La propentofylline soulage l'hyperalgésie incisionnelle en régulant la phosphorylation d'ERK1/2 dans les astrocytes et la microglie spinale

Résumé

Cette étude examine l'effet de la propentofylline administrée par voie intrathécale sur l'atténuation de l'hyperalgésie post-incisionnelle et détermine si cet effet est associé à des modifications des marqueurs gliaux médullaires et à la phosphorylation de la kinase régulée par un signal extracellulaire 1 et 2 chez le rat.

Résumé

Les astrocytes médullaires, la microglie et la kinase régulée par un signal extracellulaire 1 et 2 (ERK1/2) sont impliqués dans le traitement de la douleur. Cette étude a examiné si la propentofylline (PPF) intrathécale préopératoire atténue l'hyperalgésie aiguë post-incisionnelle chez le rat et si cet effet est associé à des marqueurs gliaux médullaires et à la phosphorylation de l'ERK1/2. Soixante-six rats mâles Sprague–Dawley ont été répartis aléatoirement en groupes témoin, douleur post-incisionnelle, solution saline normale, diméthylsulfoxyde, PPF et U0126. L'hyperalgésie mécanique et thermique a été évaluée au moment de la ligne de base et à 2, 4, 8, 24 et 72 h après l'incision. Les marqueurs neuronaux et gliaux médullaires, la p-ERK1/2 et les médiateurs inflammatoires ont été évalués par immunobuvardage et immunofluorescence. Des expériences sur des astrocytes médullaires primaires ont également été réalisées afin d'examiner la libération de médiateurs inflammatoires dépendante de l'ERK1/2. La PPF intrathécale préopératoire a atténué l'hyperalgésie mécanique et thermique tout au long de la période d'observation de 72 h, tandis que l'U0126 a atténué l'hyperalgésie principalement durant la phase précoce post-incisionnelle. À 4 h après l'incision, les deux traitements ont été associés à une diminution de l'expression médullaire de GFAP, d'Iba-1 et de p-ERK1/2, ainsi qu'à une réduction de l'immunoréactivité de TNF-α et de COX-2. Dans des astrocytes en culture, la PPF a réduit la libération de médiateurs inflammatoires induite par le LPS, tandis qu'une forme constitutivement active de l'ERK1/2 a atténué cet effet. Ces résultats soutiennent l'existence d'une association entre l'effet antihyperalgésique de la PPF et la modulation des réponses gliales médullaires, des réponses liées à l'ERK1/2 et des réponses inflammatoires après une incision.

Introduction

La douleur incisionnelle, un type courant de douleur aiguë après des interventions chirurgicales, ne persiste généralement pas plus de 7 jours, mais elle implique des mécanismes pathologiques complexes qui diffèrent de ceux de la douleur inflammatoire et de la douleur neuropathique^1,2. Si la douleur incisionnelle n'est pas correctement contrôlée pendant sa phase de développement, elle peut évoluer vers un syndrome de douleur chronique, et sa nature peut passer d'une douleur liée à une lésion tissulaire aiguë à une douleur neuropathique ou mixte³. En général, l'administration d'analgésiques, tels que les opioïdes et les anti-inflammatoires non stéroïdiens, constitue la forme d'analgésie la plus courante après une incision. Toutefois, de nombreux effets secondaires peuvent survenir en cas d'utilisation continue ou à forte dose de ces médicaments, une situation qui souligne la nécessité de stratégies analgésiques plus sûres et plus efficaces.

Des preuves fiables indiquent que la propentofylline (PPF) atténue l'hyperalgésie dans divers processus douloureux^4,5. En outre, l'effet analgésique de la PPF peut être partiellement obtenu par l'inhibition de l'expression médullaire des kinases activées par un facteur de croissance (MAPK), telles que p38 et les kinases N-terminales de c-Jun (JNK)⁶. Bien que les effets de la PPF sur les voies p38 et JNK soient établis, sa modulation potentielle de la voie de la kinase régulée par un signal extracellulaire 1 et 2 (ERK1/2), une autre sous-famille essentielle de MAPK impliquée dans la transmission de la douleur, reste inexplorée dans la douleur aiguë post-incisionnelle. Ce manque de connaissances est particulièrement important étant donné que l'activation d'ERK1/2 présente des profils temporels et cellulaires distincts par rapport à p38 et JNK, suggérant des opportunités thérapeutiques potentiellement uniques.

Les cellules gliales, incluant les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes, étaient initialement considérées comme la structure de connexion et de soutien du tissu nerveux. Toutefois, des études récentes ont montré que les astrocytes et les microglies jouent un rôle important dans la régulation de la plasticité synaptique et la transmission des informations douloureuses⁷. En tant que macrophages résidents du cerveau et de la moelle épinière, les microglies peuvent être activées par plusieurs signaux stimulateurs extracellulaires dès les premiers stades du processus douloureux, puis proliférer et libérer de grandes quantités de cytokines inflammatoires, ce qui augmente la conduction des signaux de douleur de la moelle épinière vers le cerveau^8,9. Parallèlement, les astrocytes activés peuvent augmenter la libération du neurotransmetteur excitateur glutamate et transmettre directement des informations aux neurones sensoriels en renforçant la communication intercellulaire¹⁰.

Des études ont montré qu'une activation des astrocytes se produit au stade précoce (dans les 24 premières heures) de la douleur induite par incision, tandis que l'activation des microglies apparaît beaucoup plus tard^11,12. De plus, une étude a indiqué que les microglies activées ont un effet limité sur l'hyperalgésie mécanique dans la douleur induite par incision¹³. Ces résultats soulèvent des questions persistantes concernant les rôles distincts des astrocytes et des microglies dans la douleur aiguë. La propentofylline, un agent modulant les cellules gliales, a été signalée comme atténuant l'hyperalgésie en régulant l'activation des astrocytes et des microglies après une lésion nerveuse chronique par constriction, une lésion nerveuse aiguë et une lésion tissulaire aiguë^4,5. Toutefois, à la connaissance actuelle, aucune étude n'a examiné les effets de la PPF sur l'activation des astrocytes ou des microglies dans la douleur aiguë induite par incision.

La kinase régulée par les signaux extracellulaires 1 et 2 (ERK1/2), une sous-famille majeure des MAPK activée en aval de la kinase 1 et 2 activée par les mitogènes (MEK1/2), est largement impliquée dans le traitement des signaux nociceptifs et dans la plasticité neuronale^14,15. Des études antérieures ont montré que l'ERK1/2 phosphorylé (p-ERK1/2) peut être induit dans les neurones spinaux par une stimulation nociceptive et peut également être détecté dans les astrocytes et les microglies lors d'états de douleur inflammatoire ou neuropathique^16,17,18,19. De plus, l'inhibition pharmacologique de la voie de signalisation MEK1/2–ERK1/2 a été rapportée comme atténuant l'hyperalgésie mécanique et thermique dans plusieurs modèles de douleur^{20,21,22,23,24,25}.

Cependant, la distribution cellulaire de l'ERK1/2 médullaire, en particulier dans les astrocytes et les microglies, activée par une incision aiguë, ainsi que son rôle dans la douleur induite par l'incision restent insuffisamment définis. Des études antérieures menées par le groupe de recherche indiquent que le PPF atténue l'hyperalgésie aiguë post-incisionnelle chez le rat en réduisant la signalisation médullaire de la JNK et de la p38, mais il n'est pas clair si le PPF module également la signalisation liée à l'ERK1/2 dans les cellules gliales médullaires durant la douleur induite par incision. Ainsi, la présente étude doit être considérée comme une extension des cadres existants concernant les cellules gliales et les MAPK dans la recherche sur la douleur, plutôt que comme un paradigme mécanistique entièrement indépendant. Sa principale distinction par rapport aux travaux antérieurs réside dans son accent mis spécifiquement sur la douleur aiguë post-incisionnelle, dans l'étude de l'ERK1/2 plutôt que de la p38/JNK comme composante des MAPK d'intérêt, et dans l'évaluation de la distribution cellulaire médullaire précoce de la p-ERK1/2 en relation avec le traitement par le PPF.

Cette étude a été conçue pour déterminer si l'administration intrathécale préopératoire de PPF atténue l'hyperalgésie post-incisionnelle dans un modèle de section plantaire chez le rat, et si cet effet est associé à la phosphorylation de ERK1/2 ou à des modifications de l'expression de marqueurs neuronaux et gliaux médullaires ainsi que de médiateurs inflammatoires, notamment le facteur de nécrose tumorale-α (TNF-α) et la cyclooxygénase-2 (COX-2). Plus précisément, cette étude se distingue des travaux antérieurs par la combinaison d'une évaluation comportementale avec une analyse temporelle par immunobuvardage ; par sa comparaison pharmacologique avec l'inhibiteur de MEK1/2, U0126 ; et par la localisation qualitative par immunofluorescence de p-ERK1/2 dans les neurones médullaires, les astrocytes et les microglies, dans le cadre d'un modèle de douleur aiguë post-incisionnelle. Bien que son cadre mécanistique s'appuie sur des publications antérieures reliant la modulation gliale et la signalisation MAPK à la douleur, ce travail vise à fournir des preuves supplémentaires en faveur d'une implication possible des réponses gliales liées à ERK1/2 médullaire lors de la phase initiale de l'hyperalgésie post-incisionnelle.

