Article de méthode

Identification des histones modifiées comme substrats de liaison du membre 4 de la famille des spindlines humaines (SPIN4) par des réseaux peptidiques et un pulldown des nucléosomes natifs

DOI :

10.3791/70934

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27 mars 2026

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1Division of Cellular and Molecular Pathogenesis, Department of Pathology, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Center for Precision Medicine and Genomics Research, Children's National Research Institute, 3Department of Endocrinology, Children's National Hospital, 4Department of Pediatrics, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 5Massey Comprehensive Cancer Center, Virginia Commonwealth University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des variantes génétiques chez le membre humain de la famille Spindline 4 (SPIN4) ont récemment été identifiées chez des patients atteints de prolifération osseuse, un trouble du développement nouveau. Un protocole et de nouveaux résultats décrivant l’identification biochimique des histones modifiés dans le contexte des nucléosomes en tant que substrats de liaison au SPIN4 sont présentés.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le membre de la famille Spindline humaine 4 (SPIN4) vient tout juste d’émerger comme un nouveau régulateur de la croissance osseuse. Des variants de perte de fonction dans SPIN4 ont été identifiés chez des patients présentant un syndrome de surcroissance pré- et post-natal, qui est héréditaire de manière dominante liée au X. SPIN4 contient trois répétitions en tandem de domaines Tudor, chacune formant une cage aromatique individuelle. Ces domaines de Tudor sont considérés comme des domaines lecteurs épigénétiques pour les résidus d’arginine et de lysine méthylés des histones selon l’homologie de séquences. Cependant, les substrats de liaison exacts de SPIN4 restent flous. Le SPIN4 humain, sous sa forme sauvage et mutante pathogène, a été généré avec succès via un système d’expression cellulaire d’insecte. Grâce à un réseau peptidique de modification des histones, les affinités de liaison différentielles entre le SPIN4 de type sauvage et mutant ont été déterminées. Les validations fonctionnelles ont également démontré que SPIN4 est un véritable lecteur de la méthylation de la lysine H3 (H3K4me), comme en témoigne la réduction biochimique des mononucléosomes natifs. Cette approche intégrée facilite l’identification rapide des cibles de liaison des protéines lectrices épigénétiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spindlin Family Member 4 (SPIN4) est un lecteur épigénétique et a récemment été impliqué dans le syndrome de surcroissance, présentant une constellation de prolifération pré- et postnatale et une grandetaille 1,2. Les souris Spin4 knockout (KO) ont récapitulé exactement le phénotype humain, soutenant la causalité. À ce jour, SPIN4 est le seul lecteur épigénétique exclusif identifié qui régule négativement la croissance osseuse. Cependant, les propriétés biochimiques de SPIN4, un lecteur épigénétique essentiel pour la croissance, n’ont pas été caractérisées, laissant un vide de connaissances crucial dans la compréhension des mécanismes fondamentaux responsables de la maladie dans ce nouveau trouble du développement. SPIN4 contient trois répétitions en tandem de domaines de Tudor, généralement considérés comme des domaines lecteurs d’arginine méthylée oude lysine des histones 3. Un variant SPIN4D82H missense a récemment été identifié chez un patient souffrant d’un syndrome de prolifération osseuse prénatal et postnatal. Cette mutation affecte le premier domaine Tudor de SPIN4 ; cependant, les substrats de liaison pertinents de ces domaines Tudor restent flous, limitant la dissection fonctionnelle de la régulation dépendante de SPIN4 de la chromatine et de l’expression génique lors du développement osseutier.

L’identification de nouveaux substrats liant les histones des domaines de protéines lectrices ne repose pas sur une approche unique et standardisée. Les modifications post-traductionnelles (PTM) des histones se produisent principalement au niveau des queues d’histones qui dépassent des particules nucléosomiques centrales. La reconnaissance des PTM sur les queues d’histones par les domaines de la protéine lectrice est très variable et nécessite souvent des interactions multivalentes et électrostatiques impliquant l’ADN nucléosomique, l’ADN liant et/ou d’autres domaines histoniques pour stabiliser collectivement l’interactionlecteur-cible 4. Actuellement, des PTM de peptides de queue d’histones ont été construits sous forme de micro-réseaux et commercialisés par plusieurs fournisseurs5. Bien que le criblage PTM à base de peptides de la queue d’histones pour les cibles de liaison des domaines de protéines lectrices soit à haut débit, il donne souvent des résultats faux positifs en l’absence de nucléosomes. De plus, les conditions expérimentales pour de tels criblages sont très empiriques et varient d’une protéine à l’autre, ce qui les rend techniquement difficiles à traiter. Le criblage ou pulldown de PTM à base de nucléosomes synthétiques offre une lecture beaucoup plus robuste, mais elle est beaucoup plus coûteuse et à faible débit, car reconstituer des nucléosomes portant des combinaisons variables de PTM est intrinsèquement difficile.

