Génération et différenciation des organoïdes épithéliaux olfactifs humains à partir de cellules souches adultes

Résumé

Ce protocole présente une approche établie pour isoler les cellules progénitrices olfactives à partir de tissu adulte supérieur de cornets humains afin de générer des organoïdes épithéliaux olfactifs. Il détaille également une stratégie d’induction chimique pour favoriser la différenciation de ces organoïdes en neurones sensoriels olfactifs matures, permettant ainsi la modélisation de la neurogenèse olfactive humaine.

Résumé

L’épithélium olfactif humain possède une capacité neurogénique remarquable, soutenue par une population résidente de cellules souches basales ; Cependant, établir un modèle dynamique in vitro qui récapitule fidèlement ce processus régénératif s’est avéré difficile. Ici, nous présentons un protocole établi pour générer des organoïdes olfactifs à partir de cellules progénitrices isolées dans le tissu supérieur des cornets humains adultes. Ces organoïdes maintiennent leur tige, comme en témoigne l’expression de SOX2, et présentent un schéma de différenciation spatialement organisé, caractérisé par une expression uniforme du marqueur neuronal immature GAP43 et une localisation périphérique du marqueur sensoriel olfactif mature OMP. Une différenciation ciblée ultérieure avec l’inhibiteur de Notch LY411575, l’activateur Wnt CHIR-99021 et l’acide rétinoïque a généré des cellules sensorielles sensorielles semblables à des neurones olfactifs positifs aux marqueurs qui co-exprimaient OMP et le marqueur neuronal Tuj1 (classe III β-tubuline). Ce modèle d’origine humaine contourne les limites des systèmes murins et offre une plateforme in vitro robuste pour étudier la neurogenèse olfactive, l’anosmie associée au COVID-19 et d’autres troubles neurodégénératifs liés à l’odorat.

Introduction

Le système olfactif humain soutient une neurogenèse ^continue,1 un processus principalement entraîné par les cellules souches basales dans l’épithélium olfactif, plus précisément les cellules basales horizontales (HBC) et les cellules basales globeuses (GBC). ^2,3 GBC se différencient constitutivement en neurones sensoriels olfactifs (OSN), tandis que les HBC restent immobiles jusqu’à activation par une blessure. ^4,5 La perception olfactive commence lorsque des molécules odorantes se lient aux récepteurs sur les cils des OSN, déclenchant une cascade de transduction du signal qui transmet l’information au bulbe olfactif et au cortex. ⁶ Le développement et le maintien de cette fonction sensorielle sont régis par l’épithélium olfactif.

Le dysfonctionnement olfactif causé par des insultes physiques, chimiques ou biologiques se résout souvent spontanément. ⁷ Néanmoins, elle touche de 1,5 % à 25 % de la population^{mondiale 8} et peut résulter de diverses étiologies, notamment les traumatismes,9 les infections,10 et des troubles neurodégénératifs tels que la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson¹¹ ; Dans ces cas, la récupération spontanée est fréquemment incomplète ou absente. Les approches thérapeutiques actuelles, telles que l’entraînement olfactif et l’administration de corticostéroïdes, montrent une efficacité limitée. ^12,13 Cette lacune thérapeutique découle d’une compréhension incomplète des mécanismes régissant la survie et la régénération du neuroépithélium olfactif après une blessure, un manque de connaissances aggravé par l’insuffisance des modèles in vitro existants pour étudier la biologie olfactive humaine.

