Nouvelle combinaison d’antioxydants pour restaurer une communication intercellulaire saine dans un modèle in vitro utilisant un milieu conditionné à partir de cellules sénescentes

Résumé

Cette méthode étudie comment les fibroblastes cutanés sénescents affectent les fibroblastes sains. La sénescence est induite par exposition aux UVB, et le milieu conditionné est appliqué sur des fibroblastes normaux. Elle aide à évaluer les composés bioactifs ciblant la communication cellulaire modifiée dans le vieillissement cutané.

Résumé

Le vieillissement cutané est un processus multifactoriel entraîné par des altérations au niveau moléculaire et cellulaire, également appelées marques de vieillissement. L’une de ces modifications consiste en une communication intercellulaire altérée, qui contribue à la dysfonction des tissus cutanés et aux lésions structurelles. Ici, un modèle in vitro pour imiter ces caractéristiques du vieillissement cutané est présenté en incubant des fibroblastes sains avec un milieu conditionné à partir de fibroblastes sénéscents. Premièrement, les fibroblastes irradiés UVB peuvent être analysés pour détecter les changements d’expression génique associés au photovieillissement. Deuxièmement, un milieu conditionné à partir de fibroblastes sénéscents induits par UVB peut être prélevé et transféré à des fibroblastes sains, entraînant une régulation à la baisse des protéines de la matrice extracellulaire et une augmentation de l’expression génique des cytokines pro-inflammatoires. Ces changements sont contrecarrés par l’utilisation d’une nouvelle combinaison d’antioxydants (vitamine C + idébénone). Ces résultats démontrent que le modèle in vitro peut être utilisé pour évaluer l’efficacité de nouveaux composés sur les caractéristiques de vieillissement des cellules dermiques cutanées, et ainsi pour sélectionner des composés susceptibles de moduler les processus cellulaires de régénération et de rajeunissement de la peau.

Introduction

Le vieillissement cutané est le processus naturel de diminution des fonctions et propriétés cutanées, notamment la perte de fermeté et d’élasticité et l’augmentation du relâchement. Cela est accéléré par des facteurs externes, tels que l’exposition aux ultraviolets (UV) et la pollution, qui endommagent les cellules et provoquent des changements au niveau^{moléculaire 1}. Ces changements ont été bien caractérisés par des recherches récentes et identifiés comme des signes distinctifs du vieillissement, notamment l’instabilité génomique, l’attrition des télomères, les altérations épigénétiques, la perte de protéostasie, la macroautophagie défectueuse, la détection dérégulée des nutriments, les dysfonctions mitochondriales, la sénescence cellulaire, l’épuisement des cellules souches, la communication intercellulaire altérée, l’inflammation chronique et la^{dysbiose 2}. Ces caractéristiques expliquent comment les dommages subcellulaires se traduisent par un dysfonctionnement tissulaire, favorisant ainsi le vieillissement. Fait intéressant, ces altérations n’agissent pas indépendamment mais forment une signature interdépendante du réseau. Les dommages primaires, tels que les lésions génomiques ou les altérations épigénétiques, s’accumulent et provoquent finalement la sénescence cellulaire. Dans le cas de la peau, cela est principalement causé par des dommages causés par les UV, le photovieillissement étant le principal facteur contribuant aux traits de vieillissement^{cutané 3}. Les cellules sénécentes présentent une production accrue de cytokines pro-inflammatoires, de métalloprotéinases matricielles et de facteurs de croissance, également appelés phénotype sécrétaire associé à la sénescence (SASP) et incluant IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA ou IL1A, entre^{autres 4,5,6}. Ces facteurs sécrétés affectent non seulement les propriétés structurelles de la peau, telles que la matrice extracellulaire dermique, mais perturbent aussi la fonction des cellules environnantes. Cela inclut la libération de cytokines qui stimulent l’activation des mélanocytes pour provoquer une hyperpigmentation cutanée liée à l’âge (comme le facteur des cellules souches ou IL18) ou d’autres protéines nocives qui altèrent la fonction des fibroblastes sains environnants, compromettant leur fonction et contribuant à l’amplification accrue du phénotype^sénescent 7,8,9,10,11. En conséquence, l’inflammation chronique et la communication intercellulaire altérée sont des facteurs clés de l’état dommageable qui traduit ces altérations moléculaires en signes visuels de vieillissement cutané, tels que des rides, des affaissements, des taches d’âge ou une perte de fermeté.

