Protection des cellules bêta des îlots contre les lésions induites par la surcharge de fer par le gène 3 exprimé maternellement par ARN non codant

Résumé

La surcharge de fer a réduit l’expression de MEG3 dans le tissu pancréatique. MEG3 pourrait jouer un rôle protecteur contre l’apoptose des îlots β cellules induite par le fer, impliquant potentiellement la modulation de la voie NF-ĸB. Ce mécanisme peut contribuer à la dysfonction des îlots chez les patients atteints de β-TM avec surcharge de fer.

Résumé

Les patients atteints de bêta-thalassémie majeure (β-TM) présentent fréquemment un métabolisme anormal du glucose, et des facteurs tels que la surcharge de fer, l’anémie chronique, les déséquilibres hormonaux, le dysfonctionnement hépatique et la résistance à l’insuline associée à l’inflammation sont considérés comme des contributeurs importants au dysfonctionnement des îlots pancréatiques. Les acides ribonucléiques longs non codants (ARNnc) sont de plus en plus reconnus pour leur rôle régulateur dans l’apoptose cellulaire et l’homéostasie du glucose. Cette étude explore la fonction de l’ARNnc, gène 3 exprimé par la mère (MEG3), dans la lésion des îlots β cellules induit par le fer. Un modèle murin à surcharge de fer a été induit par injection intrapéritonéale de dextran de fer. Le dépôt de fer et les lésions tissulaires dans le pancréas ont été évalués à l’aide de la coloration bleu de Prusse et d’hématoxyline et d’éoine, et l’expression de MEG3 a été quantifiée par réaction en chaîne par transcription inverse par polymérase (RT-PCR). In vitro, les cellules MIN6 ont été transfectées avec de petits ARN interférants MEG3 pour examiner l’apoptose via cytométrie en flux, et l’activité de la voie de signalisation NF-kappa (ĸ)B a été évaluée par Western blotting. La coloration histologique a confirmé une déposition importante de fer et des lésions structurelles dans le tissu pancréatique des souris surchargées en fer. L’analyse RT-PCR a révélé une réduction marquée de l’expression de MEG3 dans le pancréas (p<0,05). In vitro, le knockdown de MEG3 a significativement augmenté l’apoptose des cellules MIN6 par rapport aux témoins. L’analyse par Western blot a montré un niveau élevé de NF-ĸB, indiquant l’activation de la voie de signalisation NF-ĸB dans les cellules silencieuses par MEG3. Ces résultats suggèrent que la régulation à la baisse du MEG3 pourrait renforcer l’apoptose des îlots β-cellules via la signalisation NF-ĸB en conditions de surcharge de fer. Le gène MEG3 pourrait jouer un rôle protecteur contre l’apoptose des îlots β induite par le fer, impliquant potentiellement la modulation de la voie NF-ĸB. Ce mécanisme peut contribuer à la dysfonction des îlots chez les patients atteints de β-TM avec surcharge de fer.

Introduction

Les bêta(β)-thalassémies sont un groupe de troubles hématologiques héréditaires caractérisés par une production réduite ou absente de la chaîne de β-globine, entraînant une anémie chronique et une érythropoïèse^{inefficace 1}. Chez les patients atteints de β-thalassémie majeure (β-TM) dépendante des transfusions, les transfusions sanguines répétées et l’hémolyse entraînent fréquemment une surcharge systémique de fer, ce qui peut endommager plusieurs organes et contribuer à diverses complications endocriniennes, notamment un métabolisme anormal du^{glucose 2}. De plus, l’anémie chronique augmente la charge sur le pancréas, les déséquilibres hormonaux affectant la régulation du glucose, les dysfonctionnements hépatiques altèrent le métabolisme du glucose et la résistance à l’insuline induite par les processus inflammatoires peuvent tous contribuer à l’hyperglycémie chez les patients atteints de β-TM. Par conséquent, les troubles métaboliques du glucose chez β-TM sont de nature^{multifactorielle 2,3}. Une méta-analyse récente a rapporté que la prévalence de la glycémie à jeun altérée, de la tolérance au glucose (IGT) et du diabète sucré (DM) chez les patients atteints de β-TM était respectivement de 17,21 %, 12,46 % et 6,54 %, indiquant une augmentation du fardeau des troubles métaboliques du glucose^{dans cette population 3}.

