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Article de méthode

Isolation de petites vésicules extracellulaires du muscle squelettique murin et de la moelle osseuse par chromatographie à exclusion de taille

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DOI :

10.3791/70894

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23 juin 2026

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1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit l’isolement de petites vésicules extracellulaires à partir du muscle squelettique murin et de la moelle osseuse à l’aide de digestion enzymatique et de chromatographie à exclusion de taille, permettant la récupération reproductible de fractions enrichies en vésicule à partir de tissus structurellement complexes et à faible rendement pour une analyse moléculaire en aval.

Résumé

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont des particules nanométriques liées aux lipides qui médiatisent la communication intercellulaire par le transfert de protéines, de lipides et d’acides ribonucléïques (ARN). L’isolement des sEV des tissus solides tels que le muscle squelettique (SkM) et la moelle osseuse (BM) reste difficile en raison du faible rendement et de la contamination par des composants non vésiculaires. Ce protocole décrit un flux de travail reproductible pour isoler les sEVs à partir du SkM et du BM de la souris. Le SkM est digéré enzymatiquement, tandis que le BM est traité directement puis soumis à une centrifugation différentielle et à une chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Pour SkM, le volume vide (~2,5 mL) est rejeté, et les ~1,6 mL suivants sont collectés sous forme de fractions enrichies en EV, généralement subdivisées en fractions séquentielles de 400 μL (F1–F4). Pour BM, un volume vide de 700 μL est écarté, suivi de la collecte d’une fraction enrichie EV de ~850 μL, qui peut être subdivisée en fractions séquentielles de ~170 μL (F1–F5) et regroupée selon l’enrichissement des marqueurs EV. Grâce à cette approche, les sEVs peuvent être isolées à partir de petits volumes tissulaires (environ 500 μL d’un seul quadriceps et 150 μL d’une selle commune du fémur et du tibia), produisant ~108 particules·mL−1·mg−1 de tissu avec un diamètre de particules principalement de <200 nm. L’intégrité et la pureté des vésicules sont validées par microscopie électronique en transmission, analyse de suivi des nanoparticules et Western blotting pour les marqueurs EV canoniques, avec une caractérisation supplémentaire par détection interférométrique à particule unique afin de quantifier les sous-populations de vésicules définies par la tétraspanine. Cette méthode permet l’isolement reproductible des sEVs de haute pureté à partir de tissus structurellement complexes en utilisant un minimum de matière d’entrée, soutenant des analyses moléculaires et fonctionnelles en aval de vésicules issues des tissus.

Introduction

Les petites vésicules extracellulaires (sEV) sont des particules nanométriques liées aux lipides qui médiatent la communication intercellulaire par le transfert de protéines, lipides et acidesnucléiques 1. Ils sont libérés par tous les types cellulaires et sont présents dans pratiquement tous les fluides biologiques, où ils agissent comme des vecteurs clés de la cargaison bioactive, y compris les peptides et les microacides ribonucléiques (ARN)2. Leur cargaison est triée sélectivement, permettant une livraison précise de signauxspécifiques 3, et leur structure vésiculaire leur permet de contourner les contraintes typiques de gradient et de dilution des facteurs librement sécrétés en livrant des charges utiles moléculaires concentrées sur de longuesdistances 4. Bien que les EV issus de biofluides (par exemple, plasma, sérum et salive) fournissent un instantané pratique de la signalisation systémique, ils représentent une population très mixte provenant de nombreuxtissus 5. Cela rend difficile de déterminer quel organe produit un signal biologique spécifique ou comment la communication des EV est régulée au niveau tissulaire. Comme les EV circulants sont regroupés, les modifications spécifiques au tissu peuvent être diluées ou masquées, limitant la capacité à identifier la véritable source dessignaux 6.

Le muscle squelettique (SkM) et la moelle osseuse (BM) sont des tissus actifs métaboliquement et fonctionnellement majeurs avec des compositions cellulaires et des rôles de signalisationdistincts 7,8. Les deux tissus peuvent libérer des populations de VE enrichies avec une cargaison unique spécifique aux tissus ; cependant, ces signaux peuvent facilement être éclipsés dans le plasma par les EV provenant de tissus à forte rotation comme les cellulesimmunitaires 8,9. Isoler directement les EV du muscle ou des sémes augmente la sensibilité et permet de détecter des adaptations subtiles spécifiques aux tissus qui peuvent ne pas être observables en circulation. Les EV d’origine tissulaire fournissent donc des informations complémentaires essentielles, révélant quand un organe spécifique libère des EV, combien de temps ces signaux persistent, et quelles adaptations sont aiguës ou chroniques. Malgré un intérêt croissant pour les VE, la plupart des méthodes d’isolation établies ont été développées pour les biofluides (par exemple, plasma et sérum) ou les systèmes de culture cellulaire. Dans ces contextes, les VE peuvent être obtenus avec un rendement relativement élevé et une perturbation structurelle minimale. Cependant, isoler directement les VE des tissus solides tels que SkM et BM présente des défis techniques notables. Ces tissus sont structurellement complexes et hétérogènes, nécessitant des étapes de dissociation mécanique ou enzymatique pouvant introduire des artefacts, notamment des niveaux élevés de protéines solubles, des fragments d’organites et des nanoparticules non vésiculaires, rendant difficile l’obtention de préparations EV de haute pureté.

