Nanoparticules vertes de CuO/ZnO : réduction de la translocation et de l’accumulation de l’AFB1 dans le maïs

Résumé

Cette étude a étudié l’efficacité des nanoparticules hybrides CuO/ZnO synthétisées en vert dans la réduction de l’accumulation et de la translocation d’aflatoxine B₁ (_{AFB 1}) dans le maïs, démontrant qu’un traitement à 125 mg/kg réduisait significativement les niveaux de_{AFB 1} et minimisait les risques d’exposition alimentaire chez l’homme et l’animal.

Résumé

L’aflatoxine B₁ (AFB₁) est un puissant cancérogène produit par les espèces d’Aspergillus qui contamine les cultures de maïs, présentant de graves risques pour la santé humaine et animale en raison de l’exposition alimentaire. La gestion traditionnelle après récolte et les interventions chimiques sont souvent coûteuses ou inefficaces pour empêcher la translocation des toxines du sol dans la plante pendant la croissance. L’objectif principal de ce protocole était d’évaluer les nanoparticules hybrides (NP) d’oxyde de cuivre/oxyde de zinc (CuO/ZnO) synthétisées vert comme amendement durable du sol avant la récolte. L’étude visait à déterminer si ces NP pouvaient efficacement inhiber la translocation et l’accumulation de_{AFB 1} dans les tissus de maïs, réduisant ainsi l’accumulation de toxines dans les grains comestibles. En utilisant un plan randomisé en blocs complets sur deux sites de champ distincts, le maïs a été cultivé dans un sol inoculé avec des spores_{AFB 1} ou Aspergillus flavus et traité avec des concentrations variables de NP (0–125 mg/kg). Le protocole utilisait une synthèse verte avec un substrat de Pleurotus ostreatus pour garantir l’éco-respect. Les tissus végétaux ont été analysés à différents stades physiologiques à l’aide de la chromatographie liquide haute performance (HPLC) pour mesurer les niveaux de_{AFB 1} et calculer les évaluations des risques humains et d’élevage. Le traitement avec 125 mg/kg de NP hybrides verts (p < 0,05) a significativement réduit les concentrations de_{AFB 1} à tous les stades de croissance. Sur le site sur le campus, la_{AFB 1} a été réduite de 68 % au stade végétatif, de 82 % à la floraison et de 76 % à maturité par rapport au témoin positif. Fait crucial, les niveaux de grain AFB₁ sont tombés à 6,91 ppb, réduisant significativement l’apport quotidien estimé chez l’humain. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour évaluer les résidus potentiels de nanoparticules et leur toxicité à long terme. Cette méthode démontre que les NP hybrides verts CuO/ZnO agissent comme un agent biomédiateur efficace, empêchant le transport des toxines vers les parties comestibles de la plante. Cette approche propose une stratégie évolutive et respectueuse de l’environnement pour renforcer la sécurité alimentaire et atténuer l’exposition à_{AFB 1} dans les régions sujettes à l’aflatoxine.

Introduction

Les aflatoxines, en particulier l’aflatoxine B₁ (AFB₁), comptent parmi les mycotoxines les plus importantes en raison de leur prévalence, toxicité et impact sur l’homme. Ils sont produits par certains champignons, principalement ceux appartenant à l’espèce d’Aspergillus ^1,2,3. _{AFB 1} est liée au cancer hépatocellulaire et est la plus dangereuse de toutes les aflatoxines⁴. Ces puissants agents cancérigènes infectent diverses cultures agricoles, y compris le maïs (Zea mays L.), ce qui entraîne de graves préoccupations pour la sécurité^{alimentaire 5,6}. La présence de la base de_{l’AFB 1} dans le maïs affecte non seulement le rendement et la qualité des cultures, mais constitue également une menace sérieuse pour la santé humaine et animale par l’exposition alimentaire ^7,8.

Actuellement, la gestion de l’aflatoxine repose principalement sur des stratégies post-récolte, telles que le séchage approprié, le tri des grains endommagés, les traitements chimiques (par exemple, ammoniac ou ozone), l’irradiation et le stockage hermétique pour prévenir la croissance fongique pendant^{le stockage 9}. Les stratégies incluent une bonne gestion des cultures, des agents de biocontrôle (comme la chaux) et des installations de stockage^{améliorées 10}. Des traitements physiques et chimiques, tels que micro-ondes, ultraviolets (UV), lumière pulsée, eau électrolysée, plasma froid, ozone, faisceau d’électrons et irradiation gamma, ont également été^{testés 11}. Cependant, ces méthodes post-récolte sont souvent coûteuses, énergivores ou peu pratiques pour un usage généralisé, et elles ne préviennent pas la translocation d’aflatoxine à l’intérieur de la plante pendant la croissance.

