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Article de méthode

Isolement et culture des cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris

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DOI :

10.3791/70909

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17 juillet 2026

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1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

Dans cet article

Résumé

Un protocole est présenté pour l’isolement et la culture primaire de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) à partir de tissu cérébral murin néonatal, afin de générer un modèle in vitro robuste pour étudier la fonction de la barrière hémato-encéphalique dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Résumé

Les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) constituent le principal composant cellulaire de la barrière hémato-encéphalique (BBB) et jouent un rôle clé dans la régulation du transport moléculaire et le maintien de l’homéostasie du système nerveux central. Des modèles in vitro fiables de l’endothélium cérébral sont essentiels pour étudier la physiologie et les dysfonctionnements de la BBB dans les maladies neurologiques et systémiques. Un protocole reproductible pour l’isolement et la culture primaire des BMEC à partir du cortex cérébral murin néonal est décrit. La méthode comprend la dissection des tissus corticals, la dissociation mécanique et enzymatique, l’élimination des débris de myéline à l’aide d’un gradient de densité sérique bovine (BSA), ainsi que l’enrichissement des cellules endothéliales par immunosélection basée sur le CD31. Les cellules isolées sont ensuite cultivées sur des plaques recouvertes de collagène et caractérisées par une évaluation morphologique, la détection par immunofluorescence des marqueurs endothéliaux, des tests de formation angiogénique de tubes et des mesures de résistance électrique transendothéliale (TEER) afin d’évaluer les propriétés de la barrière. Ce protocole fournit une approche fiable pour obtenir des cultures BMEC primaires adaptées à l’étude de la biologie du BBB, de la signalisation endothéliale et des interactions neurovasculaires dans des conditions physiologiques et pathologiques.

Introduction

La barrière hémato-encéphalique (BBB) est une structure hautement spécialisée qui régule strictement l’échange des substances entre le système nerveux central (SNC) et la circulationsystémique 1. La BBB est principalement formée par des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales reliées par des jonctions serrées. Ces cellules endothéliales fonctionnent au sein d’un système multicellulaire appelé unité neurovasculaire (NVU), qui comprend également les astrocytes, péricytes, neurones, cellules gliales et la membranebasale 2. Parmi ces composantes, les cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) jouent un rôle central en formant une couche continue avec des jonctions serrées, des milliers de systèmes de transport sélectif, un trafic vésiculaire limité, et en restreignant l’infiltration des cellules immunitaires par une faible expression de molécules d’adhésion qui limitent le passage des solutés et des cellules dans le parenchymecérébral 3,4.

En plus de leur rôle de barrière physique et sélective, les BMEC sont activement impliqués dans des processus essentiels, notamment la signalisation neurovasculaire, la régulation du flux sanguin cérébral, les réponses immunitaires locales et, en particulier, l’angiogenèsecérébrale 5. Ce dernier processus est essentiel lors du développement embryonnaire, mais il est également réactivé dans des pathologies telles que l’AVC, l’ischémie ou l’inflammation. Les BMEC répondent aux signaux proangiogéniques tels que le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance placentaire (PLGF), coordonnant la formation et la maturation de nouveaux vaisseaux 6,7. Ainsi, un dysfonctionnement endothélial cérébral compromettrait gravement l’intégrité du BBB et l’homéostasie cérébrale.

L’étude des BMEC in vitro nous permet de modéliser à la fois la physiologie de la BBB et les mécanismes qui régulent l’angiogenèse cérébrale. Cependant, isoler ces cellules du tissu cérébral pose d’importants défis techniques en raison de la complexité du tissu neural, de l’abondance de myéline et de la nécessité d’obtenir des cultures à haute pureté endothéliale. Bien que des lignées cellulaires immortalisées existent, elles présentent des limitations importantes en termes de représentativité phénotypiqueet fonctionnelle.