Un autre défi majeur dans l’isolement des EV dérivés des tissus est l’absence de flux de travail standardisés pour la définition et la séparation desfractions 10. La centrifugation différentielle seule entraîne souvent la co-isolation des agrégats protéiques et de grandes vésicules, tandis que les méthodes basées sur l’ultracentrifugation, bien que largement utilisées, peuvent entraîner une agrégation, une déformation et une récupération variable des vésicules selon le type de rotor et les conditions expérimentales. Les approches du gradient de densité améliorent la pureté mais sont chronophages, de faible débit et difficiles à standardiser dans leslaboratoires 11. Par conséquent, il n’existe actuellement aucune méthode largement adoptée et reproductible, optimisée pour isoler de petits EV à partir de tissus solides à haute pureté et à rendement constant10.

La chromatographie par exclusion de taille (SEC) s’est imposée comme une alternative prometteuse à l’isolation des EV car elle sépare les particules en fonction de leur taille sans soumettre les vésicules à de fortes forces centrifuges. La SEC permet une séparation efficace des petits EV des protéines solubles et des contaminants à faible poids moléculaire tout en préservant l’intégrité des vésicules et sa fonction biologique. Il est important de noter que la SEC permet une définition claire des fractions d’élution, permettant une identification reproductible des fractions enrichies en EV et une meilleure cohérence à travers les expériences12. Cependant, les flux de travail SEC nécessitent une optimisation minutieuse pour les échantillons dérivés des tissus, notamment en ce qui concerne le traitement des tissus en amont, l’élimination des débris et la collecte des fractions. Pour remédier à ces limitations, nous avons développé un protocole reproductible et standardisé pour isoler les sEVs de SkM et BM. Cette méthode intègre une digestion enzymatique contrôlée pour les tissus fibreux, une centrifugation différentielle pour l’élimination des débris, et une purification à base de SEC pour isoler des vésicules de haute pureté. Le flux de travail est spécifiquement optimisé pour minimiser la contamination par les composants intracellulaires tout en préservant l’intégrité des vésicules et en permettant une récupération constante des tissus à faible rendement.

Ce protocole comble un manque méthodologique critique en fournissant une approche pratique et évolutive pour isoler les sEVs dérivés des tissus avec une fractionnement définie et une pureté validée, réalisée par analyse de suivi par nanoparticules (NTA), Western blotting des marqueurs EV canoniques, microscopie électronique pour l’évaluation morphologique, et analyse EV à particule unique utilisant la capture d’anticorps, le dimensionnement interférométrique et l’imagerie multicanal par fluorescence. Il est particulièrement adapté aux études nécessitant une analyse des EV spécifiques aux tissus, où les vésicules dérivées du biofluide sont insuffisantes pour résoudre l’origine cellulaire des signaux. Les chercheurs devraient utiliser cette méthode lorsque l’objectif est d’obtenir des sEVs de haute pureté à partir de tissus solides avec une contamination minimale et une intégrité vésiculaire préservée. En revanche, les méthodes basées sur l’ultracentrifugation peuvent être préférées pour les applications à haut rendement où la pureté est moins critique, et des approches du gradient de densité peuvent être sélectionnées lors de l’isolement de sous-populations spécifiques de VE malgré un rendement plus faible. Ensemble, ce protocole fournit un cadre standardisé pour l’isolement et la caractérisation des sEVs d’origine tissulaire, permettant des analyses moléculaires, biochimiques et fonctionnelles reproductibles en aval.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité des soins aux animaux de l’Université McGill (DOUG10029) et menées conformément aux directives du Conseil canadien des soins aux animaux.