Ce protocole décrit une approche rapide pour identifier les PTM des histones dans les nucléosomes comme cibles de liaison de SPIN4. Le SPIN4 recombinant a été reconstitué et examiné contre un réseau commercial de peptides PTM d’histones afin d’identifier des cibles potentielles de liaison. Des mono-nucléosomes natifs contenant divers PTM endogènes d’histones ont ensuite été générés à partir de cellules vivantes. Le pulldown SPIN4 des mono-nucléosomes a permis la validation ciblée par anticorps des PTM histones après le criblage initial. Cette stratégie biochimique intégrée démontre une approche de preuve de principe pour la découverte de cibles économe en temps et en coût, et peut être facilement appliquée pour identifier des substrats de liaison d’autres protéines lectrices épigénétiques mal caractérisées.

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Protocole

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Toutes les procédures expérimentales impliquant HEK293FT cellules ont été réalisées conformément aux directives du Comité de biosécurité institutionnelle (IBC) de la Virginia Commonwealth University.

1. Purification du SPIN4 humain recombinant

  1. Cloner un SPIN4 ouSPIN4 D82H de type sauvage pleine longueur avec une étiquette épitope N-terminale 1× FLAG en un vecteur baculoviral 6,7.
  2. Préparez le baculovirus en transfectant les cellules Sf9 avec des vecteurs baculoviraux, prélevez les virus lorsque les cellules éclatent, aliquotez, et stockez le virus à −80 °C 6,7.
  3. Dans une fiole Erlenmeyer de 500 mL, ajoutez 100 mL de milieu de croissance, 1,5 × 10 cellules8 Sf9 et 1 mL de baculovirus P1.
  4. Incubez la culture à 27,5 °C dans un incubateur shaker orbital réglé à 125 tr/min pendant 72 heures dans l’obscurité.
  5. Purifiez FLAG-SPIN4 à l’aide d’un gel d’affinité FLAG dans un tampon de lyse BC150 contenant des inhibiteurs de protéases et éluez la protéine à l’aide d’un peptide FLAG 1× à 0,1 mg/mL.
  6. Pour éliminer complètement le peptide 1× FLAG, dialysez le FLAG-SPIN4 élué contre le tampon de stockage protéique BC150 à 4 °C dans l’ordre suivant :
    1. Première dialyse : 1 L, 1 h.
    2. Deuxième dialyse : 2 L, pendant la nuit.
    3. Troisième dialyse : 1 L, 1 h.
  7. Concentrez la protéine dialysée au volume désiré (pour SPIN4, de 600 μL à 150 μL).
  8. Déterminez la concentration en protéines à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique (BCA), et calculez la concentration molaire en conséquence.
  9. La quantité de protéine brute récupérée à chaque étape de purification et les rendements estimés correspondants sont résumés dans le Tableau Supplémentaire 1. La purification a été réalisée à partir de 250 mL de culture Sf9 en utilisant 400 μL de gelée d’affinité anti-FLAG.
  10. Diluer SPIN4 concentré par 10× dans le tampon de stockage protéique BC150 (Tableau supplémentaire 2). Chargez 1, 2, 5, 10 et 20 μL sur un gel SDS–PAGE à 15 % et visualisez par coloration bleue de Coomassie (Figure 1A).
  11. Quantifiez l’intensité des bandes à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image pour déterminer l’intensité relative du signal entre les voies chargées de volumes égaux.
  12. Divisez le rapport d’intensité par le poids moléculaire de chaque protéine pour obtenir le rapport molaire.
  13. Utilisez ce rapport molaire pour corriger la concentration molaire estimée à l’étape 1.8.
  14. Aliquot purifie des protéines, les glace instantanément dans de l’azote liquide, et les stocke à −80 °C. Pour un usage à court terme, conserver à 4 °C toute la nuit avant de passer à l’expérience suivante.

