Une méthode optimisée pour isoler l’épithélium urétral chez la souris femelle pour l’analyse unicellulaire et immunofluorescence

Résumé

Ce protocole propose une méthode optimisée pour isoler la muqueuse épithéliale de l’urètre de la femelle adulte de souris pour des analyses en aval, incluant la cytométrie en flux, l’immunocoloration et la culture d’organoïdes. Les méthodes ont permis de produire des cellules épithéliales urétrales enrichies et viables, comme en témoignent l’analyse de cytométrie en flux, l’imagerie de montage complet et la formation efficace d’organoïdes.

Résumé

L’urètre, tapissé de cellules épithéliales, sert de canal pour l’évacuation de l’urine par le corps. La muqueuse épithéliale de l’urètre comprend des types cellulaires distincts avec des signatures géniques indiquant un rôle dans la défense antimicrobienne et immunitaire. Les macrophages résidents intégrés dans la couche épithéliale urétrale représentent un sous-type transcriptionnellement distinct, avec des rôles supposés dans la surveillance immunitaire et la présentation des antigènes. Les agents pathogènes urinaires remontent l’urètre pour atteindre la vessie. Une étude de la muqueuse épithéliale urétrale et des cellules immunitaires associées éclairera les mécanismes de défense de l’hôte dans les voies urinaires inférieures. Un objectif central de ce protocole est de fournir des méthodes optimisées pour disséquer l’urètre de la souris femelle et isoler la muqueuse épithéliale pour des analyses en aval. Le protocole décrit une méthode optimisée pour isoler le tissu épithélial de l’urètre de la souris femelle par une séparation enzymatique et mécanique douce. Après l’isolement épithélial, des méthodes pour une digestion enzymatique douce de l’épithélium urétral isolé et des cellules immunitaires associées afin d’obtenir des suspensions unicellulaires à haute viabilité sont décrites. Le protocole détaille également les méthodes d’analyse par cytométrie en flux des cellules épithéliales urétrales isolées de la souris et des cellules immunitaires associées à l’épithélial. De plus, des méthodes pour générer des organoïdes épithéliaux urétriels 3D stratifiés à partir de cellules épithéliales isolées sont présentées ici. Le protocole détaille également une méthode optimisée pour l’immunocoloration complète des feuilles épithéliales urétrales, qui peut être utilisée pour observer la morphologie et les structures moléculaires de l’épithélium urétrale de la souris et des cellules immunitaires associées. Dans l’ensemble, les méthodes décrites ici pour l’isolement et la digestion unicellulaire des cellules épithéliales urétrales de souris permettent des analyses en aval, notamment l’immunocoloration, la cytométrie en flux, la génération d’organoïdes et le séquençage d’ARN unicellulaire.

Introduction

Le voile urinaire inférieur de la souris (LUT) se compose de deux parties : la vessie et l’urètre. Pendant les stades embryonnaires, les structures de la LUT se développent à partir de la cloaque, une structure transitoire dérivée de l’endoderme située au niveau de l’intestin caudal. La portion ventrale de la cloaque, le sinus urogénital, forme la vessie à l’avant et l’urètre à^{l’arrière 1}. La muqueuse de la vessie est bien étudiée. Elle forme une barrière ferme contre les composants urinaires via des plaques cristallines apicales composées de protéines ^{uroplakine 2,3,4}. Bien que la muqueuse de la vessie soit un épithélium transitionnel, l’urètre présente des différences d’architecture épithéliale entre le cou de la vessie et l’ouverture urétrale distale. De plus, l’urètre présente un dimorphisme sexuel dans les structures épithéliales et l’architecture cellulaire. L’urètre mâle de la souris est constitué d’épithélium transitionnel au niveau du col de la vessie, suivi d’un épithélium colonnaire et stratifié. L’urètre de la femelle souris est tapissé d’un épithélium transitionnel au niveau du col de la vessie et d’un épithélium stratifié non squameux à plusieurs couches, parsemé de petits canaux se terminant par des glandes sécrétoires vers l’extrémité^{distale 5}.

Les femmes sont plus susceptibles aux infections urinaires (ITU), principalement causées par des bactéries uropathogènes qui montent de l’intestin par l’urètre pour infecter la^{vessie 6}. L’urètre est la première surface de la LUT qui entre en contact avec des agents pathogènes urinaires ascendants. La fonction des cellules épithéliales urétrales, en particulier leur rôle de barrière immunologique active, a été peu étudiée. Des travaux récents du même groupe ont fourni une carte spatiale à résolution unicellulaire de l’urètre⁵ de la femelle adulte de souris. Il a identifié une muqueuse urétrale à triple couche avec des cellules basales, intermédiaires et apicales. Entrecoupées dans la muqueuse épithéliale se trouvent des cellules neuroendocrines^{rares 5,7}. Vers le milieu de l’urètre, de petits canaux se ramifient du tronc principal de l’urètre, se terminant par des groupes de glandes sécrétoires, encastrés dans le compartiment stromal de l’urètre. Les données transcriptomiques ont révélé que les cellules épithéliales de l’urètre expriment des gènes immunomodulateurs et antimicrobiens qui pourraient façonner la défense de l’hôte⁵. L’étude des propriétés et attributs des cellules épithéliales urétrales liées à leur potentiel de défense et à leurs fonctions immunomodulatrices peut fournir de nouvelles stratégies pour lutter contre les infections urinaires.

L’utilisation de la souris pour étudier l’épithélium urétral permet d’étudier le temps et l’investigation du dimorphisme sexuel. Compte tenu des similitudes de la souris avec l’humain en termes d’architecture cellulaire de la vessie et de^{l’urètre 1}, la souris a été largement utilisée pour étudier le développement embryonnaire des voies urinaires^{inférieures 1,8,9}. Les souris ont également été utilisées dans des modèles d’instillation transurétrale pour étudier les infections urinaires causées par des agents pathogènes^{urinaires 10, 11, 12}. Le tissu des voies urinaires inférieures est difficile d’accès chez les patients, sauf en cas de résection pour cancer ou autres troubles. Il est difficile d’accès à une source de tissu humain stable et sain et la souris fournit un modèle utile pour étudier les tissus des voies urinaires inférieures afin d’étudier l’homéostasie tissulaire, la réparation et la réponse aux insultes inflammatoires. La muqueuse urétrale de la souris et humaine est composée d’épithélium transitoire au niveau du col de la vessie et d’un épithélium stratifié, non squameux et non kératinisé, vers l’extrémité distale. L’épithélium squameux est observé à l’extrémité distale de l’urètre féminin humain, bien que la variabilité soit observée dans la muqueuse urétrale féminine humaine à partir de ^5,13 ans. Bien que des comparaisons de la muqueuse urétrale au niveau du transcriptome n’aient pas été réalisées entre l’urètre humain et celui de la souris, la souris représente un modèle utile pour capturer le motif épithélial, les interactions épithélio-immunitaires et la réponse aux infections de l’urètre.

Dans cette étude, les auteurs décrivent des méthodes de dissection de l’urètre adulte de souris adulte, l’isolement de l’épithélium urétral et la digestion enzymatique douce pour préparer des suspensions unicellulaires. Il s’agit du premier protocole détaillé pour l’isolement et la digestion du tissu épithélial urétral de la souris femelle. Le protocole optimisé permet d’obtenir une population enrichie de cellules épithéliales unicellulaires pouvant être utilisées pour diverses analyses en aval. Comme présenté dans l’étude, les auteurs ont réalisé une cytométrie en flux sur une suspension unicellulaire d’isolats cellulaires épithéliaux urétriaux, ce qui démontre la présence de cellules uniques viables, principalement de nature épithéliale. De plus, ces cellules épithéliales sont capables de générer des organoïdes en culture 3D, qui ressemblent à la muqueuse urétrale stratifiée de la souris. Les auteurs démontrent également la coloration complète des feuilles épithéliales urétrales pour étudier l’association des cellules immunitaires associées à l’épithélium, en particulier les macrophages, avec les cellules épithéliales urétrales. Les méthodes décrites dans cet article aideront à la recherche sur la muqueuse urétrale et son rôle dans la défense immunitaire.