Ces dernières années, le développement de divers modèles d’organoïdes humains a créé de nouvelles plateformes technologiques pour étudier les maladies humaines. ¹⁴ organoïdes dérivés de cellules souches adultes (ADSC), également appelées cellules souches résidentes dans les tissus, ont été générés avec succès pour divers tissus dérivés de l’endoderme, notamment l’estomac, le foie, le pancréas, les poumons et la vessie. 15,16,17,18,19 En revanche, établir des organoïdes épithéliaux olfactifs humains à partir de la placode olfactive dérivée de l’ectoderme reste techniquement difficile. Un défi pratique majeur est la difficulté d’obtenir de manière constante un tissu épithélial olfactif viable à partir du cornet supérieur humain. L’emplacement et l’étendue de la région olfactive varient considérablement d’un individu à l’autre et subissent une dégénérescence liée à l’âge prononcée. La collecte involontaire d’épithélium respiratoire plutôt que olfactif compromet les résultats de la culture. Pour y remédier, nous avons affiné le protocole de 2021 de Ren et al., qui ont réussi à cultiver des groupes cellulaires à partir de muqueuse olfactive ^humaine,20 afin de générer de manière fiable des organoïdes épithéliaux olfactifs humains. Notre approche génère des organoïdes épithéliaux olfactifs humains avec une architecture tridimensionnelle organisée hiérarchiquement et soutient leur différenciation en neurones sensoriels olfactifs. Ce modèle offre une plateforme expérimentale précieuse pour étudier les mécanismes qui déterminent le destin des cellules souches épithéliales olfactives et pour dépister les agents thérapeutiques potentiels des troubles olfactifs.

Pour résumer explicitement, l’objectif principal de cette méthode est d’établir un flux de travail standardisé pour générer et différencier les organoïdes épithéliaux olfactifs humains des cellules progénitrices adultes. La raison d’être de cette approche est de combler le fossé critique créé par l’absence de modèles in vitro physiologiquement pertinents du système olfactif humain. Comparé aux cultures monocouches bidimensionnelles (2D) traditionnelles ou aux modèles murins, ce système tridimensionnel (3D), dérivé de l’humain, offre l’avantage distinct de reproduire fidèlement l’organisation spatiale complexe et le contexte génétique spécifique à l’humain de la muqueuse olfactive. Pour que les chercheurs envisagent ce protocole, il est essentiel de reconnaître que l’isolement précis de l’épithélium olfactif viable du cornet supérieur humain, tout en évitant la contamination par l’épithélium respiratoire, est particulièrement difficile et fortement influencé par l’âge du patient et la variation anatomique individuelle. Par conséquent, ce protocole est particulièrement adapté aux chercheurs ayant un accès constant à des échantillons cliniques humains et cherchant à modéliser la neurogenèse olfactive humaine, l’anosmie induite par le virus ou les déficits olfactifs associés aux troubles neurodégénératifs.

Protocole

Cette étude a été réalisée avec l’approbation du Conseil d’Éthique Institutionnelle (IRB) de l’Hôpital de Chine de l’Ouest de l’Université du Sichuan (Approbation n° 2024 (31)). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients participants avant la collecte des tissus et la publication des données. Des échantillons de tissu de cornet supérieur ont été prélevés chez des patients subissant une chirurgie endoscopique de la base du crâne ou une chirurgie du sinus ethmoïdien pour la rhinorrhée du liquide cérébro-rachidien.

1. Traitement et transport des échantillons de tissus

1. Immédiatement après la collecte, placez les échantillons de tissu dans un milieu de transport prérefroidi et stérile, composé de milieu basal DMEM/F12/HEPES complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal et 5 % de solution de pénicilline–streptomycine, puis transportez-les au laboratoire à 4 °C.
   REMARQUE : Le sérum aide à maintenir la viabilité cellulaire, tandis que le mélange antibiotique évite une contamination microbienne potentielle pendant le transport. Gardez le temps de transport en dessous de 2 heures pour préserver la viabilité cellulaire.