2. Réseau peptidique d’histones

  1. Préparez un tampon de blocage de réseaux peptidiques en dissolvant 5 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans un tampon de stockage protéique BC150 à un volume final de 100 mL.
  2. Éventuellement, délimitez la zone de réaction sur le réseau peptidique à l’aide d’un stylo marqueur hydrophobe pour minimiser la consommation de réactifs.
  3. Placez plusieurs feuilles de papier filtre dans une boîte de Pétri de 15 cm et humidifiez-les à l’eau.
  4. Positionnez les réseaux de peptides sur les papiers filtres humidifiés.
  5. Ajoutez soigneusement un tampon de blocage de 300 μL pour couvrir complètement chaque zone de l’array.
  6. Couvrez la boîte de Petri et étouffez à température ambiante pendant 1 à 3 heures.
  7. Préparez FLAG-SPIN4 dans un tampon de blocage jusqu’à une concentration finale de 1 μM.
  8. Préparez 1× peptide FLAG dans un tampon de blocage à une concentration finale de 1 μM.
  9. Pour améliorer le rapport signal/bruit et réduire le fond de fond indésirable, effectuez les étapes suivantes dans une pièce froide. Déplacez les réseaux bloqués (avec la boîte de Petri) dans la chambre froide avant d’ajouter les protéines.
  10. Supprimez l’excès de tampon de blocage des tableaux.
  11. Ajoutez soigneusement la protéine FLAG-SPIN4 ou le peptide FLAG désiré comme témoin sur chaque bloc.
  12. Couvrez la boîte de Petri et étouffez toute la nuit dans la chambre froide.
  13. Ajoutez environ 50 mL de tampon de lavage à la matrice peptidique dans une boîte de lavage Western blot et amenez-le dans la chambre froide.
  14. Jetez la solution protéique et transférez immédiatement les réseaux dans le tampon de lavage, côté réaction vers le haut.
  15. Lavez les ensembles cinq fois comme suit : les deux premiers lavages pendant 1 minute chacun, et les trois autres lavages pendant 5 minutes chacun.
  16. Rincez les réseaux avec un tampon bloquant les matrices peptidiques pour éliminer les résidus de détergent, puis remettez les réseaux dans la boîte de Petri.
  17. Préparez une solution anti-anticorps FLAG en dilution 1:2000 et ajoutez 300 μL par bloc.
  18. Incubez à température ambiante pendant 1 heure.
  19. Répétez les étapes 2.14 à 2.16 pour laver les tableaux.
  20. Préparez une solution anti-anti-anticorps de chèvre conjuguée à HRP en dilution 1:6000 et ajoutez 300 μL par bloc.
  21. Incubez à température ambiante pendant 1 heure.
  22. Répétez les étapes 2.14 à 2.16 pour laver les tableaux.
  23. Placez les réseaux à l’intérieur d’une feuille protectrice transparente.
  24. Ajoutez environ 1 mL de substrat à chimiluminescence améliorée (ECL), assurant une couverture uniforme de la surface de réaction.
  25. Retirez les bulles d’air et capturez des images chimiluminescentes et en champ clair à l’aide d’un système d’imagerie approprié (par exemple, imageurs numériques ou films autoradiographiques) (Figure 1B).
  26. Analyser l’intensité du signal selon le logiciel de réseau peptidique et les outils en ligne associés (Figure 2A–C).

3. Expression à grande échelle de FLAG-SPIN4 pour le test de tirage

  1. Dans une fiole Erlenmeyer de 500 mL, ajoutez 125 mL de milieu ESF921, 1,8 × 10 cellules8 Sf9 et 1,2 mL de baculovirus P1 exprimant FLAG-SPIN4 ou FLAG-SPIN4D82H.
  2. Incuber à 27,5 °C dans un incubateur à shaker orbital (125 tr/min) pendant 72 heures.
  3. Aliquote la culture comme suit :
    1. 4 mL de culture dans un tube de 15 mL pour la titration.
    2. 30 mL de culture dans quatre tubes de 50 mL.
  4. Centrifugez les tubes à 600 × g pendant 15 minutes et jetez le surnageant.
  5. Congelez les granulés dans de l’azote liquide et conservez-les à −80 °C jusqu’à utilisation.