Protocole

Toutes les études sur les souris ont été réalisées avec l’approbation du Comité d’éthique des animaux institutionnels (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) et du Comité de biosécurité institutionnelle (inStem/G-141(3)-22/DBJ) à l’Institut BRIC pour la science des cellules souches et la médecine régénérative, Bengaluru. Des souris femelles CD-1 ou C57BL6/J âgées de 6 à 12 semaines, hébergées au Centre de soins et de ressources animales (ACRC) du National Centre for Biological Sciences (NCBS), Bangalore Life Sciences Cluster (BLiSC), ont été utilisées pour cette étude. Les souris ont été hébergées dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes lors d’un cycle de 12 heures lumière-obscurité avec de la nourriture et de l’eau ad libitum.

Tous les matériaux utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Dissection et collecte de l’urètre de la souris adulte

1. Euthanasiez la souris avec du_CO2 jusqu’à ce qu’elle cesse de respirer. Effectuer une luxation cervicale comme mode d’euthanasie secondaire.
2. Placez la souris en position couchée et vaporisez à 70 % d’éthanol pour humidifier les poils de l’abdomen (Figure 1A).
3. Soulevez la peau de l’abdomen avec une paire de pinces et effectuez une incision verticale vers le bas du corps, se terminant à l’ouverture urétrale externe (figures 1B et 1C).
4. Identifiez la vessie et soulevez-la doucement avec une pince. Dans certains cas, il peut être rempli d’urine. Compressez doucement la vessie entre les pinces pour la vider.
   REMARQUE : La vessie apparaîtra comme une structure bulbeuse.
5. Coupez la graisse et le tissu conjonctif autour de la vessie à l’aide de petits ciseaux à ressort pour exposer la structure en forme de papillon où les deux os pubiens se rejoignent à la symphyse pubienne (Figure 1D). L’urètre passe sous la symphyse pubienne.
6. Coupez la symphyse pubienne en la soulevant avec une pince et en ouvrant avec de petits ciseaux à ressort (Figure 1E). Retirez les fragments d’os pubien afin que l’urètre soit visible descendant depuis la vessie (Figure 1F).
   REMARQUE : L’urètre apparaîtra sous forme d’un mince tube rouge situé sur la surface ventrale de la paroi vaginale (Figure 1G).
7. Tirez doucement la vessie vers le haut depuis la cavité corporelle à l’aide de pinces fines et faites passer de petits ciseaux à ressort entre l’urètre et la paroi vaginale pour séparer les voies urinaire et reproductrice.
8. Maintenez une légère tension sur la vessie tout en coupant le long de l’arrière de l’urètre pour la séparer de la paroi vaginale (Figure 1H–J). Coupez jusqu’à l’ouverture urétrale distale pour obtenir l’urètre de souris de pleine longueur (1,2 à 1,5 cm de long) (figures 1K et 1L).
9. Séparez l’urètre de la vessie en effectuant une seule coupure au niveau du cou de la vessie.

2. Isolement du tissu épithélial urétral

REMARQUE : Le protocole d’isolement des feuilles épithéliales de l’urètre a été modifié et optimisé à partir d’un protocole visant à isoler l’épithélium^{endométrial 14}. La figure 2 montre les étapes pour l’isolement des feuilles épithéliales urétrales du compartiment stromal environnant (figure 2A).

1. Transférez l’urètre disséqué dans une boîte de Pétri stérile contenant une solution salée équilibrée 1x fraîche (HBSS, sans Ca ni Mg, détails donnés dans le Tableau Supplémentaire 1).
   REMARQUE : Il est recommandé de regrouper 4 à 5 urètres à ce stade pour la séparation épithéliale et la digestion unicellulaire.
2. Au microscope disséqueur, coupez la graisse et le tissu conjonctif entourant l’urètre à l’aide de pinces à point fin et de petits ciseaux à ressort (Figure 2B).
3. Coupez chaque urètre en deux morceaux de taille égale en travers et placez-les sur le dessus d’une tamoire en nylon de 100 microns (Figure 2C–G).
4. Lavez les tissus en passant 1 mL de 1x HBSS (sans Ca et Mg) sur les tissus.
5. Transférez des morceaux de tissu dans un tube microcentrifuge (MCT) de 1,5 mL (Figure 2H) contenant 1 mL de trypsine à 1 % (1 % de trypsine à 1 % de trypsine à 1x sHBSSa, détails donnés dans le Tableau Supplémentaire 2).
6. Digérez le tissu en incubant pendant 15 à 30 minutes sur un rotateur d’échantillon (30 tr/min) à 4 °C.
7. Après l’incubation, retirez les tubes de 4 °C. Ajouter MgCl₂ (1 M MgCl₂, bouillon préparé en 1x HBSS) à une concentration finale de 10 mM et la DNase I (10 mg/mL DNase I, bouillon préparé en 1x PBS) à une concentration finale de 10 μg/mL dans le même tube que les morceaux de tissu.
8. Transférez le tube dans un four d’hybridation à 37 °C sur un rotateur d’échantillons pour incuber pendant 15 à 30 minutes.
   REMARQUE : Les temps d’incubation de la trypsine à 4 °C et 37 °C peuvent être ajustés en fonction de l’application en aval. Il est préférable d’utiliser des temps d’incubation de 15 minutes pour la coloration complète et une incubation de 30 minutes pour la digestion unicellulaire.
9. Transférez les tissus dans un MCT de 1,5 mL contenant 10 % de sérum de mouton dans 1x HBSS (sans Ca et Mg) pour réduire l’activité de la tryppine.
10. Transférez les tissus urétraux dans un nouveau tube contenant un HBSS glacé 1x (sans Ca et Mg). Ensuite, transférez dans une boîte de Petri stérile contenant du HBSS 1x glacé.
11. À l’aide de deux pinces à point fin, pressez l’épithélium de l’urètre. Maintenez une extrémité de la pièce urétrale à l’aide d’une paire de pinces.
12. De l’autre main, pressez la partie urétrale entre les pointes de la pince, en passant sur toute la longueur du morceau pour extraire l’épithélium. Répétez cela pour les fragments urétraux restants dans la boîte afin d’isoler l’épithélium (Figure 2I–J).
    REMARQUE : Lors de la séparation mécanique, une fine couche de tissu épithélial transparent sera extrudée de la lumière de l’urètre. L’épithélium urétral peut être identifié comme de fines fragments de tissu en feuilles, qui paraissent plus clairs (transparents) que le tissu stromal. Les isolats épithéliaux doivent être des morceaux de tissu vaporeux et transparents pouvant être transférés dans une boîte de Petri pour le haché. Les isolats tissulaires ne doivent pas être complètement décomposés. Si les morceaux de tissu sont complètement décomposés, le temps d’incubation de la trypsine peut être réduit.

