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Article de recherche

La propentofylline soulage l'hyperalgésie incisionnelle en régulant la phosphorylation d'ERK1/2 dans les astrocytes et la microglie spinale

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DOI :

10.3791/70927

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14 août 2026

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1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

Dans cet article

Résumé

Cette étude examine l'effet de la propentofylline administrée par voie intrathécale sur l'atténuation de l'hyperalgésie post-incisionnelle et détermine si cet effet est associé à des modifications des marqueurs gliaux médullaires et à la phosphorylation de la kinase régulée par un signal extracellulaire 1 et 2 chez le rat.

Résumé

Les astrocytes médullaires, la microglie et la kinase régulée par un signal extracellulaire 1 et 2 (ERK1/2) sont impliqués dans le traitement de la douleur. Cette étude a examiné si la propentofylline (PPF) intrathécale préopératoire atténue l'hyperalgésie aiguë post-incisionnelle chez le rat et si cet effet est associé à des marqueurs gliaux médullaires et à la phosphorylation de l'ERK1/2. Soixante-six rats mâles Sprague–Dawley ont été répartis aléatoirement en groupes témoin, douleur post-incisionnelle, solution saline normale, diméthylsulfoxyde, PPF et U0126. L'hyperalgésie mécanique et thermique a été évaluée au moment de la ligne de base et à 2, 4, 8, 24 et 72 h après l'incision. Les marqueurs neuronaux et gliaux médullaires, la p-ERK1/2 et les médiateurs inflammatoires ont été évalués par immunobuvardage et immunofluorescence. Des expériences sur des astrocytes médullaires primaires ont également été réalisées afin d'examiner la libération de médiateurs inflammatoires dépendante de l'ERK1/2. La PPF intrathécale préopératoire a atténué l'hyperalgésie mécanique et thermique tout au long de la période d'observation de 72 h, tandis que l'U0126 a atténué l'hyperalgésie principalement durant la phase précoce post-incisionnelle. À 4 h après l'incision, les deux traitements ont été associés à une diminution de l'expression médullaire de GFAP, d'Iba-1 et de p-ERK1/2, ainsi qu'à une réduction de l'immunoréactivité de TNF-α et de COX-2. Dans des astrocytes en culture, la PPF a réduit la libération de médiateurs inflammatoires induite par le LPS, tandis qu'une forme constitutivement active de l'ERK1/2 a atténué cet effet. Ces résultats soutiennent l'existence d'une association entre l'effet antihyperalgésique de la PPF et la modulation des réponses gliales médullaires, des réponses liées à l'ERK1/2 et des réponses inflammatoires après une incision.

Introduction

La douleur incisionnelle, un type courant de douleur aiguë après des interventions chirurgicales, ne persiste généralement pas plus de 7 jours, mais elle implique des mécanismes pathologiques complexes qui diffèrent de ceux de la douleur inflammatoire et de la douleur neuropathique1,2. Si la douleur incisionnelle n'est pas correctement contrôlée pendant sa phase de développement, elle peut évoluer vers un syndrome de douleur chronique, et sa nature peut passer d'une douleur liée à une lésion tissulaire aiguë à une douleur neuropathique ou mixte3. En général, l'administration d'analgésiques, tels que les opioïdes et les anti-inflammatoires non stéroïdiens, constitue la forme d'analgésie la plus courante après une incision. Toutefois, de nombreux effets secondaires peuvent survenir en cas d'utilisation continue ou à forte dose de ces médicaments, une situation qui souligne la nécessité de stratégies analgésiques plus sûres et plus efficaces.

Des preuves fiables indiquent que la propentofylline (PPF) atténue l'hyperalgésie dans divers processus douloureux4,5. En outre, l'effet analgésique de la PPF peut être partiellement obtenu par l'inhibition de l'expression médullaire des kinases activées par un facteur de croissance (MAPK), telles que p38 et les kinases N-terminales de c-Jun (JNK)6. Bien que les effets de la PPF sur les voies p38 et JNK soient établis, sa modulation potentielle de la voie de la kinase régulée par un signal extracellulaire 1 et 2 (ERK1/2), une autre sous-famille essentielle de MAPK impliquée dans la transmission de la douleur, reste inexplorée dans la douleur aiguë post-incisionnelle. Ce manque de connaissances est particulièrement important étant donné que l'activation d'ERK1/2 présente des profils temporels et cellulaires distincts par rapport à p38 et JNK, suggérant des opportunités thérapeutiques potentiellement uniques.

