique associée aux lymphocytes T 4 (CTLA-4), ont révolutionné le paysage du traitement de diverses malignités. Cependant, l’application clinique généralisée des ICI est souvent compliquée par les événements indésirables liés au système immunitaire (IRAE). Parmi celles-ci, la myocardite induite par ICI est une complication rare mais potentiellement fatale, caractérisée par un cours clinique rapide et des taux de mortalité élevés allant de 25 % à 50 ^%. Malgré sa gravité, les options thérapeutiques actuelles pour la myocardite induite par l’ICI restent largement limitées aux corticostéroïdes à forte dose et aux immunosuppresseurs^{non spécifiques 3,4}. Ces interventions traditionnelles produisent souvent des réponses sous-optimales et peuvent compromettre l’efficacité anti-tumorale des^{ICI 1}, créant ainsi un vide de connaissances crucial dans la recherche de stratégies cardioprotectrices plus sûres et ciblées pouvant atténuer l’inflammation cardiaque sans immunosuppression systémique.

L’inflammasome de la protéine réceptrice de type NOD 3 (NLRP3), activée via la voie de signalisation NF-κB, est apparue comme un moteur central de la tempête de cytokines observée dans la myocardite induite par^{ICI 5,6}. Une production excessive de cytokines pro-inflammatoires, en particulier IL-1β et IL-6, conduit à des lésions cardiomyocytaires profondes et à une insuffisance^{cardiaque 7}. Bien que plusieurs interventions à base de lipides aient été explorées dans les maladies cardiovasculaires, le potentiel des émulsions lipidiques à base d’huile d’olive (OOLE) dans ce contexte spécifique reste inexploré. OOLE est riche en acide oléique, un acide gras monoinsaturé connu pour sa capacité unique à moduler la fluidité des membranes et à supprimer les cascades^{inflammatoires 8,9}. Cependant, il n’a pas été établi si l’OOLE peut spécifiquement atténuer l’état hyper-inflammatoire caractéristique de la myocardite induite par l’ICI.

Dans cette étude, nous visons à combler cette lacune en étudiant le potentiel thérapeutique de l’OOLE. Nous émettons l’hypothèse que l’OOLE exerce un puissant effet cardioprotecteur en inhibant l’axe de signalisation NF-κB/NLRP3/IL-1β, supprimant ainsi la poussée inflammatoire et préservant la fonction cardiaque. En combinant un modèle de co-culture in vitro de cardiomyocytes HL-1 et de lymphocytes T avec un modèle murin in vivo. de myocardite induite par ICI, nous démontrons que l’intervention OOLE permet une récupération fonctionnelle rapide et atténue la lésion myocardique. Cette étude fournit la première preuve de l’OOLE comme nouvelle approche pharmacologique nutritionnelle ciblée pour gérer la cardiotoxicité liée aux ICI.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de Guangzhou Miles Biotechnology Co., Ltd., avec le numéro d’approbation IACUC-MIS2023076. L’entreprise mentionnée est un centre d’expérimentation animale ; Nos expériences animales sont menées ici et sont donc soumises à l’examen du comité d’éthique du centre.

Animaux et conception expérimentale
Trente souris BALB/c (mâles, 8 semaines, pesant 22 ± 2 g) ont été achetées commercialement. Critères d’induction et de validation du modèle : Un modèle de myocardite induite par inhibiteur de points de contrôle immunitaires (ICI) a été établi par injection intraveineuse d’ipilimumab (5 mg/kg) et de nivolumab (10 mg/kg) pendant 2 semaines consécutives. La posologie a eu lieu tous les 3 jours pour une durée totale de modélisation de 2 semaines. Ce protocole a déjà démontré qu’il induisait une lésion cardiaque^{immunomédiatisée significative 10}. 24 heures après l’injection finale, des échantillons de sang ont été prélevés via le plexus rétro-orbitaire et centrifugés à 300 x g pendant 15 minutes à 4 °C pour isoler le sérum ; par la suite, les niveaux sériques de cTnT ont été quantifiés à l’aide d’un kit ELISA spécifique, impliquant des étapes séquentielles de chargement d’échantillons, d’incubation d’anticorps conjugués à HRP, de lavages automatisés et de réaction du chromogène TMB, la densité optique mesurée à 450 nm pour calculer les concentrations selon une courbe logistique à quatre paramètres, et une concentration de cTnT de ≥10 ng/mL a été considérée comme un modèle réussi.