3. Digestion à suspension monocellulaire

1. Transférez des morceaux isolés d’épithélium dans une boîte de Petri stérile à l’aide d’une petite pipette de transfert en plastique ou d’une pointe de pipette de 200 μL. Réduire l’épithélium en petits fragments à l’aide de petits ciseaux à ressort dans une goutte de 1x HBSS ajoutée directement aux fragments (Figure 2K).
   REMARQUE : Les morceaux de tissu stromal restant après la séparation épithéliale peuvent être digérés selon la même méthode que l’épithélium isolé.
2. Transférez les pièces hachées à l’aide d’une pipette dans un MCT de 2 mL contenant 1,5 mL de solution de digestion Accutase préchauffée (37 °C). La solution de digestion Accutase contient les éléments suivants : Accutase, 10 μM Rocki Y-27632 et 100 μg/mL DNase I.
3. Transférez le tube contenant le tissu et la solution digestive à un rotateur d’échantillons dans un four d’hybridation à 37 °C. Incubez pendant 1 heure.
   REMARQUE : Le contenu du tube peut être vérifié pour une digestion efficace avant de procéder. Digestion réussie : Le tissu haché est bien dispersé dans la solution d’Accutase, avec seulement quelques morceaux visibles après l’incubation. Échec digestif : de gros morceaux de tissu sont encore présents après incubation dans la solution d’Accutase. Les tissus doivent être hachés aussi finement que possible pour une digestion réussie.
4. Après 1 heure, transférez l’intégralité du contenu de 2 mL de MCT dans un tube centrifugeuse de 5 mL et ajoutez 2 mL de tampon de lavage (1x PBS sans Ca ni Mg, avec 1 % d’albumine sérique bovine).
5. Faites tourner la suspension à 600 x g pendant 5 minutes dans une centrifugeuse à 4 °C avec un rotor à seau pivotant.
6. Aspirez le surnageant à l’aide d’un vide doux et resuspendez la pellete dans 1 mL de tampon de lavage à l’aide d’une pipette de 1 mL avec une pointe filtrante.
7. Avec la pointe de la pipette, brisez la pellete en pipettant de haut en bas jusqu’à ce que les amas deviennent plus petits. Faites passer la suspension en 4 temps à travers une aiguille de calibre 23 1/2 fixée à une seringue de 1 mL, suivis de 4 à 6 coups à travers une aiguille de calibre 26 1/2 fixée à une seringue de 1 mL.
   REMARQUE : Le passage à travers une aiguille de petit calibre est nécessaire pour obtenir une suspension uniforme à cellule unique et éviter l’agglomération cellulaire. Bien que cette étape puisse provoquer des contraintes de cisaillement et une mort cellulaire, les auteurs ont optimisé le nombre de coups avec l’aiguille et la seringue afin d’obtenir une seule suspension sans mort cellulaire excessive. Sauter cette étape entraîne une grande proportion de cellules regroupées, ce qui perturbera les analyses en aval comme le séquençage d’ARN unicellulaire et la cytométrie en flux.
8. Ajoutez 1 mL de tampon de lavage pour humidifier la surface d’un filtre pré-séparation de 30 microns placé sur un tube de 5 mL. Utilisez la seringue reliée à l’aiguille de calibre 26 1/2 pour transférer 1 mL de la solution cellulaire à travers la passoire.
9. Ajoutez 1 mL de tampon de lavage supplémentaire au tube contenant les cellules, puis prenez cette solution avec la seringue et faites-la passer dans le filtre. Des cellules à pellets par centrifugation à 600 x g pendant 5 minutes à 4 °C à l’aide d’un rotor à seau pivotant.
10. Aspirez le surnageant et resuspendez le pellet dans 100 μL de tampon de lavage, puis ajoutez 100 μL de tampon de lyse de globules rouges (RBC). Incubez la suspension à température ambiante pendant exactement 3 minutes, puis ajoutez 4 mL de tampon de lavage et resuspendez le pellet.
    REMARQUE : La lyse des globules rouges est recommandée pour retirer les globules sanguins de la suspension des cellules épithéliales urétrales. Bien que cette étape puisse avoir un effet mineur sur la viabilité des cellules épithéliales, le protocole utilisait un tampon de lyse des globules rouges dilué 0,5 fois et une incubation de 3 minutes pour minimiser la perte cellulaire et préserver la viabilité cellulaire.
11. Récolter les cellules par centrifugation à 600 x g pendant 5 minutes à 4 °C à l’aide d’un rotor de seau pivotant.
12. Aspirez le surnageant et resuspendez la pellete dans 50 à 200 μL de tampon de lavage selon la taille de la granule.
    REMARQUE : La taille des granules provenant de tissus obtenus à partir de 4 à 5 échantillons épithéliaux urétriels de souris regroupés sera faible mais restera visible à l’œil nu. Il est essentiel de centrifuger les cellules à l’aide d’un rotor de seau pivotant afin que la pellete s’accumule au fond du tube plutôt que de s’étaler sur le côté. Les chercheurs ont enregistré un rendement cellulaire de 28 000 à 34 000 cellules vivantes par épithélium urétral de souris.
13. Transférer 5 μL d’aliquotes de cellules dans un MCT de 0,5 mL et ajouter 5 μL de bleu de trypan. Mélangez et chargez sur l’hémocytomètre pour vérifier le rendement et la viabilité cellulaire.

4. Analyse par cytométrie en flux des isolats unicellulaires épithéliaux urétriaux

1. Aliquotes 100 000 cellules au total dans un tube centrifuge de 5 mL pour effectuer une immunocoloration fluorescente de cellules individuelles provenant du compartiment épithélial urétral ou stromal pour la cytométrie en flux. Compensez le volume dans le tube à 4 mL avec 1x PBS.
   REMARQUE : Pour obtenir des résultats fiables avec la cytométrie en flux, un minimum de 50 000 cellules par échantillon est recommandé.
2. Faites tourner la suspension à 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C en utilisant un rotor à seau pivotant.
3. Jetez le surnageant et resuspendez la pelote dans 50 μL de 1x PBS.
4. Ajoutez 50 μL de 2x colorant Ghost Violet 450 (1 μL de colorant Ghost dans 500 μL de 1x PBS) à la suspension cellulaire pour obtenir 100 μL de solution de colorant Ghost 1x.
   REMARQUE : Le colorant fantôme V450 est un colorant de viabilité réactif à l’amine qui peut être utilisé pour distinguer entre cellules viables et non viables dans des applications de cytométrie en écoulement.
5. Ajoutez 5 μL de solution bloqueuse des récepteurs Fc (anti-souris CD16/32) par 100 μL de suspension cellulaire et incubez pendant 5 minutes à température ambiante.
   REMARQUE : Cette étape est nécessaire pour bloquer la liaison des immunoglobulines aux récepteurs Fc.
6. Incubez la suspension cellulaire sur glace pendant 25 minutes supplémentaires.
7. Diluez la suspension cellulaire à 5 mL à l’aide d’un tampon de coloration cellulaire (1x PBS, 0,02 % (p/v) d’azide de sodium, et 1 % (p/v) de BSA, voir le Tableau Supplémentaire 3). Faites tourner à 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C en utilisant un rotor de seau pivotant. Écartez le surnageant et resuspendez la pelote cellulaire dans 100 μL de tampon de coloration cellulaire.
   REMARQUE : L’azide de sodium est hautement toxique. Évitez le contact avec la peau, les yeux et les vêtements. Utilisez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lors de la manipulation.
8. Dans 100 μL de suspension cellulaire, ajoutez 5 μL d’anticorps primaires conjugués : anti-CD326/EPCAM (marque les cellules épithéliales), anti-F4/80 (marque les macrophages murins) et anti-CD45 (marqueur pan-immunitaire) avec une dilution de 1:20. Incubez la suspension cellulaire sur glace pendant 30 minutes.
9. Diluez la suspension de cellules à 5 mL à l’aide d’un tampon de coloration de cellule, puis centrifugez à 500 x g pendant 5 minutes à 4 °C en utilisant un rotor de godet pivotant. Aspirez le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans 500 μL de tampon de coloration cellulaire.
10. Transférez la suspension de la cellule à travers une passoire en nylon de 35 microns sur des tubes de tri à bouchons filtrants. Placez les tubes sur de la glace jusqu’à une analyse plus approfondie.
11. Effectuez la configuration initiale et la vérification des performances du cytomètre.
12. Ajustez les tensions à l’aide d’échantillons non colorés et entièrement colorés. Effectuez la compensation avec des contrôles de billes et procédez à l’acquisition.
    REMARQUE : Les expériences avec plusieurs fluorophores nécessitent une compensation. Préparez les contrôles de rémunération nécessaires. Vous aurez besoin de témoins à une seule coloration (c’est-à-dire des billes de compensation) pour chaque fluorophore utilisé dans l’expérience. La compensation peut être effectuée automatiquement selon les paramètres du logiciel du cytomètre à débit. Les contrôles FMO (fluorescence moins un) sont recommandés pour distinguer les populations cellulaires positives et négatives pour un fluorophore donné. Préparez les FMO en incluant tous les fluorophores de l’échantillon sauf celui contrôlé.
13. Ajustez les portes en utilisant des contrôles FMO (fluorescence moins un) et obtenez 50 000 événements par échantillon.