Les cellules gliales, incluant les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes, étaient initialement considérées comme la structure de connexion et de soutien du tissu nerveux. Toutefois, des études récentes ont montré que les astrocytes et les microglies jouent un rôle important dans la régulation de la plasticité synaptique et la transmission des informations douloureuses7. En tant que macrophages résidents du cerveau et de la moelle épinière, les microglies peuvent être activées par plusieurs signaux stimulateurs extracellulaires dès les premiers stades du processus douloureux, puis proliférer et libérer de grandes quantités de cytokines inflammatoires, ce qui augmente la conduction des signaux de douleur de la moelle épinière vers le cerveau8,9. Parallèlement, les astrocytes activés peuvent augmenter la libération du neurotransmetteur excitateur glutamate et transmettre directement des informations aux neurones sensoriels en renforçant la communication intercellulaire10.

Des études ont montré qu'une activation des astrocytes se produit au stade précoce (dans les 24 premières heures) de la douleur induite par incision, tandis que l'activation des microglies apparaît beaucoup plus tard11,12. De plus, une étude a indiqué que les microglies activées ont un effet limité sur l'hyperalgésie mécanique dans la douleur induite par incision13. Ces résultats soulèvent des questions persistantes concernant les rôles distincts des astrocytes et des microglies dans la douleur aiguë. La propentofylline, un agent modulant les cellules gliales, a été signalée comme atténuant l'hyperalgésie en régulant l'activation des astrocytes et des microglies après une lésion nerveuse chronique par constriction, une lésion nerveuse aiguë et une lésion tissulaire aiguë4,5. Toutefois, à la connaissance actuelle, aucune étude n'a examiné les effets de la PPF sur l'activation des astrocytes ou des microglies dans la douleur aiguë induite par incision.

La kinase régulée par les signaux extracellulaires 1 et 2 (ERK1/2), une sous-famille majeure des MAPK activée en aval de la kinase 1 et 2 activée par les mitogènes (MEK1/2), est largement impliquée dans le traitement des signaux nociceptifs et dans la plasticité neuronale14,15. Des études antérieures ont montré que l'ERK1/2 phosphorylé (p-ERK1/2) peut être induit dans les neurones spinaux par une stimulation nociceptive et peut également être détecté dans les astrocytes et les microglies lors d'états de douleur inflammatoire ou neuropathique16,17,18,19. De plus, l'inhibition pharmacologique de la voie de signalisation MEK1/2–ERK1/2 a été rapportée comme atténuant l'hyperalgésie mécanique et thermique dans plusieurs modèles de douleur20,21,22,23,24,25.

Cependant, la distribution cellulaire de l'ERK1/2 médullaire, en particulier dans les astrocytes et les microglies, activée par une incision aiguë, ainsi que son rôle dans la douleur induite par l'incision restent insuffisamment définis. Des études antérieures menées par le groupe de recherche indiquent que le PPF atténue l'hyperalgésie aiguë post-incisionnelle chez le rat en réduisant la signalisation médullaire de la JNK et de la p38, mais il n'est pas clair si le PPF module également la signalisation liée à l'ERK1/2 dans les cellules gliales médullaires durant la douleur induite par incision. Ainsi, la présente étude doit être considérée comme une extension des cadres existants concernant les cellules gliales et les MAPK dans la recherche sur la douleur, plutôt que comme un paradigme mécanistique entièrement indépendant. Sa principale distinction par rapport aux travaux antérieurs réside dans son accent mis spécifiquement sur la douleur aiguë post-incisionnelle, dans l'étude de l'ERK1/2 plutôt que de la p38/JNK comme composante des MAPK d'intérêt, et dans l'évaluation de la distribution cellulaire médullaire précoce de la p-ERK1/2 en relation avec le traitement par le PPF.

Cette étude a été conçue pour déterminer si l'administration intrathécale préopératoire de PPF atténue l'hyperalgésie post-incisionnelle dans un modèle de section plantaire chez le rat, et si cet effet est associé à la phosphorylation de ERK1/2 ou à des modifications de l'expression de marqueurs neuronaux et gliaux médullaires ainsi que de médiateurs inflammatoires, notamment le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) et la cyclooxygénase-2 (COX-2). Plus précisément, cette étude se distingue des travaux antérieurs par la combinaison d'une évaluation comportementale avec une analyse temporelle par immunobuvardage ; par sa comparaison pharmacologique avec l'inhibiteur de MEK1/2, U0126 ; et par la localisation qualitative par immunofluorescence de p-ERK1/2 dans les neurones médullaires, les astrocytes et les microglies, dans le cadre d'un modèle de douleur aiguë post-incisionnelle. Bien que son cadre mécanistique s'appuie sur des publications antérieures reliant la modulation gliale et la signalisation MAPK à la douleur, ce travail vise à fournir des preuves supplémentaires en faveur d'une implication possible des réponses gliales liées à ERK1/2 médullaire lors de la phase initiale de l'hyperalgésie post-incisionnelle.