Dans ce contexte, les protocoles de culture primaire de BMECs à partir de modèles murins néonatals constituent un outil expérimental puissant, car ils préservent de nombreuses caractéristiques morphologiques, moléculaires et fonctionnelles de l’endothélium cérébral in vivo. Cependant, plusieurs protocoles établis pour l’isolation murine de la BMEC reposent sur la dissociation mécanique combinée à des gradients de densité (dextran ou Percoll), ce qui entraîne souvent un enrichissement endothélial variable et une contamination résiduelle par péricytes, astrocytes et débrismyéliniens 9. La purification à base d’antibiotiques utilisant la puromycine améliore la pureté endothéliale (jusqu’à ~95 %) mais peut entraîner un stress cellulaire en raison de son inhibition de la synthèse protéique et des effets potentiels sur le phénotypeendothélial 10. Alternativement, les approches basées sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) fournissent des populations hautement purifiées mais nécessitent un équipement spécialisé et un traitement étendu, ce qui peut réduire la viabilité et la scalabilité11. Les protocoles néonataux plus récents évitent les gradients de densité et réduisent le nombre d’étapes de centrifugation, améliorant le rendement tout en limitant la contamination12.

S’appuyant sur ce contexte, ce travail décrit un protocole optimisé pour isoler et cultiver les cellules endothéliales à partir de la microvascularisation du cerveau de souris néonatale. Cette méthode combine une dissection anatomique précise, une digestion enzymatique efficace, l’élimination de la myéline à l’aide d’un gradient d’albumine sérique bovine (BSA), et l’enrichissement par immunosélection avec des microspheres magnétiques conjuguées au marqueur CD31. Le protocole permet l’obtention de cultures primaires viables, reproductibles et enrichies, adaptées aux études de l’angiogenèse cérébrale, des interactions neurovasculaires, de la signalisation endothéliale et du dysfonctionnement de la BBB dans des conditions physiologiques et pathologiques.

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Protocole

Le Comité de bioéthique et de biosécurité de l’Université de Bío-Bío a approuvé ce projet (subvention Fondecyt 1240925). Le travail avec les animaux a été réalisé conformément aux principes fondamentaux des trois R concernant l’utilisation des animauxexpérimentaux 13 et conformément aux recommandations des Lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publiées par les National Institutes of Health desÉtats-Unis 14. Les animaux étaient maintenus dans des environnements appropriés au Bioterium de l’Université de Bío-Bío dans des conditions de logement standard (cycle clair/obscur de 12 h, température contrôlée de 22 ± 2 °C, avec accès ad libitum à l’alimentation et à l’eau).

Pour obtenir ces cellules, des souris gestantes de type sauvage (WT) (C57BL/6), âgées de 4 à 6 mois, ont été utilisées. Après l’accouchement, les petits sont restés avec la mère jusqu’au jour postnatal 5 (P5). À ce stade, la progéniture était profondément anesthésiée à l’isoflurane jusqu’à la perte de réflexes avant l’euthanasie. L’hypothermie était utilisée uniquement comme complément pour minimiser les mouvements et était immédiatement suivie d’une décapitation. Toutes les procédures ont été réalisées conformément aux lignes directrices de l’American Veterinary Medical Association (AVMA) pour l’euthanasie des animaux (2020)15 et aux réglementations internationales relatives aux soins et à l’utilisation des animaux de laboratoire (NIH)14. Le cortex cérébral a été isolé et utilisé pour développer ce protocole expérimental (voir Étape 3 du protocole). Le tableau des matériaux liste les matériaux et anticorps utilisés dans ce protocole.

1. Préparation du milieu endothélial

  1. Pour préparer 500 mL de milieu de culture pour cellules endothéliales cérébrales murines, dans un récipient stérile, mélangez 250 mL de DMEM complétés avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 250 mL de milieu endothélial de culture cellulaire complétés avec 10 % de FBS.
    REMARQUE : Le milieu de culture fournit des facteurs de croissance endothéliaux essentiels et soutient la prolifération cellulaire. Si le produit référencé (voir le tableau des matériaux) n’est pas disponible, des compléments équivalents pour cellules endothéliales (par exemple, ECGS, hydrocortisone et L-glutamine) peuvent être ajoutés au DMEM + FBS pour obtenir des conditions de croissance similaires16.
  2. Filtrez l’ensemble du milieu (10 % FBS) à travers un filtre de 0,22 μm pour garantir la stérilité.
  3. Conservez le substrat préparé à 4 °C jusqu’à utilisation. Préparez un médium frais toutes les 2 à 4 semaines pour maintenir l’activité du facteur de croissance.