5. Culture des organoïdes épithéliaux urétriaux

REMARQUE : Pour les organoïdes épithéliaux urétriels de souris, suivez les protocoles, section 3, Digestion vers suspension unicellulaire, étapes 3.1 à 3.11. pour obtenir des suspensions monocellulaires.

1. Resuspendez la granule cellulaire épithéliale urétrale dans un milieu d’expansion organoïde de 50 à 100 μL (détails donnés dans le Tableau Supplémentaire 4). Obtenez la viabilité cellulaire et le nombre de cellules en comptant sur un hémocytomètre.
2. Préparez un mélange 1:4 de suspension cellulaire (1 part) et de Cultrex (4 parties), avec une concentration finale de 5000 cellules à 25 μL. Ajoutez 3 gouttelettes de suspension de cellules de 25 μL (5000 cellules/gouttelette) à chaque puits d’une plaque à 12 puits.
   REMARQUE : Pipettez toujours doucement le Cultrex avec une pointe coupée pour éviter les bulles.
3. Transférez la plaque dans un incubateur à 37 °C (5 % de CO₂) pendant 15 minutes pour solidifier les gouttelettes.
4. Recouvrir les gouttelettes de 800 μL de milieu d’expansion organoïdal, doucement depuis les côtés du puits, puis transférer la plaque dans l’incubateur.
   REMARQUE : Un changement de média est obligatoire tous les deux jours. Remplacer le milieu usé par un milieu d’expansion organoïdal neuf de 800 μL.
5. Prenez des images des organoïdes chaque jour du jour 0 au 6 jours à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 4x à 20x.

6. Organoïdes urétrales histologie et immunocoloration

ATTENTION : Le xylène est un solvant hautement inflammable. Utilisez des équipements de protection individuels appropriés pour manipuler le produit chimique. Collectez le xylène utilisé comme déchet de solvant organique. Éliminez via des programmes approuvés pour les déchets chimiques dangereux. Le formol est toxique et provoque des irritations de la peau, des yeux et des voies respiratoires. Évitez le contact cutané et l’inhalation. Utilisez des équipements de protection individuels appropriés pour manipuler le produit chimique. Éliminez via des systèmes institutionnels d’élimination des déchets chimiques dangereux. Le protocole pour intégrer les organoïdes urétraux dans des blocs de paraffine a été modifié et optimisé à partir d’un protocole visant à intégrer les organoïdes^{endométrials. 14}.

1. Au 6e jour de culture organoïde, jetez le substrat usé et lavez les organoïdes avec 1x HBSS à température ambiante. Ajoutez 1,5 mL de formol neutre tamponné (10 %) dans les puits pendant 15 minutes.
2. Jetez le fixateur et ajoutez 1,5 mL d’hématoxyline dans les puits pendant 10 minutes. Jetez la tache et lavez deux fois avec 1x HBSS.
3. Ajoutez 1 mL d’agarose UltraPure à faible point de fusion à 2 % fabriquée en 1x HBSS dans chaque puits contenant 3 gouttelettes, laissez l’agarose solidifier pendant 15 minutes à température ambiante.
4. Retirez doucement l’agarose du puits à l’aide de l’extrémité plate d’une fine spatule, en veillant à ce que les gouttelettes de Cultrex s’enlèvent avec elle.
5. Transférez le disque d’agarose dans une cassette de tissu et déshydratez dans 70 % d’éthanol pendant 30 minutes à température ambiante avec une agitation constante.
6. Déshydratez également en différentes concentrations d’éthanol et de durée : 90 % d’éthanol pendant 30 minutes, 100 % d’éthanol pendant 30 minutes, 100 % d’éthanol pendant 60 minutes, 100 % d’éthanol pendant 90 minutes.
7. Épongez l’excès d’éthanol et clarifiez avec du xylène pendant 45 minutes à température ambiante avec une agitation constante. Répétez l’étape de nettoyage du xylène pendant 60 minutes.
8. Évacuez l’excès de xylène et transférez-le dans la cire de paraffine infiltrante (65 °C) pendant la nuit.
9. Ajoutez une fine couche de cire d’incrustation à la base d’un moule métallique et placez le disque d’agarose dessus. Retirez le moule du chauffe-coulisse et enrobez-le rapidement de cire à incruster à travers les lattes du fond de la cassette. Laissez solidifier à température ambiante.
10. Coupez des blocs organoïdes de paraffine sur un microtome pour obtenir des sections de 5 μm. Placez les sections sur des diapositives chargées positivement.
11. Coloration hématoxyline-éosine
    1. Cuire à 60 °C et déparaffiner avec du xylène et réhydrater par une série de lavages à l’éthanol (xylène 1 min, 100 % d’éthanol 1 min, 95 % d’éthanol 1 min, 75 % d’éthanol 1 min)
    2. Lavez les lames dans de l’eau du robinet et faites couver avec l’hématoxyline n° 2 de Gill pendant 3 minutes. Placez des lames sous un jet d’eau du robinet pour développer une couleur bleue.
    3. Incubez des lames dans de l’éthanol à 95 % pendant 1 minute, suivies d’une solution à 0,25 % d’éosine pendant 1 minute. Lavez les coulisses dans de l’eau du robinet jusqu’à ce que l’eau soit claire.
    4. Lame déshydratante (95 % d’éthanol 1 min, 100 % d’éthanol 1 min) et transparente avec du xylène (1 min) avant de monter avec un support de montage à durcissement rapide.
12. Immunocoloration des coupes de paraffine
    1. Cuire des sections de paraffine de 5 μm dans un four d’hybridation à 60 °C pendant 1 à 2 heures.
    2. Dewax glisse en l’immergeant dans du xylène pendant 6 minutes dans un pot de teinture à lames.
    3. Le réhydrater est introduit 100 %, 95 %, 75 % d’éthanol dans de l’eau distillée pendant 6 minutes chacun. Ensuite, laver les lames dans de l’eau distillée pendant 5 minutes.
    4. Ajoutez des lames dans un plat carré en Pyrex contenant 0,01 M d’acide citrique (dans de l’eau distillée) pour la récupération d’antigènes, puis recouvrez le plat d’un film plastique. Effectuez la récupération d’antigènes en la mettant au micro-ondes à haute puissance pendant 20 minutes.
    5. Refroidissez à tiède pendant 20 minutes et rinçez les lames dans des lames de sac de chaleur pendant 5 minutes. Tracez une barrière hydrophobe autour des sections tissulaires et ajoutez 100 μL/section de tampon de blocage pour chevaux pendant 1 h à température ambiante avec un léger balancement (voir le Tableau Supplémentaire 5 pour la préparation du tampon de blocage pour chevaux).
    6. Préparez une solution primaire d’anticorps dans un tampon de blocage cheval en ajoutant des anticorps primaires à une dilution appropriée (1:100–1:200). Ajoutez 100 μL de solution primaire d’anticorps à chaque section. Incubez les lames toute la nuit à 4 °C avec un léger balancement.
       REMARQUE : Les organoïdes ont été immunocolorés avec des anticorps contre Kératine 5/KRT5 (marqueur épithélial basal), P63 (marqueur épithélial basal), KRT4 (marqueur épithélial intermédiaire/suprabasal) et KRT13 (marqueur épithélial intermédiaire/suprabasal).
    7. Après incubation nocturne, les lames de lavage dans PBS 4 x 5 min à température ambiante avec un léger balancement.
       REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans une boîte protégée de la lumière à température ambiante.
    8. Préparez une solution secondaire d’anticorps dans un tampon bloquant pour chevaux, en ajoutant des anticorps secondaires marqués fluorescentement à une dilution 1:500. Incubez les lames pendant 1 heure à température ambiante avec un léger balancement.
    9. Laver les lames dans PBS 4 x 5 min à température ambiante avec un léger balancement.
       REMARQUE : Étape optionnelle : utilisez des kits de trempe à autofluorescence pour éteindre le signal d’autofluorescence.
    10. Incubez avec une solution DAPI de 300 nM pendant 5 minutes en balançant doucement. Laver dans un PBS pendant 2 x 5 minutes à température ambiante avec un léger bercement.
    11. Monter avec une solution anti-décoloration (90 % de glycérol, 0,2 % de n-propyl gallate dans 1 PBS). Sections d’images sur un microscope fluorescent grand champ.
        REMARQUE : Les réglages d’exposition de chaque fluorophore doivent être ajustés pour maximiser le rapport signal/bruit tout en évitant la saturation des pixels. Utilisez les mêmes réglages d’exposition lors de l’imagerie des organoïdes colorés lors d’une session donnée.