1. Protocole d’isolation sEV (SkM-sEV) dérivé du SkM

  1. Collecte d’échantillons et dissociation tissulaire
    1. Prélèvement et préservation des tissus
      1. Congelez instantanément le tissu SkM immédiatement après l’excision en le plongeant dans du méthylbutane prérefroidi.
        REMARQUE : Pour préparer du méthylbutane pré-refroidi, placez un récipient de méthylbutane dans un bain de glace sèche et ajoutez progressivement de petits morceaux de glace sèche directement dans le liquide. Laissez la solution refroidir, la température se situe généralement entre −70°C et −80°C. Maintenez le méthylbutane dans le bain de glace sèche pendant l’utilisation pour préserver la température. Immergez le tissu pendant environ 3 à 4 secondes jusqu’à ce qu’il soit complètement congelé, comme indiqué par un durcissement complet et une perte de flexibilité.
      2. Transférez le tissu vers des cryoviaux.
      3. Placez les échantillons sur de la glace sèche.
        REMARQUE : Conserver les échantillons à −80°C jusqu’à un traitement supplémentaire. Évitez les cycles répétés de gel-dégel. La congélation rapide préserve efficacement les VE lorsque les échantillons sont correctement scellés. Une déshydratation ou des dommages vésiculaires peuvent survenir si les tissus restent exposés ou subissent plusieurs cycles de gel-dégel13.
    2. Dissociation tissulaire
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un cabinet de biosécurité à l’aide d’instruments stériles et de gants pour éviter toute contamination, qui pourrait autrement compromettre la pureté des véhicules électriques.
      1. Peser les tissus
        1. Stérilisez les pinces à épiler à 70 % d’éthanol et laissez-les sécher à l’air.
        2. Transférez le tissu congelé sur une plaque de culture en suspension pré-pesée.
        3. Peser le tissu à l’aide d’un milligramme d’équilibre (généralement ~80–120 mg par échantillon, selon l’âge et le sexe de la souris).
          REMARQUE : Le protocole est validé pour les masses tissulaires d’entrée de ~80–120 mg. Pour les échantillons dans cette plage, utilisez les volumes de réactifs spécifiés aux étapes 1.2.3.1, 1.3.1.3 et 1.3.2.1 sans modification. Pour les échantillons hors de cette plage, on évalue tous les volumes de réactifs proportionnellement à la masse tissulaire tout en maintenant le rapport validé de RPMI-1640, collagénase D et DNase I (1000:40:4 μL par tissu de 100 mg). Cela correspond à environ 10 μL de RPMI-1640, 0,4 μL de collagénase D (stock de 100 mg/mL) et 0,04 μL de DNase I (stock de 20 000 U/mL) par mg de tissu. Maintenez ces proportions pour préserver les concentrations finales d’enzymes en réaction. L’efficacité de digestion et le rendement des EV doivent être validés empiriquement lorsqu’on travaille nettement en dehors de la plage de 80 à 120 mg.
        4. Retournez l’échantillon dans un tube pré-refroidi et conservez-le sur la glace.
      2. Préparer les enzymes
        1. Décongeler des aliquotes de collagénase D (stock de 100 mg/mL) et de DNase I (stock de 20 000 U/mL) sur glace (voir Fichier Supplémentaire 1, Étape 1.4 pour la préparation du stock enzymatique). Ces enzymes sont ajoutées à l’étape 1.3.2.1 pour atteindre des concentrations finales en réaction de 3,8 mg/mL de collagénase D et 77 U/mL de DNase I. Le volume de digestion final est de 1,044 mL.
        2. Mélangez la DNase I doucement par inversion. Ne faites pas de vortex.
      3. Préparation des tissus pour la digestion
        1. Ajouter 800 μL de RPMI-1640 dans une plaque de culture de suspension stérile posée sur la glace.
        2. Transférez le tissu dans la plaque.
        3. Découpez le tissu en 6 à 8 morceaux de taille à peu près uniforme (2 à 3 mm de chaque côté) à l’aide d’un scalpel jetable stérile. Stabilisez le tissu avec des pinces stériles pendant la découpe pour assurer une fragmentation uniforme. Terminez cette étape en 1 minute par échantillon pour maintenir la cohérence entre les échantillons.
        4. Gardez la plaque sur la glace pendant toute la procédure pour minimiser la dégradation.
    3. Transfert tissulaire et digestion enzymatique
      1. Transfert de tissu
        1. Taillez l’extrémité d’une pointe de pipette stérile P1000 à l’aide d’une lame stérile pour produire une ouverture de 2 à 3 mm de diamètre, suffisante pour permettre le libre passage des fragments de tissu générés à l’étape 1.2.3.3.
          REMARQUE : Sinon, utilisez des embouts de pipette à large calibre (large orifice) de 1 mL disponibles dans le commerce, qui offrent une ouverture standardisée (typiquement ~2–3 mm de diamètre interne) et éliminent la variabilité liée au trim manuel.