2. Prétraitement des tissus (réalisé sur glace)

1. Transférez l’échantillon dans une boîte de culture prérefroidie et stérile, retirez le milieu de transport, puis lavez le tissu avec un tampon PBS modifié contenant une solution de 5 % de pénicilline – streptomycine. Effectuez le lavage comme suit : ajoutez 5 mL de solution prérefroidie dans la plaque, tapotez doucement le mouchoir 5 à 7 fois, puis aspirez complètement le liquide. Répétez ce cycle de lavage 3 fois pour éliminer les globules sanguins et les débris tissulaires.
2. À l’aide de microciseaux stériles, réduisez le tissu en fragments d’environ 1 à 2^{mm 3}.
   REMARQUE : Durant cette étape, maintenez l’hydratation des tissus, fixez-les avec des pinces à pointe émoussée et minimisez le temps de taille pour préserver la viabilité cellulaire.

3. Digestion enzymatique

1. Transférez le tissu dissocié mécaniquement dans un tube centrifugeuse de 15 mL et ajoutez 3 mL de tampon de digestion composé préchauffé (37 °C) (contenant 0,125 % de trypsine et 10 U/mL de DNase I), en maintenant un rapport enzyme-volume de 3:1. Incubez le tube dans un bain-marie à 37 °C avec une légère agitation pendant 20 minutes. Inspectez l’échantillon toutes les 5 minutes pour surveiller la progression de la digestion et éviter les agglutinements tissulaires.
2. Arrêtez la digestion en ajoutant un volume égal de solution de terminaison, DMEM/F12/milieu basal HEPES complété avec 10 % de sérum bovin fœtal. Pipettez doucement le mélange 10 fois pour assurer un mélange complet et un contact efficace entre les enzymes et les composants inhibiteurs.
   REMARQUE : L’α1-antitrypsine présente dans le sérum neutralise efficacement l’activité de la trypsite.

4. Préparation de la suspension monocellule

1. Placez une tamoire de 40 μm sur un tube centrifuge de 50 mL. À l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL coupée, transférez le tissu digéré et le liquide du tube de 15 mL sur la passoire. Faites doucement tourner le matériau sur le filtre avec la pointe de la pipette pour faciliter le passage, puis rincez la passoire avec 1 à 2 mL supplémentaires de solution de terminaison. Une fois que tout le liquide est passé à travers la passoire, transférez le filtrat du tube de 50 mL vers un nouveau tube centrifuge de 15 mL.
2. Centrifugez la suspension à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Observez la granule cellulaire distincte au fond du tube et aspirez soigneusement le surnageant, laissant environ 100 μL pour éviter de perturber ou de perdre la pellete cellulaire.

5. Établissement d’un système culturel tridimensionnel

1. Sans resuspendre la granule cellulaire dans un milieu de culture, combinez-la directement avec Matrigel à l’aide d’une pointe de pipette prérefroidie et peu liée afin d’obtenir une densité précise de 10 000 cellules/μL. Distribuez 40 μL de ce mélange cellule–Matrigel dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et 20 μL dans chaque boîte confocale à fond de verre. Incubez les plaques à 37 °C pendant 30 minutes pour permettre au Matrigel de polymériser et de former un échafaudage tridimensionnel.
2. Après la solidification du Matrigel, ajoutez doucement 500 μL de milieu de culture olfactive de cellules souches neurales sans sérum le long de la paroi du puits pour éviter de perturber le gel. Maintenez les cultures dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO₂, en remplaçant le milieu tous les 3 jours par un milieu frais préchauffé.
   REMARQUE : Le milieu de culture de cellules souches neurales olfactives est composé de DMEM/F12/HEPES complétés avec les composants suivants : R-spondine 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), un agent antimicrobien principal (100 μg/mL), un supplément de N2 (1 %), un supplément de B27 (2 %) et une L-glutamine (1 %).

