Isolation robuste et identification multiplexée des cellules rares circulantes via microfluidique centrifuge continue et immunocytochimie hydrogel

Résumé

Cette étude présente un flux de travail centrifuge microfluidique continu pour une isolation et une identification efficaces des cellules rares en circulation. Le système permet un contrôle précis des liquides et minimise la perte cellulaire, permettant une analyse simultanée de plusieurs sous-types de CRC, y compris les CTC et les cCAF, pour une meilleure précision diagnostique.

Résumé

Les cellules rares circulantes (CRC), y compris les cellules tumorales circulantes (CTC) et les fibroblastes associés au cancer circulant (cCAF), sont des biomarqueurs prometteurs pour le diagnostic et le pronostic du cancer. Cependant, leur abondance extrêmement faible et leur hétérogénéité phénotypique rendent l’isolation efficace et l’analyse multiparamétrique techniquement difficiles. Ici, nous présentons un flux de travail centrifuge microfluidique continu pour l’isolement séquentiel et l’identification des CRC à partir du sang entier. La cartouche comprend cinq chambres interconnectées avec des valves contrôlables qui permettent une manipulation précise du milieu gradient de densité et des couches de sang pendant la centrifugation. Basé sur une plateforme d’enrichissement précédemment validée, le flux de travail actuel intègre l’immobilisation cellulaire à base d’hydrogel avec l’immunocytochimie multiplexée afin de soutenir l’identification et la caractérisation en aval de plusieurs sous-types de CRC, y compris les CTC et les cCAF. Après l’isolement, les cellules sont immobilisées dans une matrice hydrogel pour soutenir la rétention cellulaire lors d’immunocolorations répétées et d’analyses par imagerie. Grâce à ce flux de travail, les CTC et les cCAF ont été identifiés à partir du même échantillon, démontrant la faisabilité d’une analyse intégrée de plusieurs populations de cellules rares circulantes au sein d’un seul flux de travail de biopsie liquide. Cette plateforme offre une approche pratique et reproductible pour la caractérisation en aval des cellules rares dans les applications de biopsie liquide.

Introduction

Les cellules rares circulantes (CRC) sont définies comme des cellules qui existent dans la circulation sanguine à des fréquences extrêmement faibles par rapport aux composants sanguins normaux tels que les globules rouges, les globules blancs et les plaquettes. Les CRC proviennent de sources diverses, telles que les sous-produits de processus biologiques, le remodelage tissulaire, la cicatrisation des plaies ou les lésions vasculaires. Des exemples représentatifs incluent les cellules endothéliales circulantes, les cellules fœtales circulantes, les mégacaryocytes, les érythroblastes et diverses cellules progénitrices ou souches ^1,2. Bien que la seule existence des CCR ne reflète pas nécessairement un état pathologique, des niveaux élevés indiquent fréquemment des conditions physiologiques ou pathologiques^{anormales 3,4}. En conséquence, la détection et la caractérisation sensibles des CRC fournissent des informations précieuses sur les processus physiologiques et pathologiques dynamiques se produisant dans le corps.

Parmi les sous-types de CRC, les cellules tumorales circulantes (CTC) et les fibroblastes associés au cancer circulant (cCAF) sont des biomarqueurs majeurs du cancer. Les CTC fournissent une preuve directe de la dissemination des cellules tumorales et sont largement^{étudiées 5}. Les modifications dans l’énumération des CTC sont souvent associées à une détection précoce, au pronostic et à la surveillance de la réponse^{thérapeutique 6}. Parallèlement, les cCAF représentent des composants stromales libérés dans la circulation sanguine, reflétant les interactions entre le microenvironnement tumoral et la formation de la niche^{pré-métastatique 7}. Cependant, comparées aux CTC, la recherche sur les cCAF reste limitée, et leur utilité clinique ne commence que^{d’être explorée 8}.