Par rapport aux analgésiques postopératoires classiques, les approches ciblant des voies spécifiques permettent de tester un composant défini de la signalisation, mais peuvent offrir un bénéfice limité dans le temps et nécessiter une administration invasive ; l'inhibition de MEK1/2–ERK1/2 a montré des effets antihyperalgésiques dans plusieurs modèles expérimentaux de douleur20,21,22,23,24,25. Le PPF se distingue d’un inhibiteur ciblant une seule voie par sa modulation des réponses gliales et son implication dans plusieurs processus associés aux MAPK4,5,6. La traduction pratique reste limitée par la conception préclinique, l'administration intrathécale préopératoire, l'utilisation exclusive de rats mâles, ainsi que par l'absence d'études de dosage et de sécurité dans des modèles chirurgicaux plus grands.

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Protocole

Les expériences réalisées ont été approuvées par le comité d'éthique du Deuxième hôpital affilié de l'Université de Lanzhou, province du Gansu, Chine (numéro d'approbation éthique 2017-070). Toutes les procédures ont suivi les directives de l'Association internationale pour l'étude de la douleur26. Un total de 66 rats mâles adultes Sprague–Dawley provenant d'un centre agréé d'animaux de laboratoire et pesant entre 200 et 250 g ont été utilisés. Seuls des rats mâles ont été inclus dans cette étude afin de réduire les variations potentielles liées aux influences hormonales dépendant du sexe. Tous les protocoles ont été réalisés conformément aux directives de l'Association internationale pour l'étude de la douleur26, et tous les efforts nécessaires pour minimiser les souffrances ont été mis en œuvre. Des informations détaillées sur les réactifs, consommables, instruments et logiciels utilisés dans cette étude sont fournies dans le Tableau des matériaux.

Animaux

Les rats étaient logés par paires avant l'opération et individuellement après l'incision, avec nourriture et eau ad libitum. La pièce était maintenue sous un cycle lumineux de 12 heures d'obscurité et 12 heures de lumière, et la température était régulée à 24 °C ± 2 °C.

Modèle de douleur incisionnelle et d'injection intrathécale

Pour l'administration intrathécale de solutions, les rats ont été anesthésiés avec du sévoflurane à 1,5 %–3 % (administré par un embout nasal) et placés en position ventrale avec la colonne vertébrale fléchie. Le pelage de la région lombaire a été rasé, et la peau recouvrant l'espace intervertébral L5–L6 a été désinfectée. Une microseringue a été insérée percutanément au niveau de l'espace intervertébral L5–L6. L'entrée réussie dans l'espace sous-arachnoïdien était indiquée par un brusque mouvement de la queue ou un tressautement de la queue lors de l'avancement de l'aiguille, et confirmée en outre par l'apparition de liquide céphalorachidien lors d'une aspiration douce. Si ces signes n'étaient pas observés, la position de l'aiguille était ajustée avant l'injection. L'injection n'était effectuée qu'après que les deux critères de confirmation avaient été satisfaits, et les animaux présentant des signes neurologiques anormaux après l'injection étaient exclus. La solution respective était ensuite injectée lentement, et la peau était de nouveau nettoyée après l'injection. La procédure chirurgicale durait environ 3 min, et les rats reprenaient généralement conscience entre 5 et 10 min après l'anesthésie.