2. Revêtement des plaques de culture

REMARQUE : Pour favoriser l’adhésion cellulaire et maintenir le phénotype endothélial, les plaques de culture doivent être pré-enduites de collagène de type I. Les étapes de ce processus sont les suivantes :

  1. Préparez la solution de pré-revêtement en mélangeant du collagène de type I (0,1 mg/mL), du M d’acide acétique pour solubiliser le collagène, et un milieu basal stérile pour atteindre un volume total de 15 mL. Mélangez doucement jusqu’à ce que le collagène soit complètement dissous et ajustez la solution à un pH de 4,0 si nécessaire. Filtrez la solution de façon stérile à travers un filtre de 0,22 μm et laissez-la sur glace jusqu’à utilisation pour préserver la stabilité du collagène.
    REMARQUE : Le collagène de type I imite la membrane basale, soutient l’attache des cellules endothéliales et aide à maintenir le phénotype cellulaire.
  2. Homogénéisez la solution dans des conditions stériles. Appliquez la solution uniformément pour couvrir toute la surface des plaques de culture.
    REMARQUE : Seul le volume nécessaire pour couvrir la surface est utilisé.
  3. Incubez les plaques à 37 °C toute la nuit (12–16 h) pour permettre au collagène de s’adsorber correctement. Avant de semer les cellules, retirez l’excès de solution de revêtement et lavez les plaques deux fois avec un sérum stérile 1x tamponné phosphate (1x PBS, pH 7,4) pour éliminer l’acide résiduel et le collagène non lié.

3. Isolement de la culture cérébrale mixte

REMARQUE : Ce protocole s’appuie sur les rapports précédents 9,17 qui visaient à isoler les BMEC du cortex cérébral des souris P5.

