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Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital général du Hebei (Approbation n° : 2025-LW-0265). En raison du caractère rétrospectif de l’étude, l’approbation éthique a été obtenue après la période de collecte des données, ce qui a été autorisé par le comité pour les études non interventionnelles utilisant des données cliniques anonymisées. L’exigence d’un consentement éclairé écrit a été levée.
Sélection des participants
Les participants potentiels ont été recrutés au sein du département de néphrologie de l’hôpital général de Hebei entre juillet 2022 et mai 2024. Tous les patients ont été dépistés selon des critères d’inclusion et d’exclusion prédéfinis.
Les critères d’inclusion étaient les suivants : diagnostic de néphropathie diabétique (DN) au stade de MogensenIII 23, définie comme une albuminurie persistante avec un ratio albumine/créatinine urinaire (UAlb/UCR) de 30–300 mg/g sur au moins deux des trois échantillons urinaires collectés sur 3 à 6 mois, sans hématurie ni déclin rapide de la fonction rénale suggérant une maladie rénale non diabétique ; taux de filtration glomérulaire estimé (eGFR) ≥45 mL/min/1,73m2 calculé à l’aide de l’équation CKD-EPI ; diagnostic initial de DN sans traitement antérieur de vitamine D, probucol ou immunosuppresseur pour la DN ; âge <75 ans ; et une condition cliniquement stable sans complications diabétiques aiguës telles que l’acidocétose diabétique ou l’hyperglycémie hyperosmolaire, ni infections graves actives dans les 4 semaines précédant l’inscription. La biopsie rénale n’était pas requise pour l’inscription ; cependant, les patients présentant une suspicion de maladie rénale non diabétique, incluant des sédiments urinaires actifs, une glomérulonéphrite à progression rapide ou une maladie auto-immune systémique, ont été exclus.
Les critères d’exclusion incluaient des maladies systémiques graves telles que les cancers, les maladies cardiovasculaires sévères ou les maladies auto-immunes ; allergie connue à la vitamine D, au probucol, au valsartan, à l’atorvastatine ou à l’insuline ; grossesse ou allaitement ; et l’utilisation récente de médicaments dans les 4 semaines qui pourraient interférer avec les résultats de l’étude, y compris des immunosuppresseurs ou des corticostéroïdes.
Répartition des groupes
Le médecin de dépistage est resté aveugle quant à l’attribution finale du groupe jusqu’à la confirmation de l’éligibilité.
Les caractéristiques démographiques et cliniques de base, incluant l’âge, le sexe, la durée du diabète et la maladie défectueuse, ainsi que les antécédents d’hypertension ou d’hyperlipidémie, ont été enregistrées.
Cette étude a utilisé un plan contrôlé rétrospectif, non randomisé. Pour minimiser le biais de sélection et traiter les facteurs de confusion potentiels, notamment les changements temporels et la variabilité liée au médecin, l’allocation des groupes était basée sur l’ordre d’admission chronologique plutôt que sur la préférence du médecin ou du patient.
Les patients admis entre juillet 2022 et décembre 2023 ont reçu une triple thérapie standard comprenant du valsartan, de l’atorvastatine et du probucol et ont été affectés au groupe témoin (n = 56). Les patients admis entre janvier 2024 et mai 2024 ayant reçu une thérapie quadruple (valsartan, atorvastatine, probucol et vitamine D) ont été affectés au groupe d’observation (n = 94).
Le nombre plus important de patients dans le groupe d’observation reflète une application clinique accrue de la thérapie adjuvante à la vitamine D au centre d’étude à partir du début de 2024, suite à l’émergence des données. Les caractéristiques démographiques et cliniques de base étaient comparables entre les groupes (Tableau 1 ; P>0,05), et aucun changement significatif des critères diagnostiques, des méthodes de laboratoire ou de la composition de l’équipe médicale n’a été observé durant la période d’étude.