Le modèle de douleur post-incisionnelle chez le rat a été établi comme décrit précédemment27. Après anesthésie, la surface plantaire de la patte postérieure a été désinfectée avec de la povidone–iode à 10 %. Une incision longitudinale de 1 cm a été pratiquée dans la peau plantaire, à environ 0,5 cm du talon et s'étendant vers les orteils. L'incision traversait la peau et la fascia. Le muscle plantaire a été délicatement soulevé à l’aide d’une pince ophtalmique et incisé longitudinalement tout en préservant la continuité tissulaire globale. Le muscle a ensuite été remis en place, une pression douce a été appliquée pour obtenir l’hémostase, et la plaie a été fermée par deux points de suture en nylon 3-0. Le site d’incision a été désinfecté à nouveau après la fermeture. Après l’intervention, les rats ont été logés individuellement et laissés se remettre dans un environnement calme et chaud, protégés de la lumière vive et avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les animaux ont été surveillés après l’opération, et ceux ne répondant pas aux critères prédéfinis ont été exclus rapidement. Une infection de la plaie était déterminée par la présence de rougeur, d’œdème et d’augmentation de la température locale autour de la plaie, d’un exsudat purulent anormal de couleur jaune-vert et malodorant, d’un retard de cicatrisation avec persistance de l’ouverture de la plaie, de nécrose et d’élargissement, ainsi que de signes systémiques incluant une élévation de la température corporelle, de la léthargie et un refus de s’alimenter. D'autres critères d'exclusion comprenaient l’absence de réveil de l’anesthésie dans les 30 minutes, une section musculaire ou une lésion neurovasculaire peropératoire, une automutilation postopératoire, un échec de l’établissement du modèle et des déficits neurologiques tels qu’une paralysie des membres postérieurs ou une incapacité à supporter le poids du corps non liée à la douleur post-incisionnelle. Les rats présentant une infection ou une déhiscence de la plaie ont été exclus de l’étude.

Mesure du comportement

Le seuil mécanique de retrait de la patte (PWMT) et la latence thermique de retrait de la patte (PWTL) ont été mesurés par un investigateur aveugle à l'affectation des groupes. Les tests ont été réalisés dans une pièce calme, à heure fixe chaque jour, après au moins 10 minutes d'acclimatation ; l'enceinte, le sol en treillis ou en verre, l'éclairement ambiant et l'intensité de la source de chaleur ont été maintenus constants entre les groupes. Pour le test du PWMT, des filaments de von Frey étalonnés (0,4 g, 0,6 g, 1,0 g, 1,4 g, 2,0 g, 4,0 g, 6,0 g, 8,0 g, 10,0 g et 15,0 g) ont été appliqués perpendiculairement à la surface plantaire adjacente à la plaie jusqu'à ce que le filament fléchisse d'environ 1 à 2 mm. Les stimulations consécutives étaient espacées de 2 minutes, et le seuil de retrait à 50 % (PWMT) a été déterminé selon la méthode ascendante-descendante28. Pour le test du PWTL, les rats ont été placés dans des enceintes transparentes individuelles sur un sol en verre, et la source de chaleur radiante a été alignée avec la surface plantaire située à côté de la plaie. Un seuil de coupure à 30 s a été appliqué pour éviter toute lésion tissulaire, les expositions consécutives étaient espacées de 2 minutes, et la moyenne de trois mesures a été enregistrée29. Le retrait de la patte, son agitation ou son léchage ont été considérés comme une réponse positive de retrait ; les essais affectés par le toilettage, la locomotion ou une perte d'alignement de la source de chaleur ont été répétés après une nouvelle acclimatation.

Analyse par immunobuvardage

Aux moments prédéfinis, les rats ont été euthanasiés par dislocation cervicale, et la moelle épinière lombaire L4–L6 a été rapidement prélevée dans un tampon de lyse pour essai d'immunoprécipitation radio-immunologique enrichi d'un inhibiteur de protéase dans un rapport de 100:1. Les tissus ont été homogénéisés, maintenus sur glace pendant 20 min, puis centrifugés à 15 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Le surnageant a été mélangé avec un tampon de charge 4× dans un rapport de 3:1, chauffé 5 min dans de l'eau bouillante, puis stocké à −80 °C. Des échantillons protéiques (30 µg par piste) ont été séparés sur des gels de dodecyl sulfate de sodium–polyacrylamide à 10 % et transférés sur des membranes de fluorure de polyvinylidène de 0,45 ou 0,22 µm. Le transfert réussi a été vérifié en confirmant la migration attendue du marqueur de poids moléculaire pré-étiqueté et l'absence de zones de transfert inégales ou interrompues évidentes. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé et 3 % d'albumine sérique bovine pendant 2 h à température ambiante, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre NeuN (1:8 000), GFAP (1:4 000), Iba-1 (1:3 000), p-ERK1/2 (1:1 000), t-ERK1/2 (1:3 000) ou GAPDH (1:2 000). Après lavage dans du tampon salin au Tris contenant 0,05 % de Tween 20 (pH 7,4), les membranes ont été incubées avec l'anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort correspondant (1:5 000) pendant 1 h à température ambiante. Les signaux ont été révélés par chimiluminescence améliorée et enregistrés sur film en utilisant la même plage d'exposition pour chaque cible. Un investigateur aveugle concernant l'affectation aux groupes a analysé la densité des bandes à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image. Les images ont été converties en niveaux de gris 8 bits, une région rectangulaire identique d'intérêt a été appliquée à chaque bande, le fond local provenant d'une région adjacente vide a été soustrait, et la densité intégrée a été enregistrée. La même taille de région et la même procédure de fond ont été utilisées pour toutes les pistes d'un même immunoblot. NeuN, GFAP, Iba-1 et t-ERK1/2 ont été normalisés à GAPDH ; p-ERK1/2 a été normalisé à t-ERK1/2 ; puis les valeurs ont été exprimées relativement au groupe témoin.