4. Titrage du rapport billes/lysat pour FLAG-SPIN4 et FLAG-SPIN4D82H

  1. Ajouter 1 mL de tampon de lyse BC150 à chacun des pellets Sf9 à partir de 5 mL de culture Sf9 décrite à la Section 3, Étape 3.1.
  2. Sonicez les lysats pour assurer une perturbation complète : 30 % d’amplitude, 5 s allumées/5 s d’arrêt, pour un temps total de sonnation de 15 s.
  3. Centrifugez à 20 000 × g, 4 °C, pendant 10 minutes, puis transférez le surnageant dans des tubes neufs de 1,5 mL.
  4. Préparez une suspension de gel d’affinité anti-FLAG de 20 μL pour chaque réaction de tirage (60 μL pour 3 titrations)
  5. Lavez les billes avec le tampon de lyse BC150 :
    1. Ajoutez brièvement 1 mL de tampon de lyse BC150 et un vortex.
    2. Centrifugez à 3 000 × g pendant 1 minute.
    3. Aspirez et jetez le surnageant.
  6. Resuspendez les billes dans un tampon de lyse de 40 μL de BC150 pour chaque réaction de tirage (120 μL pour 3 titrations).
  7. Combinez le lysat dans des tubes de 1,5 mL contenant le tampon de lyse BC150, et la suspension à billes (Tableau supplémentaire 3)
  8. Incubez les tubes sur un rotateur de tube réglé à 15 tr/min à 4 °C pendant 1,5 heure.
  9. Centrifugez à 3 000 × g pendant 1 minute et aspirez le surnageant.
  10. Lavez les perles trois fois comme suit :
    1. Des billes de remise dans un tampon de lyse et un vortex de 500 μL BC150 à 500 μL.
    2. Centrifugeuse à 3 000 × g pendant 1 minute.
    3. Aspirez le surnageant.
  11. Résuspendez les billes dans un tampon de Laemmli de 20 μL 1× et incubez à 95 °C pendant 5 minutes.
  12. Centrifugez à 3 000 × g pendant 1 minute.
  13. Faites passer le surnageant sur un gel SDS–PAGE à 15 % et colorez avec du bleu Coomassie pour estimer le rendement protéique.
  14. Sur la base des données, sélectionnez un rapport lysate/billes qui sature les sites de liaison des anticorps sur les billes. Dans les expériences, ≥300 μL de lysat pour 20 μL de billes étaient suffisantes pour atteindre la pleine capacité de liaison.
    REMARQUE : La « saturation des sites de liaison des anticorps » est définie comme le point où l’augmentation du volume de lysat ne conduit plus à une meilleure récupération de la protéine cible.
    REMARQUE : À la même molarité, SPIN4D82H présente une affinité de liaison plus faible au gel d’affinité FLAG que son homologue de type sauvage.
    REMARQUE : Dans ce cadre expérimental, 1 mL de lysat a été extrait de 6 millions de cellules Sf9 (calculées à 1,5 × 106 cellules/mL × 4 mL), ce qui indique que SPIN4 exprimé à partir de ~6 millions de cellules Sf9 est suffisant pour saturer 20 μL de gels d’affinité anti-FLAG.

5. Préparation à grande échelle du gel d’affinité anti-FLAG lié au gel FLAG-SPIN4 comme appât

  1. Pour chaque protéine à tester, prélevez deux granulés provenant de cultures de 30 mL. Resuspendez chaque pellet dans un tampon de lyse BC150 de 6 mL, transférez dans un tube centrifuge de 15 mL, puis ajustez le volume total à 13 mL avec tampon de lyse BC150.
  2. Sonicez chaque échantillon sur glace à 100 % d’amplitude, 15 s allumé/30 s de décalage, pour un temps total de sonication de 2 min.
  3. Transférez les lysats dans des tubes centrifugeuses à grande vitesse pré-refroidis et centrifugez à 20 000 × g, 4 °C, pendant 15 minutes.
  4. Ajoutez 200 × (nombre d’échantillons + 1) × 1,1 μL de gels d’affinité anti-FLAG dans un tube centrifuge de 1,5 mL.
  5. Lavez les billes avec > volumes de 5 colonnes (CV) de tampon de lyse BC150 une fois.
  6. Resuspendez les billes en 400 × (nombre d’échantillons + 1) × 1,1 μL de tampon de lyse BC150.
  7. Transférez les surnadants obtenus à l’étape 4 vers des tubes centrifugeuses de 15 mL.
  8. Ajoutez 500 μL de suspension à talons Step 5.7 à chaque tube.
  9. Dans un tube, ajoutez 3 mL de tampon de lyse BC150 et 60 μL de peptide 1× FLAG (100 mM) en témoin négatif.
  10. Incubez les échantillons sur un rotateur tubulaire réglé à 120 tr/min à 4 °C pendant 1,5 heure.
  11. Centrifugez à 2 000 × g pendant 5 minutes et jetez le surnageant.
  12. Resuspendez les billes dans une quantité appropriée de surnageant et transférez dans des tubes de 1,5 mL.
  13. Centrifugez à 3 000 × g pendant 1 minute et aspirez le surnageant.
  14. Lavez les billes cinq fois avec le tampon de lyse BC150 comme suit :
    1. Resuspendez les billes dans un tampon de lyse de 1 mL BC150.
    2. Pour les 4e et 5e lavages, placez les échantillons sur un rotateur tubulaire réglé à 20 tr/min à 4 °C pendant 10 minutes.
    3. Centrifugez à 3 000 × g pendant 1 minute et aspirez le surnageant.
  15. Resuspendez les billes dans un tampon de lyse BC150 à 200 μL.
  16. Prenez 9 μL de la suspension bille/tampon et analysez la teneur en protéines par 15 % de SDS–PAGE, suivie d’une coloration bleue de Coomassie.
  17. Parce que l’apport de protéines dépasse la capacité de liaison des billes, la quantité de protéine liée par volume de billes devrait être similaire selon les échantillons. Quantifier semi--l’intensité des bandes par analyse d’image numérique et ajuster la quantité des billes pour les réactions ultérieures.