7. Immunocoloration complète des feuilles épithéliales urétrales isolées

REMARQUE : Pour une immunocoloration complète, suivez le protocole, section 2, Isolement du tissu épithélial urétral, étapes 2.1 à 2.12. pour obtenir des feuilles épithéliales urétrales.

1. Transférez soigneusement le tissu épithélial à l’aide d’une pipette de transfert ou d’une pointe de pipette de 200 μL dans un puits d’une boîte de culture tissulaire à 24 puits contenant 500 μL de formol tamponné neutre à 10 %. Scellez le couvercle de la plaque avec du paraffine et couvez-le sur un bascule pendant 20 minutes à 4 °C.
   REMARQUE : Effectuez toutes les étapes dans le même puits pour éviter la perte de tissu épithélial.
2. Aspirez soigneusement le formol du puits. Effectuez un lavage avec 500 μL de 1x PBS et faites couver sur un bascule pendant 5 minutes à température ambiante. Répétez la même étape de lavage une fois de plus.
3. Ajouter 500 μL de solution de perméabilisation contenant 1x PBS + 1 % Triton X-100 dans le puits. Scellez le couvercle de la plaque avec du parafilm, puis faites couver pendant 2 heures à 4 °C avec un léger balancement.
4. Aspirez soigneusement la solution de perméabilisation du puits.
5. Effectuer le blocage en incubant les tissus dans un tampon de blocage de chevaux de 500 μL contenant un Tampon de Triton X-100 supplémentaire à 1 % (la recette du tampon de blocage cheval est fournie dans le Tableau Supplémentaire 5). Scellez le couvercle du plat avec du parafilm et faites couver toute la nuit à 4 °C en le berçant doucement.
6. Préparez une solution primaire d’anticorps dans un tampon de blocage cheval contenant 1 % supplémentaire de Triton X-100 en ajoutant des anticorps primaires à une dilution appropriée (1:100–1:200). Aspirez la solution bloquante et ajoutez 500 μL de solution primaire d’anticorps : anti-CDH1 (marqueur des cellules épithéliales) et anti-F4/80 (marqueur des macrophages murins). Scellez le couvercle avec du parafilm et faites éclore pendant 48 à 72 h à 4 °C avec un léger balancement.
7. Aspirez soigneusement la solution primaire d’anticorps et lavez 3 fois avec 1 PBS pendant 30 minutes chacune à température ambiante avec un léger balancement.
8. Préparez des solutions secondaires d’anticorps dans un tampon de blocage pour chevaux avec un Triton X-100 supplémentaire à 1 % en ajoutant des anticorps secondaires à une dilution appropriée (1:500).
9. Ajoutez 500 μL de solution secondaire d’anticorps au puits, couvrez la plaque de papier aluminium, puis incubez pendant 4 à 6 heures à température ambiante sur un bascule.
10. Aspirez soigneusement la solution secondaire d’anticorps et lavez 3 fois avec 1 PBS pendant 30 minutes chacune à température ambiante.
    REMARQUE : La coloration DAPI peut être réalisée en incubant des tissus avec une solution DAPI diluée (concentration finale de 300 nM) pendant 10 minutes à température ambiante. Lavez les mouchoirs avec 1x PBS (2x 5 min) à température ambiante sur un bascule.
11. Transférez soigneusement les tissus épithéliaux sur une lame en verre ou un bol d’imagerie et ajoutez une solution anti-décoloration (90 % de glycérol, 0,2 % de n-propyl gallate dans 1 PBS).
12. Tissus d’image sur un microscope fluorescent.
    REMARQUE : Compte tenu de l’épaisseur de l’échantillon, les auteurs recommandent d’effectuer une imagerie sur un microscope fluorescent capable de coupe optique. Dans cette étude, les auteurs ont utilisé un microscope fluorescent à large champ avec une section optique Apotome pour éliminer la lumière floue et obtenir des piles z. Des piles z d’images ont été obtenues pour visualiser les projections dendritiques des macrophages associés à l’épithélium.

Résultats

Dissection et collecte de l’urètre de la souris adulte

Dans la première partie de cette étude, les auteurs fournissent un protocole détaillé pour la dissection de l’urètre de la souris femelle. Compte tenu de son attachement à la paroi vaginale ventrale et de sa position sous la symphyse pubienne, la méthode présentée ici permet la dissection nette de l’urètre féminin de pleine longueur (Figure 1).

Isolement du tissu épithélial urétral et analyse de cytométrie en flux pour les isolats unicellulaires

La digestion à la trypsine permet de séparer facilement la muqueuse épithéliale de l’urètre du stroma environnant. Des feuilles épithéliales avec une transparence plus élevée que le tissu stromal peuvent être observées après séparation (Figure 2). Les feuilles épithéliales séparées ont donné des suspensions unicellulaires lors de la digestion enzymatique. Les cellules isolées de l’épithélium urétral montrent une viabilité constamment élevée (>80 %) par exclusion du bleu de trypan sur un hémocytomètre (Figure 2L) et par cytométrie en flux utilisant des colorants de viabilité pour verrouiller les cellules vivantes (Figure 3, Fichier supplémentaire 1).