Malgré sa pertinence clinique croissante, les mécanismes sous-jacents du métabolisme anormal du glucose chez la β-TM restent peu compris. Des études antérieures ont démontré que la surcharge chronique de fer, principalement due à des transfusions répétées et à l’hémolyse, peut entraîner un dépôt excessif de fer dans le pancréas, en particulier dans les cellules β des îlots. Cette accumulation favorise la génération d’espèces réactives de l’oxygène et aggrave le stress oxydatif, déclenchant un dysfonctionnement mitochondrial, altération de la synthèse et de la sécrétion d’insuline, et induisant finalement une apoptose β-cellulaire et une carence en^{insuline 4,6}. De plus, la surcharge de fer peut contribuer à la résistance périphérique à l’insuline par une inflammation oxydative médiée par le stress et des interférences avec les voies de signalisation de l’insuline. Cependant, les voies moléculaires reliant la surcharge de fer à la lésion des cellules β et à la dysrégulation systémique du glucose sont complexes et restent à élucider complètement. Les acides ribonucléiques longs non codants (ARNnc) – une classe de transcrits plus longs que 200 nucléotides qui ne codent pas pour les protéines – sont devenus des régulateurs importants dans divers processus biologiques, notamment l’homéostasie du glucose, la sécrétion d’insuline et les réponses au stress ^{oxydatif 7,8,9}. Les cellules β des îlots pancréatiques sont connues pour exprimer plus de 1 000 ARNnc, ce qui suggère leur rôle régulateur potentiel dans le maintien de la fonction^{endocrine 10}.

Cependant, on sait peu de choses sur les profils d’expression des ARNnc et leurs rôles fonctionnels dans le contexte des dommages aux cellules β des îlots induits par une surcharge de fer, en particulier chez les β-TM. Des avancées récentes ont révélé que l’ARNlnc MEG3 (MEG3) favorise la sécrétion d’insuline et inhibe l’apoptose 11 des cellules β pancréatiques. Cependant, son effet sur les cellules β pancréatiques en cas de surcharge de fer reste insaisissable. Dans d’autres contextes pathologiques, il a été démontré que les ARNlnc interagissent avec des voies de signalisation clés telles que NF-kappa (ĸ)B, JNK et Nrf2, qui sont également impliquées dans le stress oxydatif et les lésions cellulaires liées à la surcharge de fer 12,13,14. Plus précisément, NF-ĸB est un facteur de transcription central activé sous stress oxydatif et a été impliqué dans l’apoptose des cellules β en conditions de surcharge en fer 15,16,17. Par conséquent, cette étude étudie que la régulation à la baisse du MEG3 pourrait renforcer l’apoptose des cellules β îlots via la signalisation NF-ĸB en conditions de surcharge fer. Ces travaux pourraient apporter de nouvelles perspectives sur les mécanismes moléculaires sous-jacents au métabolisme anormal du glucose chez la β-TM.

Protocole

Les protocoles expérimentaux utilisés dans la présente étude ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’Hôpital général de Hainan (protocole n° 2021-239). Le Guide des National Institutes of Health des États-Unis pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ainsi que la Déclaration d’Helsinki ont été strictement suivis dans toutes les procédures expérimentales. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Modèle animal et conception expérimentale

Trente-six souris mâles C57BL/6J (âgés de 4 semaines, environ 20 g) ont été utilisés dans cette étude. Toutes les souris étaient hébergées dans des conditions de laboratoire standard (20–25 °C, 50 %–65 % d’humidité relative, cycle clair/obscur de 12 heures) avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Après une période d’acclimatation de 7 jours, les souris ont été divisées aléatoirement en deux groupes (n=18 par groupe) : le groupe de surcharge en fer (groupe modèle), qui recevait des injections intrapéritonéales de dextrane de fer (0,2 g/kg) deux fois par semaine pendant 4 semaines ; et le groupe témoin, recevant des volumes équivalents de solution salée normale par injection intrapéritonéale. Après 4 semaines, les souris ont été euthanasiées et des tissus pancréatiques prélevés pour une analyse ultérieure.

2. Mesure du fer sérique

Des échantillons sanguins ont été prélevés dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie pentobarbitale à 1 % pendant le diestrus. Après avoir été laissé à température ambiante pendant 1 heure, le sang a été centrifugé à 4 °C, 3 000 tr/min pendant 15 minutes. Le sérum était séparé et stocké à -80 °C. Les concentrations sériques de fer ont été déterminées à l’aide d’un kit de test colorimétrique de fer selon le protocole du fabricant.

3. Analyse histologique

Les échantillons de tissu pancréatique ont été immergés dans 4 % de paraformodéhyde pour fixation, suivis d’une implantation de paraffine avant la préparation de la section. Des sections de tissu en série d’une épaisseur allant de 4 à 5 μm ont été obtenues et traitées par des procédures standard de déparaffinisation et de réhydratation. Un examen histomorphologique a ensuite été réalisé à l’aide de coloration par hématoxyline et éosine, tandis que le dépôt de fer dans les tissus pancréatiques a été évalué par coloration au bleu de Prusse selon les protocoles de coloration histologique conventionnels.