6. Préparation de mononucléosomes à partir de HEK293FT cellules

  1. Cultivez HEK293FT cellules dans des vaiselles de culture tissulaire de 15 cm jusqu’à environ 90 % de confluence en utilisant un sérum bovin fœtal à 10 % (FBS) dans un milieu DMEM à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
  2. Les cellules HEK293FT passage précoce sont obtenues commercialement et authentifiées par profilage STR.
    REMARQUE : Un plat de 15 cm produit ~27 millions de cellules, ce qui suffit pour 1 à 2 réactions de tirage. Pour six réactions (y compris les témoins négatifs), préparez au moins trois plats de 15 cm. Si la modification post-traductionnelle (PTM) de l’histone cible est rare ou instable, augmentez le nombre de cellules de 2 à 10× en conséquence.
  3. (Optionnel) Selon la modification des histones d’intérêt, ajouter les inhibiteurs PTM appropriés (Tableau supplémentaire 2) au milieu de culture et incuber pendant 24 heures.
    REMARQUE : Cette étape peut être omise si des PTM d’histones sont présentes.
  4. Lorsque les cellules atteignent près de 100 % de confluence, collectez-les comme suit :
    1. Aspirez le milieu de culture.
    2. Rincez doucement les cellules avec 10 mL de PBS bien froid, puis aspirez.
    3. Ajoutez 5 mL de PBS bien froid.
    4. Grattez les cellules sur de la glace et transférez-les dans un tube de 50 mL (tous les plats peuvent être combinés).
    5. Centrifugeuse à 13 000 × g, 4 °C, pendant 10 minutes.
    6. Jetez le surnageant.
  5. (Optionnel) Procédez immédiatement ou congelez la pastille cellulaire pour une utilisation ultérieure :
    1. Estimez le volume des pellets.
    2. Reposez dans 9× volume de pellets de Buffer G pour atteindre une concentration finale de glycérol de 20 %.
    3. Congelez instantanément dans de l’azote liquide et conservez à −80 °C.
  6. Si vous procédez avec une pastille congelée, décongelez la pastille sur de la glace, centrifugez à 1 300 × g, 4 °C, pendant 5 minutes, puis jetez le surnageant.
  7. Resuspendez le comprimé (frais ou décongelé) dans un volume de 10× de tampon TMSD (40 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mMMgCl 2, 250 mM de saccharose, 1 mM DTT) contenant des inhibiteurs de protéases à l’aide d’une pipette sérologique.
  8. Préparez 10 % de NP-40 dans le tampon TMSD fraîchement, puis ajoutez 0,11 × volume total de réaction pour atteindre une concentration finale de NP-40 de ~1 %.
  9. Incubez la suspension sur un rotateur tubulaire réglé à 120 tr/min à 4 °C pendant 5 minutes.
  10. Mélangez 10 μL de la suspension avec 10 μL de bleu de trypan, et observez au microscope pour surveiller la coloration nucléaire. Assurez-vous que les noyaux sont complètement isolés du cytosol (Figure 3A).
  11. Lorsque 95 % des noyaux sont trypan-bleu-positif, on passe à l’étape suivante. Pour HEK293FT cellules, une incubation de NP-40 à 1 % pendant 5 minutes est généralement suffisante. Pour les autres types cellulaires, vérifiez et ajustez le temps d’incubation.
  12. Centrifugez à 1 300 × g, 4 °C, pendant 5 minutes, puis jetez le surnageant.
  13. Resuspendez le pellet dans un volume de 10× de tampon TMSD.
  14. Répétez les étapes 6.12 à 6.13 cinq fois pour éliminer complètement les résidus de NP-40.
  15. Resuspendez la pellete dans un volume de 5× de la pastille du tampon B.
  16. Ajoutez 1 unité de micro-nucléase (MNase) pour 10 000 noyaux, et incubez dans un bain-marie à 37 °C. Agitez occasionnellement le tube pendant l’incubation pour maintenir les noyaux en suspension uniforme