Immunofluorescence

Aux moments prédéfinis, les rats ont été anesthésiés avec du pentobarbital sodique à 3 % (1,5 mL/kg) et perfusés par le cœur avec 300 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) prérefroidie à 0,01 mol/L (pH 7,4), suivie de 250 mL de paraformaldéhyde à 4 % prérefroidi. La moelle épinière L4–L6 a été post-fixée dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 6 h, protégée contre la congélation toute la nuit dans du PBS contenant 20 % à 30 % de saccharose à 4 °C, puis coupée en sections de 10 µm à −22 °C. Les sections ont été lavées dans du PBS à 0,01 mol/L, bloquées dans un sérum de chèvre à 10 % pendant 1 h à température ambiante, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre NeuN (1:100), GFAP (1:1 000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) ou COX-2 (1:50). Après trois lavages au PBS, les sections ont été incubées avec l'anticorps secondaire marqué par un fluorophore vert ou rouge correspondant (1:400) pendant 1 h à température ambiante, lavées trois fois supplémentaires au PBS, puis montées dans un milieu antifade sous une lamelle. Des sections de contrôle négatif traitées sans anticorps primaire ont été incluses dans chaque série de coloration. Les images ont été acquises par un investigateur en aveugle à l’aide d’un microscope à fluorescence. Des images d’ensemble à faible grossissement ont été obtenues à l’aide d’un objectif 10×, tandis que les images d’immunoréactivité cellulaire et de co-localisation ont été acquises à l’aide d’objectifs 20× ou 40× selon le panneau de la figure correspondant. Pour les comparaisons au sein de la même figure et de la même série de coloration, le grossissement de l’objectif, l’intensité d’éclairage, le temps d’exposition, le gain du détecteur, les réglages de la caméra et les paramètres de traitement d’image ont été fixés après optimisation en dessous du seuil de saturation. Les canaux de fluorescence distincts ont été acquis séquentiellement afin de minimiser le recouvrement des canaux. Trois champs non superposés de la corne dorsale homolatérale ont été capturés par animal. L’intensité de fluorescence a été quantifiée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image après conversion en 8 bits, soustraction du fond utilisant une région sans cellules, et application d’une région d’intérêt et d’un seuil identiques au sein de chaque série de coloration ; les valeurs des champs ont été moyennées pour obtenir une valeur par animal. Les champs présentant une surexposition, un pli du tissu, une déchirure, un mauvais focus ou un fond irrégulier ont été exclus et réacquis avec les mêmes réglages non saturants. La coloration a été validée lorsque l’architecture tissulaire était intacte, que le signal cible dépassait celui du contrôle sans anticorps primaire, et qu’aucun pli majeur, déchirure ou région saturée n’affectait l’analyse.

In vitro expériences sur des astrocytes spinaux primaires

Des astrocytes primaires de moelle épinière de rat ont été cultivés dans des conditions stériles standard dans un milieu de culture complet à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO2. Les cellules ont été utilisées lorsqu'elles atteignaient une confluence d'environ 70 à 80 % et ont été réparties en groupes contrôle, stimulés par le LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 et groupe de récupération ERK1/2. Le PPF et l'U0126 ont été ajoutés à 10 µM. La stimulation par le LPS, le traitement par les médicaments et les conditions de récolte ont été maintenus identiques dans les puits parallèles de chaque expérience. Pour l'analyse de la spécificité de la voie, des lysats cellulaires ont été recueillis afin de réaliser un immunoblotting pour p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, p38 total, p-JNK, JNK total et le contrôle de chargement correspondant. Les surnageants de culture provenant de puits parallèles ont été recueillis, clarifiés par centrifugation et analysés pour la TNF-α, le PGE2 et l'IL-6 par dosage immunoenzymatique selon les instructions du fabricant. La densitométrie des immunoblottings a suivi les mêmes principes d'analyse d'image décrits précédemment. Pour les expériences de récupération, l'ERK1/2 endogène a été inhibée par transfection d'ARNi, et un vecteur d'expression d'ERK1/2 constitutivement actif (CA-ERK1/2) a été introduit avant le traitement. L'efficacité de l'extinction et de la surexpression a été confirmée par immunoblotting avant l'interprétation des données sur les cytokines. Les cellules exposées au réactif de transfection sans ARNi actif ni vecteur ont servi de témoins procéduraux lorsque cela était applicable.

