Un protocole rationalisé pour la microscopie de localisation à molécule unique dans les noyaux d’Arabidopsis

Summary

Ce protocole propose un flux de travail efficace pour l’imagerie microscopique de localisation à molécule unique des noyaux isolés d’Arabidopsis, utilisant une isolation, une fixation et un marquage optimisés pour obtenir une visualisation fiable à l’échelle nanométrique de la chromatine et de la polymérase ARN II. Cette approche peut être facilement adaptée à d’autres protéines associées à la chromatine ou à des modifications histoniques pour l’imagerie haute résolution.

Abstract

Bien que la microscopie à fluorescence confocale ait fourni des informations précieuses sur l’organisation de la chromatine dans les noyaux des plantes, sa résolution limitée par la diffraction limite l’étude de l’architecture de la chromatine, ce qui motive l’utilisation de techniques de super-résolution telles que la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM). Parmi ces approches, la microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM) fournit une résolution à l’échelle nanométrique dans des cellules individuelles, permettant une visualisation précise des domaines de chromatine, des modifications des histones et de l’organisation nucléaire. Bien que ces méthodes soient de plus en plus appliquées dans les systèmes mammifères, leur utilisation en biologie végétale reste limitée, principalement en raison de défis techniques dans la préparation des échantillons.

Ici, nous présentons un flux de travail simplifié et reproductible pour l’imagerie SMLM des noyaux isolés d’Arabidopsis thaliana. Ce protocole commence par la fixation des semis pour préserver la morphologie nucléaire, suivie d’un découpage doux des tissus et d’une centrifugation pour enrichir les noyaux intacts. Les noyaux isolés sont ensuite marqués par fluorophore dans un milieu liquide et immobilisés sur des coussinets d’agarose à faible fondeur, une stratégie qui améliore la stabilité lors de longues séances d’imagerie à molécule unique. Ces étapes minimisent collectivement la fluorescence de fond, améliorent la cohérence du marquage et augmentent la reproductibilité entre réplicés biologiques.

Les préparations résultantes offrent une meilleure clarté pour visualiser les modifications de la chromatine et l’architecture nucléaire dans les centrales. En abaissant les barrières techniques à la mise en œuvre de l’imagerie SMLM dans Arabidopsis, ce protocole offre un moyen polyvalent d’étudier la régulation épigénétique, l’organisation de la chromatine et les variations topologiques nucléaires à l’échelle nanométrique. Ce travail établit une base méthodologique pour appliquer la SMLM aux plantes, comblant le fossé avec la biologie cellulaire des mammifères et ouvrant de nouvelles opportunités pour étudier comment l’architecture nucléaire contribue à la régulation du génome en réponse aux indices développementaux et environnementaux dans les systèmes végétaux.

Introduction

La microscopie est depuis longtemps une pierre angulaire pour l’étude de l’organisation de la chromatine et de l’architecture nucléaire, révélant comment l’ADN et les protéines associées aux histones s’organisent dans l’espace nucléaire 3D et influencent la régulation des^{gènes 1,2}. La microscopie à fluorescence conventionnelle a fourni des informations précieuses sur les domaines de chromatine à grande échelle tels que les territoires chromosomaliques, les chromocentres et les corps^{nucléaires 3,4}, réalisables in situ, en particulier dans les tissus racinaires des^{plantes 3,5,6}. Cependant, ces techniques sont fondamentalement limitées par la barrière de diffraction de la lumière, qui limite la résolution spatiale à environ 200 nm latéralement et 500 nm^{axialement 7}. Cette limitation masque les détails à l’échelle nanométrique du repliement de la chromatine, des schémas de modification des histones et de la compartimentation transcriptionnelle qui sous-tendent la régulation épigénétique. Pour surmonter ce blocau, des approches de microscopie à super-résolution (SRM) telles que la microscopie à illumination structurée (SIM⁾⁸, la déplétion d’émission stimulée (STED^)9,10 et la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM)^11,12 ont été développées pour atteindre des résolutions allant de 100 nm à quelques^{nm 13}.