        2. Transférez les fragments de tissu et le milieu RPMI-1640 dans des tubes pré-marqués de 1,5 mL à l’aide d’une pipette P1000 équipée de la pointe modifiée. Effectuer 2 à 3 aspirations successives pour récupérer les fragments résiduels et le milieu. Inspectez visuellement la plaque et la pointe de la pipette après le transfert et utilisez des pinces stériles pour transférer les fragments restants afin de s’assurer qu’aucun tissu visible ne reste ici.
        3. Ajoutez 200 μL de RPMI-1640 à chaque tube.
      2. Digestion enzymatique
        1. Ajoutez 40 μL de collagénase D stock (100 mg/mL) et 4 μL de DNase I stock (20 000 U/mL) à chaque tube à partir d’aliquotes décongelées sur glace. Cela donne des concentrations finales en réaction de 3,8 mg/mL de collagénase D et 77 U/mL de DNase I. Pour les échantillons en dehors de la plage tissulaire de 80 à 120 mg, ajustez proportionnellement les volumes enzymatiques comme décrit dans la NOTE suivante à l’étape 1.2.1.3.
          REMARQUE : Ces volumes sont calibrés pour les masses tissulaires dans la plage typique de 80 à 120 mg. Pour les masses tissulaires hors de cette plage, ajustez proportionnellement tous les volumes de réactifs comme décrit dans la NOTE suivante à l’étape 1.2.1.3 (0,4 μL de collagénnase D et 0,04 μL de DNase I par mg de tissu), ce qui préserve les mêmes concentrations finales d’enzymes en réaction, quelle que soit la masse tissulaire.
        2. Ajoutez les enzymes à tous les échantillons simultanément lors du traitement de plusieurs échantillons.
        3. Gardez les tubes sur la glace pendant l’ajout d’enzymes.
        4. Inversez doucement les tubes pour mélanger. Ne faites pas de vortex.
        5. Incubez les tubes à 37°C pendant 30 minutes sur un mélangeur nutant (24 tr/min, angle d’inclinaison de 20° ; voir Tableau des matériaux). Assurez-vous de mélanger de façon uniforme pendant l’incubation.
          REMARQUE : Digérer chaque échantillon dans un volume total de 1,044 mL (1000 μL RPMI-1640, 40 μL de collagénase D et 4 μL de DNase I par échantillon ; équivalent à ~25:1 ratio tampon/collagénase).
    4. Enlèvement des débris
      REMARQUE : Lancer l’équilibre de la colonne SEC au début de la première centrifugation (Étape 1.4.1.1). La colonne SEC nécessite 20 à 25 minutes pour le rinçage et l’équilibre. Commencer l’équilibre à ce point garantit que la colonne est prête à être chargée immédiatement après l’achèvement de l’étape de filtration (étape 1.4.3).
      1. Première centrifugation
        1. Centrifugez les échantillons à 300 × g pendant 10 minutes à 4°C pour pelleter les débris non digérés, les cellules intactes et les fragments de tissu restants.
        2. Transférez soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes microcentrifuge stériles de 1,5 mL sans déranger la pellete.
      2. Deuxième centrifugation
        1. Centrifugez les échantillons à 2 000 × g pendant 15 minutes à 4°C pour pelleter de gros débris, des cellules mortes, des corps apoptotiques et de grosses vésicules.
        2. Transférez soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes microcentrifuge stériles de 1,5 mL sans déranger la pellete.
          REMARQUE : La seconde centrifugation est optionnelle et doit être incluse lorsque des débris supplémentaires sont nécessaires. Effectuez cette étape si le surnageant apparaît visiblement trouble ou contient des particules résiduelles après la première centrifugation. Cette étape est également recommandée si des préparations antérieures ont montré une contamination par des marqueurs intracellulaires (par exemple, Calnexin ou BiP) dans des fractions de SEC enrichies en EV ou la présence de particules non vésiculaires par microscopie électronique de transmission. La nécessité de cette étape doit être validée lors de l’optimisation initiale du protocole pour chaque type de tissu.
      3. Filtration
        1. Pré-humidifiez les filtres cellulaires stériles de 30 μm en les rinçant avec du RPMI-1640 pour équilibrer la membrane et minimiser la perte d’échantillons. Jetez le rinçage.
        2. Filtrez chaque échantillon à travers la tamoire cellulaire préhumidifiée de 30 μm dans des tubes microcentrifuges stériles de 1,5 mL à faible liaison aux protéines afin d’éliminer les débris cellulaires restants et les grosses particules avant la SEC.
        3. Laissez les échantillons passer à travers le filtre par gravité.
        4. Prévoyez 10 à 15 minutes par échantillon pour la filtration.
          REMARQUE : La filtration est complète lorsqu’aucun liquide visible ne reste au-dessus de la membrane filtrante et que le volume filtré dans le tube de collecte s’est stabilisé. Si la filtration est plus lente ou s’arrête, cela peut indiquer un bouchon dû à des débris résiduels ; Dans de tels cas, il faut envisager de répéter l’étape de clarification ou de réduire la charge de l’échantillon.