Conception expérimentale

Sous-groupement des animaux d'expérience

Les rats ont été répartis en six groupes à l'aide d'une table de nombres aléatoires, et l'attribution aux groupes a été effectuée avant les tests comportementaux et la collecte de tissus. Les six groupes comprenaient un groupe témoin (n = 6), un groupe de douleur incisionnelle (IP) (n = 18), un groupe de sérum physiologique (NS) (NS à 0,9 %, 10 µL ; n = 9), un groupe PPF (10 µg dans 10 µL ; n = 12), un groupe de diméthylsulfoxyde (DMSO) (DMSO à 10 %, 10 µL ; n = 9) et un groupe U0126 (10 µg dans 10 µL ; n = 12). Les rats du groupe témoin n'ont subi ni incision plantaire ni injection intrathécale et ont servi de témoins non traités. Les rats du groupe IP ont subi une incision plantaire sans prétraitement par injection intrathécale. Les rats des groupes NS, PPF, DMSO et U0126 ont reçu une administration intrathécale de leurs agents respectifs 30 min avant l'incision plantaire. Le groupe NS a servi de témoin véhicule pour le PPF, tandis que le groupe DMSO a servi de témoin véhicule pour l'U0126.

Doses de propentofylline et de U0126

La propentofylline est un modulateur glial, et une dose de 10 µg a été choisie car elle avait atténué l'hyperalgésie aiguë dans des études antérieures menées par le groupe de recherche. U0126 est un inhibiteur non compétitif de la MEK1/2 vis-à-vis de l'adénosine triphosphate, utilisé pour bloquer la phosphorylation de l'ERK1/2. Des doses intrathécales efficaces comprises entre 1 et 10 µg ont été rapportées dans divers modèles de douleur30,31,32 ; la dose de 10 µg a été utilisée dans la présente étude. U0126 a été dissous dans 10 % de diméthylsulfoxyde, tandis que PPF a été dissous dans une solution saline normale à 0,9 %. Les concentrations finales étaient de 1 µg/µL. Les médicaments et leurs véhicules ont été préparés avant la chirurgie, conservés à 4 °C et utilisés dans les 12 heures suivant leur préparation.

Effet de l'administration intrathécale préopératoire de propentofylline ou d'U0126 sur l'hyperalgésie

Six rats de chaque groupe ont été sélectionnés aléatoirement pour la mesure comportementale 24 h avant l'opération, et les seuils de réponse mécanique (PWMT) et thermique (PWTL) obtenus ont été désignés comme valeurs de base. Des injections intrathécales ont été administrées 30 min avant l'opération. Afin d'évaluer les effets de l'administration intrathécale préopératoire de PPF et d'U0126 sur l'hyperalgésie mécanique et thermique, les PWMT et les PWTL ont été mesurés à 2 h, 4 h, 8 h, 24 h et 72 h après l'incision.

Conception expérimentale pour évaluer les effets de la propentofylline ou de l'U0126 administrés par voie intrathécale avant l'intervention chirurgicale sur l'expression des marqueurs neuronaux et gliaux dans la moelle épinière après incision

Pour déterminer le moment post-incision approprié pour l'évaluation de l'effet du traitement, une analyse préliminaire en fonction du temps a d'abord été réalisée dans le groupe IP. Plus précisément, les rats du groupe IP ont été euthanasiés à 2 h, 4 h, 24 h et 72 h après l'incision, et les niveaux d'expression des marqueurs cellulaires NeuN, GFAP et Iba-1 dans la moelle épinière ont été mesurés par immunobuvardage (Western blot) (n = 3 par point temporel). D'après cette analyse préliminaire, les 4 premières heures suivant l'incision ont été choisies comme fenêtre d'observation précoce, car l'expression de NeuN atteignait son niveau maximal au point temporel de 4 h et parce que les modifications moléculaires précoces étaient considérées comme les plus pertinentes pour le développement initial de l'hyperalgésie post-incisionnelle. Toutefois, le point temporel de 4 h n'était pas destiné à représenter l'ensemble des modifications moléculaires temporelles après l'incision.