Parmi les techniques de SRM, la SMLM — incluant la microscopie de localisation photoactivée (PALM⁾¹³ et la microscopie directe de reconstruction optique stochastique (dSTORM) — offre une résolution spatiale exceptionnelle combinée à une spécificité^{moléculaire 14}. En détectant les positions de fluorophores individuels au fil du temps, la SMLM reconstruit des images nanométriques à haute précision des domaines de chromatine, des marques d’histones et des structures nucléaires dans des cellules^{individuelles 15,16}. Cette capacité a transformé la recherche sur la chromatine dans les systèmes mammifères, où la SMLM a été appliquée pour visualiser le regroupement des nucléosomes, la compactation de la chromatine et les schémas de modification des histones avec un niveau de détail sans précédent 15,16,17. En revanche, l’application de la SMLM aux noyaux des plantes reste limitée, principalement en raison de défis techniques liés aux propriétés des tissus végétaux — telles que l’autofluorescence élevée, la rigidité de la paroi cellulaire et la présence de composés diffuseurs de lumière comme l’amidon et^{la chlorophylle 18}. De plus, la nature délicate des noyaux lors de l’isolement et du marquage nécessite des flux de travail optimisés pour maintenir l’intégrité structurelle et minimiser la fluorescence de fond lors de longues séances d’imagerie.

Le protocole décrit ici a été initialement développé par Elizabeth Kracik-Dyer et Célia Baroux pour la microscopie STED (STED^{) 19}. Il a ensuite été optimisé et adapté pour répondre aux exigences spécifiques de l’imagerie STORM grâce à l’intégration des connaissances issues des applications de microbiologie^publiées 20,21,22. L’objectif global est de fournir un flux de travail rationalisé et reproductible pour l’imagerie SMLM des noyaux isolés d’Arabidopsis thaliana. En intégrant une fixation optimisée, une perturbation mécanique douce et un marquage fluorophore en suspension, cette méthode préserve la morphologie nucléaire tout en éliminant efficacement les contaminants cytoplasmiques qui compromettent souvent la qualité de l’imagerie. L’immobilisation des noyaux marqués sur des tampons d’agarose à faible fusion assure une stabilité mécanique lors de l’acquisition, permettant une imagerie à long terme d’une seule molécule à l’échelle nanométrique. Comparé aux protocoles SRM précédemment décrits pour les noyaux de plantes — en particulier ceux basés sur la microscopie^{STED 19,23} — ce flux de travail utilise des fluorophores photocommutables (par exemple, AF647, JF549), réduit la fluorescence de fond grâce à des étapes de lavage qui éliminent la chlorophylle et les débris tissulaires, et améliore l’homogénéité du marquage en ajoutant directement les molécules de marquage aux noyaux fixes et perméabilisés. Par conséquent, il permet une visualisation cohérente des modifications de la chromatine, des compartiments nucléaires et des schémas épigénétiques dans des noyaux individuels. En abaissant les barrières techniques à la mise en œuvre de la SMLM dans les plantes, cette méthode élargit l’accessibilité de l’imagerie à l’échelle nanométrique et fournit une base pour étudier comment l’organisation de la chromatine et l’architecture nucléaire contribuent à la régulation des gènes en réponse aux signaux développementaux et environnementaux.

Protocol

REMARQUE : Les informations détaillées sur les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole sont disponibles dans le Tableau des matériaux. Sauf indication contraire, les tampons sont dégagés sur des filtres apyrogènes de 0,2 μm. L’H₂O ultra-pur (ddH₂O) double distillé est utilisé tout au long de ce protocole. Les étapes de centrifugation sont effectuées dans des microtubes de 1,5 mL utilisant un rotor à angle fixe.