Par rapport aux analgésiques postopératoires classiques, les approches ciblant des voies spécifiques permettent de tester un composant défini de la signalisation, mais peuvent offrir un bénéfice limité dans le temps et nécessiter une administration invasive ; l'inhibition de MEK1/2–ERK1/2 a montré des effets antihyperalgésiques dans plusieurs modèles expérimentaux de douleur^{20,21,22,23,24,25}. Le PPF se distingue d’un inhibiteur ciblant une seule voie par sa modulation des réponses gliales et son implication dans plusieurs processus associés aux MAPK^4,5,6. La traduction pratique reste limitée par la conception préclinique, l'administration intrathécale préopératoire, l'utilisation exclusive de rats mâles, ainsi que par l'absence d'études de dosage et de sécurité dans des modèles chirurgicaux plus grands.

Protocole

Les expériences réalisées ont été approuvées par le comité d'éthique du Deuxième hôpital affilié de l'Université de Lanzhou, province du Gansu, Chine (numéro d'approbation éthique 2017-070). Toutes les procédures ont suivi les directives de l'Association internationale pour l'étude de la douleur²⁶. Un total de 66 rats mâles adultes Sprague–Dawley provenant d'un centre agréé d'animaux de laboratoire et pesant entre 200 et 250 g ont été utilisés. Seuls des rats mâles ont été inclus dans cette étude afin de réduire les variations potentielles liées aux influences hormonales dépendant du sexe. Tous les protocoles ont été réalisés conformément aux directives de l'Association internationale pour l'étude de la douleur²⁶, et tous les efforts nécessaires pour minimiser les souffrances ont été mis en œuvre. Des informations détaillées sur les réactifs, consommables, instruments et logiciels utilisés dans cette étude sont fournies dans le Tableau des matériaux.

Animaux

Les rats étaient logés par paires avant l'opération et individuellement après l'incision, avec nourriture et eau ad libitum. La pièce était maintenue sous un cycle lumineux de 12 heures d'obscurité et 12 heures de lumière, et la température était régulée à 24 °C ± 2 °C.

Modèle de douleur incisionnelle et d'injection intrathécale

Pour l'administration intrathécale de solutions, les rats ont été anesthésiés avec du sévoflurane à 1,5 %–3 % (administré par un embout nasal) et placés en position ventrale avec la colonne vertébrale fléchie. Le pelage de la région lombaire a été rasé, et la peau recouvrant l'espace intervertébral L5–L6 a été désinfectée. Une microseringue a été insérée percutanément au niveau de l'espace intervertébral L5–L6. L'entrée réussie dans l'espace sous-arachnoïdien était indiquée par un brusque mouvement de la queue ou un tressautement de la queue lors de l'avancement de l'aiguille, et confirmée en outre par l'apparition de liquide céphalorachidien lors d'une aspiration douce. Si ces signes n'étaient pas observés, la position de l'aiguille était ajustée avant l'injection. L'injection n'était effectuée qu'après que les deux critères de confirmation avaient été satisfaits, et les animaux présentant des signes neurologiques anormaux après l'injection étaient exclus. La solution respective était ensuite injectée lentement, et la peau était de nouveau nettoyée après l'injection. La procédure chirurgicale durait environ 3 min, et les rats reprenaient généralement conscience entre 5 et 10 min après l'anesthésie.

Le modèle de douleur post-incisionnelle chez le rat a été établi comme décrit précédemment²⁷. Après anesthésie, la surface plantaire de la patte postérieure a été désinfectée avec de la povidone–iode à 10 %. Une incision longitudinale de 1 cm a été pratiquée dans la peau plantaire, à environ 0,5 cm du talon et s'étendant vers les orteils. L'incision traversait la peau et la fascia. Le muscle plantaire a été délicatement soulevé à l’aide d’une pince ophtalmique et incisé longitudinalement tout en préservant la continuité tissulaire globale. Le muscle a ensuite été remis en place, une pression douce a été appliquée pour obtenir l’hémostase, et la plaie a été fermée par deux points de suture en nylon 3-0. Le site d’incision a été désinfecté à nouveau après la fermeture. Après l’intervention, les rats ont été logés individuellement et laissés se remettre dans un environnement calme et chaud, protégés de la lumière vive et avec un accès libre à la nourriture et à l’eau. Les animaux ont été surveillés après l’opération, et ceux ne répondant pas aux critères prédéfinis ont été exclus rapidement. Une infection de la plaie était déterminée par la présence de rougeur, d’œdème et d’augmentation de la température locale autour de la plaie, d’un exsudat purulent anormal de couleur jaune-vert et malodorant, d’un retard de cicatrisation avec persistance de l’ouverture de la plaie, de nécrose et d’élargissement, ainsi que de signes systémiques incluant une élévation de la température corporelle, de la léthargie et un refus de s’alimenter. D'autres critères d'exclusion comprenaient l’absence de réveil de l’anesthésie dans les 30 minutes, une section musculaire ou une lésion neurovasculaire peropératoire, une automutilation postopératoire, un échec de l’établissement du modèle et des déficits neurologiques tels qu’une paralysie des membres postérieurs ou une incapacité à supporter le poids du corps non liée à la douleur post-incisionnelle. Les rats présentant une infection ou une déhiscence de la plaie ont été exclus de l’étude.

Mesure du comportement

Le seuil mécanique de retrait de la patte (PWMT) et la latence thermique de retrait de la patte (PWTL) ont été mesurés par un investigateur aveugle à l'affectation des groupes. Les tests ont été réalisés dans une pièce calme, à heure fixe chaque jour, après au moins 10 minutes d'acclimatation ; l'enceinte, le sol en treillis ou en verre, l'éclairement ambiant et l'intensité de la source de chaleur ont été maintenus constants entre les groupes. Pour le test du PWMT, des filaments de von Frey étalonnés (0,4 g, 0,6 g, 1,0 g, 1,4 g, 2,0 g, 4,0 g, 6,0 g, 8,0 g, 10,0 g et 15,0 g) ont été appliqués perpendiculairement à la surface plantaire adjacente à la plaie jusqu'à ce que le filament fléchisse d'environ 1 à 2 mm. Les stimulations consécutives étaient espacées de 2 minutes, et le seuil de retrait à 50 % (PWMT) a été déterminé selon la méthode ascendante-descendante²⁸. Pour le test du PWTL, les rats ont été placés dans des enceintes transparentes individuelles sur un sol en verre, et la source de chaleur radiante a été alignée avec la surface plantaire située à côté de la plaie. Un seuil de coupure à 30 s a été appliqué pour éviter toute lésion tissulaire, les expositions consécutives étaient espacées de 2 minutes, et la moyenne de trois mesures a été enregistrée²⁹. Le retrait de la patte, son agitation ou son léchage ont été considérés comme une réponse positive de retrait ; les essais affectés par le toilettage, la locomotion ou une perte d'alignement de la source de chaleur ont été répétés après une nouvelle acclimatation.

Analyse par immunobuvardage

Aux moments prédéfinis, les rats ont été euthanasiés par dislocation cervicale, et la moelle épinière lombaire L4–L6 a été rapidement prélevée dans un tampon de lyse pour essai d'immunoprécipitation radio-immunologique enrichi d'un inhibiteur de protéase dans un rapport de 100:1. Les tissus ont été homogénéisés, maintenus sur glace pendant 20 min, puis centrifugés à 15 000 × g pendant 20 min à 4 °C. Le surnageant a été mélangé avec un tampon de charge 4× dans un rapport de 3:1, chauffé 5 min dans de l'eau bouillante, puis stocké à −80 °C. Des échantillons protéiques (30 µg par piste) ont été séparés sur des gels de dodecyl sulfate de sodium–polyacrylamide à 10 % et transférés sur des membranes de fluorure de polyvinylidène de 0,45 ou 0,22 µm. Le transfert réussi a été vérifié en confirmant la migration attendue du marqueur de poids moléculaire pré-étiqueté et l'absence de zones de transfert inégales ou interrompues évidentes. Les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé et 3 % d'albumine sérique bovine pendant 2 h à température ambiante, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre NeuN (1:8 000), GFAP (1:4 000), Iba-1 (1:3 000), p-ERK1/2 (1:1 000), t-ERK1/2 (1:3 000) ou GAPDH (1:2 000). Après lavage dans du tampon salin au Tris contenant 0,05 % de Tween 20 (pH 7,4), les membranes ont été incubées avec l'anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort correspondant (1:5 000) pendant 1 h à température ambiante. Les signaux ont été révélés par chimiluminescence améliorée et enregistrés sur film en utilisant la même plage d'exposition pour chaque cible. Un investigateur aveugle concernant l'affectation aux groupes a analysé la densité des bandes à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image. Les images ont été converties en niveaux de gris 8 bits, une région rectangulaire identique d'intérêt a été appliquée à chaque bande, le fond local provenant d'une région adjacente vide a été soustrait, et la densité intégrée a été enregistrée. La même taille de région et la même procédure de fond ont été utilisées pour toutes les pistes d'un même immunoblot. NeuN, GFAP, Iba-1 et t-ERK1/2 ont été normalisés à GAPDH ; p-ERK1/2 a été normalisé à t-ERK1/2 ; puis les valeurs ont été exprimées relativement au groupe témoin.