À ce point temporel sélectionné, les rats ayant reçu une injection intrathécale ont été euthanasiés afin d'effectuer une analyse par immunobuvardage de différents marqueurs cellulaires (n = 3 par groupe) et une évaluation en immunofluorescence de la morphologie de différents types cellulaires (n = 3 par groupe). Dans le groupe témoin, les rats ont été sacrifiés aléatoirement afin de déterminer les niveaux de base d'expression de divers marqueurs cellulaires (NeuN, GFAP et Iba-1) dans la moelle épinière par immunobuvardage (n = 3) ainsi que la morphologie des différentes cellules (neurones, astrocytes et microglies) par immunofluorescence (n = 3). Ainsi, le groupe témoin a servi de contrôle de référence non incisé et non traité.

Effets du traitement sur la protéine ERK1/2 phosphorylée au niveau de la moelle épinière et sur les médiateurs de l'inflammation

Afin de déterminer le moment post-incision approprié pour évaluer les effets du traitement sur l'expression de p-ERK1/2 et les niveaux de cytokines inflammatoires, une analyse préliminaire en fonction du temps a d'abord été réalisée dans le groupe IP. Plus précisément, les rats du groupe IP ont été euthanasiés à 2 h, 4 h, 24 h et 72 h après l'incision, et l'expression de p-ERK1/2 dans la moelle épinière a été mesurée par immunobuvardage (n = 3 par point temporel). Sur la base de cette expérience cinétique, ainsi que du moment où l'expression de NeuN était maximale après l'incision, le délai de 4 h après l'incision a été retenu comme point temporel fixe pour l'évaluation ultérieure des effets de l'administration intrathécale préopératoire de PPF ou d'U0126 sur l'expression de p-ERK1/2 et les cytokines inflammatoires au niveau médullaire. Ce moment a été choisi comme une fenêtre d'observation mécanistique précoce, et non comme une représentation exhaustive de l'ensemble des modifications temporelles post-incision.

À ce point temporel sélectionné, les rats ayant reçu une injection intrathécale ont été euthanasiés afin d'analyser l'expression de p-ERK1/2 par immunobuvardage (n = 3 par groupe) et d'évaluer les cytokines inflammatoires par immunofluorescence (n = 3 par groupe). Dans le groupe témoin, les rats ont été sacrifiés aléatoirement afin de déterminer les niveaux basaux d'expression de p-ERK1/2 dans la moelle épinière par immunobuvardage (n = 3) et des cytokines inflammatoires (TNF-α et COX-2) par immunofluorescence (n = 3). Ainsi, le groupe témoin a servi de contrôle de référence non incisé et non traité.

Localisation cellulaire de la p-ERK1/2 rachidienne dans les neurones, les astrocytes et les microglies

Afin d'évaluer davantage la distribution cellulaire de la p-ERK1/2 spinale après incision, une coloration par immunofluorescence a été réalisée dans les groupes Témoin et IP à 4 h après l'incision (n = 3).

Analyse statistique

Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. La taille de l'échantillon a été déterminée en se référant à des études antérieures du groupe de recherche et à des expériences préliminaires. Les données comportementales ont été analysées par une analyse de variance (ANOVA) à deux facteurs avec mesures répétées, le groupe étant le facteur inter-sujets et le temps le facteur intra-sujets. Les données de western blot en fonction du temps ont été évaluées par une ANOVA à un facteur suivie de comparaisons par paires ajustées selon Bonferroni. Les données de western blot et d'immunofluorescence à temps fixe ont été évaluées par une ANOVA à un facteur avec comparaisons planifiées ajustées selon Bonferroni ; les comparaisons entre deux groupes ont été évaluées par le test t de Student. La normalité et l'homogénéité des variances ont été évaluées respectivement à l'aide des tests de Shapiro–Wilk et de Levene. Une valeur p bilatérale < 0,05 a été considérée comme significative. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel d'analyse statistique indiqué dans le Tableau des matériaux. Pour les expériences sur les astrocytes in vitro, des expériences de culture indépendantes ont été prises comme unité d'analyse ; la densitométrie des western blot et les concentrations en cytokines ont été comparées à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie de comparaisons planifiées ajustées selon Bonferroni ou du test t de Student pour des comparaisons préspécifiées entre deux groupes, selon le cas.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :

Les données appuyant les résultats de cette étude sont fournies dans le Fichier supplémentaire 1.