  17. Aux points de temps indiqués (0,5, 1 et 2,5 h), retirer 50 μL de la réaction dans des tubes de 1,5 mL, ajouter immédiatement 1 μL de 0,5 M EDTA-Na (pH 8,0), et un vortex.
  18. Extraire l’ADN de chaque point temporel en suivant la procédure ci-dessous :
    1. Ajouter 80 μL de H₂O, 30 μL de SDS à 10 %, et 20 μL de 5 M NaCl ; Vortex.
    2. Ajouter 200 μL de phénol/chloroforme ; Vortex complètement.
    3. Centrifugeuse à 20 000 × g, RT, 3 min.
    4. Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL.
    5. Ajouter 1 mL d’éthanol à 100 % et 20 μL d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2) ; Vortex.
    6. Centrifugeuse à 20 000 × g, RT, 5 min.
    7. Retirez le surnageant, ajoutez 1 mL d’éthanol à 70 %.
    8. Centrifugeuse à 20 000 × g, RT, 1 min.
    9. Retirez le surnageant et séchez la pellete à 55 °C avec le bouchon ouvert pendant 10 minutes.
    10. Resuspendez le pellet dans un tampon TE de 50 μL.
  19. Prélever des échantillons sur un gel d’agarose TBE à 1 % pour confirmer la taille de l’ADN mononucléosome (147 pb) (Figure 3B).
  20. (Optionnel) Les efficacités digestives de la micronucléase (MNase) varient selon les types cellulaires, la MNase supplémentaire peut être ajoutée en pleine réaction si nécessaire pour éliminer complètement les polynucléosomes. Par exemple, si les échantillons d'1 h et de 2 h se ressemblent, ajoutez plus de MNase à 3 h.
  21. Lorsqu’une bande prédominante de ~147 pb est observée, ou lorsque la MNase supplémentaire/l’incubation prolongée ne modifie plus la taille des fragments, arrêtez la réaction en ajoutant 0,5 M EDTA-Na (pH8,0) à une concentration finale de 2 mM.
  22. Centrifugeuse à 1 300 × g, 4 °C, pendant 5 minutes. Récupérez le surnageant (S1).
  23. Reposez le pellet dans un volume de 10× de tampon TE + inhibiteurs de protéase et incubez l’échantillon sur un rotateur tubulaire réglé à 20 tr/min à 4 °C pendant au moins 30 minutes.
    REMARQUE : Les efficacités d’extraction des mononucléosomes varient selon les types cellulaires. Le NaCl de 0 à 300 mM peut être utilisé pour extraire efficacement les nucléosomes.
  24. Centrifugeuse à 1 300 × g, 4 °C, pendant 5 minutes. Collectez le surnageant (S2).
  25. Transférez 50 μL chacun de S1 et S2 dans des tubes séparés de 1,5 mL.
  26. Analyser toutes les fractions par électrophorèse sur gel d’agarose (étapes 6.17 à 6.18) pour évaluer la taille de l’ADN, la distribution et l’efficacité de l’extraction. La plupart des mononucléosomes se trouvent dans la fraction S2 (Figure 3C).
  27. Transférez S2 dans des tubes centrifugeuses à grande vitesse et faites tourner à 20 000 × g, 4 °C, pendant 10 minutes pour éliminer le matériau insoluble.
  28. Collectez le surnageant et dialysez contre le tampon de lyse BC150 (sans inhibiteurs) :
    1. Première dialyse : 1 L, 1 h.
    2. Deuxième dialyse : 2 L, pendant la nuit.
  29. Après la dialyse, centrifugez à nouveau à 20 000 × g, 4 °C, pendant 10 minutes pour éliminer tout débris insoluble restant.
  30. Récupérez le dernier surnageant.
  31. Mélangez 5 μL du surnageant avec un tampon de lyse BC150 à 35 μL et 10 μL tampon de Laemmli 5× chauffez à 95 °C pendant 5 minutes, puis chargez 1, 2, 5, 10 et 20 μL sur un gel SDS–PAGE à 15 %.
  32. Charge de 1, 2 et 5 μL de 0,1 mg/mL de BSA dans le tampon de Laemmli comme référence pour l’estimation du rendement.
  33. Colorez avec du bleu Coomassie et estimez le rendement des nucléosomes de manière semi-quantitative à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image (Figure 3D).