  1. Sacrifier cinq petits P5 avec une anesthésie profonde avec de l’isoflurane ; Utilisez l’hypothermie uniquement en complément, suivie d’une décapitation cervicale.
    REMARQUE : À partir de cette étape, toutes les procédures doivent être réalisées dans un cabinet de sécurité biologique à flux laminaire.
  2. Prélever les cerveaux (Figure 1A) et les placer dans un PBS froid stérile (1x) dans un tube conique de 50 mL jusqu’à ce que tous les cerveaux soient traités.
  3. Séparez les méninges en roulant soigneusement chaque cerveau sur une membrane nitrocellulose stérilisée. Transférez le cerveau sur une plaque de 100 mm contenant du PBS froid (1x). À l’aide d’un scalpel stérile, retirez le tronc cérébral, le cervelet, le thalamus et le bulbe olfactif (Figure 1B,C).
  4. Collectez les cortex cérébraux libérés de méninges et stockez-les dans un PBS froid (1x). Transférez immédiatement tout le cortex cérébral dans un tube conique de 50 mL contenant 5 mL de PBS 1x sur glace (Figure 1D).
  5. Dissociez mécaniquement le tissu à l’aide de ciseaux stériles, puis une pipette de 1 mL jusqu’à ce qu’aucune pièce ne soit observée et que la suspension soit homogène (Figure 1E).
    REMARQUE : La pointe de la pipette peut être coupée pour réduire les contraintes mécaniques lors de la trituration. La dissociation tissulaire est obtenue par succion contrôlée et pipetage doux, tandis qu’une ouverture élargie de la pointe minimise les forces de cisaillement et la lyse cellulaire mécanique, préservant ainsi la viabilité cellulaire.
  6. Rassemblez tous les tissus et placez-les dans des tubes de 15 mL.
  7. Pour digérer le tissu, transférez l’échantillon dans un tube conique stérile de 15 mL contenant 2 mL de solution de collagénase (2 mg/mL en DMEM) et incubez pendant 2 heures à 37 °C sur un vibrateur orbital à 180 tr/min.
  8. Après la digestion, ajoutez 5 mL de DMEM complétés à 10 % de FBS à la suspension et centrifugez à 3 000 × g . pendant 10 minutes (voir Figure 1F). Jetez le surnageant.
  9. Pour retirer la myéline, resuspendez le pellet dans 4 mL de 20 % de BSA dans PBS (p/v) et centrifugez à 3 000 × g . pendant 20 minutes (Figure 1G). Après centrifugation, retirez soigneusement la couche supérieure laiteuse contenant la myéline à l’aide d’une pipette Pasteur et jetez tout surnageant restant (Figure 1H).
  10. Résuspendez le pellet dans 2 mL de DMEM contenant 10 % de FBS, puis centrifugez à nouveau à 3 000 × g pendant 10 minutes. Jetez le surnageant, puis resuspendez doucement la dernière pastille dans 1 mL de DMEM contenant 10 % de FBS.
    REMARQUE : À ce stade, la résuspension finale contient une population hétérogène de cellules issues du cerveau résultant de la dissociation tissulaire. Ce mélange peut inclure des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, des astrocytes, des péricytes et d’autres cellules neuronales. Des étapes ultérieures de purification et de culture sont nécessaires pour enrichir sélectivement les BMEC.
  11. Avant de plaquer les cellules isolées, retirez la solution de revêtement des plaques de culture préparées (voir étape 2.3) et rincez chaque puits deux fois avec du PBS stérile (1x).
  12. Semez les cellules en suspension (étape 3.10) sur les plaques enduites (recommandé : plaques de 60 mm).
    REMARQUE : En général, l’ensemble de la suspension cellulaire obtenue à partir d’un seul isolement est distribué en un ou deux plats revêtus, chacun contenant 5 mL de milieu endothélial.