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Résultats

Les effets de l'incision et de l'administration intrathécale préopératoire de propentofylline ou d'U0126 sur l'hyperalgésie après incision

Hyperalgésie mécanique

Il n'y avait aucune différence significative des seuils de mécanonociception post-opératoires (PWMT) entre les six groupes à 24 h avant l'opération (p > 0,05 ; Figure 1A,B). Dans le groupe IP, le PWMT a diminué après l'inci...

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Discussion

La plupart des patients souffrent de douleur aiguë après une chirurgie, non seulement sur le plan physique, mais parfois aussi sur le plan mental33, bien que les mécanismes détaillés de la douleur postopératoire aiguë restent encore mal compris. Aux effets puissants des médicaments analgésiques s'ajoutent leurs effets indésirables inévitables, ce qui rend essentielle l'exploration d'analgésiques plus sûrs et efficaces. Cette étude s'appuyait sur un modèle rat de douleur postopératoire aiguë par in...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun conflit d'intérêts personnel, financier, commercial ou académique.

Remerciements

Les auteurs remercient Haijiao Zhou et Ming Wang pour leur soutien technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tampon PBS 0,01 MSolarbioP1020
Tampon Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)SolarbioT1020
Tampon Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)SolarbioT1010
Dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 %SolarbioS1010
Solution mère TBST 10×SolarbioT1081
Acrylamide à 30 %SolarbioA1010
Tampon de chargement des protéines 4×SolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
Persulfate d'ammoniumSolarbioA1030
Machine automatique à glace en floconsChangshu XuekeIMS-40
Albumine sérique bovine (BSA)SolarbioA8020
Cryostat CM150LeicaCM150
pH-mètre numérique—PHS-3C
Diméthylsulfoxyde (DMSO)SolarbioD8371
Balance analytique électroniqueCany—
Réactif de chimiluminescence amplifiée (ECL)SolarbioPE0010
PelliculeKodak—
Microscope à fluorescence DP71OlympusDP71
Milieu d'inclusion pour coupes congeléesSakura4583
Appareil d'électrophorèse sur gelBIO-RAD—
GlycérolSolarbioIG0910
GlycineSolarbioG8200
Anticorps secondaire marqué Alexa Fluor 594 anti-souris provenant de chèvreProteintechSA00013-3
Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase anti-souris provenant de chèvreZSGB-BIOZB2305
Anticorps secondaire marqué Alexa Fluor 488 anti-lapin provenant de chèvreProteintechSA00013-2
Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase anti-lapin provenant de chèvreZSGB-BIOZB2301
Sérum de chèvreSolarbioSL038
GraphPad PrismGraphPad Software5
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse 3K15Sigma3K15
Agitateur orbital horizontal TS-1000Haimen QilinbeierTS-1000
ImageJNational Institutes of Health1.51j8
MéthanolTianjin Guangfu—
Anticorps primaire anti-rat GAPDH de sourisProteintech60004-1-Ig
Anticorps primaire anti-rat p-ERK1/2 de sourisCST9101S
Na2HPO3Tianjin Beichen Fangzheng—
NaH2PO3Tianjin Damao—
ParaformaldéhydeBiosharpBL539A
Lames de microscope de qualité histopathologiqueShitai—
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)BeyotimeST506
Test plantaire 37370UGO BASILE37370
Mébrane de fluorure de polyvinylidèneSolarbio—
Propentofylline (PPF)TaosuT19812
Anticorps primaire anti-rat COX-2 de lapinAbcamAb179800
Anticorps primaire anti-rat GFAP de lapinProteintech16825-1-AP
Anticorps primaire anti-rat Iba-1 de lapinProteintech10904-1-AP
Anticorps primaire anti-rat NeuN de lapinAbcamAb279297
Anticorps primaire anti-rat t-ERK1/2 de lapinProteintech11257-1-AP
Anticorps primaire anti-rat TNF-α de lapinProteintech29652-1-AP
Tampon de lyse RIPASolarbioR0010
SDSSolarbioS8010
Poudre de lait écréméSolarbioD8340
SPSSIBM22
Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
Triton X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
Congélateur à ultra-basse températureHaier—
Congélateur à ultra-basse températureSanyo—
Système de purification d'eau ultrapureHeal Force—
Filaments de von FreyNorth Coast Medical—

Références

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