Immunofluorescence

Aux moments prédéfinis, les rats ont été anesthésiés avec du pentobarbital sodique à 3 % (1,5 mL/kg) et perfusés par le cœur avec 300 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) prérefroidie à 0,01 mol/L (pH 7,4), suivie de 250 mL de paraformaldéhyde à 4 % prérefroidi. La moelle épinière L4–L6 a été post-fixée dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 6 h, protégée contre la congélation toute la nuit dans du PBS contenant 20 % à 30 % de saccharose à 4 °C, puis coupée en sections de 10 µm à −22 °C. Les sections ont été lavées dans du PBS à 0,01 mol/L, bloquées dans un sérum de chèvre à 10 % pendant 1 h à température ambiante, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dirigés contre NeuN (1:100), GFAP (1:1 000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) ou COX-2 (1:50). Après trois lavages au PBS, les sections ont été incubées avec l'anticorps secondaire marqué par un fluorophore vert ou rouge correspondant (1:400) pendant 1 h à température ambiante, lavées trois fois supplémentaires au PBS, puis montées dans un milieu antifade sous une lamelle. Des sections de contrôle négatif traitées sans anticorps primaire ont été incluses dans chaque série de coloration. Les images ont été acquises par un investigateur en aveugle à l’aide d’un microscope à fluorescence. Des images d’ensemble à faible grossissement ont été obtenues à l’aide d’un objectif 10×, tandis que les images d’immunoréactivité cellulaire et de co-localisation ont été acquises à l’aide d’objectifs 20× ou 40× selon le panneau de la figure correspondant. Pour les comparaisons au sein de la même figure et de la même série de coloration, le grossissement de l’objectif, l’intensité d’éclairage, le temps d’exposition, le gain du détecteur, les réglages de la caméra et les paramètres de traitement d’image ont été fixés après optimisation en dessous du seuil de saturation. Les canaux de fluorescence distincts ont été acquis séquentiellement afin de minimiser le recouvrement des canaux. Trois champs non superposés de la corne dorsale homolatérale ont été capturés par animal. L’intensité de fluorescence a été quantifiée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image après conversion en 8 bits, soustraction du fond utilisant une région sans cellules, et application d’une région d’intérêt et d’un seuil identiques au sein de chaque série de coloration ; les valeurs des champs ont été moyennées pour obtenir une valeur par animal. Les champs présentant une surexposition, un pli du tissu, une déchirure, un mauvais focus ou un fond irrégulier ont été exclus et réacquis avec les mêmes réglages non saturants. La coloration a été validée lorsque l’architecture tissulaire était intacte, que le signal cible dépassait celui du contrôle sans anticorps primaire, et qu’aucun pli majeur, déchirure ou région saturée n’affectait l’analyse.

In vitro expériences sur des astrocytes spinaux primaires

Des astrocytes primaires de moelle épinière de rat ont été cultivés dans des conditions stériles standard dans un milieu de culture complet à 37 °C dans un incubateur humidifié avec 5 % de CO₂. Les cellules ont été utilisées lorsqu'elles atteignaient une confluence d'environ 70 à 80 % et ont été réparties en groupes contrôle, stimulés par le LPS, LPS + PPF, LPS + U0126 et groupe de récupération ERK1/2. Le PPF et l'U0126 ont été ajoutés à 10 µM. La stimulation par le LPS, le traitement par les médicaments et les conditions de récolte ont été maintenus identiques dans les puits parallèles de chaque expérience. Pour l'analyse de la spécificité de la voie, des lysats cellulaires ont été recueillis afin de réaliser un immunoblotting pour p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, p38 total, p-JNK, JNK total et le contrôle de chargement correspondant. Les surnageants de culture provenant de puits parallèles ont été recueillis, clarifiés par centrifugation et analysés pour la TNF-α, le PGE2 et l'IL-6 par dosage immunoenzymatique selon les instructions du fabricant. La densitométrie des immunoblottings a suivi les mêmes principes d'analyse d'image décrits précédemment. Pour les expériences de récupération, l'ERK1/2 endogène a été inhibée par transfection d'ARNi, et un vecteur d'expression d'ERK1/2 constitutivement actif (CA-ERK1/2) a été introduit avant le traitement. L'efficacité de l'extinction et de la surexpression a été confirmée par immunoblotting avant l'interprétation des données sur les cytokines. Les cellules exposées au réactif de transfection sans ARNi actif ni vecteur ont servi de témoins procéduraux lorsque cela était applicable.

Conception expérimentale

Sous-groupement des animaux d'expérience

Les rats ont été répartis en six groupes à l'aide d'une table de nombres aléatoires, et l'attribution aux groupes a été effectuée avant les tests comportementaux et la collecte de tissus. Les six groupes comprenaient un groupe témoin (n = 6), un groupe de douleur incisionnelle (IP) (n = 18), un groupe de sérum physiologique (NS) (NS à 0,9 %, 10 µL ; n = 9), un groupe PPF (10 µg dans 10 µL ; n = 12), un groupe de diméthylsulfoxyde (DMSO) (DMSO à 10 %, 10 µL ; n = 9) et un groupe U0126 (10 µg dans 10 µL ; n = 12). Les rats du groupe témoin n'ont subi ni incision plantaire ni injection intrathécale et ont servi de témoins non traités. Les rats du groupe IP ont subi une incision plantaire sans prétraitement par injection intrathécale. Les rats des groupes NS, PPF, DMSO et U0126 ont reçu une administration intrathécale de leurs agents respectifs 30 min avant l'incision plantaire. Le groupe NS a servi de témoin véhicule pour le PPF, tandis que le groupe DMSO a servi de témoin véhicule pour l'U0126.

Doses de propentofylline et de U0126

La propentofylline est un modulateur glial, et une dose de 10 µg a été choisie car elle avait atténué l'hyperalgésie aiguë dans des études antérieures menées par le groupe de recherche. U0126 est un inhibiteur non compétitif de la MEK1/2 vis-à-vis de l'adénosine triphosphate, utilisé pour bloquer la phosphorylation de l'ERK1/2. Des doses intrathécales efficaces comprises entre 1 et 10 µg ont été rapportées dans divers modèles de douleur^30,31,32 ; la dose de 10 µg a été utilisée dans la présente étude. U0126 a été dissous dans 10 % de diméthylsulfoxyde, tandis que PPF a été dissous dans une solution saline normale à 0,9 %. Les concentrations finales étaient de 1 µg/µL. Les médicaments et leurs véhicules ont été préparés avant la chirurgie, conservés à 4 °C et utilisés dans les 12 heures suivant leur préparation.

Effet de l'administration intrathécale préopératoire de propentofylline ou d'U0126 sur l'hyperalgésie

Six rats de chaque groupe ont été sélectionnés aléatoirement pour la mesure comportementale 24 h avant l'opération, et les seuils de réponse mécanique (PWMT) et thermique (PWTL) obtenus ont été désignés comme valeurs de base. Des injections intrathécales ont été administrées 30 min avant l'opération. Afin d'évaluer les effets de l'administration intrathécale préopératoire de PPF et d'U0126 sur l'hyperalgésie mécanique et thermique, les PWMT et les PWTL ont été mesurés à 2 h, 4 h, 8 h, 24 h et 72 h après l'incision.

Conception expérimentale pour évaluer les effets de la propentofylline ou de l'U0126 administrés par voie intrathécale avant l'intervention chirurgicale sur l'expression des marqueurs neuronaux et gliaux dans la moelle épinière après incision

Pour déterminer le moment post-incision approprié pour l'évaluation de l'effet du traitement, une analyse préliminaire en fonction du temps a d'abord été réalisée dans le groupe IP. Plus précisément, les rats du groupe IP ont été euthanasiés à 2 h, 4 h, 24 h et 72 h après l'incision, et les niveaux d'expression des marqueurs cellulaires NeuN, GFAP et Iba-1 dans la moelle épinière ont été mesurés par immunobuvardage (Western blot) (n = 3 par point temporel). D'après cette analyse préliminaire, les 4 premières heures suivant l'incision ont été choisies comme fenêtre d'observation précoce, car l'expression de NeuN atteignait son niveau maximal au point temporel de 4 h et parce que les modifications moléculaires précoces étaient considérées comme les plus pertinentes pour le développement initial de l'hyperalgésie post-incisionnelle. Toutefois, le point temporel de 4 h n'était pas destiné à représenter l'ensemble des modifications moléculaires temporelles après l'incision.

À ce point temporel sélectionné, les rats ayant reçu une injection intrathécale ont été euthanasiés afin d'effectuer une analyse par immunobuvardage de différents marqueurs cellulaires (n = 3 par groupe) et une évaluation en immunofluorescence de la morphologie de différents types cellulaires (n = 3 par groupe). Dans le groupe témoin, les rats ont été sacrifiés aléatoirement afin de déterminer les niveaux de base d'expression de divers marqueurs cellulaires (NeuN, GFAP et Iba-1) dans la moelle épinière par immunobuvardage (n = 3) ainsi que la morphologie des différentes cellules (neurones, astrocytes et microglies) par immunofluorescence (n = 3). Ainsi, le groupe témoin a servi de contrôle de référence non incisé et non traité.