Administration du traitement
Tous les participants ont reçu un schéma quotidien standardisé d’infusion d’insuline sous-cutanée pour le contrôle glycémique tout au long de la période de 8 mois de l’étude. La dose d’insuline a été ajustée individuellement selon la surveillance quotidienne de la glycémie capillaire. Les patients du groupe témoin ont reçu du valsartan (80 mg une fois par jour à jeun), de l’atorvastatine (20 mg une fois par jour) et du probucol (250 mg deux fois par jour) pendant 8 mois. Les patients du groupe d’observation ont reçu le même schéma de valsartan, d’atorvastatine et de probucol avec des dosages et schémas identiques, ainsi qu’une supplémentation orale quotidienne en vitamine D.
La dose de vitamine D a été déterminée selon les niveaux sériques de 25-hydroxyvitamine D [25(OH)D] mesurés à l’inscription à l’aide d’un immunotest électrochimioluminescence (ECLIA). La suffisance en vitamine D était définie comme 25(OH)D ≥30 ng/mL, l’insuffisance comme 20 ng/mL ≤25(OH)D <30 ng/mL, et la carence comme 25(OH)D <20 ng/mL. Les patients recevant une supplémentation pour prévenir une carence recevaient 600 à 800 UI/jour, tandis que les patients présentant une insuffisance ou une carence en vitamine D établie recevaient 2000 UI/jour.
Surveillance de la sécurité et critères d’arrêt
Pour garantir la sécurité des participants pendant la période de traitement de 8 mois, les niveaux sériques de calcium, de phosphore et d’hormones parathyroïdiennes (PTH) ont été mesurés au départ et toutes les 4 semaines afin de surveiller l’hypercalcémie induite par la vitamine D et le déséquilibre calcium-phosphore. Un électrocardiogramme à 12 dérivations (ECG) a été réalisé au départ et après 8 mois pour évaluer la prolongation de l’intervalle QTc associée au probucol. Chez les patients présentant un QTc de base ≥450 ms chez les hommes ou ≥460 ms chez les femmes, l’ECG a été répété au premier mois.
Les paramètres de la fonction rénale, y compris la créatinine sérique et l’eGFR, ainsi que les électrolytes sériques, étaient surveillés toutes les deux semaines durant le premier mois et chaque mois suivant. Les participants ont été invités à signaler immédiatement de nouveaux symptômes. Les critères d’arrêt du traitement comprenaient un calcium sérique corrigé >10,5 mg/dL (2,62 mmol/L) confirmé par des tests répétés dans les 48 heures ; Intervalle QTc >500 ms ou augmentation de >60 ms par rapport à la référence lors de deux ECG consécutifs ; le doublement de la créatinine sérique à partir de la ligne de départ ou le développement d’une insuffisance rénale aiguë selon les critères Kidney Disease : Improving Global Outcomes (KDIGO) ; et tout événement indésirable de grade ≥3 selon les Common Terminology Criteria for Adverse Events (CTCAE) considéré comme possible, probable ou définitivement lié à la vitamine D ou au probucol. Des événements indésirables graves ont été signalés au comité d’éthique de l’hôpital dans un délai de 24 heures.
Collecte et traitement des échantillons biologiques
Des échantillons de sang et d’urine ont été prélevés avant le début du traitement et après la fin de la période de traitement de 8 mois. Tous les échantillons ont été prélevés le matin après un jeûne nocturne de 8 à 12 heures. Environ 20 mL de sang veineux ont été prélevés à l’aide de techniques de phlébotomie standard dans des tubes sérum-séparateur et EDTA. Les échantillons sanguins ont été laissés coaguler à température ambiante pendant 30 minutes et centrifugés à 1000 × g pendant 15 minutes à 4 °C. Les surnadants séricaux clairs étaient soigneusement aspirés sans perturber le caillot ou la couche buffy, aliquotés dans des cryovials pour différents tests, étiquetés avec l’identification du participant, la date et le type d’échantillon, et conservés à −80 °C jusqu’à analyse. Les échantillons de sérum pouvaient être conservés à −80 °C pendant jusqu’à 12 mois.