1. Fixation des semis et libération des noyaux

1. Placez une plaque de culture à 6 puits sur de la glace sous la hotte, puis ajoutez à chaque puits environ 4 mL de solution de fixation glacée préparée de façon improvisée sous une hotte (formaldéhyde stabilisé au méthanol à 4 % (v/v), 0,1 % Triton X-100 dans 1× solution à phosphate tamponnée [PBS]).
2. À l’aide de pinces propres, retirez les semis (entre 8 et 15 jours après la germination) qui ont été cultivés sur des sels de MS de 2,2 g/L solides (0,8 % agar) à moitié intensité, 1 % de saccharose (p/v), pH 5,7, comme décrit pour les semis de SEP à la référence²⁴, puis immergez-les immédiatement dans la solution de fixation. Utilisez un puits pour environ 20 plants (3 puits étaient nécessaires pour obtenir suffisamment de matière par échantillon).
3. Placez la plaque dans la chambre à vide remplie de glace et appliquez un vide à des pressions oscillant entre 0,2 bar et 0,8 bar pendant 15 minutes pour éliminer l’air piégé et permettre une pénétration profonde du fixateur dans les^{tissus de la plante 25}. Relâchez lentement le vide, agitez l’échantillon, puis apliquez le vide pendant encore 15 minutes.
4. Sous la hotte, retirez la solution de fixation avec une pipette, puis lavez chaque puits 3 fois pendant 10 minutes sous une agitation douce, en utilisant 5 mL de PBS bien froid.
5. Retirez le PBS et utilisez des pinces pour transférer le tissu fixé dans une boîte de Petri de 120 mm × 120 mm. Ajouter aux semis fixés 50 μL de tampon d’isolation des noyaux (NIB), préparé tel que décrit par Kracik-Dyer et Baroux (45 mM MgCl₂, 20 mM MOPS, 30 mM citrate de sodium, 0,3 % de Triton X-100). Ajustez à pH 7 en utilisant 1 N HCl)¹⁹. Éclat avec une lame.
   REMARQUE : Les lames Microtome se sont révélées plus efficaces que les lames de rasoir conventionnelles pour cette tâche.
6. Grattez le tissu haché sur un bord de la boîte de Petri avec la même lame et ajoutez 600 μL de NIB, en veillant à bien enlever tout tissu collé à la lame également.
7. Transférez la bouillie de tissu dans le tube homogénéiseur Dounce de 2 mL et faites un coup de 5 à 10 fois avec le pilon plus petit, puis avec le pilon plus grand jusqu’à ce qu’il se déplace doucement à l’intérieur du tube (cela nécessite généralement 5 à 10 coups).
8. Filtrez l’échantillon homogénéisé obtenu à travers un filtre en maille de 30 μm dans un microtube de 1,5 mL.
9. Centrifugez la suspension pendant 10 minutes à 800 × g en utilisant la rampe la plus basse pour l’accélération et la décélération. Un petit granule blanc est visible parmi les débris de tissu vert.
10. Jetez le surnageant et resuspendez la pellete à 150 μL de nib.
11. Centrifugez à nouveau pendant 10 minutes à 800 × g et retirez le surnageant. S’il y a des débris verts visibles, lavez-le une seconde fois. Resuspendez dans 50 μL à 150 μL de PIN, en fonction de la taille du pellet.
12. Conservez la suspension de noyaux isolés résultante à 4 °C pendant un maximum d’une semaine avant d’effectuer la coloration. Cependant, il est recommandé de procéder immédiatement.

2. (immuno)coloration

REMARQUE : Dans les étapes suivantes, le protocole est appliqué à un volume de 50 μL de suspension de noyaux, correspondant typiquement à 20 semis. Sauf indication contraire, les étapes suivantes sont effectuées à température ambiante.