Effets du traitement sur la protéine ERK1/2 phosphorylée au niveau de la moelle épinière et sur les médiateurs de l'inflammation

Afin de déterminer le moment post-incision approprié pour évaluer les effets du traitement sur l'expression de p-ERK1/2 et les niveaux de cytokines inflammatoires, une analyse préliminaire en fonction du temps a d'abord été réalisée dans le groupe IP. Plus précisément, les rats du groupe IP ont été euthanasiés à 2 h, 4 h, 24 h et 72 h après l'incision, et l'expression de p-ERK1/2 dans la moelle épinière a été mesurée par immunobuvardage (n = 3 par point temporel). Sur la base de cette expérience cinétique, ainsi que du moment où l'expression de NeuN était maximale après l'incision, le délai de 4 h après l'incision a été retenu comme point temporel fixe pour l'évaluation ultérieure des effets de l'administration intrathécale préopératoire de PPF ou d'U0126 sur l'expression de p-ERK1/2 et les cytokines inflammatoires au niveau médullaire. Ce moment a été choisi comme une fenêtre d'observation mécanistique précoce, et non comme une représentation exhaustive de l'ensemble des modifications temporelles post-incision.

À ce point temporel sélectionné, les rats ayant reçu une injection intrathécale ont été euthanasiés afin d'analyser l'expression de p-ERK1/2 par immunobuvardage (n = 3 par groupe) et d'évaluer les cytokines inflammatoires par immunofluorescence (n = 3 par groupe). Dans le groupe témoin, les rats ont été sacrifiés aléatoirement afin de déterminer les niveaux basaux d'expression de p-ERK1/2 dans la moelle épinière par immunobuvardage (n = 3) et des cytokines inflammatoires (TNF-α et COX-2) par immunofluorescence (n = 3). Ainsi, le groupe témoin a servi de contrôle de référence non incisé et non traité.

Localisation cellulaire de la p-ERK1/2 rachidienne dans les neurones, les astrocytes et les microglies

Afin d'évaluer davantage la distribution cellulaire de la p-ERK1/2 spinale après incision, une coloration par immunofluorescence a été réalisée dans les groupes Témoin et IP à 4 h après l'incision (n = 3).

Analyse statistique

Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. La taille de l'échantillon a été déterminée en se référant à des études antérieures du groupe de recherche et à des expériences préliminaires. Les données comportementales ont été analysées par une analyse de variance (ANOVA) à deux facteurs avec mesures répétées, le groupe étant le facteur inter-sujets et le temps le facteur intra-sujets. Les données de western blot en fonction du temps ont été évaluées par une ANOVA à un facteur suivie de comparaisons par paires ajustées selon Bonferroni. Les données de western blot et d'immunofluorescence à temps fixe ont été évaluées par une ANOVA à un facteur avec comparaisons planifiées ajustées selon Bonferroni ; les comparaisons entre deux groupes ont été évaluées par le test t de Student. La normalité et l'homogénéité des variances ont été évaluées respectivement à l'aide des tests de Shapiro–Wilk et de Levene. Une valeur p bilatérale < 0,05 a été considérée comme significative. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide du logiciel d'analyse statistique indiqué dans le Tableau des matériaux. Pour les expériences sur les astrocytes in vitro, des expériences de culture indépendantes ont été prises comme unité d'analyse ; la densitométrie des western blot et les concentrations en cytokines ont été comparées à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie de comparaisons planifiées ajustées selon Bonferroni ou du test t de Student pour des comparaisons préspécifiées entre deux groupes, selon le cas.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :

Les données appuyant les résultats de cette étude sont fournies dans le Fichier supplémentaire 1.

Résultats

Les effets de l'incision et de l'administration intrathécale préopératoire de propentofylline ou d'U0126 sur l'hyperalgésie après l'incision

Hyperalgésie mécanique

Il n'y avait aucune différence significative des seuils de mécanonociception plantaires (PWMT) entre les six groupes à 24 h avant l'opération (p > 0,05; Figure 1A,B). Dans le groupe IP, le PWMT a diminué après l'incision et est resté significativement inférieur au seuil de base de 2 h à 72 h après l'incision (p < 0,05 par rapport au niveau de base; Figure 1A). Dans les groupes NS et DMSO, aucune différence significative des PWMT n'a été observée entre les différents temps après l'incision (p > 0,05 par rapport au groupe IP; Figure 1B). Dans le groupe PPF, le PWMT était significativement plus élevé que dans le groupe IP de 2 h à 72 h après l'incision (p < 0,05 par rapport au groupe IP; Figure 1A), et à 72 h après l'incision, il n'était plus significativement différent du niveau de base (p > 0,05 par rapport au niveau de base; Figure 1A). Dans le groupe U0126, les PWMT étaient significativement plus élevés que dans le groupe IP durant les 24 premières heures après l'incision (p < 0,05 par rapport au groupe IP; Figure 1A), mais cet effet n'était plus maintenu à 72 h après l'incision, moment où le PWMT restait significativement inférieur au niveau de base et n'était plus significativement différent de celui du groupe IP (p < 0,05 par rapport au niveau de base; p > 0,05 par rapport au groupe IP; Figure 1A).

Hyperalgésie thermique

Il n'y avait pas de différences significatives entre les seuils de douleur plantaire (PWTL) des six groupes à 24 h avant l'opération (p > 0.05; Figure 1C, D). Dans le groupe IP, le PWTL a diminué de 24,85 s ± de 1,06 s avant l'opération à 4,38 s ± 1,02 s à 4 h après l'incision, puis augmentation partielle à 18,37 s ± 1,38 s à 72 h après l'incision, mais est resté significativement inférieur au niveau de base pendant toute la période d'observation (p < 0.05 contre ligne de base Figure 1C). Dans les groupes NS et DMSO, aucune différence significative des seuils de latence au retrait de la patte (PWTL) n'a été observée entre les différents temps suivant l'incision (p > 0.05 contre le groupe d'IP ; Figure 1D). Dans le groupe PPF, le DLAP a été significativement plus élevé que dans le groupe IP tout au long de la période d'observation de 72 heures (p < 0,05 par rapport au groupe IP ; Figure 1C) et 72 h après l'incision, il était revenu à un niveau qui ne différait pas de manière significative de la valeur de base (p > 0,05 par rapport à la ligne de base ; Figure 1C). Dans le groupe U0126, la durée de la réponse à la douleur (PWTL) était significativement plus élevée que dans le groupe IP au cours des 24 premières heures suivant l'incision (p < 0,05 par rapport au groupe IP ; Figure 1C); cet effet n'était plus observé 72 h après l'incision, moment où le seuil de retrait au stimulus douloureux (PWTL) restait significativement inférieur à la valeur de base mais n'était plus significativement différent de celui du groupe IP (p < 0,05 par rapport à la ligne de base ; p > 0,05 par rapport au groupe IP ; Figure 1C).

Analyse par immunoblot de l'évolution temporelle de l'expression des marqueurs cellulaires médullaires et de la phosphorylation de la kinase régulée par les signaux extracellulaires 1 et 2 après une incision

Plusieurs bandes ont été identifiées aux poids moléculaires exacts avec un anticorps spécifique sur les membranes en PVDF, notamment NeuN (48 et 50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD ; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD ; t-ERK2 = 42 kD) et GAPDH (36 kD). La bande GAPDH a été utilisée comme témoin pour NeuN, GFAP, Iba-1 et t-ERK1/2, et la bande t-ERK1/2 a été utilisée comme témoin pour p-ERK1/2.

Les données de western blot provenant des moelles épinières du groupe IP ont montré des augmentations de degrés variables après l'incision (Figure 2A). L'expression de la protéine nucléaire spécifique des neurones a atteint sa valeur maximale 4 h après l'incision (p < 0,001 par rapport à la ligne de base ; Figure 2A) et est restée significativement élevée 72 h après l'incision (p < 0,001 par rapport à la ligne de base ; Figure 2A). Les niveaux de la protéine acide fibrillaire gliale ont augmenté progressivement au cours de la période d'observation de 72 h (p < 0,001 par rapport à la ligne de base ; Figure 2A), avec la concentration la plus élevée observée à 72 h parmi les différents points temporels mesurés. De même, Iba-1 a également atteint un niveau significativement accru 4 h après l'incision (p < 0,001 par rapport à la ligne de base ; Figure 2A) et a fluctué dans une plage étroite. Notamment, les données de western blot provenant des moelles épinières du groupe IP ont montré que l'activation d'ERK1/2 n'a augmenté que durant les 24 premières heures après l'incision (p < 0,05 par rapport à la ligne de base ; Figure 2B) mais a diminué à 72 h après l'incision (p < 0,05 par rapport à la ligne de base ; Figure 2B), tandis que l'expression de t-ERK/2 n'a montré aucun changement significatif à aucun moment.