Les auteurs ont réalisé une cytométrie en flux pour évaluer l’enrichissement des cellules épithéliales à partir de suspensions unicellulaires de l’épithélium urétral. Pour vérifier la viabilité cellulaire, la suspension cellulaire a été colorée avec un marqueur vivant/mort, le colorant fantôme réactif à l’amine V450. Les auteurs ont constamment observé une viabilité cellulaire de >80 % par rapport au marqueur vivant/mort. Le marqueur vivant/mort permettait de verrouiller les débris et les cellules mortes lors de l’analyse du flux. Ils ont coloré des échantillons avec un marqueur cellulaire épithélial (CD326/EPCAM), un marqueur macrophage (F4/80) et un marqueur cellulaire immunitaire (CD45) afin d’enregistrer la composition des cellules isolées par cette méthode. Les résultats de la cytométrie en flux ont montré que les auteurs ont isolé une population cellulaire épithéliale enrichie de l’épithélium urétral de la femelle souris. Pour les deux expériences indépendantes réalisées, le groupe a obtenu 80 à 90 % des cellules épithéliales positives à l’EPCAM après passage sur des cellules vivantes. Les auteurs ont également observé ~1,30 % des cellules immunitaires CD45+ dans la préparation épithéliale. Les macrophages associés à la muqueuse épithéliale représentaient ~1,18 % des cellules vivantes provenant du compartiment épithélial. L’analyse par cytométrie en flux des suspensions unicellulaires à partir de feuillets épithéliales montre une contamination stromale minimale (5–6 %), principalement attribuée à l’endothélium vasculaire selon leur étude^{précédente 5}. Le fichier supplémentaire 1 montre les résultats de la cytométrie en flux pour les préparations unicellulaires provenant des compartiments épithélial et stromal. Comparé à l’enrichissement de 80 à 90 % des cellules épithéliales isolées du compartiment épithélial, le compartiment stromal montrait également 40 à 50 % des cellules épithéliales, qui proviennent des canaux courts et de l’épithélium glandulaire s’étendant de la lumière urétrale vers le stroma environnant (Figure 3, Fichier supplémentaire 1).

Culture, histologie et immunocoloration des organoïdes épithéliaux urétrales

Les auteurs démontrent également comment des cellules épithéliales uniques isolées de l’urètre sont viables et peuvent former des organoïdes dans une matrice 3D, et ont observé la croissance organoïde à partir de cellules épithéliales urétrales simples jusqu’au jour 6 en culture (Figure 4B–G). Ils ont effectué une coloration à hématoxyline-éosine (H&E) pour observer l’histologie des organoïdes (Figure 4H–J). Les auteurs ont observé deux morphologies distinctes d’organoïdes épithéliaux urétraux, l’une étant grande et creuse, tandis que l’autre type était plus petite et solide. Dans les deux cas, les organoïdes étaient stratifiés et réaffectés par des marqueurs exprimés dans la paroi épithéliale de l’urètre féminine, incluant KRT5 et P63 marquant la couche basale et KRT4 et KRT13 marquant les couches cellulaires suprabasales/intermédiaires (Figure 4K–N), Figure supplémentaire 1). Les différences dans la capacité de formation organoïde entre l’urètre proximal et distal ont été examinées. Les organoïdes générés par l’urètre proximal présentaient une proportion plus élevée d’organoïdes creux, tandis que ceux de l’urètre distale formaient des sphères solides (Figure 4O–P). De plus, ils ont observé des différences dans l’efficacité de formation d’organoïdes dans les cellules épithéliales isolées des parties proximale et distale de l’urètre. L’épithélium urétral distal a formé des organoïdes avec une efficacité supérieure à l’épithélium urétral proximal avec la même densité initiale de semence (5000 cellules/gouttelette) (Figure 4Q–S).

Immunocoloration complète des feuilles épithéliales urétrales isolées

Les chercheurs présentent également une méthode optimisée pour la coloration complète des feuilles épithéliales urétrales de la souris. Ici, ils ont coloré les feuilles épithéliales avec deux marqueurs : F4/80 pour les macrophages et E-cadherine/CDH1 pour marquer les jonctions épithéliales cellule-cellule (Figure 5). Les tissus ont été imagés à l’aide d’un microscope Zeiss Axio Observer 7 avec une section optique Apotome 3. Les feuilles épithéliales présentent un marquage fort avec l’anticorps CDH1. Des préparations complètes d’épithélium urétral marquées avec des anticorps contre F4/80 ont montré que des macrophages formaient une arbe de dendrites dans la muqueuse épithéliale. Des macrophages ont pu être observés envoyant des processus dendritiques entre les cellules épithéliales de l’urètre. Dans l’ensemble, les résultats démontrent l’utilité des protocoles décrits ici pour l’étude de la muqueuse épithéliale de l’urètre de la souris.