1. Centrifugez la solution pendant 10 minutes à 800 × g et jetez le surnageant. Faites attention à ne pas toucher la pastille.
2. Resuspendez les noyaux en pipotant doucement 50 μL de tampon de blocage (143 mM NaCl, 4 % de BSA dans PBS, stockés à 4 °C). Incubez pendant 30 minutes sous une agitation douce.
3. Centrifugez la solution pendant 10 minutes à 800 × g et jetez le surnageant sans toucher à la pelote de noyau.
4. Resuspendez les noyaux en pipotant doucement 50 μL de 1× PBS. Centrifugeuse à nouveau pendant 10 minutes à 800 × g. Écartez le surnageant comme ci-dessus.
5. Resuspendez les noyaux dans 50 μL de solution primaire d’anticorps préparée dans un tampon immunocolorant composé de 143 mM de NaCl, 1 % de BSA, 0,05 % de Tween 20 en PBS (les dilutions d’anticorps et de travail sont détaillées dans le Tableau des matériaux). Incubez les échantillons pendant 60 minutes sous une agitation douce.
6. Procédez à 2 lavages (répétez les étapes 2.3 et 2.4).
7. Resuspendez les noyaux dans 50 μL d’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre AF647 à 1/200^{dilution 26}. Enveloppez les tubes dans du papier aluminium pour protéger le fluorophore de la lumière. Incubez les tubes pendant 60 minutes sous une légère agitation.
8. Procédez à 2 lavages (répétez les étapes 2.3 et 2.4).
9. Resuspendez la pellete à 50 μL de nib. Stockez la suspension dans des microtubes de 1,5 mL enveloppés dans du papier aluminium. Le marquage est stable pendant plusieurs semaines à 4 °C.

3. Montage

1. Pour l’imagerie STORM, préparez une solution d’agarose à faible fusion (LMA 1,5 % en v/v) en dissolvant la poudre dans un tampon B à 1,25× composé de 50 mM de pH 8 Tris, 10 mM de NaCl, 10 % de glucose. Préparez 1,25× solution de bouillon, et conservez à 4 °C.
2. Chauffez à 90 °C pendant 1 minute pour dissoudre la poudre et obtenir une solution claire. Refroidissez et maintenez la solution LMA fondue à 37 °C avant de passer à l’étape suivante pour éviter la dénaturation thermique du tampon glucose oxydase (GLOX) (préparez 10x solution stock stockée à -20°C composée de 100 mM de pH Tris 7,5, 25 mM KCl, 1 mM de pH TCEP 7,0, 5 mg/mL de glucose oxydase, 0,4 mg/mL de Catalase, 50 % contre Glycérol).
3. Après que la solution LMA atteint 37 °C, préparez le tampon STORM en ajoutant 100 mM de Mercaptoéthylamine (MEA) et de GLOX à la solution LMA chaude pour atteindre 1× concentration finale. Conservez la solution MEA 1 M stock jusqu’à 1 mois à 4 °C, mais l’utilisation d’une solution fraîchement préparée est recommandée. Mélangez doucement.
   REMARQUE : Pour un marquage ADN optionnel, ajoutez 1,5 nM (concentration finale, 1 mM de solution standard en DMSO) du Hoechst conjugué JF549. Gardez la suspension à 37 °C jusqu’à utilisation.
4. Mélangez doucement la suspension des noyaux avec des nanodiamants à une dilution de 1/1500. Écouvez-les avec l’échantillon pendant 5 minutes.
   REMARQUE : Les nanodiamants servent de marqueurs fiduciaux pour corriger la dérive de l’échantillon.
5. Déposez 10 μL du mélange sur une couche de couverture de 1,5 H traitée à l’ozone (20 min dans un système de nettoyage à l’ozone ultraviolet) et attendez 3 minutes pour laisser les noyaux se déposer sur la couche de recouvert.
6. Enlève l’excès de liquide, attends 2 minutes. Ajoutez 10 μL de la LMA préparée à l’étape 3.3 à la gaine de couverture et couvrez immédiatement avec une lame de microscope.
7. Scellez la housse avec un scellant silicone. Mélangez des quantités égales de solution A et B dans une petite boîte de Petri à l’aide d’une pointe de micropipette. Appliquez le mélange sur les bords de la gaine pour sceller l’échantillon. Le silicone durcit en 5 minutes.
8. Une fois monté, effectuer l’imagerie des lames sans délai, en fin de compte dans les 4 à 5 heures suivantes, afin d’éviter la perte des propriétés d’absorption d’oxygène du plateau de montage.