Les protéines spécifiques contribuant aux effets néfastes du SASP peuvent être étudiés grâce à des techniques bien connues telles que le test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA), le Luminex, la réaction en chaîne quantitative en temps réel (qRT-PCR) ou le Western Blot, entre^{autres 5,12}. Cependant, cette approche est utile pour identifier des protéines spécifiques d’un point de vue individuel et caractériser un mécanisme d’action spécifique, mais elle ne prend pas en compte les effets du SASP complet sur les cellules voisines. Ici, un protocole in vitro est proposé pour étudier l’effet du SASP produit par les fibroblastes dermiques sénéscents induits par les UVB sur les fibroblastes voisins sains, imitant la caractéristique altérée de la communication intercellulaire liée au vieillissement. Comme indiqué précédemment, les UV sont le principal moteur de la sénescence cellulaire dans la peau. Ainsi, les dommages UV sont sélectionnés comme source de dommages plutôt que la sénescence réplicative ou induite par oncogène pour construire le modèle³ actuel. Pour cela, le milieu contenant les facteurs sécrétés par les fibroblastes sénéscents (milieu conditionné) est utilisé, et les marqueurs de fonction cellulaire sont quantifiés dans des fibroblastes sains incubés avec ce milieu. Selon ce protocole, une fois le milieu conditionné transféré des cellules sénescentes aux cellules saines, les fibroblastes sénéscents induits par UVB sont prélevés pour quantifier les caractéristiques moléculaires, telles que les gènes impliqués dans la signalisation pro-inflammatoire et paracrine. Ensuite, des fibroblastes sains traités avec un milieu conditionné à partir de fibroblastes sénéscents sont prélevés pour caractériser l’effet du SASP sur les cellules voisines, quantifiant les gènes impliqués dans la matrice extracellulaire, les facteurs de croissance et l’activation des fibroblastes. Ainsi, l’effet des composés d’intérêt (COI) est analysé initialement chez les fibroblastes sénescents puis chez les fibroblastes sains traités avec le milieu conditionné. Concernant ces composés, des recherches antérieures ont montré que les antioxydants sont efficaces pour protéger contre et corriger les signes du vieillissement cutané induit par le photovieillissement. Par conséquent, la combinaison de deux antioxydants (vitamine C et idébénone) est utilisée pour inverser certaines des altérations induites par les UVB, tant chez les cellules sénécentes que dans les cellules saines incubées avec un milieu conditionné à partir de cellules sénécentes 13,14,15

Dans l’ensemble, ce protocole est conçu pour étudier les effets du SASP sur les cellules cutanées et identifier de nouvelles molécules/interventions qui restaurent la communication intercellulaire modifiée, étant ainsi adaptés aux produits régénératifs et biostimulants en médecine esthétique et en dermatologie régénérative.

Protocole

Les fibroblastes dermiques humains utilisés dans cette étude ont été obtenus auprès d’un fournisseur commercial de lignées cellulaires. Comme aucun échantillon humain primaire, données de patients ou expériences in vivo n’a été impliqué, l’approbation du Conseil d’Éthique Institutionnelle (IRB) et le consentement éclairé n’étaient pas nécessaires pour cette étude.