Figure 1 : Dissection de souris pour la collecte de l’urètre féminine. (A) Placez la souris en position couchée et vaporisez l’abdomen avec 70 % d’EtOH. (Si si et do) Ouvrez l’abdomen en soulevant la peau et en pratiquant une incision verticale. (D) Tailler les tissus graisseux et conjonctifs pour exposer les os pubiens en forme de papillon reliés à la symphyse pubienne (flèche en noir). (E) Coupez la symphyse pubienne. (F) Une fois les os pubiens retirés, l’urètre peut être visible descendant (délimitée d’une ligne pointillée en noir) depuis la vessie. (G) Tirez doucement la vessie avec une pince. L’urètre est clairement visible sous forme d’un tube rouge et fin. (H–I) Tirez la vessie vers le haut depuis la cavité corporelle. Utilisez la tension sur la vessie pour séparer l’urètre de la paroi ventrale du vagin. Faites passer les ciseaux entre l’urètre et la paroi vaginale pour séparer les voies urinaire et reproductrice. (J–K) Détachez l’extrémité distale de l’urètre attachée à la peau. (À gauche) Image d’une femelle disséquée des voies urinaires inférieures (FLUT), montrant vessie et urètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Isolement de l’épithélium urétral et préparation d’une suspension unicellulaire. (A) Schéma représentant la digestion enzymatique et la séparation mécanique des compartiments épithélial et stromal de l’urètre, suivie d’une digestion unicellulaire. (B) Éliminer la graisse supplémentaire des voies urinaires inférieures féminines. (C–F) Coupez l’urètre de la région du cou de la vessie pour séparer l’urètre de la vessie. Ensuite, coupez l’urètre en deux moitiés avec des ciseaux fins. (G) Laver les morceaux urétrales avec une solution 1x HBSS en passant sur un filtre de 100 microns. (H) Transférer les fragments de tissu urétral dans une solution de trypsine à 1 %. Incubez sur un rotateur d’échantillons dans la chambre froide. Ajoutez MgCl₂ et DNase I dans le même tube. Incuber à 37 °C dans un four d’hybridation sur un rotateur d’échantillons. (I–J) Isoler l’épithélium en pressant doucement avec une pince fine le long du fragment urétral. (K) Les tissus sont hachés en petits fragments à l’aide de ciseaux fins. Transférez le tissu épithélial haché dans une solution digestive Accutase et incubez à 37 °C dans un four d’hybridation sur un rotateur d’échantillons. (L) Compter les cellules épithéliales et évaluer la viabilité à l’aide du bleu de trypan à l’aide d’un hémocytomètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Cytométrie en flux pour évaluer les suspensions unicellulaires provenant de l’épithélium urétral et des compartiments stromatiques. La cytométrie en flux a été réalisée sur des préparations unicellulaires des compartiments épithéliaux de l’urètre (A) et du stromal (B) de souris regroupés. Les cellules vivantes ont été verrouillées pour exclure les cellules mortes colorées au Ghost Dye V450. Les cellules vivantes ont été évaluées pour l’expression de CD45 (marqueur pan-immunitaire), CD326/EPCAM (marqueur pan-épithélial) et F4/80 (marqueur macrophage murin). Les données sont représentatives de 2 expériences indépendantes menées sur un groupe de 5 à 6 souris par expérience afin de générer des échantillons épithéliaux et stromals. Abréviations ; SSC-A = aire de pic de dispersion latérale ; FITC = isothiocyanate de fluorescéine ; APC = allophycocyanine ; PE = phycoérythrine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Histologie et immunocoloration des organoïdes épithéliaux urétraux. (A) Schéma montrant le flux de travail pour la génération d’organoïdes épithéliaux urétraux. (B–G) Micrographies représentatives en champ clair des organoïdes épithéliaux urétrales (UEO) générées à partir de cellules uniques à différents jours d’expansion in vitro. Images représentatives en champ clair des organoïdes épithéliaux urétrales (H) creux et (I) solides (UEOs) colorés à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E). (J) Quantification des types d’organoïdes générés à travers trois expériences indépendantes. La barre d’erreur représente l’erreur standard de la moyenne. Images représentatives des organoïdes épithéliaux urétriels (K) creux et (L) solides (UEOs) immunocolorés avec les marqueurs épithéliaux KRT13 (marqueur épithélial suprabasal), KRT5 (marqueur épithélial basal) et P63 (marqueur épithélial basal). Des images représentant des canaux fluorescents uniques sont représentées dans K', K'', K''', L'', L'' et L'''. Images représentatives des organoïdes épithéliaux urétriels (M) creux et (N) solides (UEOs) immunocolorés avec les marqueurs épithéliaux KRT4 (marqueur épithélial suprabasal) et KRT5 (marqueur épithélial basal). Les images représentant des canaux fluorescents uniques sont représentées en M', M'', N’et N". (O) Schéma de la dissection de l’urètre proximal et distal. (P) Quantification des types d’organoïdes générés à partir de l’urètre proximal et distal à travers deux expériences indépendantes. Micrographies représentatives en champ clair des organoïdes épithéliaux urétrales (UEO) du jour 6 générées à partir de l’épithélium isolé de l’urètre proximal (Q) et (R) distal. Les données sur les organoïdes générées à partir de l’urètre complet sont représentatives de 3 expériences indépendantes menées avec un groupe de 3 à 5 souris par expérience. (S) Les données des organoïdes générées à partir de l’urètre proximal et distal sont représentatives de 2 expériences indépendantes menées avec un pool de 3 à 4 souris par expérience. Noyaux marqués avec DAPI (bleu). (Barres d’échelle, 100 μM). Schémas préparés avec BioRender et Adobe Illustrator. Créé dans BioRender. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Immunocoloration complète des feuilles épithéliales urétrales. (A) Coupe congelée de 10 microns de l’urètre de la femelle adulte dans un milieu de coupe optimal, montrant une immunocoloration pour le marqueur macrophage murin F4/80 (en rouge) et la protéine épithéliale E-cadherine/CDH1 (en vert). (A') représente un zoom en vue de l’encastrement dans (A). (B) Schéma montrant les étapes pour la coloration complète des feuilles épithéliales urétrales isolées. L’immunocoloration complète de la muqueuse épithéliale urétrale femelle de souris isolée a été réalisée avec des anticorps contre le marqueur macrophage murin F4/80 (en rouge) et la protéine épithéliale E-cadherine/CDH1 (en vert). (C) Image représentative de la vue fusionnée. (D) Projection orthogonale d’intensité maximale du canal rouge montrant l’organisation des macrophages. (E–F) Vue zoomée de l’épithélium et des macrophages associés. Barre d’écailles blanches, 50 μM. Barre d’écailles de gris, 500 μM. Les données sont représentatives de 2 expériences indépendantes menées sur un pool de 4 à 5 souris. Schémas préparés dans BioRender et Adobe Illustrator. Créé dans BioRender. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau complémentaire 1 : Préparation d’un HBSS 1x (sans Ca, Mg).Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 2 : Préparation d’une solution 1x de sHBSSa et d’une solution de trypsine à 1 %.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 3 : Préparation du tampon de coloration cellule/flux.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 4 : Préparation des milieux d’expansion organoïdaux pour les organoïdes épithéliaux urétraux.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 5 : Préparation du tampon de blocage des chevaux.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Comptage cellulaire pour l’expérience de cytométrie en flux réalisée sur des cellules individuelles des compartiments urétral, épithélial et stromale issues de deux expériences indépendantes.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : Comparaison de l’épithélium urétral de la femelle adulte avec les organoïdes épithéliaux urétriels. Images représentatives de (A) épithélium urétrique féminin adulte de souris, (B) organoïdes épithéliaux urétriels creux, et (C) organoïdes épithéliaux urétrales solides (UEO) immunocolorés avec les marqueurs épithéliaux KRT13 (marqueur épithélial suprabasal), KRT5 (marqueur épithélial basal) et P63 (marqueur épithélial basal). Les images représentant des canaux fluorescents uniques sont indiquées dans A', A'', A', B', B'', B'', C'' et C'''. Images représentatives de (D) épithélium urétral féminin adulte de souris, (E) organoïdes épithéliaux urétrales creux et (F) organoïdes épithéliaux urétraux solides (UEOs) immunocolorés avec les marqueurs épithéliaux KRT4 (marqueur épithélial suprabasal) et KRT5 (marqueur épithélial basal). Les images représentant des canaux fluorescents uniques sont indiquées en D', D'', E', E'', F' et F ». Données représentatives de 3 expériences indépendantes menées avec un groupe de 3 à 4 souris par expérience. Noyaux marqués avec DAPI (bleu). (Barres d’échelle, 100 μM). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les barrières épithéliales dans le corps sont d’une importance cruciale pour la défense de l’hôte. Ce sont des compartiments spécialisés avec plusieurs types de cellules épithéliales et des cellules immunitaires résidentes associées. Les barrières épithéliales évoluent au fil du développement, acquérant l’expression génique de défense de l’hôte souvent en réponse au microbiote ou à l’exposition environnementale. Des défauts d’intégrité épithéliale ou d’expression génique peuvent influencer la défense de l’hôte¹⁵. Il est essentiel d’étudier le tissu épithélial isolément pour comprendre les signatures transcriptomiques ainsi que pour étudier les contacts cellulaire-cellule et l’intégrité épithéliale. Actuellement, aucune méthode optimisée n’a été décrite en détail pour isoler le tissu épithélial urétral de la souris femelle. Alors que l’épithélium de la vessie ne peut être isolé que par séparation^{mécanique 16}, l’épithélium urétral est présent à l’intérieur du tube stromal de l’urètre et nécessite une combinaison de séparation enzymatique et mécanique pour isoler le tissu épithélial.

Ici, les auteurs présentent une méthode optimisée pour isoler les feuillets épithéliales de la lumière urétrale des souris femelles. La méthode peut être utilisée pour générer des suspensions unicellulaires à haute viabilité de cellules épithéliales urétrales pour des applications en aval telles que la cytométrie en flux, la culture d’organoïdes et l’immunocoloration. La compatibilité de cette méthode avec les flux de travail de séquençage d’ARN à cellules uniques a déjà été démontrée par le même groupe⁵. Avec des modifications et des optimisations supplémentaires, le protocole présenté ici peut être adapté pour extraire les tissus épithéliaux d’autres organes tubulaires pour des applications en aval.

