Un protocole rationalisé pour la microscopie de localisation à molécule unique dans les noyaux d’Arabidopsis

Summary

Ce protocole propose un flux de travail efficace pour l’imagerie microscopique de localisation à molécule unique des noyaux isolés d’Arabidopsis, utilisant une isolation, une fixation et un marquage optimisés pour obtenir une visualisation fiable à l’échelle nanométrique de la chromatine et de la polymérase ARN II. Cette approche peut être facilement adaptée à d’autres protéines associées à la chromatine ou à des modifications histoniques pour l’imagerie haute résolution.

Abstract

Bien que la microscopie à fluorescence confocale ait fourni des informations précieuses sur l’organisation de la chromatine dans les noyaux des plantes, sa résolution limitée par la diffraction limite l’étude de l’architecture de la chromatine, ce qui motive l’utilisation de techniques de super-résolution telles que la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM). Parmi ces approches, la microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) fournit une résolution à l’échelle nanométrique dans des cellules individuelles, permettant une visualisation précise des domaines de chromatine, des modifications des histones et de l’organisation nucléaire. Bien que ces méthodes soient de plus en plus appliquées dans les systèmes mammifères, leur utilisation en biologie végétale reste limitée, principalement en raison de défis techniques dans la préparation des échantillons.

Ici, nous présentons un flux de travail simplifié et reproductible pour l’imagerie SMLM des noyaux isolés d’Arabidopsis thaliana. Ce protocole commence par la fixation des semis pour préserver la morphologie nucléaire, suivie d’un découpage doux des tissus et d’une centrifugation pour enrichir les noyaux intacts. Les noyaux isolés sont ensuite marqués par fluorophore dans un milieu liquide et immobilisés sur des coussinets d’agarose à faible fondeur, une stratégie qui améliore la stabilité lors de longues séances d’imagerie à molécule unique. Ces étapes minimisent collectivement la fluorescence de fond, améliorent la cohérence du marquage et augmentent la reproductibilité entre réplicés biologiques.

Les préparations résultantes offrent une meilleure clarté pour visualiser les modifications de la chromatine et l’architecture nucléaire dans les centrales. En abaissant les barrières techniques à la mise en œuvre de l’imagerie SMLM dans Arabidopsis, ce protocole offre un moyen polyvalent d’étudier la régulation épigénétique, l’organisation de la chromatine et les variations topologiques nucléaires à l’échelle nanométrique. Ce travail établit une base méthodologique pour appliquer la SMLM aux plantes, comblant le fossé avec la biologie cellulaire des mammifères et ouvrant de nouvelles opportunités pour étudier comment l’architecture nucléaire contribue à la régulation du génome en réponse aux indices développementaux et environnementaux dans les systèmes végétaux.

Introduction

La microscopie est depuis longtemps une pierre angulaire pour l’étude de l’organisation de la chromatine et de l’architecture nucléaire, révélant comment l’ADN et les protéines associées aux histones s’organisent dans l’espace nucléaire 3D et influencent la régulation des^{gènes 1,2}. La microscopie à fluorescence conventionnelle a fourni des informations précieuses sur les domaines de chromatine à grande échelle tels que les territoires chromosomaliques, les chromocentres et les corps^{nucléaires 3,4}, réalisables in si....

Protocol

REMARQUE : Les informations détaillées sur les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole sont disponibles dans le Tableau des matériaux. Sauf indication contraire, les tampons sont dégagés sur des filtres apyrogènes de 0,2 μm. L’H₂O ultra-pur (ddH₂O) double distillé est utilisé tout au long de ce protocole. Les étapes de centrifugation sont effectuées dans des microtubes de 1,5 mL utilisant un rotor à angle fixe.

1. Fixation des semis et libération des noyaux

1. Placez une plaque de culture à 6 puits sur de la glace sous la hotte, pu....

Results

Le protocole décrit ci-dessus permet la préparation de noyaux d’Arabidopsis thaliana de haute qualité adaptés au SMLM. Plusieurs séries d’optimisation ont été réalisées pour améliorer l’intégrité nucléaire et réduire les débris cytoplasmiques et cellulaires compromettant la qualité de l’image. Après chaque étape d’optimisation, la qualité des préparations nucléaires était évaluée par imagerie confocale à l’aide d’un microscope à disque rotatif Olympus IX81 avant de procéder à l’.......