7. Pulldown des nucléosomes modifiés

  1. Préparez un tampon bloquant 2× billes en dissolvant 1 g de BSA dans un tampon de lyse BC150 à un volume final de 10 mL, puis en alternant jusqu’à la dissolution complète.
  2. Transférez les billes FLAG-SPIN4-WT et FLAG-SPIN4D82H contenant des quantités molaires équivalentes de protéines (de la section 5, étapes 5.16 à 5.17) dans des tubes séparés de 1,5 mL.
  3. Ajouter un volume égal de billes de contrôle négatives (de la Section 5, étape 10) à l’échantillon FLAG-SPIN4-WT.
  4. Ajustez le volume total de tous les échantillons de billes pour qu’ils soient identiques à l’aide du tampon de lyse BC150.
  5. Ajoutez un volume équivalent de tampon de blocage de billes de 2× à chaque tube contenant des billes et le tampon de lyse BC150.
  6. Incubez les échantillons sur un rotateur tubulaire réglé à 20 tr/min à 4 °C pendant la nuit (O/N).
  7. Décongeler une quantité appropriée de 1× nucléosome extrait de HEK293FT cellules sur la glace. Le volume requis dépend du rapport nucléosome/molaire SPIN4 souhaité. Pour une optimisation initiale, utilisez un rapport molaire de 1:1 entre nucléosome et SPIN4.
  8. Mélangez soigneusement 1× nucléosome avec un volume égal de 2× tampon bloquant les billes.
  9. Combinez le mélange de l’étape 7.8 avec les billes pré-bloquées dans un tube de 15 mL.
  10. Incubez le mélange sur un rotateur tubulaire réglé à 20 tr/min à 4 °C pendant 4 heures ou toute la nuit.
  11. Centrifugeuse à 3 000 × g, 4 °C, pendant 3 minutes.
  12. Jetez soigneusement le surnageant.
  13. Resuspendez les billes dans un tampon de lyse de 1 mL de BC150 et transférez dans des tubes de 1,5 mL.
  14. Lavez les perles trois fois comme suit :
    1. Centrifugez à 3 000 × g, 1 min, puis aspirez le surnageant.
    2. Resuspendez les billes dans un tampon de lyse de 1 mL BC150.
    3. Agitez parfois le tube pour maintenir les billes bien suspendues pendant le lavage.
  15. Lavez les perles deux fois supplémentaires comme suit :
    1. Centrifugez à 3 000 × g, 1 min, puis aspirez le surnageant.
    2. Resuspendez les billes dans un tampon de lyse de 1 mL BC150.
    3. Tournez à 20 tours/min, 4 °C, pendant 10 minutes.
  16. Après lavage, resuspendez les billes en 9 volumes colonnes (CV) de tampon de lyse BC150.
  17. Prenez 160 μL de chaque échantillon, mélangez avec 40 μL de tampon de Laemmli 5× et chauffez à 95 °C pendant 5 minutes.
    REMARQUE : Une élution peptidique flag du complexe protéine-nucléosome est recommandée, donnant des résultats plus propres avec moins de fond.
  18. Centrifugez à 3 000 × g, température ambiante, pendant 5 minutes.
  19. Chargez 5 μL du surnageant sur un gel SDS–PAGE à 15 % et effectuez une coloration à l’argent (Figure 4A).
  20. Chargez 5 μL supplémentaires de surnageant sur un gel SDS–PAGE à 15 %, transférez dans une membrane PVDF, puis sondez avec les anticorps primaires et secondaires appropriés spécifiques aux PTM histones cibles (Figure 4B).