Pour une excrétion de protéines urinaires à 24 heures (UPE de 24 h), les participants ont jeté le premier échantillon d’urine du matin à 7h00 le jour 1 puis ont collecté toute l’urine, y compris le premier échantillon du matin à 7h00 le jour 2, dans un contenant de collecte fourni. Les participants ont reçu l’instruction de réfrigérer le récipient de collecte pendant la période de collecte. Le volume total d’urine a été enregistré, soigneusement mélangé et aliquoté pour analyse en laboratoire. Les échantillons étaient stockés à 4 °C lorsqu’analysés dans les 24 heures ou à −20 °C pour une analyse ultérieure.
Pour le rapport albumine/créatinine urinaire (UAlb/UCR), des échantillons d’urine en cours de courant du premier matin ont été prélevés dans des contenants stériles et traités de manière similaire. Les mêmes procédures ont été répétées après la fin de la période de traitement de 8 mois.
Analyse biochimique et clinique des paramètres
Les échantillons de sérum congelés ont été décongelés sur la glace ou à 4 °C avant analyse de créatinine sérique (SCr). La SCr a été mesurée à l’aide d’un test colorimétrique enzymatique sur un analyseur biochimique automatisé, conformément aux instructions du fabricant. L’étalonnage quotidien était effectué à l’aide de calibrateurs multi-niveaux, et deux niveaux de matériaux commerciaux de contrôle qualité étaient inclus dans chaque lot. Les échantillons ont été analysés en double, et des tests avec un coefficient de variation >5 % ont été répétés. La limite inférieure de détection pour le SCr était de 2,0 μmol/L.
La concentration de protéines dans les aliquotes urinaires de 24 h a été mesurée à l’aide de la méthode pyrogallol rouge-molybdate. Les échantillons ont été analysés en double, et des matériaux de contrôle qualité ont été inclus dans chaque tirage. Les échantillons au-dessus de la plage d’étalonnage (>3,0 g/L) ont été dilués avec du sérum physiologique normal et réévalués. L’EPU de 24 heures a été calculée à partir de la concentration de protéines urinaires et du volume urinaire total.
Les concentrations d’albumine urinaire et de créatinine dans les échantillons urinaires du premier matin ont été mesurées à l’aide de l’analyseur biochimique, et le rapport UAlb/UCR a ensuite été calculé.
La glycémie plasmatique à jeun (FPG) et la glycémie postprandiale à 2 h (2h-PPG) ont été mesurées à l’aide d’un glucomètre sanguin validé et d’échantillons de sang capillaire par piqûre capillaire, selon les instructions du fabricant.
L’hémoglobine glyquée (HbA1c) a été analysée à l’aide de chromatographie liquide haute performance avec un système d’analyse dédié à l’HbA1c. Les participants ont été invités à éviter les médicaments hypolipidiques pendant 7 jours et les repas riches en graisses ou l’alcool pendant 24 heures avant la prise de sang post-traitement. Le cholestérol total sérique (TC), les triglycérides (TG), le cholestérol lipoprotéique de haute densité (HDL-C) et le cholestérol lipoprotéique de basse densité (LDL-C) ont été mesurés à l’aide d’analyses enzymatiques. Des matériaux de contrôle qualité à deux niveaux étaient analysés quotidiennement. Les paramètres lipidiques ont d’abord été mesurés en singlicate, et des échantillons avec un coefficient de variation de >10 % ont été réévalués en double. Les limites de détection étaient de 0,1 mmol/L pour le TC, 0,05 mmol/L pour le TG, 0,08 mmol/L pour le HDL-C et 0,10 mmol/L pour le LDL-C. Les valeurs de LDL-C ont été déterminées par test direct ou par l’équation de Friedewald lorsque les niveaux de triglycérides étaient de <400 mg/dL.