4. Culture cellulaire et transfection de petits acides ribonucléiques interférents

Les β pancréatiques de souris MIN6 ont été cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco à haute glycémie, complétés avec 15 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 10 mM HEPES, 50 mM pyruvate de sodium et 50 μmol/L β-mercaptoéthanol. Toutes les expériences ont été réalisées à 80 % de confluence cellulaire. À chaque fois pendant la culture cellulaire, on prélève entre 6 et 8 ml de milieu de culture. Les cellules étaient maintenues à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO₂. Pour les études fonctionnelles, les cellules MIN6 en phase de croissance logarithmique ont été transfectées avec un petit ARNn interférant (si) spécifique à lncRNA (ciblant des ARNnc sélectionnés sur la base des résultats de microarrays ; Groupe inhibiteur) ou siRNA témoins négatif (groupe inhibiteur NC) utilisant Lipofectamine 2000, selon les instructions du fabricant. Après une culture pendant 24 heures, les cellules ont été analysées par réaction en chaîne quantitative par polymérase (qRT-PCR) ou western blot pour déterminer l’efficacité du knockdown. Les séquences cibles de ce siRNA étaient les suivantes : siMEG3 : GCGUCUUCCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACAGGAAGGCTT ; siNC : UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACGUUCGGAGAATT. Chaque expérience a été réalisée en triple exemplaire et répétée trois fois.

5. Essai de réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse

L’ARN total a été extrait d’échantillons de tissu pancréatique et de cellules MIN6 à l’aide d’un réactif d’isolement d’ARN à base de phénol disponible dans le commerce, conformément aux instructions du fabricant. L’ADN complémentaire a été synthétisé à l’aide d’un kit de transcription inverse dans un volume total de réaction de 20 μL. Après transcription inversée, la concentration d’ADNc de la plupart des échantillons était d’environ 1 μg/μL selon l’analyse de quantification de l’échantillon. Par la suite, 1 μL de gabarit d’ADNc a été utilisé pour l’amplification quantitative en temps réel par PCR. La qRT-PCR a été réalisée à l’aide d’un kit de détection PCR à base de SYBR Green dans les conditions de cycle suivantes : 95 °C pendant 30 s, 90 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 34 s, et 68 °C pendant 30 s. Les niveaux relatifs d’expression génique ont été déterminés à l’aide de la méthode du cycle seuil comparatif (méthode ^2-ΔCT ). Le GAPDH a été utilisé comme gène de référence interne pour la normalisation des données PCR en temps réel. Toutes les procédures expérimentales étaient réalisées selon les protocoles des fabricants respectifs, et chaque expérience était répétée indépendamment au moins trois fois. Les séquences d’amorces utilisées dans cette étude sont listées dans les Panneaux Supplémentaires 1 et Tableau 2.

6. Kit de comptage cellulaire - Essai 8

La capacité de prolifération cellulaire a été déterminée à l’aide d’un test de comptage cellulaire kit-8 conformément aux directives du fabricant. En résumé, les cellules MIN6 ont été placées dans des plaques de culture de 96 puits à une densité de 5 x 10^cellules 3 par puits après transfection avec si-MEG3 ou si-NC et maintenues pendant 24 heures. Aux moments désignés, 10 μL de réactif de viabilité cellulaire étaient introduits dans chaque puits, et les plaques étaient incubées à 37 °C pendant 2 heures. Les valeurs d’absorbance ont ensuite été mesurées à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. La viabilité cellulaire a été calculée en pourcentage par rapport au groupe témoin.

7. Détection de l’apoptose par cytométrie en flux

Les modifications apoptotiques des cellules MIN6 ont été examinées à l’aide d’un kit de détection d’apoptose Annexin V-FITC/PI selon les instructions du fabricant. Après 48 heures de transfection d’ARNsi, les cellules ont été prélevées, lavées deux fois avec du sérum physiologique tampon phosphaté à froid, puis remises en suspension dans un tampon de liaison. Par la suite, les cellules ont été incubées avec 5 μL d’annexine V-FITC et 5 μL d’iodure de propidium pendant 15 minutes à température ambiante dans des conditions sombres. Immédiatement après la coloration, les échantillons ont été analysés par cytométrie en flux. Les populations cellulaires apoptotiques précoces et tardives ont été quantifiées à l’aide d’un logiciel d’analyse cytométrique en flux. La proportion de cellules apoptotiques a ensuite été calculée pour des comparaisons intergroupes. Chaque expérience a été menée indépendamment trois fois.