4. Imagerie

REMARQUE : Les paramètres d’imagerie doivent être soigneusement optimisés selon la nature de l’échantillon, les propriétés photophysiques des fluorophores et la configuration optique du microscope. Il est crucial d’assurer un rapport signal sur bruit élevé pour chaque fluorophore tout en minimisant le passage spectral et l’excitation croisée entre canaux fluorescents. Les échantillons ont été observés avec un microscope à fluorescence inversée équipé d’un objectif d’immersion à huile à haute concentration de 100x, d’une unité de maintien de la mise au point et d’une LED blanche pour l’imagerie en champ clair. Les marquants fluorescents AlexaFluor647 (AF647) étaient excités à 640 nm et JF549-Hoechst à 561 nm. La lumière émise était filtrée avec un miroir dichroïque compatible et un ou plusieurs filtres passe-bande, puis enfin des images ont été collectées avec une caméra scientifique complémentaire à semi-conducteur d’oxyde métallique (sCMOS).

1. Montez la lame d’échantillon et trouvez la mise au point. Activez un module de maintien de focus si le système en possède un (fortement recommandé pour les acquisitions longues).
2. Trouvez et concentrez-vous sur un noyau. Il est préférable d’avoir un ou quelques nanodiamants près du noyau d’intérêt pour corriger plus efficacement la dérive lors de la reconstruction.
3. (Optionnel) Capturez des instantanés limités par la diffraction du champ lumineux et de chaque canal fluorescent à faible puissance laser.
4. Lors de l’imagerie bicolore, commencez par l’acquisition du canal de longueur d’onde plus longue puis passez au canal de longueur d’onde plus courte (c’est-à-dire acquérir le canal AF647 avant JF549).
   REMARQUE : Exemple de paramètres d’acquisition utilisés dans ce travail :
   Canal A - étiquetage de l’épitope - AF647
   Temps d’exposition : 20 ms
   Intensité laser : 640 nm – 2,2 kW/^{cm 2}
   Mode excitation : HiLo²⁷
   Canal B - Marquement ADN - JF549-Hoechst
   Temps d’exposition : 50 ms
   Intensité laser : 561 nm - 1 kW/^{cm 2}
   Mode excitation : Epi
   Nombre d’images enregistrées : 10 000 à 30 000 par canal, garantissant que la densité de fluorophores par image reste suffisamment faible pour une localisation précise d’une seule molécule, tandis que le nombre cumulatif de localisations a été déterminé empiriquement à l’aide du Super-resolution QUANTATIVE IMAGE Rating and Reporting of Error Locations (SQUIRREL)²⁸, qui indique également le nombre suffisant d’images.

Results

Le protocole décrit ci-dessus permet la préparation de noyaux d’Arabidopsis thaliana de haute qualité adaptés au SMLM. Plusieurs séries d’optimisation ont été réalisées pour améliorer l’intégrité nucléaire et réduire les débris cytoplasmiques et cellulaires compromettant la qualité de l’image. Après chaque étape d’optimisation, la qualité des préparations nucléaires était évaluée par imagerie confocale à l’aide d’un microscope à disque rotatif Olympus IX81 avant de procéder à l’acquisition en super-résolution.