1. Induction de sénescence dans les fibroblastes dermiques utilisant UVB

1. Placez des fibroblastes dermiques humains à une densité de 6 × 10⁴ cellules par puits dans une plaque à 6 puits en utilisant le Médium Eagle Modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec un sérum bovin fœtal à 10 % (FBS).
2. Après 24 heures, retirez le milieu de culture cellulaire et remplacez-le par 1 mL de solution saline tamponnée phosphate (PBS) par puits.
3. Irradiez les cellules avec une lumière UVB à 25 mJ/^cm2.
   REMARQUE : Cette énergie a été optimisée pour le dispositif d’irradiation UVB utilisé dans ce protocole (voir Tableau des matériaux) afin d’induire suffisamment de dommages pour déclencher la sénescence tout en évitant des dommages excessifs pouvant entraîner l’apoptose. Lorsque vous utilisez d’autres dispositifs, ajustez l’énergie d’irradiation en conséquence.
   ATTENTION : Les rayons UVB sont dangereux. Utilisez un équipement de protection et des protections appropriés pour éviter l’exposition.
4. Retirez le PBS et ajoutez 2 mL de milieu de culture cellulaire frais par puits.
5. Après 72 heures, retirez le milieu de culture cellulaire, ajoutez 1 mL de PBS par puits, et répétez l’irradiation UVB comme décrit à l’étape 1.3.
6. Après 72 heures, retirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez 0,5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % par puits. Incubez pendant 1 à 2 minutes à 37 °C, puis prélevez les cellules à l’aide de 1,5 mL de milieu de culture cellulaire frais.
7. Placez les cellules à une densité de 8 × 10⁴ cellules par puits dans une plaque à 6 puits à l’aide d’un milieu de culture cellulaire (DMEM complété avec 10 % de FBS). La sénescence cellulaire est induite après cette étape.

2. Traitement des cellules sénescentes avec des composés d’intérêt

1. Après 24 heures, retirez le milieu de culture cellulaire et ajoutez 2 mL de milieu de culture cellulaire contenant les composés d’intérêt.
2. Après 24 heures supplémentaires, placez un lot séparé de fibroblastes dermiques humains (comme décrit à l’étape 1.1) dans des plaques à 6 puits. Ces cellules serviront de fibroblastes dermiques sains pour le transfert d’un milieu conditionné.

3. Transfert conditionné du milieu des cellules sénécentes vers les cellules saines

1. À 48 h après un traitement composé des cellules sénescentes et 24 h après avoir placé les fibroblastes sains, on prélève 2 mL de milieu conditionné par puits à partir des cellules sénescentes et on les transfère aux fibroblastes sains.
   REMARQUE : Retirez immédiatement le milieu de culture des fibroblastes sains avant d’ajouter le milieu conditionné pour garantir un transfert efficace.
2. Ajoutez 1 mL de PBS aux cellules sénescentes et prélevez-les à l’aide de la trypsine comme décrit à l’étape 1.6. Utilisez ces cellules pour l’analyse des marqueurs de sénescence ou d’inflammation en utilisant un kit ELISA ou une qPCR.
   REMARQUE : Les granulés cellulaires peuvent être stockés à −80 °C si les tests en aval ne sont pas effectués immédiatement.
3. Incuber des fibroblastes sains recevant un milieu conditionné à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 heures.

4. Récolte des cellules saines pour l’activation des fibroblastes par analyse de l’expression génique

1. Après 24 heures d’incubation avec un milieu conditionné, prélèvez des fibroblastes sains à l’aide de la trypsine comme décrit à l’étape 1.6. Analysez l’expression génique de la matrice extracellulaire par qPCR.
2. Effectuez une analyse qPCR.
   1. Extraire l’ARN des granulés cellulaires selon les instructions du fabricant (kit d’extraction d’ARN).
   2. Effectuer la transcription inverse de 200 ng d’ARN selon les instructions du fabricant (kit de transcription inversée).
   3. Amplifier le cDNA selon les instructions du fabricant (mélange maître qPCR). Effectuer la qPCR dans les conditions suivantes : 95 °C pendant 30 s, suivi de 40 cycles de 95 °C pendant 5 s et 60 °C pendant 30 s. Les amorces utilisées sont listées dans le Tableau 1.