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour étudier les substrats de liaison du SPIN4 humain, le SPIN4 de type sauvage et un mutant dérivé du patient associé au syndrome de surcroissance ont été reconstitués à l’aide d’un système d’expression cellulaire d’insecte Sf9. Plus précisément, il s’agit d’une mutation missense de l’acide aspartique (D) en histidine (H) au résidu 82 (D82H), qui réside dans le premier domaine Tudor de SPIN4, ce qui implique son rôle dans la régulation de la liaison au substrat de SPIN4. Un vecteur bacu...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une méthode efficace en termes de temps et de coûts pour identifier biochimiquement des PTM d’histones spécifiques comme cibles d’une protéine mal caractérisée, et pour évaluer comment sa mutation associée à la maladie affecte l’affinité de liaison de la cible, a été présentée. L’avantage de cette méthode est qu’elle ne nécessite pas de reconstitution coûteuse ou chronophage des nucléosomes synthétiques. Cette approche tirait parti de la commodité des réseaux de peptides PTM d’histones c...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient tous les membres passés et actuels du laboratoire Yu et Jee pour leur soutien technique. J.-R.Y. a été soutenu par le NIH NIGMS Maximizing Investigators' Research Award (MIRA) R35GM160046. OUI. J a été soutenu par l’Hôpital national pour enfants et l’Institut de recherche pour enfants.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes microcentrifuges de 1,5 mLSarstedt72.690.001Expériences générales
Plat de culture tissulaire de 15 cmSarstedt83.3903.300Expériences générales
Tubes centrifugeuses coniques de 15 mLSarstedt62.554.101Expériences générales
Tubes centrifugeuses coniques de 50 mLSarstedt62.548.004Expériences générales
Flasque Erlenmeyer de 500 mLStellar ScientificCT229809Culture cellulaire Sf9
Imageur CCD Amersham ImageQuant 800CytivaIMQ800Système d’imagerie CCD
Gel d’affinité anti-FLAG M2Sigma-AldrichA2220Pulldown biochimique
Anticorps anti-FLAG M2Sigma-AldrichF1804Tache occidentale
AprotinineMedChemExpressHY-P0017Inhibiteur de la protéase
Array Analyze SofrwareMotif actifhttps://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zipAnalyse de données de matrices peptidiques MODified
ASI Agarose LEAlkali ScientificA7700Gel ADN
Système d’expression du baculovirus Bac-to-BacThermo Scientific10359016Expression baculovirale
Chlorhydrate de benzamidineMedChemExpressHY-W018781Inhibiteur de la protéase
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA9647Norme de quantification des protéines
Bromophénol BlueThermo ScientificA18469.08Tampon de Lammeli
Coomassie Brilliant Blue R-250Thermo Scientific20278Coloration en gel Protien
Dithiothréitol (TDT)Sigma-Aldrich & nbsp ;D5545Tampon de lyse
EDTAProduits de recherche RPIE58100Tampon de lyse
Substrat à chimiluminescence améliorée (ECL)CytivaRPN2232Tache occidentale
Milieu de culture cellulaire d’insectes ESF 921Systèmes d’expression96-001Culture cellulaire Sf9
Éthanol (200 proof)Chemical du spectreET107Précipitation de l’ADN
Système d’imagerie EVOS M5000InvitrogenM5000Imagerie générale
Peptide FLAGMedChemExpressHY-P7006Élution par pulldown
GlycérolSigma-Aldrich & nbsp ;G77893Tampon de stockage
Anticorps H3K4me1   ;Motif actif39300Tache occidentale
Anticorps H3K4me2   ;Signalisation cellulaire9725TTache occidentale
Anticorps H3K4me3 & nbsp ;Signalisation cellulaire9751TTache occidentale
HEK293FT cellulesThermo ScientificR70007Lignée de fibroblasts rénaux embryonnaires humains
HEPESSigma-Aldrich & nbsp ;H3375Tampon de lyse
ImageJInstituts nationaux de la santéhttps://imagej.net/ij/download.html  ; Programme de traitement d’image basé sur Java
Hémisulfate de leupeptineMedChemExpressHY-18234AInhibiteur de la protéase
Nucléase microcoque (MNase)NEB  ;M0247SEndonucléase pour la digestion de la chromatine
Modèle 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110Sonication
Réseau peptidique d’histones MODifiedMotif actif13005Dosage de liaison aux protéines
Pepstatine AMedChemExpressHY-P0018Inhibiteur de la protéase
Fraction d’IgG de peroxydase IgG monoclonale de chèvre anti-souris, spécifique à la chaîne légèreJackson ImmunoResearch115-035-174Tache occidentale
pFastBac1-Flag-SPIN4Thermo Scientific10360014Vecteur d’expression baculoviral
pFastBac1-Drapeau-SPIN4-D82HThermo Scientific10360014Vecteur d’expression baculoviral
Phénol : Chloroforme : Alcool isoamylique (25:24:1)Sigma-AldrichP2069Purification de l’ADN
Kit de test protéique Pierce Rapid Gold BCAThermo ScientificPIA53226Quantificaiton protéique
Kit de teinture Pierce SilverThermo Scientific24612Détection des protéines
Inhibiteur de la protéase PMSFThermo Scientific36978Inhibiteur de la protéase
Polyacrylamide GelFabriqué en interneN/AGel protéique
Cellules d’insectes Sf9ATCCCRL-1711Lignée cellulaire d’insectes pour l’expression du baculovirus
Dispositif de dialyse Slide-A-Lyzer MINI, MWCO 10KThermo Scientific69572Dialyse des protéines
Acétate de sodiumSigma-AldrichS8750Précipitation de l’ADN
Chlorure de sodium & nbsp ;Fischer  ;BP358-1Tampons généraux
Dodécyle sulfate de sodium (SDS)Sigma-Aldrich & nbsp ;L3771Tampons généraux
Solution bleue de Trypan (0,4 %)Thermo Scientific15250061Coloration des noyaux

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
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Mots-clés

SPIN4 ProteinHistone ModificationPeptide ArrayNative Nucleosome PulldownTudor DomainHistone ReaderH3K4 MethylationWestern BlotBone Growth RegulationPost Translational Modification

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