Les CTC et les cCAF peuvent fournir des informations biologiques complémentaires dans la biopsie liquide, car les CTC reflètent la diffusion des cellules tumorales et les traits métastatiques, tandis que les cCAF peuvent représenter des signaux de progression associés au microenvironnement tumoral et un remodelage stromal. L’analyse simultanée de ces deux populations de cellules rares circulantes pourrait donc soutenir une compréhension plus intégrée de la progression du cancer que l’analyse de l’une ou l’autre des seules populations. Cependant, leur utilité clinique et translationnelle est fortement limitée par leur extrême rareté dans le sang périphérique, l’absence de marqueurs universellement acceptés des cCAF, et l’hétérogénéité significative de l’expression des marqueurs à travers les sous-populations cellulaires, ce qui entrave ensemble une identification fiable. Ainsi, minimiser la perte cellulaire lors de l’enrichissement et de l’identification est essentiel pour garantir une analyse robuste et fiable. De plus, une caractérisation complète de la diversité fonctionnelle et des marqueurs des CTC et des cCAF est essentielle pour élucider leur rôle dans les métastases et pour développer des biomarqueurs cliniquement^{significatifs 8,9}.

Ici, nous présentons une méthode pour l’isolation simultanée des cCAF et des CTC ^10,11, combinée à l’identification multi-marqueur par l’encapsulation hydrogel de cellules rares (ICC)¹². Les méthodes actuelles d’isolation des CRC rencontrent souvent des limitations techniques, notamment la perte cellulaire lors du traitement en plusieurs étapes, la capture restreinte de cellules phénotypiquement hétérogènes, et le biais de sélection associé aux stratégies d’enrichissement dépendantes des marqueurs. En revanche, la plateforme centrifuge microfluidique continue utilisée dans cette étude repose sur un cadre d’enrichissement complet, réduisant ainsi la dépendance aux marqueurs conventionnels de sélection positive. La performance analytique et de flux de travail de la plateforme d’enrichissement sous-jacente a été décrite dans nos études^{précédentes 9}.

S’appuyant sur cette plateforme validée, la présente étude se concentre sur l’intégration de l’immobilisation cellulaire à base d’hydrogel et de l’immunocytochimie multiplexée afin de permettre l’isolement et l’identification complets de multiples populations de cellules rares circulantes, y compris les CTC et les cCAF, au sein d’un flux de travail unifié. En combinant enrichissement, rétention cellulaire stable et analyses répétées compatibles avec la coloration, ce protocole offre un cadre pratique pour l’analyse intégrée des cellules rares à partir d’échantillons de biopsie liquide.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des prélèvements de sang humain provenant de patients et de donneurs en bonne santé ont été menées conformément aux directives du Conseil d’Éthique Institutionnelle (IRB) de l’hôpital Severance. Le protocole de l’étude a été approuvé par le Conseil d’Éthique Institutionnel de l’Hôpital de Séparation (IRB n° 4-2013-0059). Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de l’appareil

1. Appuyez sur l’interrupteur d’alimentation pour allumer l’instrument.
2. Activez l’interrupteur d’enclenchement laser , puis allumez l’interrupteur d’alimentation laser .
3. Lance le logiciel d’exploitation et confirme que le système s’initialise normalement.
4. Depuis l’interface logicielle principale, sélectionnez Opération du dispositif et choisissez le protocole prédéfini pour les échantillons de sang total standard EDTA.

2. Fonctionnement de l’appareil -^1re étape

REMARQUE : Les détails des positions d’entrée et de la structure des cartouches sont présentés à la Figure 1A.

1. Depuis l’entrée 6, ajoutez 2 mL de réactif A (média du gradient de densité) à la chambre initiale.
2. Depuis l’entrée 8, ajoutez 875 μL de réactif A à la chambre d’appauvrissement.
3. Montez la cartouche sur le support à disques, en assurant un équilibre adéquat pour la centrifugation.
4. Appuyez sur le bouton Porte du CTCeptor pour ouvrir le support, puis montez le rack de disques sur le CTCeptor et fixez-le avec les vis de fixation.
5. Appuyez sur le bouton Porte pour fermer le support, puis exécutez l’étape Spin Down avec le logiciel CTCeptor (environ 30 s).
6. Après avoir confirmé que le réactif A a été transféré dans la partie inférieure de la chambre initiale, relâchez les vis de fixation et retirez le rack de disques de l’instrument tout en maintenant la cartouche montée.