        5. Collectez 550 à 600 μL de surnageant filtré pour charger ultérieurement sur la colonne SEC. Pour la cohérence entre les échantillons, normaliser le volume de charge à 500 μL par colonne (voir l’étape 2.2.1), quel que soit le volume total récupéré.
  2. Chromatographie par exclusion de taille (SEC)
    1. Colonne SEC équilibrée
      REMARQUE : Effectuez cette étape pendant la centrifugation si possible.
      1. Rincer la colonne SEC avec 17 mL de 1× PBS (filtré 0,22 μm).
      2. Laissez passer l’ensemble du volume à travers la colonne par gravité à un débit attendu de 0,75 mL/min (20–25 min au total pour le volume de rinçage de 17 mL). Des débits plus rapides ou plus lents peuvent indiquer un mauvais équilibrage de la colonne ou un blocage.
      3. Maintenir la colonne et le PBS à température ambiante (RT, 21°C ± 2°C) pendant l’équilibre afin d’assurer un débit constant et une performance optimale de la colonne.
      4. Préparez des tubes microcentrifuges de 1,5 mL à faible liaison aux protéines pour la collecte de toutes les fractions.
      5. Préparez un tube supplémentaire pour la collecte du volume vide si nécessaire.
    2. Chargement des échantillons et élution
      1. Chargez 500 μL de surnageant filtré sur la colonne SEC.
      2. Laissez l’échantillon pénétrer complètement dans la résine. L’extrémité est atteinte lorsque le ménisque liquide atteint la surface du lit de résine, sans qu’aucun liquide visible ne reste au-dessus de la résine tandis que la résine reste visiblement humide.
      3. Ne laissez pas le ménisque descendre sous la surface de la résine ni la colonne s’assécher, car cela introduit de l’air dans le lit de résine et perturbe l’élution. Lorsque le ménisque liquide atteint la surface de la résine (comme défini à l’étape 2.2.2), on passe immédiatement à l’étape 2.2.4 sans délai.
      4. Ajoutez immédiatement 2 mL de PBS pour initier l’élution.
      5. Collectez le volume vide (~2,5 mL).
      6. Éliminez le volume vide ou conservez-le comme une fraction non EV.
      7. Commencez à collecter la fraction enrichie par EV immédiatement après que le volume de vide de 2,5 mL soit élu.
      8. Collectez un total de 1,6 mL d’éluat enrichi en EV après le volume vide, soit en fraction continue unique dans un tube, soit en fractions séquentielles qui sont ensuite regroupées.
      9. Sinon, collectez des fractions séquentielles de 0,4 mL pour optimiser la pureté par rapport au rendement. Des volumes de fractions plus petits sont recommandés lorsque la pureté est plus élevée (par exemple, pour des analyses protéomiques ou des applications sensibles en aval), tandis que des fractions plus importantes peuvent être utilisées pour maximiser le rendement global des EV.
      10. Évaluer les fractions pour l’enrichissement des EV à l’aide de méthodes de caractérisation (par exemple, Western blot pour les marqueurs et contaminants EV, et NTA), ainsi que les fractions enrichies en EV telles que définies dans la section caractérisation.
        REMARQUE : Faites en sorte que la chronique continue de s’écouler. À mesure qu’une fraction est en train de finir, ajoutez du PBS pour maintenir un liquide constant au-dessus du lit de résine et éviter que la colonne ne s’assèche. Utilisez des tubes à faible liaison protéique et sans nucléase pour la collecte.
    3. Concentration
      1. Concentrer les échantillons de VE à l’aide de filtres centrifuges (coupure de 100 kDa de masse moléculaire [MWCO]) pour des applications en aval (par exemple, séquençage d’ARN, protéomique ou Western blot).
      2. Rincez les filtres au préalable avec du PBS avant utilisation.
      3. Centrifugez les échantillons à 4 000 × g à 4°C, en vérifiant toutes les 2 à 3 minutes jusqu’à atteindre le volume final souhaité (généralement 50–100 μL). Utilisez des volumes finaux plus faibles (par exemple, ~50 μL) pour les applications nécessitant des concentrations et des volumes plus élevés (par exemple, ~100 μL) lorsque la récupération maximale est privilégiée.
        ATTENTION : Évitez la surconcentration en arrêtant la centrifugation une fois le volume cible atteint.
      4. Récupérez la rétention en pipettant doucement.
      5. Enregistrer les volumes d’échantillons avant et après concentration pour estimer la récupération, si nécessaire. L’NTA peut être utilisé pour évaluer la concentration des particules avant et après la concentration, si disponible.
    4. Stockage
      1. Conservez les fractions enrichies en EV sur glace ou à 4°C pour les tests immédiats (par exemple, NTA et microscopie électronique en transmission [TEM]) et traitez dans les 24 heures pour les TEM et dans les 48 heures pour les NTA.
      2. Des échantillons de véhicules électriques aliquotes dans des tubes à faible liaison aux protéines pour le stockage.
      3. Conservez les échantillons à −80°C pour une utilisation à long terme.
      4. Évitez les cycles répétés de gel-dégel.