Discussion

La préparation des noyaux d’Arabidopsis thaliana pour la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM) nécessite plusieurs étapes critiques qui influencent fortement la qualité finale de l’échantillon. Comme décrit précédemment^19,35, un découpage tissulaire approfondi et régulier est essentiel pour maximiser la récupération des noyaux intacts. L’utilisation de lames de microtomes au lieu de lames de rasoir standar...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody	Abcam	ab5095	Anticorps primaire utilisé à une dilution de 1/200 dans un tampon d'immunomarquage pour visualiser la forme active de la polymérase (anticorps polyclonaux élevés chez le lapin )
Logiciel d'acquisition	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Albumine sérique bovine	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Agarose certifié à basse température de fusion	Bio-Rad	1613111
Lames de couverture d'épaisseur 1.5H rondes	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glucose, anhydre, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Miroir dichroïque	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Miroir dichroïque pour la séparation excitation/émission
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´	biowest	X0515 - 500	Travailler dans des conditions stériles
Lames de microtome jetables Epredia Ultra	FisherScientific	12191830	Profil bas, usage unique
Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	Falcon	353046
Solution de formaldéhyde 37%	Carl Roth	7398	Travail sous hotte
Oxydase au glucose	Sigma-Aldrich	G2133
Glycérol	VWR	24388.295
Anticorps secondaire anti-lapin IgG (H+L) hautement adsorbé en croix, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Utilisé à 1/200 comme anticorps secondaire couplé à AF647
Solution de Hoechst 33258	Sigma-Aldrich	94403	Utilisé à 1/500 pour contre-colorer l'ADN, ajouté au tampon agarose
Solution d'acide chlorhydrique	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)	JF549-Hoechst	Utilisé pour contre-colorer l'ADN, ajouté au tampon agarose à une concentration finale de 1,5 nM
Ensemble de broyeur de tissus Dounce KIMBLE	Sigma-Aldrich	D8938	Tube de 2 mL avec des pilons de dégagement grands (0,0030-0,0050 pouces) et petits (0,0005-0,0025 pouces)
Unité de lasers	Oxxius	L6Cc	Équipé de six lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW et 730 nm - 30 mW
Chlorure de magnésium hexahydraté	Carl Roth	HN03
Mercaptoéthylamine (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
Sel de sodium du MOPS 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Filtre d'émission multibande	Semrock	FF01-446/523/600/677	Filtrage d'émission multibande pour bloquer la lumière de diffusion laser
Nanodiamants	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Stock 1 mg/mL
Caméra CMOS numérique ORCA-Fusion	Hamamatsu	C14440-20UP
Plat de Petri, 100/20 mm, PS, transparent, avec évents, stérile	Greiner Bio-One	664161	Utilisé pour cultiver les plantes sur milieu 1/2 MS
Plat de Petri, carré, PS, transparent, 120/120/17 mm, stérile	Greiner Bio-One	688161	Utilisé lors de la découpe des semis de plantes
pluriStrainer Mini filtre à cellules	pluriSelect	43-10030-50	Taille de maille 30 µm, adapté pour tube Eppendorf de 1,5 mL
Chlorure de potassium	Sigma-Aldrich	P9333
Filtre d'émission à bande unique	Semrock	FF01-698/70	Filtre d'émission spécifique pour le canal AF647
Filtre d'émission à bande unique	Chroma	ET600/50m	Filtre d'émission spécifique pour le canal JF549
Chlorure de sodium (99,5%)	Euromedex	1112-A
Lames Star-Frost 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Filtre de seringue stérileø 33 mm porosité 0,2 µm Luer Lock cône	ClearLine	146560
Système de super-résolution	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 équipé d'une objectif 100x NA1.5 à immersion dans l'huile
Citrate de trisodium 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Grade Biologie Moléculaire	Promega	H5135
Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001002	Scellant en silicone
Système de nettoyage par ozone ultraviolet UVOCS four	UVOCS Inc.	T10X10	Exposition de 20 min pour le nettoyage des lamelles
Pompe à vide	Vacuubrand	VP 100C
Centrifugeuse Heraeus Megafuge 16R	Thermo Scientific		Rotor TX-400 75003629. Centrifugation réalisée avec des tubes Eppendorf.