3. Fonctionnement de l’appareil -^2e étape

1. Avant de manipuler des échantillons de sang, effectuez toutes les procédures dans un cabinet de sécurité biologique certifié et portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, une blouse de laboratoire et une protection oculaire, conformément aux directives institutionnelles de biosécurité.
2. Une fois la cartouche retirée de l’instrument, injectez 3 mL de sang dans la chambre initiale par l’entrée 6.
3. Montez le rack de disques sur le CTCeptor et fixez-le à l’aide des vis de fixation.
4. Exécutez l’étape de retrait des globules rouges avec le logiciel CTCeptor (environ 40 minutes). Au cours de cette étape, la centrifugation sépare le plasma, les globules rouges et les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à l’intérieur de la cartouche, et la fraction contenant le PBMC est transférée dans la chambre suivante pour une déplétion ultérieure des leucocytes.
5. Après avoir terminé l’étape de retrait des globules rouges, retirez le rack de disques de l’instrument.

4. Fonctionnement du dispositif -^3e étape

1. Désinfectez soigneusement la zone de travail pour maintenir la stérilité.
2. Manipuler le réactif B (billes d’isolation leucocytaire) pour assurer une suspension homogène.
3. Préparez le tampon de lavage en mélangeant Ca²⁺/^{Mg 2}⁺-free DPBS avec 0,1 % de BSA et 2 mM d’EDTA (pH 7,4).
4. Transférez le volume désiré du réactif B dans un tube de 1,5 mL (par exemple, 50 μL par cartouche).
5. Ajoutez le tampon de lavage à cinq fois le volume du réactif B, et mélangez doucement en pipettant.
6. Placez le tube sur un support magnétique pendant 1 minute pour permettre aux billes du réactif B de s’accumuler, puis jetez soigneusement le surnageant.
7. Résuspendez les billes dans le tampon de lavage à un volume égal au volume initial des billes.
8. Conservez les billes à 4 °C jusqu’à utilisation.
9. Juste avant utilisation, mélangez 50 μL des billes préparées avec 50 μL de DPBS, puis chargez 100 μL du mélange dans l’entrée 7.
10. Montez le rack de disques sur le CTCeptor et fixez-le à l’aide des vis de fixation.
11. Exécutez l’étape de retrait des globules blancs avec le logiciel CTCeptor (environ 50 minutes). Dans cette étape programmée, les billes d’isolation des leucocytes chargées sont mélangées avec la fraction contenant le PBMC en secouant pour favoriser la liaison bille–globule blanc, suivies d’un retrait par centrifugation de la fraction de globules globulaires lié au bille.
12. Après avoir terminé l’étape de retrait des globules blancs, retirez le rack de disques de l’instrument.

5. Récupération d’échantillons

1. Insérez une pointe de pipette dans la sortie 9 de la chambre finale et resuspendez le contenu, puis transférez l’échantillon collecté dans un tube de 15 mL.
2. Injectez 2 mL de DPBS dans la sortie 9, rincez soigneusement la chambre en pipettant, puis transférez le lavage dans le même tube de 15 mL.
3. Répétez l’étape de lavage deux fois.
4. Ajustez le volume du liquide collecté dans le tube de 15 mL à 14 mL avec un DPBS, bouchez le tube et mélangez doucement par inversion.
5. Centrifugez le tube à 380 × g pendant 4 minutes à température ambiante.
6. Retirez soigneusement le surnageant, ne laissant qu’environ 1 mL, et utilisez la suspension restante pour l’analyse en aval.

6. Identification des CRC

1. Pour préparer le pré-polymère hydrogel, mélangez Ca^2⁺/Mg 2^⁺-free DPBS, la solution A (prépolymère d’immunocytochimie de la pellicule hydrogel) (HypICC) et le photoinitiateur dans un ratio de 80:20:1.
2. Mélangez 870 μL de suspension CRC avec un polymère pré-hydrogel de 270 μL.
3. Transférez le mélange dans la chambre HypICC et centrifugez à 500 × g pendant 5 minutes pour permettre aux cellules de se déposer sur la plateforme.
4. Insérez le contrôleur d’épaisseur dans la chambre HypICC pour régler l’épaisseur de l’hydrogel.
5. Irradiez l’échantillon avec de la lumière UV (365 nm) pendant 20 à 30 secondes depuis le fond pour réticuler la couche d’hydrogel.
6. Retirez le contrôleur d’épaisseur et lavez les cellules encapsulées en hydrogel trois fois avec du DPBS.
7. Fixez les cellules avec du paraformodéhyde (PFA) à 4 % pendant 10 minutes à température ambiante, puis lavez les échantillons trois fois avec du DPBS, 10 minutes chacun.
8. Perméabiliser les cellules avec 0,05 % de Triton X-100 pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, lavez les échantillons trois fois avec du DPBS, 10 minutes chacun.
9. Bloquez les échantillons avec 2 % de BSA pendant 1 h à température ambiante.
10. Incubez les échantillons avec des anticorps primaires toute la nuit à 4 °C.
11. Lavez les échantillons cinq fois avec du DPBS, 20 minutes par lavage.
12. Colorez les noyaux avec du Hoechst pendant 10 minutes à température ambiante, puis lavez les échantillons trois fois avec du DPBS, 10 minutes chacun.
13. Si nécessaire, l’incubation secondaire des anticorps peut être réalisée dans les mêmes conditions nocturnes que l’incubation primaire des anticorps.
14. Effectuer l’imagerie microscopique à fluorescence et identifier les CRC.