  13. Maintenir les cultures dans un milieu cellulaire endothélial à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂. Remplacez le substrat tous les 2 à 3 jours. Lorsque les cultures atteignent une confluence de 90–100 %, on procède à l’immunosélection en utilisant des billes recouvertes de CD31 pour enrichir les cellules endothéliales.
    REMARQUE : Après l’isolement et l’établissement initial de la culture, la procédure donne généralement environ 5 × 10 6 cellules par préparation, qui adhèrent aux plaques recouvertes de collagène et développent la morphologie caractéristique des pavés des monocouches endothéliales.

4. Isolement des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) à l’aide de billes magnétiques CD31

  1. Préparation et détachement des cellules
    1. Une fois que les cultures atteignent 90–100 % de confluence, lavez les cellules 3 fois avec du PBS (1x) pour éliminer le milieu résiduel.
    2. Ajoutez 1 mL de trypsine (0,5 % 1x) à la plaque et incubez pendant 3 à 5 minutes à 37 °C pour détacher les cellules.
    3. Neutralisez la trypsine en ajoutant 1 mL de milieu endothélial avec 10 % de FBS. Transférez la suspension de la cellule (~2 mL) dans un tube microcentrifuge stérile et centrifugez à 220 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant.
  2. Préparation des billes magnétiques CD31
    1. Placez 8 μL de billes magnétiques CD31 dans un nouveau tube de 15 mL. Lavez les billes avec 1 mL de solution de Hank à 1 %, en les resuspendant doucement en déplaçant le tube.
    2. Placez le tube sur un aimant pendant 2 minutes pour précipiter les billes. Retirez soigneusement le surnageant sans déranger les billes. Répétez l’étape du lavage 3 fois.
      REMARQUE : Toujours travailler près de l’aimant pour éviter de perdre les billes, et effectuer cette étape dans des conditions stériles pour éviter la contamination de la culture cellulaire primaire.
  3. Incubation de cellules avec des billes
    1. Resuspendez le pellet cellulaire dans 1 mL de solution de Hank à 1 % contenant FBS (pour réduire la liaison non spécifique).
    2. Transférez les cellules dans le tube contenant les billes pré-lavées à l’aide d’une pipette de 1 000 μL. Faites couver le mélange sur de la glace en secouant doucement pendant 20 minutes.
  4. Séparation magnétique des cellules endothéliales
    1. Placez le tube sur un aimant pendant 3 minutes pour précipiter les cellules endothéliales liées aux perles.
    2. Retirez le surnageant avec précaution.
      REMARQUE : À ce stade, deux types cellulaires isolés peuvent être purifiés — une cellule endothéliale (voir étape 4.5), et un mélange de différents types de cellules cérébrales. À ce stade, deux options sont disponibles.
      1. Retirez et jetez le surnageant (c’est-à-dire le mélange des cellules cérébrales) tout en maintenant le tube sur l’aimant. Lavez les cellules liées aux billes (c’est-à-dire celles CD31+ ) avec 2 mL de solution de Hank et répétez 3 fois.
      2. Utiliser le surnageant contenant des débris cellulaires pour générer une nouvelle culture contenant des cellules non sélectionnées (par exemple, fibroblastes, astrocytes, microglies, neurones, péricytes, entre autres).
  5. Culture des BMEC purifiés
    1. Resuspendez les cellules endothéliales liées aux billes dans 7 mL de milieu endothélial complet (FBS à 10 %).
    2. Semez les cellules sur une plaque de 60 mm préalablement recouverte de collagène toute la nuit (voir section 2). Incuber dans des conditions standard (37 °C, 5 % CO₂).
      REMARQUE : Le phénotype endothélial est conservé jusqu’au passage (p) 3 dans les conditions de culture décrites. Pour maintenir les propriétés liées à la barrière hémato-encéphalique, il est recommandé de réaliser des tests expérimentaux à l’aide de passages précoces (p0–p3).