2. Protocole d’isolation sEV dérivé de BM (BM-sEV)

  1. Collecte d’échantillons et dissociation tissulaire
    1. Prélèvement et préservation des tissus
      1. Ne congelez pas les os immédiatement après l’excision, car cela durcit la moelle et complique l’extraction par la méthode du tube piqué. À la place, gardez les os sur la glace ou à 4°C lors de courtes périodes de manipulation avant le traitement ou la congélation, comme décrit à l’étape 3.1.1.4 (posage sur glace sèche avant un stockage à −80°C).
      2. Retirez les muscles et tissus conjonctifs environnants des os disséqués.
      3. Transférez les os sur des cryoviaux.
      4. Placez les échantillons sur de la glace sèche.
        REMARQUE : Conserver les échantillons à −80°C jusqu’à un traitement supplémentaire.
    2. Traitement BM
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans un cabinet de biosécurité à l’aide d’instruments stériles et de gants pour éviter toute contamination, qui pourrait autrement compromettre la pureté des véhicules électriques.
      1. Pré-pesez et étiquetez les tubes centrifugeuses de 1,5 mL avant d’ajouter un quelconque matériau. Calculez la masse de la smotion en comparant les poids des tubes avant et après l’extraction.
      2. Préparez le système à tube piqué en insérant un tube PCR de 0,2 mL (bouchon intact) dans un tube centrifugeuse de 1,5 mL avec un ajustement serré. Percer le fond du tube de 0,2 mL une fois avec une aiguille stérile de 16 G tenue perpendiculairement à la base, produisant une perforation uniforme unique de ~1,6 mm de diamètre. Préparez un montage par jambe et par souris.
      3. Placez la jambe, nettoyée de tous les muscles et tissus environnants, dans une boîte de Petri stérile.
      4. Séparez le fémur et le tibia en coupant l’espace articulaire.
      5. Coupez les deux extrémités du fémur et du tibia pour exposer la moelle rouge. Placez les os dans le tube PCR perforé positionné à l’intérieur du tube de 1,5 mL et scellez l’ensemble avec un parafilm pour assurer un installation sécurisée lors de la centrifugation.
      6. Centrifugez les échantillons pendant 10 s dans une microcentrifugeuse de laboratoire à environ 8 000 × g, ou le réglage le plus proche possible de l’instrument utilisé, à température ambiante.
      7. Vérifier l’extraction réussie de la moelle selon trois critères : (i) les os paraissent visiblement blancs sans moelle rouge résiduelle, (ii) la granule dans le tube inférieur apparaît rouge foncé et compacte, remplissant généralement la pointe conique du tube de 1,5 mL, et (iii) la masse moelleuse mesurée (Étape 3.1.2.9) se situe dans la plage attendue de ~15–30 mg par souris.
      8. Repositionnez ou recoupez les os et répétez la courte rotation si la moelle rouge visible reste à l’intérieur de l’os.
      9. Peser à nouveau les tubes pour déterminer la masse de la moelle extraite (généralement ~15 à 30 mg par échantillon, selon l’âge de la souris, le sexe et l’efficacité de l’extraction).
        REMARQUE : Le protocole est validé pour des rendements de moelle de ~15 à 30 mg par échantillon. Parce que le volume de resuspension du RPMI-1640 reste constant à 250 μL quelle que soit la masse moelleuse (Étape 3.1.2.10), le rendement EV est normalisé à la masse moelleuse de départ mesurée lors de l’analyse en aval (particules·mL−1·mg−1 tissu en aval). Pour des échantillons bien inférieurs à 15 mg, la moelle de piscine de souris appariées (même âge, sexe et os) avant la resuspension afin de maintenir une apport suffisant pour une caractérisation en aval. Pour les échantillons bien supérieurs à 30 mg, soit répartir la moelle sur deux resuspensions séparées de 250 μL chacune, soit augmenter proportionnellement le volume RPMI-1640 (~12,5 μL par mg de moelle) afin d’éviter une resuspension incomplète ; Dans les deux cas, appliquer la même normalisation par masse lors de l’analyse.