7. Immunocoloration multiplex des CRC

1. Après immunocoloration et imagerie, les CRC peuvent subir une nouvelle série de coloration par anticorps après la trempe.
2. Préparez une solution de trempe composée de 4,5 %_d’H2O2 et 24 mM de NaOH dans du PBS.
3. Retirez le DPBS de la chambre HypICC et ajoutez la solution de trempe.
4. Incubez pendant 1 heure à température ambiante sous une lumière blanche avec des secousses.
5. Remplacez la solution de trempe et incubez pendant une heure supplémentaire dans les mêmes conditions.
6. Lavez les échantillons quatre fois avec du DPBS pendant 10 minutes par lavage.
7. Recommencez la procédure d’immunocoloration à partir de l’étape de blocage en utilisant un BSA à 2 %.

Résultats

La figure 1A montre une image d’une seule cartouche utilisée pour l’isolation des cellules rares. La cartouche se compose de cinq chambres individuelles reliées par des microcanaux et des valves contrôlables qui régulent le débit du liquide. La structure de la cartouche est la suivante : (1) une chambre à plasma qui collecte le plasma séparé du sang total ; (2) une chambre initiale dans laquelle le sang total est séparé en couches de plasma, de globules roug...

Discussion

Les CRC sont des biomarqueurs importants ayant une valeur potentielle tant pour le diagnostic que pour le pronostic du cancer. Pour améliorer l’utilité clinique de l’analyse des CRC, il est cependant important de couvrir une gamme plus large de populations de CRC phénotypiquement diverses et de soutenir la caractérisation multiparamétrique parallèle¹³. De plus, de plus en plus de preuves en onco-immunologie indiquent que les composants immunitaires et le microenvi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
15 mL Conical Tube	SPL	50015
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28908
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-545-152
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-585-003
Bovine Serum Albumin	GenDepot	A0100-010
CD45 antibody	Biolegend	304060
CellTracker Green CMFDA	Invitrogen	C7025
CTCD	CTCELLS	CTD-C103	Cartouche de disque
CTCD rack	CTCELLS	CTDR-CM3	Rack à disques
CTCeptor	CTCELLS	CTM-C2203	CTCeptor
CTR-S Reagent A	CTCELLS	CTR-S1001	Média de gradient de densité
CTR-S Reagent B	CTCELLS	CTR-S1002	Billes d'isolement leucocytaire
FAP antibody	Invitrogen	PA5-99313
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
HypICC Photoinitiator	CTCELLS	CTR-G1002
HypICC Solution A	CTCELLS	CTR-G1001
HypICC Unit	CTCELLS	CTH-V01	Chambre HypICC
Latex glove	Ansell	93743080
Magnetic stand			Fabriqué en interne à l'aide d'une imprimante 3D
Manual Pipetting  (0,5-10 µL)	Eppendorf	3120000020
Manual Pipetting  (100-1000 µL)	Eppendorf	3120000062
Manual Pipetting  (10-100 µL)	Eppendorf	3120000046
Manual Pipetting  (20-200 µL)	Eppendorf	3120000054
Manual Pipetting  (2-20 µL)	Eppendorf	3120000038
pancytokeratin antibody	Invitrogen	53-9003-82
PBS (Phosphate Buffered Saline Solution)	Welegene	LB001-02
SMA antibody	Invitrogen	PA5-18292
Tip, 10 µL	TipOne	9104020333
Tip, 1250 µL	TipOne	9104020740
Tip, 200 µL	TipOne	9104020422
Triton X-100	Signma	X100-100ML
Whole Blood			Stocké à 4-8 °C en le collectant dans de l'EDTA
β actin antibody	abcam	ab8226