Six souris modèles avec le poids corporel et la concentration de cTnT les plus proches ont été divisés aléatoirement en deux groupes : un groupe témoin et un groupe de traitement (n=3 pour les deux, réplication biologique). Le groupe témoin a reçu quotidiennement des injections intraveineuses de solution saline normale à une dose de 5 mL/kg. Le groupe traité a reçu quotidiennement des injections intraveineuses d’émulsion lipidique à base d’huile d’olive (OOLE) à 5 mL/kg via la veine de la queue pendant 6 jours (cela représente la dose que nous utilisons pour le traitement clinique dans notre établissement ; elle a été extrapolée pour une utilisation chez la souris en fonction des rapports de surface corporelle). Les tests suivants ont été réalisés sur une fenêtre d’observation de 6 jours : la fonction cardiaque a été évaluée au départ (jour 0) et après le traitement (jour 6) à l’aide d’un système d’imagerie photoacoustique par ultrasons. Le sang a été prélevé via la veine rétroorbitale au jour 6, et les cytokines sériques ont été quantifiées par ELISA. Après avoir euthanasié les animaux par overdose d’anesthésie, le tissu cardiaque a été congelé instantanément pour une analyse des protéines.

Isolation des cellules T
Les souris du groupe témoin ont été euthanasiées par overdose d’anesthésie. Les rates ont été excisées de façon aseptique après une stérilisation de surface de 5 minutes avec 75 % d’éthanol, et tous les tissus conjonctifs ont été retirés. Les rates ont été dissociées mécaniquement à l’aide d’un filtre cellulaire de 70 μm avec PBS complété par 2 % de FBS pour créer une suspension unicellulaire. Cette suspension a ensuite été centrifugée à 300 x g., 4 °C pendant 5 minutes, et les érythrocytes ont été lysés avec 1 mL de tampon de lyse ACK pendant 2 minutes à température ambiante. Le processus de lyse s’est terminé par un lavage avec du PBS. Les lymphocytes T ont été enrichis négativement pour empêcher l’activation à l’aide d’un kit d’isolation des cellules T de souris. Pour chaque 10 million de cellules, 50 μL de cocktail de sélection ont été ajoutés et incubés à température ambiante pendant 10 minutes. Cela a été suivi par l’ajout de 75 μL de billes magnétiques de streptavidine par 10 millions de cellules, avec une incubation de 5 minutes. Les cellules liées aux billes ont été conservées à l’aide d’un aimant pendant 3 minutes, et les cellules T enrichies (avec plus de 94 % de pureté) ont été collectées à partir du surnageant. Pour trier les sous-ensembles CD4⁺ et CD8⁺, les cellules enrichies ont été colorées avec des anticorps anti-CD3ε-PE, anti-CD4-APC et anti-CD8-FITC pendant 15 minutes dans l’obscurité, puis lavées 3 fois avec des PBS pré-refroidis. Le tri a été effectué sur un cytomètre à flux en utilisant la stratégie de gating suivante : lymphocytes (FSC/SSC), puis sous-ensembles CD3⁺, puis CD4⁺ ou CD8⁺. Les cellules ont été triées en mode pureté dans des tubes de collecte pré-remplis de 200 μL de PBS, produisant ainsi des sous-ensembles cibles avec une pureté supérieure à 98 %.

Construction et traitement du modèle cellulaire de la myocardite
Les cellules HL-1 ont été cultivées dans un milieu DMEM/F12 complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (PS) dans des conditions standard (37 °C, 5 % CO₂). Les cellules ont été divisées en trois groupes : groupe témoin (non traité), groupe modèle (cellules HL-1 traitées avec des cellules T CD4+/CD8+ pendant 24 heures) et groupe OOLE (groupe modèle co-traité avec 10 % d’OOLE pendant 24 heures).