6. Passage et différenciation

1. Pré-refroidissez la solution de récupération des organoïdes sur de la glace pendant 10 minutes avant utilisation ; aspirez le milieu de culture des puits, puis ajoutez 1 mL de solution de récupération glacée à chaque puits. Inclinez la plaque à un angle de 45° et aspirez doucement et distribuez la solution 5 à 7 fois pour déloger les organoïdes de la matrice membranaire basale et transférer la suspension résultante dans un tube centrifuge de 15 mL. Incubez le tube sur de la glace pendant 3 à 5 minutes, puis centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C, et retirez soigneusement le surnageant, en laissant environ 100 μL de liquide pour éviter la perte du pellet.
2. Ajoutez 1 mL de réactif organoïde de dissociation directement sur la granule cellulaire et incubez le tube à 37 °C avec un léger secouement à 220 tours par minute pendant 5 minutes. Interrompez immédiatement la digestion en ajoutant un volume égal de solution Stop et pipettez doucement le mélange 5 fois pour assurer l’homogénéité. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à 4 °C pour collecter les cellules dissociées.
3. Resuspendre la granule cellulaire dans Matrigel à un volume de 40 μL par puits pour les plaques à 24 puits ou 20 μL par puits pour les plats de culture confocale à fond de verre ; Mélangez soigneusement à l’aide d’une pointe de pipette prérefroidie à faible fixation pour garantir une suspension uniforme. Après ensemencement dans les plaques ou plats appropriés, incubez les constructions à 37 °C pendant 30 minutes pour permettre la polymérisation Matrigel et la formation tridimensionnelle de l’échafaudage. Ensuite, ajoutez doucement 500 μL de milieu spécialisé sans sérum pour la culture sphéroïde des cellules souches neurales olfactives le long des parois du puits afin d’éviter de perturber le gel. Maintenir les cultures dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité relative.
4. Environ 7 jours après le départ, une fois que la nouvelle génération d’organoïdes épithéliaux olfactifs s’est reformée en sphéroïdes, aspirez le milieu d’expansion des plats confocaux à fond de verre et remplacez-le par un milieu de différenciation. Remplacez le milieu de différenciation par un milieu frais, préchauffé, tous les 3 jours. Les neurones olfactifs morphologiquement distincts deviennent généralement apparents à la microscopie après environ 7 jours de différenciation.
   REMARQUE : Le milieu de différenciation se compose de DMEM/F12/HEPES complété avec R-Spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), LY411575 (5 μM), CHIR99021 (3 μM), acide rétinoïque (PR, 1 μM), un agent antimicrobien principal (100 μg/mL), supplément de N2 (1 %), supplément de B27 (2 %) et L-glutamine (1 %).

7. Immunofluorescence

1. Aspirez le milieu de culture et lavez doucement les échantillons une fois avec 500 μL de PBS. Retirez le PBS, puis ajoutez 500 μL de paraformodéhyde à 4 % et fixez les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes. Aspirer et jeter le fixateur ; puis lavez les échantillons fixes avec du PBS (3 x 500 μL) et conservez-les à 4 °C pendant jusqu’à 48 heures.
2. Aspirez le PBS et ajoutez 500 μL de solution de perméabilisation (0,2 % de Triton X-100 dans PBS), incubez pendant 15 minutes à température ambiante, puis aspirez et jetez la solution. Lavez les échantillons avec 0,02 % de PBST (0,02 % de Triton X-100 en PBS ; 3 x 500 μL).
3. Ajoutez 500 μL de solution bloqueante (3 % de BSA dans le PBS) et incubez pendant 1 heure à température ambiante.
4. Aspirer la solution bloqueante et la remplacer par 500 μL de solution primaire d’anticorps, préparée en diluant l’anticorps primaire approprié (par exemple, anti-GAP43 à 1:160, anti-OMP à 1:50, ou anti-SOX2 à 1:50) dans une solution bloqueante, puis incuber toute la nuit à 4 °C. Le lendemain, aspirez la solution primaire d’anticorps et lavez les échantillons avec du PBST à 0,02 % (3 x 500 μL).
5. Ajouter 500 μL de solution secondaire d’anticorps, contenant un anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 488– ou Alexa Fluor 555, dilué à 1:500 dans une solution bloqueante, et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 1 heure. Aspirez la solution secondaire d’anticorps et effectuez des lavages supplémentaires avec un PBST à 0,02 % (3 x 500 μL).
6. Ajoutez 500 μL de solution de travail DAPI (DAPI diluée dans PBS) et incubez dans l’obscurité pendant 10 minutes pour colorer les noyaux. Aspirez la solution DAPI et lavez les échantillons avec du PBST à 0,02 % (3 x 500 μL). Conservez les échantillons colorés à 4 °C pendant jusqu’à 48 heures avant l’imagerie.