8. Analyse des taches occidentales

Les expériences Western blot ont été réalisées selon les protocoles¹⁸ précédemment rapportés. Les cellules ont d’abord été digérées avec de la trypsine, collectées, puis lysées sur glace à l’aide d’un tampon de lyse par immunoprécipitation radio. Les concentrations de protéines ont été quantifiées, et des quantités équivalentes de protéines ont été soumises à une séparation sur des gels d’électrophorèse en gel de dodécyle à 10 % de sulfate de sodium et de polyacrylamide avant le transfert sur des membranes de fluorure de polyvinylidène. Après le blocage membranaire, des échantillons ont été incubés avec des anticorps primaires contre NF-κB (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), caspase-3 (1:1000) et glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (1:2000) aux rapports de dilution indiqués, suivis d’une incubation avec des anticorps secondaires liés à la peroxydase du raifort. Les signaux protéiques étaient détectés à l’aide d’un système de chimiluminescence et quantifiés avec le logiciel ImageJ. Le GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge interne, et les niveaux d’expression protéique étaient exprimés par des changements de pli par rapport au groupe témoin.

9. Analyse statistique

Les données étaient exprimées en moyenne ± écart-type (DE). Des comparaisons entre groupes ont été réalisées à l’aide du test Mann–Whitney^{U 19} à l’aide d’analyses statistiques. Une valeur p <0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Évaluation du modèle murin en surcharge de fer et mesure de l’expression maternelle du gène 3 dans les tissus pancréatiques

Pour étudier le rôle de MEG3 in vivo, nous avons établi un modèle de surcharge de fer chez la souris via injection intrapéritonéale de dextran de fer. Comparé au groupe témoin, les niveaux de fer sérique dans le groupe modèle étaient significativement augmentés (p<0,05) (Figure 1A). L’examen histologique a révélé un dépôt ...

Discussion

Un métabolisme anormal du glucose est une complication fréquente et grave chez les patients atteints de β-TM, se manifestant souvent sous forme d’IGT ou de DM. Dans cette étude, nous avons constaté qu’une surcharge de fer entraînait des lésions pancréatiques et diminuait significativement l’expression de l’ARNncRNA MEG3 dans le tissu pancréatique, accompagnée d’une augmentation de l’apoptose des cellules β des îlots. De plus, le knockdown de MEG3 dans les cellules MIN6 favorisait l’apopt...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1M Tris-HCL (pH=6.8)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	T1020
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
50bp DNA Ladder	TIANGEN	MD108
6×DNA Loading Buffer	TIANGEN	GH101-01
6×DNA Loading Buffer	TRANS	GH101-01
-80ºC refrigerator	BIOBASE	BDF-86V348
ABI 7500 real-time PCR system	Applied Biosystems, USA
Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit	MULTI SCIENCES	AP101-100-kit
BCA Protein Assay Kit	Elabscience Biotechnology Co.,Ltd.	E-BC-K318-M
Biopulverizer	biospec
BSA	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A8020
C57BL/6J male mice	Gempharmatech Co,Jiangsu,China
CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit	KeyGEN BioTECH	KGA317
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
DMEM	KeyGEN BioTECH
Flow cytometry	ACEA Biosciences, USA	NovoCyte 2060R
Fluorescence PCR instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai
Glycine	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	G8200
High-capacity cDNA reverse transcription kit	Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Servicebio	GB23301	1/2000
HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Servicebio	GB23303	1/2000
Human LncRNA Array V5.0	Arraystar,Rockville, Maryland, USA
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Invitrogen	L3000015
Microarray scanner	Agilent Technologies,California, USA
MIN6 cell	procell	KGM12800N
Mini-Bead-Beater-16	biospec
Mouse Anti-GAPDH	TransGen Biotech	HC301	1/2000
NanoDrop spectrophotometer	NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA	ND-2000
PAGE Pre-Solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	A1010
Primers	Generay Biotech,Anhui, China
PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser	CWBIO,Jiangsu, China
PVDF	Millipore	IPVH00010
Rabbit Anti Bax	proteintech	50599-2-ig	1/5000
Rabbit Anti Bcl-2	abcam	ab194583	1/1000
Rabbit Anti Caspase3	abcam	ab184787	1/2000
Rabbit Anti P65	abcam	ab32536	1/8000
Rabbit Anti p-P65	Affinity	af2006	1/1000
TB Green Premix Ex Taq II	TaKaRa, Japan
TRIzol	Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA
TRIzol reagent	CWBIO,Jiangsu, China
Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument	Bio-Rad Laboratories, Shanghai	Chemi DocTM XRS+
Ultraviolet spectrophotometer	NanoPhotometer	NP80