ELISA pour la détection sérique des protéines liées aux lésions myocardiques
Incubez 50 μL d’échantillon sérique dans les microplaques pré-enduites riches en anticorps du kit pendant 30 minutes, puis lavez trois fois avec du PBST pour éliminer les composants non liés. Ajoutez la solution d’avidine préparée marquée par la peroxydase de raifort (HRP) pour une seconde incubation. Rinçez trois fois de plus avec du PBST, ajoutez 100 μL de substrat 3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) pour initier la réaction colorimétrique, puis terminez la réaction avec 100 μL de solution d’arrêt dans les 30 à 45 minutes suivant l’initiation. Mesurez l’absorbance (OD) à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques et quantifiez la concentration de l’analyte cible à l’aide d’une courbe standard tracée avec des standards de référence connus.

Tache occidentale
Les tissus cardiaques ont été pulvérisés à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire avec de l’azote liquide. Par la suite, des échantillons de tissu et de cellules ont été lysés dans 200 μL de tampon RIPA sur glace pendant 30 minutes. Les lysats ont été centrifugés à 12 000 x g pendant 15 minutes à 4 °C afin de collecter les surnatants protéiques. Les concentrations de protéines ont été déterminées à l’aide d’un kit de test protéique BCA. Après avoir ajusté la concentration de protéines à 5 μg/μL, les échantillons ont été mélangés avec un tampon de charge de 5× et dénaturés par chauffage à 95 °C pendant 10 minutes. Les protéines ont été séparées sur des gels SDS-PAGE à 10 % (administrées à 100 V pendant 90 minutes) puis transférées dans les membranes PVDF par électroblotting semi-sec à 15 V pendant 30 minutes. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé puis sondées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires (y compris IL-1β, NLRP3, MyD88, NF-κB p65 et Tubuline ; dilution 1:1 000)². Après avoir lavé les membranes trois fois pendant 10 minutes chacune avec du sérum physiologique tamponné à Tris contenant 0,1 % de Tween 20 (TBST), elles ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) (dilution 1:10 000) pendant 1 h à température ambiante. Les bandes protéiques ont été visualisées en appliquant un substrat à chimiluminescence améliorée (ECL), et les signaux ont été capturés à l’aide d’un système d’imagerie chimiluminescence. Enfin, les niveaux d’expression relatifs ont été analysés quantitativement en normalisant les valeurs densitométriques des bandes protéiques cibles au contrôle interne de la tubuline à l’aide du logiciel ImageJ.

Analyse d’apoptose cellulaire par cytométrie en flux
Les cellules HL-1 ont été lavées deux fois avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS). Pour la dissociation cellulaire, 1 mL de trypsine a été ajouté et incubé pendant 1 minute, suivi immédiatement d’une neutralisation avec 2 mL de milieu de culture complet. La suspension à cellules était ensuite centrifugée à 250 x g pendant 5 minutes à 4 °C, et le surnageant était abandonné. La granule cellulaire collectée a été lavée deux fois avec du PBS glacé et resuspendue dans un tampon de liaison 1x pour obtenir une densité cellulaire de 1 x 10⁶ cellules/mL. Une aliquote de 100 μL de cette suspension cellulaire a été transférée dans un tube de cytométrie en flux, suivi de l’ajout de 5 μL de FITC-Annexine V et de 5 μL d’iodure de propidium (PI). Après un vortex doux, le mélange était incubé pendant 15 minutes à température ambiante (25 °C) dans l’obscurité. Enfin, 400 μL de tampon de liaison 1x ont été ajoutés à chaque tube, et l’apoptose cellulaire a ensuite été analysée à l’aide d’un cytomètre en flux. Pour la stratégie de gating, les événements ont d’abord été déclenchés sur la diffusion directe (FSC) et la dispersion latérale (SSC) afin d’exclure les débris subcellulaires et d’isoler la population cellulaire HL-1 intacte. À l’intérieur de cette porte primaire, les cellules apoptotiques ont été quantifiées par analyse quadrante, les cellules apoptotiques précoces étant définies comme FITC-Annexine V⁺/PI⁻ et les cellules apoptotiques tardives définies comme FITC-Annexine V⁺/PI⁺.