      10. Ajoutez 250 μL de RPMI-1640 à chaque tube. Maintenir un volume constant entre les échantillons, quelle que soit la masse de la moelle, afin de permettre la normalisation du rendement des EV à la masse moelleuse de départ. Gardez les échantillons sur glace.
      11. Resuspendez la moelle en pipettant doucement de haut en bas 10 à 15 fois à l’aide d’une pipette P1000 jusqu’à ce que la suspension paraisse visuellement homogène, sans amas visibles ni fragments de tissu intacts. Évitez la pipetage forcée ou la formation de bulles, qui pourraient perturber l’intégrité des vésicules.
  2. Enlèvement des débris
    1. Première centrifugation
      1. Centrifugez les échantillons à 300 × g pendant 10 minutes à 4°C pour pelleter les débris non digérés, les cellules intactes et les fragments de tissu restants.
      2. Transférez soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes microcentrifuge stériles de 1,5 mL sans déranger la pellete.
    2. Deuxième centrifugation
      1. Centrifugez les échantillons à 2 000 × g pendant 15 minutes à 4°C pour éliminer les gros débris.
      2. Transférez soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes microcentrifuge stériles de 1,5 mL sans déranger la pellete.
    3. Troisième centrifugation
      1. Centrifugez les échantillons à 10 000 × g pendant 30 minutes à 4°C pour éliminer les corps apoptotiques et les grandes vésicules.
      2. Transférez soigneusement le surnageant dans de nouveaux tubes microcentrifuge stériles de 1,5 mL sans déranger la pellete.
      3. Assurez-vous d’obtenir un volume final de surnageant de 200 μL.
  3. Chromatographie par exclusion de taille (SEC)
    1. Préparation des colonnes
      1. Équilibrez la colonne SEC en rinçant avec 6 mL de 1× PBS (filtré à 0,22 μm).
        REMARQUE : Le volume d’équilibrage est spécifique à chaque colonne et doit correspondre au type de colonne indiqué dans le Tableau des matériaux. Cette colonne nécessite un volume d’équilibrage de 6 mL, qui diffère de la colonne utilisée pour les échantillons SkM.
      2. Laissez tout le volume passer par gravité.
      3. Maintenir la colonne et le PBS à RT pendant l’équilibre afin d’assurer un débit optimal et des performances optimales de la colonne.
    2. Chargement des échantillons et élution
      1. Chargez 150 μL de surnageant filtré sur la colonne SEC.
      2. Laissez l’échantillon pénétrer complètement dans la résine. L’extrémité est atteinte lorsque le ménisque liquide atteint la surface du lit de résine sans qu’aucun liquide visible ne reste au-dessus de la résine tandis que la résine reste humide (comme décrit à l’étape 2.2.2).
      3. Ne laissez pas le ménisque descendre sous la surface de résine ni la colonne s’assécher (voir la limite définie à l’étape 3.3.2.2), car cela introduit de l’air dans le lit de résine et perturbe l’élution. Lorsque le ménisque liquide atteint la surface de la résine, passez immédiatement à l’étape 3.3.2.4 sans délai.
      4. Ajoutez immédiatement 550 μL de PBS pour initier l’élution.
      5. Collectez le volume vide (700 μL).
      6. Éliminez le volume vide ou conservez-le comme une fraction non EV.
      7. Commencez à collecter la fraction enrichie par EV immédiatement après que le volume de vide de 700 μL a élu.
      8. Collectez 850 μL d’éluat enrichi en EV après le volume vide de 700 μL.
      9. Sinon, collectez des fractions séquentielles d’environ 170 μL pour optimiser la pureté par rapport au rendement.
        REMARQUE : Des volumes de fractions plus petits sont recommandés lorsque la pureté est plus élevée (par exemple, pour des analyses protéomiques ou des applications sensibles en aval), tandis que des fractions plus importantes peuvent être utilisées pour maximiser le rendement global des EV.
      10. Évaluer les fractions pour les marqueurs EV et regrouper les fractions enrichies en EV selon les besoins.
        REMARQUE : Faites en sorte que la chronique continue de s’écouler. À mesure qu’une fraction est en train de finir, ajoutez du PBS pour maintenir un liquide constant au-dessus du lit de résine et éviter que la colonne ne s’assèche.