Les approches pré-récolte utilisées incluent des pratiques agronomiques telles que les cultivars résistants, la plantation rapide, l’irrigation pour réduire le stress lié à la sécheresse, et le biocontrôle avec des souches aflatoxigènes d’A. flavus (par exemple, Aflasafe), qui excluent de manière compétitive les souches toxigènes mais nécessitent des applications répétées et peuvent ne pas traiter entièrement la translocation d’origine du sol 11,12,13. Ces méthodes rencontrent souvent des limites : les interventions post-récolte ne peuvent pas inverser une contamination préexistante, entraînent des coûts élevés pour l’infrastructure de tri/stockage dans des contextes limités en ressources, risquent de perdre des nutriments ou de résidus dus à des produits chimiques, et l’efficacité du biocontrôle varie selon les conditions^{environnementales 14}.

En revanche, les nanoparticules hybrides CuO-ZnO synthétisées vert offrent une nouvelle stratégie d’amendement du sol avant la récolte. Contrairement aux NP chimiques conventionnels, la synthèse verte utilisant des extraits végétaux (par exemple, substrat de champignon) évite les solvants toxiques, réduit les coûts et améliore la biocompatibilité, les rendant durables^{pour l’environnement 15,16}. L’hybridation CuO-ZnO renforce synergiquement l’activité antifongique en générant des espèces réactives d’oxygène (ROS), en perturbant les membranes fongiques et en fournissant une grande surface pour l’adsorption de_{l’AFB 1}, empêchant ainsi l’absorption et la translocation dans des parties comestibles de la plante comme les céréales. Cela diffère des stratégies existantes en permettant une intervention précoce à l’interface sol-plante, en atteignant une réduction allant jusqu’à 80-99 % de la base_{AFB 1} à de faibles doses (par exemple, 125 mg/kg), sans compromettre le rendement des cultures ni laisser de résidus^{nocifs 17}. Les principaux avantages incluent l’éco-respect par rapport aux fongicides chimiques, une efficacité supérieure aux parcs nucléaires à un seul métal ou au biocontrôle dans des conditions de champ variables, ainsi qu’un potentiel d’intégration évolutive dans les pratiques agricoles dans les régions sujettes aux aflatoxines comme l’Afrique subsaharienne.

Les NP d’oxyde métallique, en particulier l’oxyde de zinc (ZnO) et l’oxyde de cuivre (CuO), ont attiré l’attention parmi ces matériaux en raison de leurs caractéristiques antifongiques et de leur capacité à absorber les^{toxines 18,19}. Par exemple, il a été rapporté que les NP de Cu ont la capacité de créer des ROS, qui peuvent nuire aux macromolécules biologiques bactériennes et^{fongiques 20}. De plus, dans une autre expérience, il a été démontré que les souches fongiques présentent un changement notable avec une tendance claire à une augmentation de l’ordre lorsque F. solani a été traité avec des NP CuO à base de chitosan, ce qui a entraîné le plus grand effet^{d’ordre 21}. La synthèse verte des NP a attiré l’attention comme une alternative plus sûre et durable aux méthodes chimiques conventionnelles, minimisant ainsi les sous-produits toxiques et l’impact^{environnemental 15,22.}

L’hybridation des NP de CuO et ZnO combine les propriétés bénéfiques des deux métaux, améliorant potentiellement leur efficacité pour dégrader ou adsorber_{AFB 1}^23,24. Actuellement, ces NP synthétisés par le vert sont principalement utilisés pour contrôler la production de FA dans des souches fongiques lors d’expériences in vitro ; par exemple, Sheik et Awad ont étudié l’impact des AgNP, AuNP et leur mélange sur la croissance et l’accumulation d’aflatoxine_B1 de la souche aflatoxigène A. flavus ²⁵. Cependant, la concentration nécessaire pour contrôler la croissance d’A. flavus est inconnue. Ainsi, il est crucial d’évaluer les hybrides verts CuO-ZnO dans des conditions pertinentes pour le terrain pour leur impact sur la translocation de la base_AFB 1 provenant de sources modifiées dans le sol vers les tissus de maïs, par rapport aux NP conventionnels. Ainsi, les objectifs de cette étude étaient de déterminer l’effet de différentes concentrations de NP hybrides verts CuO/ZnO sur la concentration de_{AFB 1}/A. flavus dans les tissus du maïs et d’évaluer le risque de AFB₁ dans le maïs après avoir traité le maïs avec des NP hybrides verts CuO/ZnO. Les hypothèses de recherche devaient fournir une base mécanistique pour l’efficacité observée des NP hybrides CuO-ZnO synthétisés par le vert. Cette étude teste les hypothèses mesurables suivantes : 1) L’hypothèse d’inhibition antifongique, selon laquelle les NP hybrides réduisent significativement la sporulation d’A. flavus et la production de novo de_{AFB 1} dans le sol par rapport aux NP métalliques uniques, identifiées par une charge fongique et des niveaux de toxines plus faibles sur le site de Molelwane. 2) L’hypothèse d’adsorption-translocation : dans laquelle la présence de toxines préexistantes (site du campus) a permis aux NP de démontrer une forte affinité de liaison pour_{AFB 1}, réduisant significativement le taux de translocation de toxines du sol vers le système raciculaire du maïs. 3) L’hypothèse de biocompatibilité (phytotoxicité) : selon laquelle les NP hybrides synthétisés verts devaient entraîner une accumulation métallique résiduelle moindre et réduire les marqueurs de stress oxydatif dans les tissus du maïs par rapport aux références chimiques conventionnelles, améliorant ainsi la biosécurité des cultures.