Analyse de la fonction immunitaire et des marqueurs inflammatoires
Les concentrations d’immunoglobuline G (IgG) sériques ont été mesurées à l’aide d’un kit IgG ELISA humain commercial. La plage de détection par le test était de 1,37 à 1000 ng/mL, la sensibilité de 0,52 ng/mL, le coefficient de variation intra-essai était de <6 %, et le coefficient de variation inter-essais était de <9 %. Tous les échantillons ont été analysés en double, et des matériaux de contrôle de haute qualité et faible fournis avec le kit étaient inclus sur chaque plaque. Les plaques dont les valeurs de QC sont en dehors de 2 écarts-types par rapport aux valeurs cibles ont été rejetées et répétées. Les échantillons au-dessus de la limite supérieure standard ont été dilués 1:2 et réévalués.
Tous les réactifs et échantillons sérumiques ont été équilibrés à température ambiante avant analyse. Les échantillons de sérum étaient dilués selon les instructions du kit, généralement à 1:100 000. Des étalons, des échantillons dilués et des blancs (100 μL) ont été ajoutés dans des puits appropriés de microplaques pré-revêtues et incubés à 37 °C pendant 90 minutes. Les puits ont été lavés trois fois avant l’incubation avec un anticorps de détection biotinylé pendant 60 minutes à 37 °C. Après un lavage supplémentaire, un conjugué de peroxydase de raifort a été ajouté et incubé pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après le lavage, la solution de substrat a été ajoutée, puis le mélange a été incubé dans l’obscurité pendant 15 minutes avant d’ajouter la solution d’arrêt. La densité optique a été mesurée à 450 nm avec des longueurs d’onde de référence de 570 nm ou 630 nm. Des courbes standard ont été générées pour calculer les concentrations d’IgG.
Les sous-ensembles de lymphocytes ont été analysés par cytométrie en flux sur un BD FACSCanto II équipé de lasers 488 nm et 640 nm. La tension de diffusion directe était réglée à 300 V, la diffusion latérale à 350 V, et les tensions des tubes photomultiplicateurs pour les canaux FITC, APC et PE à 400 V, 550 V et 480 V, respectivement. Les doublets ont été exclus en utilisant la grille FSC-A versus FSC-H.
La coloration de viabilité a été réalisée à l’aide de 7-aminoactinomycine D (7-AAD), et seuls les événements 7-AAD-négatifs ont été analysés. Les échantillons de sang total ont été distribués en tubes non colorés, isotype et éprouvettes. Les anticorps anti-humains CD3-FITC, CD4-APC et CD8-PE ont été ajoutés aux tubes à essai, tandis que des anticorps isotype-témoins appariés ont été ajoutés aux tubes témoins. Les échantillons ont été incubés dans l’obscurité à température ambiante pendant 30 minutes. Les contrôles de compensation étaient préparés avec BD CompBeads, et la compensation automatique était effectuée dans le logiciel FACSDiva. Les globules rouges ont été lysés avec un tampon de lyse des globules rouges, puis lavés et resuspendus dans un tampon de coloration contenant le 7-AAD.
Un système quotidien de cytomètres et des billes de suivi étaient utilisés pour le contrôle qualité. La hiérarchie des filtres comprenait l’exclusion des doubles, la sélection des lymphocytes, la sélection des lymphocytes, la fermeture des droits de viabilité, la fermeture des Jours 3+ et l’identification des sous-ensembles des Cycles 4/CD8. Au moins 50 000 événements lymphocytaires vivants ont été acquis par échantillon, avec un total d’événements acquis allant de 100 000 à 150 000. Les données ont été analysées à l’aide du logiciel FlowJo, et les pourcentages de cellules CD3+, CD4+ et CD8+, ainsi que les rapports CD4+/CD8+, ont été calculés.