8. Imagerie par microscopie confocale

1. Effectuer une microscopie confocale en utilisant une taille d’axe Z de 1 μm pour les organoïdes de diamètre de ≤100 μm, et de 0,5 μm pour les organoïdes supérieurs à 100 μm. Acquérir des images en mode séquentiel multicanal, en scannant dans l’ordre suivant : DAPI, FITC, TRITC et Cy5. Importez les fichiers de séquence d’images Z-stack acquis dans le logiciel de rendu 3D (par exemple, Imaris). Utilisez la fonction de rendu volumique 3D pour générer un modèle tridimensionnel complet de l’organoïde. Observez ce modèle reconstruit pour visualiser la distribution spatiale de marqueurs cellulaires spécifiques (par exemple, SOX2, GAP43 et OMP) et pour confirmer qualitativement l’architecture hiérarchique et le statut de différenciation neuronale des organoïdes épithéliaux olfactifs comme point final.

Résultats

Isolement du tissu épithélial olfactif et culture des organoïdes épithéliaux olfactifs primaires
Pour établir un système de culture des organoïdes épithéliaux olfactifs, nous avons isolé l’épithélium olfactif du tissu supérieur des cornets humains et l’avons intégré dans une matrice de Matrigel tridimensionnelle (Figure 1). En nous appuyant sur les conditions de culture définies rapportées par Ren et al., nous avons validé et affiné les c...

Discussion

Les organoïdes représentent un modèle in vitro unique car leur architecture tridimensionnelle auto-organisée reproduit étroitement celle des tissus humains natifs et, dans certains cas, peut être histologiquement indiscernable des organes réels. ¹⁴ L’établissement de modèles organoïdes humains est donc crucial pour l’étude des maladies humaines. Ici, nous présentons un protocole pour générer un système de culture organoïde à partir de cellules épithéliale...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ALEXA FLUOR 488 DONKEY	Thermo	A11055	1:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEY	Thermo	A31572	1:500
Anti-GAP43 antibody	Abcam	ab75810	1:160
Anti-OMP antibody	SANTA CRUZ	sc-365818	1:50
Anti-Sox-2 antibody	SANTA CRUZ	sc-365823	1:50
B-27 Supplement	Gibco	17504044	2%
CHIR99021	Novoprotein	HY-10182	3 μM
DMEM/F12/HEPES	Procell	PM150310	/
Glutamax (L-glutamine supplement)	Gibco	35050061	1%
LY411575	Novoprotein	HY-50752	5 μM
Matrigel (basement membrane matrix)	Corning	356231	4% (Vol/Vol)
N-2 Supplement	Gibco	17502048	1%
Organoid Dissociation Reagent	Precedo	PRS-ODR	/
Organoid Recovery Solution	Thewellbio	MS04-100	/
Primocin (primary antimicrobial agent)	Invivogen	ant-pm-05	100 μg/mL
Recombinant Human EGF	Novoprotein	C029	50 ng/mL
Recombinant Human Noggin	Novoprotein	CB89	100 ng/mL
Recombinant Human RSPO1	Novoprotein	CX83	200 ng/mL
Recombinant Human Wnt3a	Novoprotein	C18K	50 ng/mL
Retinoic acid	MCE	HY-14649	1 μM
Y27632	MCE	HY-10071	10 μM