Protocole

Sites expérimentaux
Les essais ont été menés sur deux sites situés à 7 km l’un de l’autre ; Les sites ont été inoculés avec différents traitements. Lors du premier essai, une installation de réseau avec 40 % d’ombre a été installée à la ferme de recherche de Molelwane, North-West University (NWU) (25,810°S, 25,630°E, 1276 m) dans la province du Nord-Ouest de l’Afrique du Sud. Le sol limoneux sableux rouge était classé en forme Hutton et contenait 75 % de sable, 4 % de limon et 21 %^{d’argile 25}. La deuxième expérience a été menée dans l’installation de la maison en réseau du campus NWU Mafikeng (25 8278 °S, 25 6079 °E, 1 276 m). Les sols du second site présentaient du limon sablonneux avec 82 % de sable, 3 % de limon, 15 % d’argile, et étaient auparavant classés comme Arcadia forme²⁵. Les NP hybrides verts CuO/ZnO ont été synthétisés dans le laboratoire du Département de chimie, École des sciences physiques et chimiques, Faculté des sciences naturelles et agricoles de la NWU, en Afrique du Sud.

Synthèse des NP hybrides verts CuO/ZnO
Dix (10) g de substrat de champignon usé (SMS) séché de Pleurotus ostreatus ont été ajoutés à 100 mL d’eau désionisée, chauffés à 70 °C, puis remués pendant 2^{h 26}. Le mélange a ensuite été refroidi à température ambiante, filtré, et 30 mL de filtrat ont été ajoutés à une solution contenant 2,5 g d’acétate de cuivre et 2 g d’acétate de zinc dans 30 mL d’eau distillée. Le pH de cette solution était ajusté à 8 à l’aide d’hydroxyde de sodium (NaOH), chauffé à 80 °C pendant 2 heures, centrifugé après la réaction, séché toute la nuit au four, puis calciné à 650 °C pendant 2^{h 26}. Les NP synthétisés ont été caractérisés et confirmés comme des NP hybrides verts CuO/ZnO.

Échantillonnage et analyse des sols
Des échantillons de sol ont été prélevés à la ferme universitaire de Molelwane et au site d’essai du campus à des profondeurs de 0 à 15 cm et de 15 à 30 cm. Ils ont ensuite été catégorisés et examinés pour leurs propriétés physiques et chimiques, comme l’a décrit²⁷.