Analyse par immunotransfert des effets de l'administration intrathécale préopératoire de propentofylline ou d'U0126 sur l'expression de marqueurs cellulaires et de l'extracellular signal-regulated kinase phosphorylée 1 et 2 dans la moelle épinière

Les données de western blot ont montré que l'expression de NeuN atteignait son niveau maximal 4 h après l'incision, moment auquel la mesure comportementale était à son seuil le plus bas. Par conséquent, les effets sur l'expression des marqueurs cellulaires et la phosphorylation de ERK1/2 induits par la PPF et l'U0126 administrés par voie intrathécale 30 min avant l'opération ont été évalués 4 h après l'incision.

Les données de western blot ont montré que, par rapport au groupe témoin, l'expression médullaire de tous les marqueurs cellulaires était significativement augmentée dans le groupe IP à 4 h après l'incision (p < 0,05 par rapport à la ligne de base ; Figure 3). Par rapport au groupe IP, l'administration intrathécale préopératoire de PPF a réduit l'expression médullaire de NeuN (p < 0,05 vs le groupe IP ; Figure 3A), de GFAP (p < 0,05 vs le groupe IP ; Figure 3B) et d'Iba-1 (p < 0,01 vs le groupe IP ; Figure 3C). Par rapport au groupe IP, l'administration intrathécale préopératoire d'U0126 a également réduit l'expression médullaire de NeuN (p < 0,01 vs le groupe IP ; Figure 3D), de GFAP (p < 0,05 vs le groupe IP ; Figure 3E) et d'Iba-1 (p < 0,01 vs le groupe IP ; Figure 3F). Toutefois, par rapport au groupe témoin, l'expression de NeuN dans le groupe PPF restait significativement plus élevée que la ligne de base (p < 0,01 vs la ligne de base ; Figure 3A), tandis que l'expression de NeuN dans le groupe U0126 était significativement inférieure à celle du groupe témoin (p < 0,01 vs la ligne de base ; Figure 3D). Pour GFAP et Iba-1, le texte met désormais l'accent sur la comparaison avec le groupe IP, comme indiqué dans Figure 3. L'administration intrathécale préopératoire de NS et de DMSO n'a eu aucun effet significatif sur l'expression de marqueurs cellulaires.

Les données de western blot ont montré que l'expression de t-ERK1/2 dans la moelle épinière ne différait pas de manière significative entre les groupes Témoin, IP, NS et PPF à 4 h après l'incision (Figure 4A). En revanche, par rapport au groupe témoin, l'expression de p-ERK1/2 a été significativement augmentée dans les groupes IP et NS à 4 h après l'incision (p < 0,001 par rapport au groupe témoin ; Figure 4B). Par rapport au groupe IP, l'administration préopératoire intrathécale de PPF a significativement réduit l'expression de p-ERK1/2 à 4 h après l'incision (p < 0.001 contre le groupe d'IP ; Figure 4B). Par rapport au groupe NS, l'expression de p-ERK1/2 dans le groupe PPF était également significativement plus faible (p < 0.01 contre le groupe NS ; Figure 4B). Toutefois, par rapport au groupe témoin, l'expression de p-ERK1/2 dans le groupe PPF est restée significativement élevée 4 h après l'incision. De même, l'expression médullaire de t-ERK1/2 ne différait pas de manière significative entre les groupes Témoin, IP, DMSO et U0126 à 4 h après l'incision (Figure 4C). Par rapport au groupe témoin, l'expression de p-ERK1/2 a été significativement augmentée dans les groupes IP et DMSO à 4 h après l'incision (p < 0.001 contre le groupe témoin ; Figure 4D). Par rapport au groupe IP, l'administration intrathécale préopératoire d'U0126 a significativement réduit l'expression de p-ERK1/2 (p < 0.001 contre le groupe IP ; Figure 4D). Par rapport au groupe DMSO, l'expression de p-ERK1/2 dans le groupe U0126 était également significativement plus faible (p < 0,001 par rapport au groupe DMSO ; Figure 4D). Notamment, par rapport au groupe témoin, l'expression de p-ERK1/2 dans le groupe U0126 ne différait pas significativement de celle du groupe témoin à 4 h après l'incision. Un prétraitement par NS ou DMSO n'a pas eu d'effet significatif sur l'expression de p-ERK1/2 par rapport au groupe IP.

Observations en immunofluorescence des marqueurs cellulaires de la moelle épinière et des médiateurs inflammatoires

Les résultats de l'immunofluorescence ont montré qualitativement une immunoréactivité NeuN plus forte dans la corne dorsale homolatérale à 4 h après l'incision, comparée au côté controlatéral (Figure 5). Dans le groupe témoin, des images représentatives ont montré une immunoréactivité de base pour NeuN, GFAP et Iba-1 dans la corne dorsale médullaire homolatérale (Figure 6A–C). Dans le groupe IP, l'immunoréactivité NeuN était qualitativement plus forte que dans le groupe témoin (Figure 6D vs Figure 6A), l'immunoréactivité GFAP était également plus marquée (Figure 6E vs Figure 6B), et l'immunoréactivité Iba-1 était également augmentée (Figure 6F vs Figure 6C). Parallèlement, les astrocytes et les microglies du groupe IP apparaissaient hypertrophiques, avec des corps cellulaires agrandis et des prolongements plus épais et plus fortement ramifiés (Figure 6E,F).

Dans le groupe PPF, des images représentatives suggéraient une immunoréactivité NeuN plus faible que dans le groupe IP (Figure 6G par rapport à Figure 6D), une immunoréactivité GFAP plus faible (Figure 6H par rapport à Figure 6E) et une immunoréactivité Iba-1 plus faible (Figure 6I par rapport à Figure 6F). Dans le groupe U0126, des images représentatives suggéraient également une immunoréactivité NeuN plus faible que dans le groupe IP (Figure 6J par rapport à Figure 6D), une immunoréactivité GFAP plus faible (Figure 6K par rapport à Figure 6E) et une immunoréactivité Iba-1 plus faible (Figure 6L par rapport à Figure 6F). Dans les groupes PPF et U0126, les astrocytes et les microglies apparaissaient moins hypertrophiques, avec des corps cellulaires plus petits et des prolongements moins nombreux et plus fins (Figure 6H,I,K,L). L'analyse correspondante de l'intensité de fluorescence pour NeuN, GFAP et Iba-1 était conforme aux observations représentatives d'immunofluorescence (Figure 6M–O, respectivement).

À 4 h après l'incision, l'immunoréactivité et l'intensité de fluorescence relative de TNF-α et de COX-2 étaient augmentées dans la corne dorsale homolatérale du groupe IP par rapport au groupe témoin. Ces deux paramètres étaient réduits après un traitement préopératoire intrathécal par PPF ou U0126 (Figure 7A–C).

Localisation cellulaire de la p-ERK1/2 épinière par immunofluorescence

Les résultats d'immunofluorescence ont montré que, dans le groupe témoin, l'immunoréactivité de p-ERK1/2 était faible dans la moelle épinière et observée uniquement dans les neurones positifs pour NeuN (Figure 8A–C). En revanche, 4 h après l'incision, l'immunoréactivité de p-ERK1/2 augmentait nettement dans la corne dorsale médullaire homolatérale et co-localisait non seulement avec les neurones, mais aussi avec les astrocytes positifs pour GFAP et les microglies positives pour Iba-1 (Figure 8D–I). Cette observation indique que l'incision induit une distribution cellulaire plus étendue de p-ERK1/2, passant des neurones seuls en conditions basales aux neurones, astrocytes et microglies après la lésion.

In vitro validation du mécanisme dépendant de la voie ERK1/2 dans les astrocytes spinaux

Afin d'évaluer davantage si le PPF pouvait supprimer la libération de médiateurs inflammatoires via une signalisation liée à ERK1/2 au niveau cellulaire, des astrocytes primaires de moelle épinière de rat ont été stimulés avec du LPS et traités avec du PPF ou du U0126 (10 µM). Une analyse par immunobuvardage a montré que le PPF réduisait l'expression de p-ERK1/2 induite par le LPS, tandis que la phosphorylation de p-p38 et de p-JNK n'était pas nettement modifiée (Figure 9A), ce qui soutient une sélectivité relative de la voie ERK1/2 dans ces conditions. Parallèlement, le PPF réduisait les niveaux de TNF-α, de PGE2 (un produit en aval de l'activité de COX-2) et d'IL-6 dans le surnageant de culture par rapport au groupe Stim ; le U0126 produisait des effets inhibiteurs similaires (Figure 9B).

Afin de tester si une activation persistante de ERK1/2 pouvait affaiblir l'effet anti-inflammatoire du PPF, des expériences de sauvetage ont été réalisées. L'ERK1/2 endogène a été inhibé par ARNsi, puis un construit d'ERK1/2 constitutivement actif (CA-ERK1/2) a été introduit (Figure 9C). Dans les astrocytes exprimant le CA-ERK1/2, le PPF n'a plus réduit les niveaux de TNF-α, de PGE2 ou d'IL-6 dans la même mesure (Figure 9D), indiquant que la suppression de la phosphorylation d'ERK1/2 contribue à l'effet anti-inflammatoire du PPF dans ce système d'astrocytes in vitro.