5. Caractérisation cellulaire

  1. Observation microscopique des cellules capturées par des billes
    REMARQUE : Dans les conditions de culture décrites dans ce protocole, les BMEC primaires peuvent généralement être maintenues jusqu’à trois passages (p3) tout en préservant leur morphologie endothéliale caractéristique et leur phénotype. Selon la densité de semis et le taux de croissance, les cultures peuvent généralement être maintenues jusqu’à environ 2 à 3 semaines in vitro avant que des changements phénotypiques significatifs ne puissent survenir.
    1. Après immunosélection avec des billes magnétiques CD31, observez les cellules attachées sous un microscope à contraste de phase (Figure 2A).
      1. Recherchez des cellules endothéliales CD31 positives présentant une morphologie typique de pavés et formant des monocouches homogènes en 5 à 7 jours.
        REMARQUE : Lors de l’immunosélection, les billes magnétiques recouvertes de CD31 se lient spécifiquement aux cellules endothéliales, enrichissant ainsi la population endothéliale. Après le processus de sélection, les billes (d’environ 4,5 μm de diamètre) peuvent encore être observées associées ou internalisées par les cellules endothéliales lors des premiers passages. Ces mesures diminuent généralement avec les lavages et le maintien en culture ultérieurs, et n’interfèrent pas avec la viabilité du BMEC ni la croissance cellulaire (Figure 2B).
      2. Utilisez la morphologie uniforme et l’absence de cellules allongées ou de type astrocyte pour estimer la pureté de la population endothéliale.
  2. Immunofluorescence pour CD31 et GLUT1
    1. Graines 2 × 10,3 BMEC sur des manteaux recouverts de collagène et la culture jusqu’à atteindre une confluence de 80–90 %.
    2. Fixez les cellules avec du paraformoldéhyde à 4 % pendant 10 minutes à température ambiante (22–25 °C) et lavez avec du PBS.
    3. Perméabiliser avec 0,1 % de Triton X-100 pendant 5 minutes et bloquer la liaison non spécifique avec 5 % de BSA pendant 30 minutes.
    4. Incubez toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre CD31 et GLUT1 (transporteur de glucose spécifique à l’endothélium cérébral).
    5. Laver avec du PBS et incuber pendant 1 heure avec les anticorps secondaires fluorescents appropriés.
    6. Contre-colorer les noyaux avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et fixer les couches de couverture avec un support antifondu.
    7. Visualisez sous un microscope à fluorescence ou confocal. Cherchez CD31 localisé aux frontières cellulaires (Figure 3A), tandis que GLUT1 montre la distribution cytoplasmique et membranaire, confirmant l’identité endothéliale et le phénotype endothélium cérébral (Figure 3B).
      REMARQUE : Des images représentatives issues d’isolations BMEC indépendantes illustrent la morphologie typique et l’expression des marqueurs des BMEC en culture. La présence de protéines à jonction serrée, telles que la claudine-5, peut également être utilisée pour caractériser l’endothélium cérébral. Pour évaluer davantage la pureté des cultures endothéliales, une coloration supplémentaire par immunofluorescence peut être réalisée à l’aide de marqueurs négatifs pour d’autres types de cellules neuronales. Par exemple, la protéine acide gliale fibrillaire (GFAP) peut être utilisée pour détecter les astrocytes, et la molécule adaptatrice ionisée de liaison au calcium 1 (Iba1) pour identifier les cellules microgliales. L’absence de coloration pour ces marqueurs confirme l’absence de contamination par ces populations cellulaires non endothéliales (Figure 3C,D).
  3. Essai de formation en tube
    REMARQUE : Les cellules endothéliales présentent une capacité proangiogénique dans les testsMatrigel 18, et l’identité endothéliale peut être confirmée grâce à ce test.
    1. Pré-revêtez une plaque de 96 puits avec du Matrigel et laissez-la polymériser pendant 30 minutes à 37 °C.
    2. Graine 1 × 104 BMEC par puits dans 100 μL de milieu endothélial complet (FBS à 10 %). Incubez à 37 °C et surveillez la formation du tube pendant 4 à 8 heures à l’aide d’un microscope à contraste de phase (Figure 4A).
    3. Quantifiez la longueur totale du tube, le nombre de jonctions et les maillages en utilisant ImageJ (plugin Angiogenesis Analyzer)19. (Figure 4B).
      REMARQUE : La capacité des BMEC à former des structures tubulaires interconnectées confirme leur potentiel angiogénique et leur fonctionnalité endothéliale.
  4. Mesure de la résistance électrique transendothéliale (TEER)
    REMARQUE : Les cellules endothéliales cérébrales doivent former une barrière solide, car elles sont un composant critique duBBB 20. La capacité endothéliale à générer une barrière électrique doit être confirmée.
    1. Semez 20 000 BMECs sur des inserts Transwell recouverts de collagène (taille de pore 0,4 μm) dans le compartiment supérieur et cultivez jusqu’à leur confluence.
    2. Mesurez le TEER à l’aide d’un voltohmètre épithélial pour évaluer l’intégrité de la monocouche. Enregistrer les valeurs TEER quotidiennement jusqu’à la stabilisation ; une augmentation de la résistance indique la formation de jonctions intercellulaires serrées, caractéristiques des barrières endothéliales fonctionnelles (Figure 4C).
      REMARQUE : Les restes du mélange cellulaire non sélectionné, y compris les astrocytes, peuvent être utilisés pour générer un système de coculture. Cette configuration nécessite une optimisation minutieuse du ratio cellulaire entre les compartiments supérieur (BMEC) et inférieur (mélange cellulaire non sélectionné), qui devrait être standardisé dans chaque laboratoire. Cette configuration de coculture a été adaptée des modèlesBBB 21 décrits précédemment.
    3. Semez le mélange cellulaire non sélectionné (étape 4.4.2.2) dans le puits inférieur de la plaque de culture et les BMECs sur le côté supérieur de la membrane d’insertion Transwell.
      REMARQUE : Une expérience représentative comparant les conditions de monoculture et de coculture a été incluse pour évaluer l’étancheté de la barrière par mesure TEER (Figure 4C).