Conception expérimentale
L’étude a utilisé une expérience factorielle organisée selon un plan randomisé par blocs complets (RCBD) avec trois réplications. Pour évaluer l’efficacité des NP hybrides CuO-ZnO synthétisés en vert dans divers scénarios de contamination, deux modes d’exposition indépendants ont été établis sur des sites distincts : le Site 1 (campus de l’Université North-West) représentait un modèle de contamination exogène où le sol a été ajouté à AFB₁ extrait à un taux de 160 ppb/kg afin d’évaluer les capacités d’adsorption directe et de protection par translocation. Site 2 (Ferme de recherche Molelwane) : Représentait un modèle d’infection biologique où le sol était inoculé avec des spores d’A. flavus à 160 spores/kg pour étudier l’impact antifongique des NP sur la production de mycotoxines de novo et l’absorption ultérieure par les plantes. Les NP poudrés ont été pesés et mélangés uniformément avec 1 kg de terre dans un sac plastique de plantation après l’inoculation (spores_{AFB 1} ou A. flavus ). Chaque traitement était réalisé séparément, et les mains étaient désinfectées entre les séances. Ensuite, quatre graines de maïs ont d’abord été plantées dans chaque pot (9 cm de diamètre supérieur, 6,5 cm de diamètre inférieur). Pour garder trois semis en bonne santé par pot, les semis étaient taillés une semaine après leur sortie. Conformément aux recommandations pour une production optimale de maïs issues de l’analyse du sol, le sol a été fertilisé. Les pots étaient placés à des espacements entre et intra-rangées de 0,75 m × 0,3 m, pour un total de 216 pots. Le sol dans les pots a été arrosé à 60 % de la capacité des champs après l’ensemencement. Des échantillons de sol et de plantes ont été prélevés à trois stades de développement : V10 (développement), R1 (floraison) et R6 (maturité). Les échantillons étaient ensuite apportés au laboratoire dans une glacière remplie de glace et conservés à -20 °C pour des examens complémentaires. Des sacs en papier brun ont été utilisés pour stocker et congeler en profondeur les échantillons restants de plantes pour les concentrations_{AFB 1} et d’autres tests. Les échantillons restants de plantes pour les concentrations de base₁ et autres analyses ont été conservés dans des sacs en papier brun et congelés jusqu’à l’analyse.

Analyse des aflatoxines du maïs
Les composants de développement du maïs (racine, tige, feuille et grain) à différents stades de croissance étaient rassemblés dans des sacs plastiques stériles, marqués avec soin et transportés au laboratoire. Pour préserver l’intégrité des données de croissance et garantir des observations indépendantes à chaque étape du développement, un protocole d’échantillonnage destructif a été mis en place. Pour éliminer la contamination croisée entre concentrations de nanoparticules et types d’inoculation, les outils de récolte et les gants ont été nettoyés à 70 % d’éthanol et rincés à l’eau déionisée entre chaque groupe de traitement. À l’aide d’un mortier et pilon, 10 g de matière végétale et 1 g de chlorure de sodium (NaCl) ont été pulvérisés pendant 10 minutes dans 25 mL de 80 % de méthanol et 20 % d’eau distillée. Pour les grains de maïs et les carottes de maïs, 25 g d’échantillon moulu et 2,5 g de NaCl ont été mélangés à 100 mL d’eau distillée à 80 % de méthanol :20 à grande vitesse pendant 10 minutes. Ensuite, l’extrait homogénéisé a été filtré à travers un filtre en microfibre de verre, suivi d’un lavage avec 20 mL de Tween-2 à 20 % dans une solution séline tamponnée phosphate (PBS). Les aflatoxines ont été extraites de la colonne d’affinité immunitaire après élution à un débit d’une goutte par seconde, et le surnageant (cytoplasme) a été collecté dans un flacon ambré. Ensuite,_{AFB 1} et d’autres aflatoxines ont été mesurées selon la méthode de chromatographie^{liquide 28} , qui consistait à dériver les aflatoxines avec une solution d’o-phtaldialdéhyde et à injecter les composés dérivés dans un système de chromatographie liquide haute performance (HPLC). Le système HPLC était équipé d’un détecteur de fluorescence Jasco FP-920 réglé sur une excitation de 362 nm et une émission de 425 nm. L’AFB₁ était intrinsèquement structurée physiologiquement pour être détectée à une longueur d’onde d’excitation de 362 nm. Une colonne Hichrom (4,6 mm × 150 mm) avec des particules de 5 μm a été utilisée, et le réacteur de dérivatisation était un programme KOBRA Cell à 100 μA. Les séparations des pics chromatographiques ont été effectuées dans une colonne Hichrom à laquelle une pré-colonne de phase stationnaire similaire avait été fixée. Les Inertsil ODS-3 et ODS-3 V étaient utilisés respectivement comme cartouches de garde et d’analyse, tandis que l’injecteur consistait en un autoéchantillonneur avec une valve réodyne. La phase mobile était composée d’eau : méthanol (65:35, v/v), bromure de potassium (119 mg) et 4 M d’acide nitrique (350 μL) par litre, et était pompée à un débit de 1,0 mL/min dans un programme isocratique. La détection d’aflatoxines a été considérée comme positive pour chaque pic à un temps de rétention similaire à chaque standard et à une hauteur cinq fois supérieure au bruit de^{base 29}.