Dans leur ensemble, ces résultats in vitro apportent un appui mécanistique au niveau cellulaire, indiquant que le PPF atténue la libération de médiateurs inflammatoires par un mécanisme dépendant de l'ERK1/2 dans les astrocytes spinaux, complétant ainsi les données observationnelles in vivo.

Figure 1 : Effets de la PPF ou de l'U0126 intrathécale préopératoire sur l'hyperalgésie mécanique et thermique induite par incision. (A) Seuil mécanique de retrait à la pression (PWMT) dans les groupes témoin, IP, PPF et U0126. (B) Seuil mécanique de retrait à la pression (PWMT) dans les groupes IP et contrôle véhicule. (C) Latence thermique de retrait à la pression (PWTL) dans les groupes témoin, IP, PPF et U0126. (D) Latence thermique de retrait à la pression (PWTL) dans les groupes IP et contrôle véhicule. Les données sont exprimées en moyenne ± ÉT (n = 6 rats par groupe) et ont été analysées par une ANOVA à mesures répétées à deux facteurs. ***p < 0,001 par rapport à la ligne de base ; #p < 0,05, ##p < 0,01 et ###p < 0,001 par rapport au groupe IP. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Évolution temporelle de l'expression des marqueurs cellulaires médullaires et de la phosphorylation de ERK1/2 après incision. (A) Quantification et immunotransferts représentatifs de NeuN, GFAP et Iba-1 dans le groupe IP, depuis la ligne de base jusqu'à 72 h après l'incision. (B) Quantification et immunotransferts représentatifs de t-ERK1/2 et p-ERK1/2 sur la même période. Les valeurs ont été normalisées par rapport au groupe témoin (100 %) et sont exprimées en moyenne ± ÉT (n = 3 rats par point temporel). Les différences globales ont été analysées par ANOVA à un facteur avec des comparaisons par paires indiquées. *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 par rapport à la ligne de base. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Effets de la PPF ou de l'U0126 intrathécal préopératoire sur les marqueurs neuronaux et gliaux de la moelle épinière 4 h après l'incision. (A–C) NeuN, GFAP et Iba-1 dans les groupes témoin, IP, sérum physiologique et PPF. (D–F) NeuN, GFAP et Iba-1 dans les groupes témoin, IP, diméthylsulfoxyde et U0126. Des immunotransferts représentatifs sont montrés à droite. Les valeurs ont été normalisées par rapport au groupe témoin (100 %) et sont exprimées en moyenne ± écart-type (n = 3 rats par groupe). *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 par rapport au groupe témoin ; #p < 0,05 et ##p < 0,01 par rapport au groupe IP ; Δp < 0,05, ΔΔp < 0,01 et ΔΔΔp < 0,001 par rapport au groupe contrôle correspondant. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Effets de la PPF ou de l'U0126 intrathécale préopératoire sur la phosphorylation de ERK1/2 spinal à 4 h après l'incision. (A,B) t-ERK1/2 et p-ERK1/2 dans les groupes témoin, IP, sérum physiologique et PPF. (C,D) t-ERK1/2 et p-ERK1/2 dans les groupes témoin, IP, diméthylsulfoxyde et U0126. Des immunoblottings de type Western représentatifs sont présentés à droite. Les valeurs ont été normalisées par rapport au groupe témoin (100 %) et sont exprimées en moyenne ± écart-type (n = 3 rats par groupe). **p < 0,01 et ***p < 0,001 par rapport au groupe témoin ; ###p < 0,001 par rapport au groupe IP ; ΔΔp < 0,01 et ΔΔΔp < 0,001 par rapport au groupe contrôle correspondant. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Immunoréactivité médullaire ipsilatérale et controlatérale de NeuN après incision. Une coupe transversale représentative de la moelle épinière lombaire du groupe IP, réalisée 4 h après l'incision, montre une coloration de NeuN dans les cornes dorsales controlatérale et ipsilatérale. L'image est représentative de n = 3 rats et est fournie à des fins de comparaison anatomique qualitative. Échelle = 500 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Effets du PPF et de l'U0126 sur l'immunoréactivité neuronale et gliale de la moelle épinière 4 h après l'incision. (A–C) NeuN, GFAP et Iba-1 dans le groupe témoin. (D–F) Colorations correspondantes dans le groupe IP. (G–I) Colorations correspondantes après traitement au PPF. (J–L) Colorations correspondantes après traitement à l'U0126. (M–O) Intensités de fluorescence relatives de NeuN, GFAP et Iba-1, respectivement. Les barres représentent la moyenne ± ÉT (n = 3 rats par groupe) ; *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001 pour les comparaisons indiquées. Échelles = 200 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Immunoréactivité de la TNF-α et de la COX-2 au niveau rachidien après incision et traitement. (A) Images représentatives de la TNF-α et de la COX-2 provenant des groupes témoin, IP, PPF et U0126 à 4 h après l’incision. (B) Intensité relative de fluorescence de la TNF-α. (C) Intensité relative de fluorescence de la COX-2. Les barres indiquent la moyenne ± ÉT (n = 3 rats par groupe) ; ***p < 0,001 pour les comparaisons indiquées. Échelles = 200 µm. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Localisation cellulaire de la p-ERK1/2 épinière à 4 h après l'incision. (A–C) Double marquage de la p-ERK1/2 avec NeuN, GFAP et Iba-1, respectivement, dans le groupe témoin. (D–F) Double marquage correspondant dans le groupe IP ; les flèches indiquent des cellules représentatives présentant une co-localisation. Le rouge indique la p-ERK1/2, le vert indique le marqueur cellulaire, et le jaune indique la co-localisation. (G–I) Intensités de fluorescence relatives associées aux régions positives pour NeuN, GFAP et Iba-1, respectivement. Les barres représentent la moyenne ± ÉT (n = 3 rats par groupe) ; **p < 0,01 et ***p < 0,001 pour les comparaisons indiquées. Échelles = 100 µm. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Effets anti-inflammatoires dépendants de la voie ERK1/2 induits par le PPF dans des astrocytes spinaux primaires de rat. (A) Immunoblottings représentatifs montrant que le PPF réduit la phosphorylation de ERK1/2 induite par le LPS, sans effet notable sur p-p38 ou p-JNK. (B) Concentrations de TNF-α, de PGE2 et d'IL-6 dans les surnageants de culture après traitement par LPS, PPF ou U0126. (C) Immunoblottings confirmant l'extinction d'ERK1/2 par ARNsi et l'expression d'ERK1/2 activé de manière constitutive (CA-ERK1/2). (D) Concentrations de TNF-α, PGE2 et IL-6 après expression de CA-ERK1/2 avec ou sans PPF. Les barres représentent la moyenne ± ÉT à partir d'expériences in vitro indépendantes ; ***p < 0,001 pour les comparaisons indiquées ; ns, non significatif. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Fichier supplémentaire 1 : Données soutenant les résultats de cette étude.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La plupart des patients souffrent de douleur aiguë après une chirurgie, non seulement sur le plan physique, mais parfois aussi sur le plan mental³³, bien que les mécanismes détaillés de la douleur postopératoire aiguë restent encore mal compris. Aux effets puissants des médicaments analgésiques s'ajoutent leurs effets indésirables inévitables, ce qui rend essentielle l'exploration d'analgésiques plus sûrs et efficaces. Cette étude s'appuyait sur un modèle rat de douleur postopératoire aiguë par incision, précédemment validé, facile et réalisable à mettre en œuvre²⁷. La présente étude a évalué les modifications des marqueurs neuronaux et gliaux médullaires, de la phosphorylation de l'ERK1/2 et des médiateurs inflammatoires après l'incision, et a examiné si l'effet antihyperalgésique de l'administration intrathécale préopératoire de PPF était associé à des modifications parallèles de la phosphorylation médullaire de l'ERK1/2 et de l'expression des cytokines inflammatoires.

Après l'incision, les rats du groupe IP ont développé une hyperalgésie mécanique et thermique marquée, tandis que le traitement préalable par le véhicule n'a eu aucun effet détectable sur les résultats comportementaux ou moléculaires. Ces résultats soutiennent la stabilité du modèle et indiquent que les effets observés dans les groupes PPF et U0126 étaient peu probables d'être attribuables à la procédure d'injection ou au véhicule lui-même. De plus, bien que l'expression de NeuN ait augmenté après l'incision, ce changement doit être interprété avec prudence comme une modification de l'expression d'un marqueur neuronal plutôt que comme une preuve directe d'activation neuronale. Ensemble, ces observations fournissent la base pour examiner les réponses gliales et liées à ERK1/2 lors du développement précoce de la douleur post-incisionnelle.

On a montré que les cellules gliales jouent un rôle important dans la formation synaptique, la transmission et l'intégration de l'information synaptique, ainsi que dans la régulation de la plasticité synaptique. Les fonctions immunologiques et pro-inflammatoires des cellules gliales dans le traitement de la douleur, et notamment des astrocytes et de la microglie spinale activés, peuvent renforcer la sensibilisation centrale impliquée dans la médiation de l'hyperalgésie et des modifications comportementales postopératoires^7,34. Des modifications neurologiques mal adaptées dans la moelle épinière peuvent entraîner une augmentation de la réponse aux stimuli nocifs ou non nocifs. De nombreuses données indiquent que l'activation des astrocytes et de la microglie spinale est impliquée dans le développement et le maintien de l'hyperalgésie dans des modèles de lésion des nerfs spinaux³⁵, de douleur induite par l'activateur tissulaire du plasminogène¹⁶, de douleur post-incisionnelle^11,12 et de douleur liée au cancer osseux^19,31. Par conséquent, l'activation gliale spinale semble être une caractéristique commune à plusieurs états douloureux, et une exploration plus approfondie de son rôle dans la douleur post-incisionnelle pourrait élargir la compréhension actuelle des mécanismes de la douleur postopératoire.