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Résultats

Pour évaluer l’efficacité de ce protocole pour isoler les sEVs dérivés des tissus, des résultats représentatifs issus d’échantillons de SkM et de BM sont présentés. L’isolement réussi a été défini par (i) l’enrichissement des marqueurs EV canoniques (TSG101, CD63, CD81 et CD9) dans les premières fractions SEC, (ii) la détection minimale de contaminants intracellulaires (par exemple, Calnexin et BiP), (iii) une distribution unimodale de la taille des particules avec la majorité des partic...

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Discussion

Ce protocole décrit une approche robuste et reproductible pour isoler directement des préparations enrichies en sEV à partir de SkM et BM, deux tissus à faible rendement et hautement hétérogènes. Bien que l’isolement des EV soit bien établi pour les biofluides et les systèmes de culture cellulaire, les méthodes standardisées pour les EV d’origine tissulaire restent limitées en raison des difficultés liées à la dissociation tissulaire, à la contamination par le matériel intracellulaire et...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions Jennie Yang, Dariusz Żurawek et Volodymyr Yerko pour leur assistance technique et leurs discussions utiles. Nous remercions la plateforme Center for Applied Nanomedicine, en particulier Nadim Tawil et Laura Montermini, pour leur soutien dans la caractérisation des vésicules extracellulaires et l’acquisition de données. Nous remercions également le personnel de l’établissement animalier, Guylaine Gadoury et Tara Thomson, pour leur aide dans la manipulation des souris.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1.5 mL centrifuge tubeSarstedt72.690.300Tube de microcentrifugation générale utilisé dans tout le protocole
1.5 mL low-protein-binding tubeSarstedt72.706.600Utilisé pour la manipulation des VE, la collecte des fractions SEC et le stockage
0.2 mL PCR tubeFisher Scientific14-222-262Utilisé pour la configuration de l'extraction de moelle osseuse par tube percé
16 G needleBD305197Utilisé pour percer le tube PCR de 0,2 mL
30 µm cell strainerMiltenyi Biotec 130-098-458Utilisé pour la filtration des échantillons de muscle squelettique
70% ethanolSigma-Aldrich1.11727Utilisé pour stériliser les pincettes
Biosafety cabinetNANAUtilisé pour la manipulation stérile des tissus
Bone cutting instrumentFisher Scientific10-001-976Utilisé pour séparer le fémur et le tibia et exposer la moelle
Bovine serum albumin (BSA)BioShopALB001Utilisé pour le blocage des Western blot et la dilution des anticorps
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302Utilisé pour la préparation du tampon HEPES
Carbon-coated copper grid, 200-meshSigma-Aldrich930342Utilisé pour la préparation des échantillons TEM
Centrifugal filter, 100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096Utilisé pour la concentration des VE
Collagenase DRoche11088858001Utilisé pour la digestion enzymatique du muscle squelettique
CryovialSarstedt72.690.300Utilisé pour le stockage des tissus et des os
Deionized water (ultrapure)NANAUtilisé pour la préparation des tampons et les étapes de lavage TEM
DNase IRoche11284932001Utilisé pour la digestion enzymatique du muscle squelettique
Dry iceNANAUtilisé pour le refroidissement des échantillons et leur transport
Enhanced chemiluminescence substrateBiorad1705061Utilisé pour la détection des Western blot
Filter unit, 0.22 µmSarstedt83.3941.501Utilisé pour filtrer le PBS le cas échéant
Forceps / tweezersMilliporeSigmaF3892Utilisé pour la manipulation des tissus
GlutaraldehydeNANAUtilisé pour la fixation TEM
GlycineNANAUtilisé dans les étapes de lavage des grilles TEM
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Gibco14175-095Utilisé pour la préparation du stock de DNase I
HEPESBioShopHEP001.500Utilisé pour la préparation du tampon HEPES-NaOH
Horseradish peroxidase-conjugated streptavidinThermo FisherS911Utilisé pour la détection des Western blot
Imaging system for chemiluminescenceBiorad12003153Utilisé pour imager les membranes Western blot
KClBioShopPOC308Utilisé pour la préparation du tampon HEPES
Magnesium chloride (MgCl2)BioShopMAG510.500Utilisé pour la préparation du tampon HEPES
2-MethylbutaneThermo Fisher78-78-4Utilisé pour la cryoconservation du muscle squelettique
Milligram balanceMilliporeSigmaZ741359Utilisé pour le pesage des tissus et de la moelle
NaClBioShopSOD004.1Utilisé pour la préparation du tampon HEPES
Nano-particle tracking analysis instrumentMalvern PanalyticalNanoSight NS300NanoSight NS300 utilisé pour le dimensionnement et le comptage des particules
NaOHBioShopSHY500.500Utilisé pour l'ajustement du pH
Nitrocellulose membraneBioRad1704271Utilisé pour le transfert Western blot
Nutating mixerLabnet S0500Utilisé pendant la digestion enzymatique
P1000 pipetteMilliporeSigmaFA10006M-1EAUtilisé pour le transfert des tissus
Pipette tip, 1 mLSarstedt70.3050.275La pointe est rognée pour élargir l'ouverture pour le transfert des fragments de tissus
Phosphate-buffered saline (PBS)WisentINC 811.012-FLUtilisé dans tout le protocole; également utilisé pour l'équilibration et l'élution SEC
Phosphatase inhibitorMilliporeSigma4906845001Utilisé pour la préparation des lysats Western blot
Petri dishMilliporeSigmaCLS351146Utilisé pour la préparation de la moelle osseuse
Polyacrylamide gel, 4–20% gradient stain-freeBioRad4561094Utilisé pour la séparation Western blot
Protease inhibitorMilliporeSigma11697498001Utilisé pour la préparation des lysats Western blot
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR7388-500MLNon complété; pas de FBS ou d'antibiotiques
RIPA buffer, 10×Merck20-188Utilisé pour l'extraction des protéines pour le Western blotting
Scalpel, sterile disposableUltident Paragon02-90000-10Utilisé pour découper le tissu musculaire squelettique
SEC column, original 70 nmIZONICO70PUtilisé pour le SEC du muscle squelettique
SEC column, single 70 nmIZONICS70PUtilisé pour le SEC de la moelle osseuse
Sodium azideSigma-AldrichS2002Ajouté au PBS pour le lavage de la colonne
Sodium cacodylate bufferNANAUtilisé pour le tampon de fixation TEM
Luer Slip Single Use Syringe without Needle MedlineSYR101020Utilisé pendant l'acquisition NTA si applicable
Transmission electron microscopeFEINATecnai G2 Spirit Twin 120 kV Cryo-TEM utilisé pour l'imagerie TEM

Références

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