Gene	Séquence avant	Séquence inversée
CDKN2A	5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3'	5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3'
CDKN1A	5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3'	5'-CCAGGACTGCAGGCTTCCT-3'
SCF	5'-AATCCTCTCGTCAAAACTGAAGG-3'	5'-CCATCTCGCTTATCCAACAATGA-3'
IL-18	5'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3'	5'-GTTTGTTGCGAGAGGAAGCG-3'
ELN	5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAG-3'	5'-TGTAGGGCAGTCCATAGCCA-3'
FBN1	5'-GGTGAATGTACAAACACAGTCAGCAG-3'	5'-ATAGGAACAGAGCAGCTTGTTGA-3'
IL-6	5'-AGCCCTGAAAGGAGACATGTA-3'	5'-TCTGCCAGTGCCTCTTTGC-3'
IL-8	5'-ATTTCTGCAGCTGTGTGTGTGAAGGT-3'	5'-TTTTTTTATGAATTCTCAGCCCTCT-3'
CTGF	5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGTGT-3'	5'-TGTCTTCCAGTCGGTAGGCAGCTA-3
IGF1	5'-CAGAGCAGATAGAGCCTGCG-3'	5'-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3'

Tableau 1 : Liste des amorces utilisées pour les tests qPCR. Des séquences directes et inverses sont fournies pour chaque amorce correspondant aux gènes étudiés et quantifiés dans ce modèle.

Résultats

Le protocole actuel décrit une méthode pour simuler la marque altérée de la communication intercellulaire liée au vieillissement in vitro. La Figure 1 présente un schéma graphique illustrant les principales étapes du protocole, incluant l’induction de la sénescence, la quantification des marqueurs et l’analyse de la communication intercellulaire altérée dans les cellules cutanées in vitro.

Discussion

Comprendre le processus de vieillissement au niveau moléculaire est essentiel pour concevoir de nouvelles approches et interventions qui retardent les caractéristiques liées au vieillissement et prolongent la longévité et la fonctionnalité des cellules et des tissus. La définition et l’identification des caractéristiques du vieillissement ont été essentielles pour établir un cadre scientifique pour le développement de ces^{interventions 2,16}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
6-well plates	Fisher Scientific	10578911	Plaque de culture cellulaire multipuits à utiliser pendant le test (induction de la sénescence et traitement par composés)
Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (dispositif d'irradiation UVB)	Vilber Lourmat	VL-6111-1090-1	Dispositif utilisé pour produire des dommages par irradiation UVB et par conséquent induire la sénescence
Milieu de Dulbecco modifié de l'aigle (DMEM)	Merck Life science	D6046-500ML	Milieu de culture cellulaire standard pour les fibroblastes dermiques
Sérum bovin foetal (FBS)	Fisher Scientific	17593595	Supplément nutritionnel utilisé comme source de facteurs de croissance, d'hormones, de protéines et de micronutriments essentiels pour la croissance cellulaire
Kit ELISA H3K27me3	Epigentek	P-3014T-096	Un immunodosage spécifique pour détecter la modification épigénétique de H3K27me3 dans les échantillons biologiques
Fibroblastes dermiques humains	Promocell	C-12302	Cellule cutanée principale dans le derme et régulateur du photovieillissement cutané
Solution tampon phosphate (PBS)	Merck Life science	D8537-500ML	Solution tampon qui imite l'environnement physiologique. Utilisé pour laver les cellules sans induire de stress ou réduire la viabilité cellulaire
Kit PrimeScript RT réactif (kit de transcription inverse)	Takara Bio	RR037A	Le kit pour obtenir de l'ADNc à partir de l'ARN isolé des cellules. 2e étape pour l'essai qPCR après la purification de l'ARN.
TB Green Premix Ex Taq  (mélange master qPCR)	Takara Bio	RR420A	Le kit pour produire la réaction en chaîne par polymérase à partir de l'ADNc pour quantifier les niveaux d'expression génique. 3e étape pour l'essai qPCR après la transcription inverse.
Kit de purification totale d'ARN (kit d'extraction d'ARN)	Norgen	17200	Le kit pour obtenir l'ARN à partir des cellules récoltées. 1ère étape pour l'essai qPCR après la récolte des cellules.
Trypsine/EDTA 0,05%	Merck Life science	T2601-100ML	Solution enzymatique utilisée dans les étapes de récolte/passage pour le détachement des cellules des plaques de culture cellulaire