Les résultats actuels appuient l'idée que les astrocytes et les microglies médullaires participent à la réponse neuroinflammatoire précoce suivant une incision¹². Plutôt que de présenter des profils temporels identiques, la GFAP, l'Iba-1 et la p-ERK1/2 ont montré des cinétiques partiellement distinctes, suggérant que différents processus liés aux cellules gliales pourraient contribuer à différentes phases du développement de la douleur postopératoire^31,35. Les résultats d'immunofluorescence ont davantage appuyé cette interprétation en révélant des modifications morphologiques hypertrophiques des astrocytes et des microglies après l'incision. Conjointement aux augmentations de l'immunoréactivité de la TNF-α et de la COX-2, ces observations sont compatibles avec l'hypothèse selon laquelle la signalisation inflammatoire associée aux cellules gliales contribue à l'hyperalgésie aiguë post-incisionnelle^7,36.

La propentofylline, un dérivé de la méthylxanthine, a été initialement étudiée comme médicament actif sur la circulation cérébrale en raison de son activité antiplaquettaire et de son rôle dans le maintien de la mémoire à long terme³⁷. Toutefois, l'effet régulateur de la PPF sur les cellules gliales la rend potentiellement intéressante également comme agent analgésique. Des études montrent que la PPF peut entraver l'activation des microglies en inhibant la dégradation du monophosphate d'adénosine cyclique intracellulaire et en réduisant la recapture de l'adénosine extracellulaire^4,5. Dans une étude in vitro, la PPF a inhibé la prolifération des astrocytes en bloquant la voie du mammalian target of rapamycin induite par le TNF-α⁶. Ainsi, c'est l'effet régulateur de la PPF sur les cellules gliales qui permet son implication dans la modulation des processus douloureux.

L'effet anti-hyperalgésique prolongé du PPF dans la présente étude, conjugué à la réduction de l'expression de GFAP et d'Iba-1, soutient l'interprétation selon laquelle la modulation gliale constitue un élément important de l'action analgésique du PPF dans ce modèle. Des études antérieures ont également suggéré que le PPF pourrait supprimer la signalisation inflammatoire liée aux cellules gliales dans les états douloureux^5,31. De plus, la réduction parallèle de TNF-α et de COX-2 suggère que le PPF pourrait atténuer la douleur post-incisionnelle en partie en atténuant les réponses inflammatoires associées aux cellules gliales. Toutefois, comme les données actuelles sont associatives plutôt que mécanistiques, ces résultats doivent être interprétés comme un appui en faveur de l'implication des cellules gliales, plutôt que comme une preuve d'un lien de causalité direct.

L'implication de ERK1/2, une paire de kinases régulées par le signal intracellulaire importantes, dans le développement et le maintien de différents processus douloureux (en régulant l'excitabilité neuronale et la plasticité synaptique dans le cerveau et la moelle épinière) a été démontrée²¹. Par exemple, une étude a montré que l'injection de capsaïcine ou de formol induisait une augmentation brève et rapide de p-ERK1/2 dans la moelle épinière, mais l'activation de ERK1/2 rachidienne persistait beaucoup plus longtemps après l'injection d'adjuvant de Freund complet ou de venin d'abeille (après une courte latence)^38,39. Inversement, dans une autre étude, l'activation rachidienne de ERK1/2 induite par une lésion nerveuse atteignait un pic extrêmement précoce et persistait pendant un certain temps, une hyperalgésie se développant après le pic de p-ERK1/2³⁵. Ainsi, la phosphorylation de ERK1/2 pourrait survenir à différents stades selon les processus douloureux, et l'augmentation de p-ERK1/2 dans la moelle épinière pourrait être importante tant pour l'induction immédiate que pour la réponse génique à long terme.

Dans la présente étude, la phosphorylation de ERK1/2 induite par l'incision a augmenté de manière significative durant les 24 premières heures suivant l'incision par rapport au groupe témoin, et l'expression de p-ERK1/2 a atteint un maximum 4 heures après l'incision (comme décrit précédemment)²⁴, coïncidant avec le moment où l'expression de NeuN était la plus élevée. Parallèlement, les résultats d'immunofluorescence ont révélé que la phosphorylation de ERK1/2 induite par l'incision était simultanément distribuée dans les neurones, les astrocytes et les microglies de la corne dorsale médullaire controlatérale, ce qui soutient l'idée que la signalisation liée à ERK1/2 est particulièrement pertinente pour la phase précoce de l'hyperalgésie post-incisionnelle. De plus, l'administration intrathécale préopératoire de U0126 a réduit l'expression des marqueurs gliaux médullaires, de NeuN et de p-ERK1/2 à 4 heures après l'incision, et a atténué à la fois l'hyperalgésie mécanique et thermique durant la phase précoce post-incision, suggérant que p-ERK1/2 médullaire pourrait être impliqué dans le stade initial de l'hyperalgésie aiguë après incision. Toutefois, comme les profils temporels de GFAP, d'Iba-1, de p-ERK1/2 et des résultats comportementaux étaient différents, l'interprétation mécanistique actuelle devrait être limitée à la phase post-incisionnelle précoce représentée par le point temporel à 4 heures, plutôt que généralisée à l'ensemble de la période postopératoire.

En outre, dans la présente étude, l'administration intrathécale préopératoire de PPF a également réduit la phosphorylation de ERK1/2 à 4 h après l'incision, suggérant que les modifications observées dans l'expression de NeuN, de GFAP et de Iba-1 au niveau médullaire pourraient être associées, du moins en partie, à une signalisation liée à ERK1/2. L'administration intrathécale préopératoire d'U0126 a également diminué l'immunoréactivité de TNF-α et de COX-2, appuyant une association possible entre la phosphorylation de ERK1/2 et l'expression des médiateurs inflammatoires après l'incision. Les expériences supplémentaires in vitro sur les astrocytes présentées dans la Figure 9 ont fourni un appui au niveau cellulaire en faveur d'un composant anti-inflammatoire dépendant de ERK1/2, car une activation persistante de ERK1/2 affaiblit la capacité du PPF à réduire la libération de TNF-α, de PGE2 et d'IL-6. Toutefois, étant donné que ces expériences de sauvetage ont été réalisées sur des astrocytes en culture plutôt que sur la moelle épinière intacte, et qu'aucune manipulation de sauvetage in vivo ou spécifique à un type cellulaire n'a été effectuée, les conclusions in vivo doivent encore être interprétées comme un appui plutôt qu'une preuve définitive d'un mécanisme causal dépendant de ERK1/2.

Afin d'approfondir les relations possibles entre l'activation des cellules gliales, l'expression de p-ERK1/2 et la libération de cytokines inflammatoires, les profils de localisation spatiale observés par immunofluorescence ont été pris en compte. Après l'incision, p-ERK1/2 était coexprimé avec les astrocytes positifs pour GFAP et les microglies positives pour Iba-1 dans la corne dorsale médullaire à 4 h après l'incision. Conjointement aux résultats de Western blot et d'immunofluorescence montrant que le PPF et l'U0126 étaient associés à une réduction de l'expression de p-ERK1/2, de TNF-α et de COX-2, ces données suggèrent que la phosphorylation de ERK1/2 dans les cellules gliales médullaires pourrait être impliquée dans la réponse inflammatoire suivant l'incision. Les données in vitro obtenues sur des astrocytes primaires appuient davantage un lien cellulaire direct entre le traitement par PPF, la suppression de ERK1/2 et la libération de médiateurs inflammatoires. Néanmoins, les preuves in vivo démontrent des associations et des changements parallèles liés au traitement, tandis que les expériences cellulaires complètent, mais ne remplacent pas, la validation causale spécifique aux types cellulaires in vivo. Étant donné que l'analyse par immunofluorescence s'appuyait sur un nombre limité d'animaux et de champs, ces observations doivent être interprétées avec prudence et en complément des résultats de Western blot et des données in vitro.

Plusieurs étapes du protocole ont un effet disproportionné sur la reproductibilité. L'injection intrathécale exige à la fois une réponse caractéristique de la queue et une confirmation par le liquide céphalorachidien ; une résistance durant l'injection, l'absence de confirmation ou l'apparition d'un nouveau déficit neurologique devraient conduire à l'exclusion plutôt qu'à une réinjection au même site. Les tests comportementaux sont sensibles à l'acclimatation, aux conditions d'enceinte, au positionnement du stimulus et aux attentes de l'expérimentateur ; par conséquent, le masquage, des intervalles fixes et des conditions environnementales constantes sont essentiels. Le moment du prélèvement tissulaire, le transfert uniforme des protéines, l'incubation avec les anticorps et des réglages identiques de microscopie au sein de chaque série de coloration sont tout aussi importants. Les problèmes courants incluent des seuils de retrait variables dus à une acclimatation insuffisante, des bandes faibles ou irrégulières en immunotransfert dues à un transfert incomplet ou à une sur-exposition, et un fond de fluorescence élevé causé par des lavages insuffisants, une concentration excessive d'anticorps ou des paramètres d'acquisition saturés.