Les limites de détection (LOD), la limite de quantification (LOQ) et le pourcentage ( %) de récupération ont été calculées pour confirmer l’approche analytique du HPLC, à l’aide des équations 1, 2 et 3 respectivement. Le LOD est la concentration la plus faible d’aflatoxine pouvant être distinguée de manière fiable du bruit de fond, tandis que le LOQ est la concentration la plus faible d’aflatoxine pouvant être mesurée quantitativement avec une précision et une précision^{acceptables 30}. _{AFB 1} et ses métabolites ont été récupérés en ajoutant 10 μL d’étalons totaux d’aflatoxine (AFB₁,_{AFB 2}, AFG₁ et AFG₂) aux échantillons témoins de maïs négatifs en triple exemplaire. Les échantillons ont ensuite été extraits à l’aide de HPLC en utilisant les procédures mentionnées précédemment.

LOD = X + 3s 1

LOQ = X + 10s 2

3

Où : « X » est la concentration moyenne des valeurs d’écarts d’échantillons fortifiés, et « s » est l’écart-type de l’échantillon.

Estimation de l’exposition AFB1
Les niveaux moyens d’aflatoxines dans le régime alimentaire du maïs, la consommation quotidienne de maïs et le poids corporel moyen (enfants, adultes, bovins de viande, vaches laitières et poussins) ont été utilisés pour calculer l’apport journalier estimé (EDI). L’EDI moyen des aflatoxines a été calculé selon l’équation 2 et exprimé en (ng/kg de poids corporel/jour) ; pour le calcul de l’indice de danger (HI), les valeurs de l’EDI ont été converties en ng/kg de poids corporel/jour (1 ppb/kg/jour = 1 000 ng/kg de poids corporel/jour) afin de correspondre aux unités de TD5032³¹.

4

Évaluation des risques et caractérisation
L’indice de danger (HI) a été calculé en divisant l’EDI par le TD50 et en multipliant par un facteur de sécurité de 50 000. La dose médiane toxique (TD) 50 est la dose nécessaire (ng/kg/poids corporel/jour) pour provoquer des tumeurs chez 50 % des animaux de test qui n’auraient pas développé de tumeurs à la dose^{zéro 31,32}.

Analyse des données
L’analyse de la variance a été réalisée sur les données de croissance et de rendement collectées en utilisant la procédure RCBD dans SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Des comparaisons multiples des moyennes des moindres carrés ont été réalisées à l’aide du test³³ de la différence honnêtement significative (HSD) de Tukey.

Résultats

Concentration d’aflatoxine dans les composants de croissance
Les résultats ont montré que des concentrations d’aflatoxines dans les composants de croissance et dans les grains de maïs traités avec des NP de CuO/ZnO synthétisés verts ont été détectées, indiquant la présence de tous les principaux types d’aflatoxines (AFG₂, AFG₁, AFB₂ et AFB₁). Les courbes d’étalonnage utilisées pour calculer ...

Discussion

Le succès de ce protocole pour réduire la translocation et l’accumulation de la base_AFB 1 dans le maïs dépend de plusieurs étapes critiques qui garantissent à la fois l’efficacité biologique et la fiabilité^{analytique 16,27}. Les résultats démontrent que 125 mg/kg de NP hybrides CuO-ZnO synthétisés vert ont significativement réduit les concentrations de_{AFB 1} dans les deux modèles expérimentaux, bien que via de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétate de cuivre(II) [Cu(CO2CH3)2]	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, États-Unis	10,53,753	Solide cristallin bleu-vert foncé (pureté à 98 %)
Filtre en microfibre de verre & nbsp ;	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, États-Unis	1703965	Verre borosilicate   ;
Système de chromatographie liquide haute performance (HPLC)	Shimadzu	20H2	Pour la séparation et la quantification des analytes   ;
Éthanol de qualité HPLC	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, États-Unis	34923	Solvant incolore de haute pureté ( &ge ; 99 %)
Méthanol de qualité HPLC	Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne	322415	Solvant incolore de haute pureté ( &ge ; 99 %)
Colonne d’affinité immunitaire	Shimadzu	KJ524	Pour la purification sélective des analytes cibles
Graines de maïs de PAN 5R-590R	NWK	N/A	Petits grains durs avec coluor blanc
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)	Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne	3526580	Une solution tampon isotonique   ;
Sacs plastiques	Eco-Agro Enterprise (Pty) Ltd	N/A	Perforé
AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 et AF purifiés – totalement in situ	Laboratoire Analytique Trilogy, Inc (Vossbrink Drive, WA, États-Unis)	TAS-M12DA1-10	Solide cristallin blanc à blanc foncé
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, États-Unis	N/A	Solide cristallin blanc
Acétate de zinc [Zn(CH3COO2)2H2O]	Produits chimiques VWR	2331 210 2	Solide cristallin blanc (pureté à 99 %)