Les étapes clés du protocole consistent à disséquer soigneusement l’urètre de la femelle adulte de souris sur toute la longueur, permettant d’étudier les différences régionales le long de l’axe proximal-distal. Par la suite, le protocole utilise une digestion enzymatique douce pour desserrer la muqueuse épithéliale de l’urètre du stroma environnant. La digestion enzymatique desserre l’épithélial pour permettre une séparation mécanique en comprimant doucement le tube urétral entre les pinces afin de libérer le tissu épithélial. Les chercheurs ont soigneusement optimisé le moment de la digestion de la trypsine afin de permettre l’isolement de l’épithélium urétral à haute viabilité (> 80 %) sous forme de feuilles pour l’immunocoloration ou pour l’isolement monocellulaire en aval (Figure 3, Fichier supplémentaire 1). La digestion unicellulaire de l’épithélium urétral a révélé 80 à 90 % des cellules épithéliales dans les isolats urétriaux. D’après une étude antérieure, les auteurs ont identifié que les cellules non épithéliales de cette préparation sont principalement composées de cellules immunitaires associées à l’épithélium et d’endothélium^{vasculaire 5}. La méthode actuelle d’isolation monocellulaire permet de produire des suspensions monocellulaires de haute qualité pour des applications en aval telles que la cytométrie en flux et le séquençage d’ARN unicellulaire, en éliminant les amas cellulaires par perturbation mécanique via aspiration à aiguille de petit calibre et en retirant les globules rouges par lyse douce.

Les résultats démontrent que cette méthode peut être utilisée pour enrichir des cellules immunitaires spécifiques aux compartiments (Figure 3). L’épithélium isolé de l’urètre proximal et distal peut également être étudié séparément. De plus, les auteurs ont démontré que des cellules épithéliales isolées peuvent être utilisées pour la génération d’organoïdes urétrales qui n’avaient pas été décrits auparavant (Figure 4). Ces résultats démontrent également une variabilité régionale de la capacité de génération d’organoïdes dans l’urètre féminin. Bien que les études récentes de l’auteur aient montré des différences proximal-distales dans l’expression des gènes épithéliaux et l’organisation des cellules immunitaires dans l’urètre⁵ de la souris femelle, l’étude actuelle montre que les cellules épithéliales urétrales proximales forment moins d’organoïdes que l’épithélium isolé de l’urètre distal (Figure 4). Une limitation de cette démarcation spatiale entre urètre proximal et distal est qu’il n’existe aucun repère anatomique pouvant être utilisé au moment de la dissection pour distinguer ces deux zones. Dans cette étude, les auteurs ont divisé la longueur de l’urètre par deux pour obtenir les compartiments proximal et distal. La méthode d’isolement épithélial décrite ici peut être utilisée pour caractériser davantage les différences d’expression génique et de composition cellulaire entre l’épithélium urétral proximal et distal.

Bien que le protocole optimisé présenté ici soit accessible et reproductible, certaines étapes nécessitent de la pratique et un calibrage minutieux. En particulier, la méthode de dissection présentée ici nécessite une extraction soigneuse du tube urétrale sous la symphyse pubienne tout en préservant toute la longueur de l’urètre. De plus, il faut prendre soin de retirer tout tissu vaginal attaché à la paroi urétrale dorsale après la dissection. La graisse présente autour du cou de la vessie doit être retirée avec précaution pour réduire la contamination par les adipocytes lors d’applications en aval comme le séquençage de l’ARN unicellulaire. De plus, la digestion de la trypsine doit être soigneusement optimisée avec chaque lot d’enzyme afin d’assurer une digestion constante. Une surdigestion des tissus peut entraîner une perte de viabilité cellulaire. Les auteurs ont soigneusement optimisé le temps de digestion de la trypchine, indiquant une fenêtre de 15 à 30 minutes pour les étapes d’incubation à 4 °C et 37 °C. Cela peut être optimisé en fonction du lot d’enzymes utilisé. Il est également crucial de réduire les tissus en petits morceaux pour une digestion efficace d’une seule cellule. Les auteurs ont utilisé Accutase pour une digestion ultérieure des cellules uniques, car cela entraîne une dissociation douce. En cas de réduction de la viabilité cellulaire, le temps d’incubation d’Accutase peut être réduit. De plus, les auteurs ont inclus l’inhibiteur de roche dans le mélange digestif Accutase pour améliorer la survie cellulaire. La digestion de la DNase est recommandée pour réduire les agglomérations cellulaires en digérant l’ADN extracellulaire libéré par des cellules mortes et mourantes. Les auteurs recommandent également l’utilisation d’un tampon de lyse des globules rouges pour réduire la contamination des globules rouges qui compromettrait les résultats en aval tels que la cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN unicellulaire.

Une limitation de la méthode d’isolement épithélial présentée ici est qu’elle a été optimisée pour l’urètre de la souris femelle. L’urètre de la souris mâle est plus complexe anatomiquement, avec une architecture épithéliale changeante de l’urètre proximal au distal. De plus, la méthode ne peut isoler que les cellules épithéliales tapissant la lumière urétrale. Les glandes sécrétaires urétrales reliées à la lumière urétrale par de courts canaux épithéliaux ne peuvent pas être isolées car elles sont intégrées dans le tissu stromal. Au contraire, ces structures épithéliales sont enrichies dans le compartiment stromal restant après l’isolement de la muqueuse épithéliale urétrale (Figure 3).

Malgré ces limitations, cette méthode a permis d’acquérir des connaissances importantes sur l’architecture épithéliale urétrale et permettra d’approfondir les recherches sur les cellules immunitaires associées à l’épithélio via la visualisation in situ des macrophages associés à l’épithélium. La méthode a déjà démontré sa compatibilité avec les flux de travail de séquençage de l’ARN unicellulaire pour identifier l’hétérogénéité cellulaire dans l’épithélium urétral et les cellules immunitaires^{associées 5}. De plus, la capacité à isoler l’épithélium de l’urètre proximal et distal permettra aux études de comprendre les différences spatiales dans l’urètre. De manière significative, la méthode de digestion des cellules épithéliales permet de produire des cellules uniques viables capables de générer des organoïdes épithéliaux urétraux, utiles pour étudier les interactions hôte-pathogène et la biologie épithéliale de l’urètre. Dans l’ensemble, ces méthodes enrichissent la boîte à outils pour permettre des recherches plus approfondies sur la biologie épithéliale urétrale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
#5 fine forceps
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12-well plate	Corning	3513
30-micron pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		Pour créer des panneaux de figures
Adobe Photoshop	Adobe		Pour créer des panneaux de figures
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Antibiotic/antimycotic	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	Dilution 1:20, pour la cytométrie en flux
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	Dilution 1:20, pour la cytométrie en flux
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	Dilution 1:200
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	Dilution 1:20, pour la cytométrie en flux
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	Dilution 1:200
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	Dilution 1:200
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	Dilution 1:200
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	Dilution 1:800
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	Dilution 1:200
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	Dilution 1:200
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 supplement	Invitrogen	12587010
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Genetix	PG-2330
CD-1 Mice	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI solution	Sigma Aldrich	D5942
D-Glucose	Qualigens	Q15405
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Himedia	MB058
di-Sodium Hydrogen Ortophosphate (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	Dilution 1:500
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	Dilution 1:500
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	Dilution 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	Dilution 1:500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	Dilution 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	Dilution 1:500
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	Dilution 1:500
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosin	Himedia	GRM938
Ethanol	Supelco	1.00983
Eukitt mounting media	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
Filter cap sorting tubes	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
Glycerol anhydrous	Merck	DA1P692899
Hematoxylin	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
Horse serum	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	Analyse des données de cytométrie en flux
Magnesium chloride (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )	Biolegend	101320
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130
Paraffin wax	Qualigens	Q19215
Potassium chloride (KCl)	Qualigens	Q13305
Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC Lysis Buffer (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625
Rocki  (Y-27632)	Cell Signalling Technology	13624S
R-spondin 1	PeproTech	315-