Le protocole peut être modifié selon la question scientifique posée. Un suivi temporel plus étendu peut être utilisé lorsque les réponses gliales tardives sont d'intérêt, et des tests de dosage ou des voies d'administration alternatives peuvent être ajoutés lorsque la faisabilité translationnelle est prioritaire. Comparé aux modèles de douleur inflammatoire ou neuropathique, le modèle d'incision plantaire est relativement rapide et pratique, et reproduit une lésion postopératoire bien définie²⁷. La combinaison de tests comportementaux, de western blot et d'immunofluorescence cellulaire fournit des informations fonctionnelles, moléculaires et spatiales complémentaires ; toutefois, cette approche est plus exigeante en ressources qu'un dosage à point final unique et n'établit pas en soi une causalité spécifique aux cellules. Une comparaison pharmacologique avec l'U0126 renforce l'interprétation de la voie impliquée, mais reste moins spécifique qu'une manipulation génétique ou sélective du type cellulaire^{20,21,22,23,24,25}.

Les applications futures comprennent le test des deux sexes, des lésions chirurgicales plus importantes, des voies d'administration cliniquement réalisables, des points temporels postopératoires supplémentaires, ainsi que des interventions ciblant des populations gliales spécifiques. Le protocole est pratique pour le criblage de traitements analgésiques ou modulant les cellules gliales, car le modèle d'incision est bref, les critères comportementaux sont reproductibles, et les dosages moléculaires utilisent des méthodes de laboratoire standard. La reproductibilité dépend toutefois de critères d'exclusion prédéfinis, d'une évaluation des résultats en aveugle, d'une acquisition d'images cohérente, et d'une description complète des données brutes et des paramètres d'analyse.

Limites

Cette étude comporte plusieurs limites. Premièrement, le modèle d'incision plantaire de la patte représente une lésion chirurgicale relativement mineure et pourrait ne pas refléter fidèlement des interventions chirurgicales plus étendues, telles qu'une thoracotomie ou une laparotomie. Par conséquent, il convient de faire preuve de prudence lorsqu'on extrapole les résultats actuels à d'autres formes de douleur postopératoire. De plus, seuls des rats Sprague–Dawley mâles ont été inclus, ce qui limite la généralisation de ces résultats à l'ensemble des sexes. Compte tenu des différences connues selon le sexe en matière de réponses à la douleur, d'effets analgésiques et de profils d'activation gliale, des études supplémentaires incluant des animaux femelles sont nécessaires.

Les principales observations moléculaires et histologiques se sont concentrées sur le point temporel de 4 h après l'incision. Étant donné que différents critères d'évaluation, notamment GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 et les résultats comportementaux, présentaient des profils temporels distincts suite à l'incision, l'interprétation mécanistique des résultats actuels devrait être principalement limitée au stade précoce post-incision. De plus, les expériences moléculaires décrites ici ont été réalisées avec une taille d'échantillon relativement limitée, ce qui pourrait réduire la robustesse statistique de ces observations.

La kinase régulée par les signaux extracellulaires 1 et 2 a été évaluée conjointement sous la forme p-ERK1/2 ; leurs contributions individuelles n'ont pas été examinées séparément. Par conséquent, les rôles respectifs d'ERK1 et d'ERK2 dans le traitement de la douleur induite par une incision n'ont pas pu être déterminés dans la présente étude. De plus, la quantification de l'intensité de fluorescence s'est appuyée sur un nombre limité d'animaux et de champs observés et n'a pas inclus de dénombrement stéréologique des cellules ni de coefficients formels de co-localisation. Ces observations doivent donc être interprétées avec prudence, en parallèle avec les résultats des immunotransferts.

Enfin, bien que les expériences de sauvetage in vitro des astrocytes aient fourni un appui mécanistique à la régulation des médiateurs inflammatoires dépendante de l'ERK1/2, les événements régulateurs en amont après l'incision ainsi que les événements en aval dans le tissu médullaire intact n'ont pas été approfondis. Le système de culture in vitro ne peut pas non plus reproduire complètement les interactions entre les neurones, les astrocytes, les microglies et les cellules immunitaires infiltrantes dans la corne dorsale médullaire. Ainsi, la présente étude appuie un mécanisme lié à l'ERK1/2, mais n'établit pas une causalité cellulaire spécifique complète in vivo.

Conclusion

La présente étude montre que l'augmentation induite par l'incision de l'expression de NeuN, de GFAP et de Iba-1 au niveau médullaire est atténuée par l'administration intrathécale préopératoire de PPF. Cet effet s'accompagne d'une atténuation de l'hyperalgésie mécanique et thermique aiguë, ainsi que de réductions de la phosphorylation de ERK1/2 et de l'expression de TNF-α et de COX-2 après l'incision. Toutefois, ces résultats appuient (plutôt qu'ils ne démontrent de façon définitive) une association entre l'effet anti-hyperalgésique du PPF et la diminution de la phosphorylation de ERK1/2 dans les cellules gliales médullaires (en lien avec une réduction de l'expression des médiateurs inflammatoires). L'effet anti-hyperalgésique du PPF persiste tout au long de la période d'observation suivant l'incision, tandis que l'effet de l'inhibiteur de MEK1/2, U0126, est principalement limité à la phase précoce post-incision. Ces résultats suggèrent que la voie de signalisation ERK1/2 pourrait être particulièrement impliquée au cours des premiers stades du développement de la douleur post-incisionnelle. La durée d'action plus prolongée du PPF indique que son mécanisme d'action pourrait impliquer des voies supplémentaires au-delà de l'inhibition exclusive de ERK1/2. Ainsi, le PPF pourrait représenter une intervention thérapeutique potentielle, plutôt qu'une cible biologique, pour améliorer la prise en charge de la douleur postopératoire aiguë.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon PBS 0,01 M	Solarbio	P1020
Tampon Tris-HCl 1,0 M (pH 6,8)	Solarbio	T1020
Tampon Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)	Solarbio	T1010
Dodécylsulfate de sodium (SDS) à 10 %	Solarbio	S1010
Solution mère TBST 10×	Solarbio	T1081
Acrylamide à 30 %	Solarbio	A1010
Tampon de chargement des protéines 4×	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
Persulfate d'ammonium	Solarbio	A1030
Machine automatique à glace en flocons	Changshu Xueke	IMS-40
Albumine sérique bovine (BSA)	Solarbio	A8020
Cryostat CM150	Leica	CM150
pH-mètre numérique	—	PHS-3C
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Solarbio	D8371
Balance analytique électronique	Cany	—
Réactif de chimiluminescence amplifiée (ECL)	Solarbio	PE0010
Pellicule	Kodak	—
Microscope à fluorescence DP71	Olympus	DP71
Milieu d'inclusion pour coupes congelées	Sakura	4583
Appareil d'électrophorèse sur gel	BIO-RAD	—
Glycérol	Solarbio	IG0910
Glycine	Solarbio	G8200
Anticorps secondaire marqué Alexa Fluor 594 anti-souris provenant de chèvre	Proteintech	SA00013-3
Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase anti-souris provenant de chèvre	ZSGB-BIO	ZB2305
Anticorps secondaire marqué Alexa Fluor 488 anti-lapin provenant de chèvre	Proteintech	SA00013-2
Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase anti-lapin provenant de chèvre	ZSGB-BIO	ZB2301
Sérum de chèvre	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	GraphPad Software	5
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse 3K15	Sigma	3K15
Agitateur orbital horizontal TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	National Institutes of Health	1.51j8
Méthanol	Tianjin Guangfu	—
Anticorps primaire anti-rat GAPDH de souris	Proteintech	60004-1-Ig
Anticorps primaire anti-rat p-ERK1/2 de souris	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
Paraformaldéhyde	Biosharp	BL539A
Lames de microscope de qualité histopathologique	Shitai	—
Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)	Beyotime	ST506
Test plantaire 37370	UGO BASILE	37370
Mébrane de fluorure de polyvinylidène	Solarbio	—
Propentofylline (PPF)	Taosu	T19812
Anticorps primaire anti-rat COX-2 de lapin	Abcam	Ab179800
Anticorps primaire anti-rat GFAP de lapin	Proteintech	16825-1-AP
Anticorps primaire anti-rat Iba-1 de lapin	Proteintech	10904-1-AP
Anticorps primaire anti-rat NeuN de lapin	Abcam	Ab279297
Anticorps primaire anti-rat t-ERK1/2 de lapin	Proteintech	11257-1-AP
Anticorps primaire anti-rat TNF-α de lapin	Proteintech	29652-1-AP
Tampon de lyse RIPA	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
Poudre de lait écrémé	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
Congélateur à ultra-basse température	Haier	—
Congélateur à ultra-basse température	Sanyo	—
Système de purification d'eau ultrapure	Heal Force	—
Filaments de von Frey	North Coast Medical	—