6. Expansion et entretien des BMEC purifiés

  1. Conditions culturelles
    1. Maintenir les BMEC purifiés dans un milieu de culture endothéliale complète (10 % FBS) à 37 °C dans un incubateur humidifié (95 % d’humidité) avec 5 % de CO₂. Changez le milieu de culture tous les 2 à 3 jours pour fournir des nutriments frais et maintenir la viabilité cellulaire.
  2. Surveillance de la croissance et de la morphologie cellulaires
    1. Observez les cultures quotidiennement sous un microscope à contraste de phase pour surveiller l’attachement, la croissance et la morphologie cellulaires. Recherchez la morphologie caractéristique des pavés des BMEC, qui forment une monocouche confluente en 5 à 7 jours.
  3. Sous-culture et passage
    1. Lorsque les cultures atteignent une confluence de 80–90 %, détacher les cellules en utilisant 0,05 à 0,1 % de trypsine pendant 3 à 5 minutes à 37 °C.
    2. Neutraliser la trypsine avec un volume égal de milieu complet, centrifuger à 220 × g pendant 10 minutes à 4 °C, puis resuspendre la pellete dans un milieu endothélial frais.
    3. Semez les cellules sur des plaques recouvertes de collagène à la densité souhaitée pour une expansion continue.
      REMARQUE : Limitez les passages BMEC à 3–5 pour maintenir le phénotype endothélial et l’intégrité fonctionnelle.
  4. Cryoconservation optionnelle
    1. Pour un stockage à long terme, resuspendez les BMEC dans un milieu congelant (10 % de DMSO dans un milieu endothélial complet). Congelez progressivement jusqu’à –80 °C dans un congélateur à taux contrôlé, puis transférez dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.

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Résultats

Le protocole décrit ici permet l’isolement et la culture des BMEC primaires à partir de souris néonatales (P5). Ces cellules constituent le principal composant cellulaire du BBB et constituent donc un outil expérimental précieux pour étudier la physiologie et la physiopathologie cérébrovasculaires. L’isolement et la culture réussis des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales (BMEC) ont été démontrées grâce à des évaluations morphologiques, phénotypiques et fonctionnelles.

...

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Discussion

L’isolement des BMEC est un outil essentiel pour étudier les mécanismes qui régulent la physiologie du BBB et son dysfonctionnement dans diverses pathologies du système nerveux central (SNC) 4,9, y compris l’AVC. Contrairement aux lignées cellulaires immortalisées, les cultures BMEC primaires préservent des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles clés de l’endothélium cérébral, notamment l’expression de protéines forteme...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Des parties de ce manuscrit ont été écrites avec ChatGPT d’OpenAI (GPT-4, version juillet 2025) afin d’améliorer la clarté, le langage et la cohérence. Les auteurs ont examiné de manière critique, édité et approuvé tout contenu assisté par l’IA. Aucun outil d’IA n’a été utilisé pour l’analyse des données, l’interprétation des résultats ou la génération de conclusions scientifiques.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les chercheurs de GRIVAS Health et NEUROVAS pour leurs précieuses contributions. Cette étude a été financée par Fondecyt Regular 1240295.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
60 mm culture platesCorning430166
96 Well culture platesCorning41122107
Acide acétiqueSigma-AldrichA6283
Antibiotique-antimycotique (facultatif)Gibco15240062
Anti-CD31Santa Cruz sc-466941:100
Anti-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Anti-GLUT1Abcamab1157301:200
Anti-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Anti-mouse IgG Alexa Fluor (594 Dye)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor  (488 Dye)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
Pipettes automatiques et sérologiques Oxford LP  OXL.OXL.OSP-5C
Milieu basal (pour la solution de collagène)Gibco (DMEM)11965092
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA9647
Collagénase de type IISigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 µg/mL
DMEM (glucose élevé)Thermo Fisher Scientific11965092
EndoGRO-MV Complete MediumMerck MilliporeSCME004Milieu de croissance pour cellules endothéliales
Tubes Falcon (15 & 50 mL)Corning®352096 / 352070
Sérum bovin foetal (FBS)Gibco (Thermo Fisher)16000044
Microscope à fluorescenceMoticBA410
Gants, masques, consommables de laboratoireDivers fournisseurs—
Héparine (100 U/mL)Sigma-AldrichH3393
Microscope inverséOlympus CKX41
Aimant de séparation magnétiqueEasySep  NC9284020
Agitateur orbital (37 °C)Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
ParafilmBemisPM996
PBS (1×)Thermo Fisher Scientific10010023
Centrifugeuse réfrigéréeHITACHICT5RE
ScalpelFine Science ToolsVarious
Ciseaux et pincettes finesFine Science ToolsVarious
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Références

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