Analyse statistique
Chaque expérience a été réalisée en triple exemplaire, et l’analyse statistique a été réalisée à l’aide de logiciels statistiques. Les différences entre deux groupes ont été analysées à l’aide du test t des échantillons indépendants ; les différences entre trois groupes ou plus ont été analysées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle suivie du test post-hoc de Bonferroni. Les données sont exprimées en moyenne ± erreur standard (SEM). p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

La combinaison d’ipilimumab et de Novolumab induit une myocardite induite par ICI dans un modèle animal
Pour établir un modèle de myocardite induite par l’ICI, des souris BALB/c ont reçu des injections intraveineuses d’ipilimumab (5 mg/kg) et de nivolumab (10 mg/kg) via la veine de la queue. Les niveaux sériques de troponine T cardiaque (cTnT) ont ensuite été mesurés à l’aide d’un test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA). Un niveau de cTnT ≥ 10 ng/mL a été défini co...

Discussion

Dans cette étude, nous avons démontré pour la première fois que les émulsions lipidiques à base d’huile d’olive (OOLE) atténuent efficacement la myocardite induite par l’inhibiteur du point de contrôle immunitaire (ICI) en supprimant la voie de signalisation IL-1β/NLRP3/NF-κB. Nos résultats fournissent à la fois des preuves mécanistiques et fonctionnelles que l’OOLE améliore non seulement la fonction cardiaque, mais soulage également l’inflammation myocardale in vivo et in v...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Membranes PVDF de 0,22 μm	Millipore	ISEQ00010  ;
4 % de paraformoldéhyde	Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd.	BL539A
Souris BALB/c	Guangdong Zhiyuan Biomedicine Technology Co., Ltd.
Kit de test BCA	Dingguo Biotech	BCA02
Microscopie en champ clair	MSHOT	ML31
Kit elisa cTnT	Lunchangshuobiotech	ED-28107
Appareil d’électrophorèse	WIX	miniPro4
Système d’analyse d’images par chimiluminescence entièrement automatisé	FUJIFILM	LAS-3000
kit d’hématoxyline-éosine   ;	Guangzhou Jadeite Biotechnology Co., Ltd.	BL2236A
IFN-& gamma ; Kits ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, Chine).	ED-10284
IL-1 & bêta ; anticorps	Affinité	BF8021
IL-1 & bêta ; Kits ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, Chine).	ED-10351
Kits IL-6 ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, Chine).	ED-10377
Logiciel ImageJ 1.54	NIH
Ipilimumab	MCE	CAS : 477202-00-9
Anticorps MyD88	Affinité	AF5195
NF-& kappa ; Anticorps B p65	Affinité	BF8005
Nivolumab	MCE	CAS : 946414-94-4
Anticorps NLRP3	Affinité	BF8029
Émulsion lipidique à base d’huile d’olive	le département de nutrition de l’hôpital du cancer de Fuda de Guangzhou
Appareil à film rotatif semi-sec rapide	Bio-Rad	788BR04132
Système quantitatif qPCR à fluorescence en temps réel	YARUI	MA-6000
Tampon de lyse RIPA	Beyotime	P0013B
Microtome rotatif	Leica	RM2235
Gels SDS-PAGE	Beyotime	P0052A, P0053A
Le kit de détection d’apoptose Annexin V-FITC/PI	Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.	MA0220-1
le kit d’isolation des cellules T EasySep CD4+	Stemcell	19765
La lignée cellulaire de cardiomyocytes de rat HL-1	Guangzhou All-perfect Biotechnology Co., Ltd.	TCM-C783
TNF-& alpha ; Kits ELISA	Xiamen Lenchangshuo Biotechnology Co., Ltd. (Fujian, Chine).	ED-11776
Système d’imagerie photoacoustique à ultrasons	Fujifilm VisualSonics	VEvo3100
Système de test urodynamique	Techman	BL-420