Discussion

La préparation des noyaux d’Arabidopsis thaliana pour la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) nécessite plusieurs étapes critiques qui influencent fortement la qualité finale de l’échantillon. Comme décrit précédemment^19,35, un découpage tissulaire approfondi et régulier est essentiel pour maximiser la récupération des noyaux intacts. L’utilisation de lames de microtomes au lieu de lames de rasoir standar.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-ARN polymérase II anticorps répété YSPTSPS (phospho S2)	Abcam	AB5095	Anticorps primaire utilisé à dilution 1/200 dans un tampon immunocolorant pour visualiser la forme active de la polymérase (anticorps polyclonal élevé chez le lapin)
Logiciels d’acquisition	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906  ;   ;
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Agarose certifiée à faible fusion	Bio-Rad	1613111
Épaisseur des couvercles de 1,5 h	Marienfeld	117640	Ø : 24 mm
D-(+)-glucose, anhydre, 99 %	Thermo Scientific	A16828-36  ;
Miroir dichroïque	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Miroir dichroïque pour la séparation excitation/émission
Dulbecco » s Solution tamponnée phosphate 10 & aiguë ;	BioWest	X0515 - 500  ;	Travail dans des conditions stériles
Lames Epredia Ultra Jetables Microtome	FisherScientific	12191830	Profil bas, usage unique
Plaque de culture cellulaire multipuits à fond plat clair à fond plat traité par TC à 6 puits Falcon, avec couvercle	; Faucon	353046
Solution de formaldéhyde 37 %	Carl Roth	7398	Travail sous la hotte
Glucose oxydase	Sigma-Aldrich	G2133
Glycérol	VWR	24388.295
Anti-IgG anti-lapin de chèvre (H+L) Anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Utilisé à 1/200 comme anticorps secondaire couplé à AF647
Solution Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	94403	Utilisé à 1/500 pour contre-colorer l’ADN, ajouté au tampon d’agarose
Solution d’acide chlorhydrique	Laboratoire de chimie	CL05.0311.1000  ;
JF549-Hoechst	Laboratoire Lavis et équipe de chimie ouverte (Janelia)	JF549-Hoechst	Utilisé pour contre-colorer l’ADN, ajouté à la tampon d’agarose à une concentration finale de 1,5 nM
Ensemble de moulins KIMBLE Dounce	Sigma-Aldrich	D8938	Tube de 2 mL avec des pilons à dégagement grands (0,0030-0,0050 pouce) et petits (0,0005-0,0025 pouce)
Unité lasers	Oxxius	L6Cc	Équipé de six lasers : 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW et 730 nm - 30 mW
Chlorure de magnésium hexahydraté	Carl Roth	HN03
Mercaptoéthylamine (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sel de sodium 98 %	Fisher Scientific SAS	352590010
Filtre d’émission multibande	Semrock	FF01-446/523/600/677	Filtration par émission multibande pour bloquer la lumière diffusée par laser
Nanodiamants	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Stock 1 mg/mL
Appareil photo CMOS numérique ORCA-Fusion	Hamamatsu	C14440-20UP  ;
Boîte de Petri, 100/20 mm, PS, transparente, avec évents, stérile	Greiner Bio-One	664161	Utilisé pour cultiver des plantes sur un demi-substrat MS
Boîte de Petri, carrée, PS, transparente, 120/120/17 mm, stérile	Greiner Bio-One	688161	Utilisé lors de la coupe des semis
PluriStrainer Mini filtre	pluriSelect	43-10030-50	Taille de maillage 30 & micro ; m, adapté à un tube Eppendorf de 1,5 mL
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P9333
Filtre d’émission à bande unique	Semrock	FF01-698/70	Filtre d’émission spécifique pour le canal AF647
Filtre d’émission à bande unique	Chroma	ET600/50m	Filtre d’émission spécifique pour le canal JF549
Chlorure de sodium (99,5 %) & nbsp ;	Euromedex	1112-A
Lames Star-Frost 76 x 26 mm	Knittel	; VS112711FKB.01
Filtre à seringue stérile & oslash ; 33 mm porosité 0,2 & micro ; m Cône de l’écluse de Luer	ClearLine	146560
Système de super-résolution	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 équipé d’un objectif à immersion à l’huile 100x NA1.5
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Grade de Biologie Moléculaire de base Tris	Promega	H5135
Tris(2-carboxyéthyl)phosphine chlorhydrate (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Préadolescent 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001002	Scellant silicone
Système de nettoyage à l’ozone ultraviolet Four UVOCS	UVOCS Inc.	T10X10	20 minutes d’exposition pour le nettoyage de la couvre-couverne  ;
Pompe à vide	Vacuubrand	VP 100C
Centrifugeuse Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific		Rotor TX-400 75003629. Centrifugation réalisée avec des tubes d’Eppendorf.