Les concentrations sériques de hs-CRP, IL-6, TNF-α et MCP-1 ont été mesurées à l’aide de kits ELISA commerciaux obtenus. Les plages et sensibilités de détection étaient les suivantes : hs-CRP (0,07–12,5 ng/mL ; sensibilité 0,022 ng/mL), IL-6 (0,7–300 pg/mL ; sensibilité 0,35 pg/mL), TNF-α (1,6–100 pg/mL ; sensibilité 0,8 pg/mL) et MCP-1 (5–1000 pg/mL ; sensibilité 2,5 pg/mL). Tous les essais étaient réalisés en double. Des matériaux de contrôle de faible et haute qualité étaient inclus sur chaque plaque. Les coefficients de variation intra-essais étaient de <8 %, et ceux inter-essais étaient de <10 %. Les valeurs inférieures aux limites de détection ont été enregistrées comme la moitié de la limite inférieure de quantification, tandis que les valeurs supérieures à la norme la plus élevée ont été diluées et réévaluées. Les échantillons n’ont subi qu’un seul cycle de congélation-dégel avant analyse. Les procédures ELISA des cytokines suivaient des protocoles identiques à ceux décrits pour l’ELISA IgG, selon les instructions du fabricant concernant les facteurs de dilution, les conditions d’incubation et les températures.
Évaluation des résultats cliniques et gestion des données
À la fin de la période de traitement de 8 mois, les médecins traitants, aveugles à l’allocation des groupes, ont évalué l’état clinique des participants. Les patients ont été classés comme sortis lorsque tous les critères d’amélioration clinique prédéfinis pour la néphropathie diabétique ont été remplis pendant au moins deux semaines consécutives : réduction de ≥ de 30 % dans l’EPI sur 24 heures par rapport à la base initiale, stabilisation ou amélioration de l’eGFR définie comme une diminution <5 mL/min/1,73m2 par rapport au départ, et l’absence de complications aiguës du diabète ou d’autres affections nécessitant une prise en charge continue en hospitalisation. Les participants qui ne remplissaient pas tous les critères étaient classés comme non sortis. Les taux de réponse clinique ont ensuite été calculés pour chaque groupe.
Toutes les données démographiques, de laboratoire et cliniques collectées ont été saisies dans une base de données électronique utilisant une double saisie par deux chercheurs indépendants. Des contrôles de portée et de cohérence étaient effectués pour garantir l’exactitude des données. Les critères principaux comprenaient des changements entre la ligne de base et 8 mois dans les paramètres de fonction rénale, incluant une UPE de 24 heures et un UAlb/UCR, ainsi que des paramètres de fonction immunitaire, notamment le pourcentage de cellules T CD3+ et le ratio CD4+/CD8+. Les critères secondaires comprenaient des changements de la base à 8 mois dans les paramètres glycémiques (FPG, 2h-PPG, HbA1c), le profil lipidique (TC, TG, LDL-C, HDL-C), les marqueurs inflammatoires (hs-CRP, IL-6, TNF-α, MCP-1) et le taux de réponse clinique. Toutes les mesures de jugement ont été évaluées au départ, dans les 48 heures précédant le début du traitement, et après le traitement, dans la semaine suivant la fin de la période de traitement de 8 mois.
Analyse statistique
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel SPSS. Les variables continues à distribution normale étaient exprimées en moyenne ± écart-type, tandis que les variables catégorielles étaient exprimées en fréquence et en pourcentage. Des tests t à échantillons indépendants ont été utilisés pour les comparaisons entre groupes, et des tests chi-carré pour les variables catégorielles. La signification statistique a été définie comme P<0,05. Compte tenu du caractère exploratoire de l’étude et du grand nombre de résultats évalués, les résultats secondaires n’ont pas été ajustés pour la multiplicité. Par conséquent, les valeurs P étaient considérées comme descriptives plutôt que confirmatrices. En raison du plan d’étude rétrospective non randomisée, toutes les comparaisons entre les groupes témoins et observateur n’étaient pas ajustées pour les facteurs de confusion potentiels, et des confondus résiduels ont pu persister. Les 150 patients inscrits (56 dans le groupe témoin et 94 dans le groupe observation) ont tous complété la période complète de 8 mois de traitement et de suivi. Aucun patient n’a été perdu lors du suivi, retiré ou exclu après l’inscription. Aucune donnée manquante n’a été identifiée pour les caractéristiques de base ou les critères de jugement, y compris la fonction rénale, les profils glycémiques et lipidiques, les marqueurs immunitaires et les facteurs inflammatoires. Par conséquent, aucune procédure d’imputation n’était requise.