Isolement et caractérisation des exosomes dérivés des cellules souches de la pulpe dentaire à travers les passages cellulaires

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail standardisé pour isoler et caractériser les exosomes dérivés des cellules souches pulpaires dentaires (DPSC) à travers les passages, permettant une évaluation reproductible de la qualité des exosomes et de son activité fonctionnelle pour des applications régénératives.

Résumé

Les cellules souches pulpaires dentaires (DPSC) représentent une source accessible et cliniquement pertinente de cellules souches mésenchymateuses, et leurs exosomes dérivés se sont révélés être des vésicules bioactives prometteuses pour des applications sans cellules en ingénierie tissulaire et en médecine régénérative. Cependant, les méthodes reproductibles et standardisées pour isoler et valider fonctionnellement les exosomes dérivés de DPSC restent limitées, notamment en ce qui concerne la variabilité introduite lors de l’expansion cellulaire à travers les passages. Ici, nous décrivons un flux de travail complet, standardisé et basé sur des kits, pour l’isolement et la purification des exosomes à partir d’un milieu conditionné par le DPSC, compatible avec la pratique de laboratoire courante. Cette méthode permet une récupération cohérente de vésicules intactes, adaptées à la caractérisation morphologique, moléculaire et fonctionnelle à l’aide de techniques courantes. L’identité des exosomes est évaluée en fonction de la morphologie, de la répartition des tailles et de l’expression des marqueurs, tandis que l’activité biologique est évaluée à l’aide d’un test anti-inflammatoire in vitro défini. Pour examiner les effets liés aux passages, les exosomes dérivés de différents passages DPSC sont comparés à l’aide de cette lecture fonctionnelle, fournissant un cadre pratique pour évaluer la cohérence lors de l’expansion cellulaire. En intégrant l’isolement, la purification, la caractérisation et la validation fonctionnelle dans un seul flux de travail, ce protocole propose une approche reproductible et évolutive pour générer des exosomes dérivés DPSC validés fonctionnellement pour la recherche en biomatériaux et les applications régénératives.

Introduction

Les exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses servent de médiateurs cruciaux de la communication intercellulaire et démontrent un potentiel thérapeutique significatif dans les domaines de l’ingénierie tissulaire et de la médecine régénérative. Les exosomes sont des vésicules mesurant entre 30 et 150 nm de diamètre, capables de délivrer des molécules bioactives et de réguler diverses fonctions dans les cellules réceptrices, telles que la prolifération, la différenciation et la réponse^{immunitaire 1,2}. Parmi les différentes sources de cellules souches mésenchymates (MSC), les cellules souches pulpaires dentaires (DPSC) suscitent un intérêt particulier en raison de leur accessibilité facile, de leur robuste capacité proliférative, de leur faible risque tumorigène et de leurs préoccupations éthiques ^{minimales 3,4,5}. Les exosomes dérivés des DPSC (DPSC-Exos) contiennent un répertoire diversifié de charges fonctionnelles, incluant des protéines, des ARNm et des microARN, leur permettant de conserver de nombreuses propriétés biologiques de leurs cellules parentales. Des études antérieures ont démontré que DPSC-Exos peut favoriser l’angiogenèse, la réparation neuronale, la régénération osseuse et les réponses anti-inflammatoires. Au-delà de leur rôle en ingénierie tissulaire, les exosomes sont de plus en plus reconnus comme des régulateurs importants dans l’oncogenèse et la thérapie contre le cancer, où ils contribuent à la remodelation du microenvironnement tumoral, à la résistance aux médicaments et à l’évasion^{immunitaire 6}. Les exosomes dérivés des MSC, y compris ceux des DPSC, possèdent des capacités inhérentes à la recherche de tumeurs et des propriétés immunomodulatrices, les positionnant comme des véhicules prometteurs de nouvelle génération pour une administration ciblée de médicaments anticancéreux ou comme agents immunothérapeutiques sans cellules. En contournant plusieurs limites associées aux thérapies à base de cellules, DPSC-Exos s’est imposé comme un composant bioactif acellulaire prometteur pour des applications^{régénératrices} 7,8,9,10,11,12.

Malgré ces avantages, la traduction de la recherche DPSC-Exo en un usage expérimental ou clinique reproductible reste un défi. Une limitation majeure est l’absence de protocoles unifiés et standardisés pour l’isolement et la purification des exosomes. Les approches actuellement utilisées incluent l’ultracentrifugation¹³, l’ultrafiltration, la précipitation, la chromatographie par exclusion de taille et la capture^{d’immunoaffinité 14,15}. Parmi ces méthodes, la précipitation à base de polymères offre des avantages pratiques, notamment un débit élevé, la compatibilité avec une large gamme de volumes d’échantillons et la simplicité opérationnelle, ce qui la rend adaptée aux études impliquant de grands nombres d’échantillons ou des exigences d’échelle^{16, 17, 18}. Des analyses comparatives de différentes méthodes d’isolement, notamment concernant le rendement protéique et le rapport particule-protéine, ont été largement documentées dans la^{littérature 19}. Cependant, l’influence du nombre de passages DPSC sur les caractéristiques et l’activité biologique des exosomes dérivés n’a pas été suffisamment prise en compte, ce qui représente une lacune importante pour la normalisation et le contrôle qualité de la production DPSC-Exo.

Pour remédier à ces limites techniques, cette étude présente un protocole standardisé basé sur des kits pour isoler et purifier les exosomes à partir d’un milieu conditionné par la DPSC. En plus de la caractérisation physique et moléculaire, le protocole intègre un test fonctionnel pour évaluer l’activité anti-inflammatoire des exosomes dérivés de différents passages DPSC, permettant une évaluation comparative de la cohérence dépendante du passage dans la qualité et la fonction des exosomes. Le flux de travail est conçu pour une mise en œuvre simple dans des laboratoires équipés d’installations standard en culture cellulaire et biologie moléculaire. Il s’appuie sur des kits disponibles dans le commerce pour réduire la variabilité inter-expérimentale et peut être facilement adapté à différents besoins expérimentaux. Pour minimiser la variabilité d’un donneur à l’autre, les DPSC sont isolés de dents individuelles et développés indépendamment plutôt que regroupés à partir de plusieurs donneurs. Ce protocole est particulièrement utile pour les chercheurs cherchant à générer des exosomes dérivés du DPSC validés fonctionnellement pour des applications en aval, notamment la cicatrisation des plaies, l’ingénierie tissulaire osseuse et les études d’immunomodulation, où la cohérence de type à lot est essentielle. Dans l’ensemble, il fournit un cadre pratique et standardisé pour produire des exosomes dérivés du DPSC destinés à la recherche en ingénierie tissulaire et en médecine régénérative.

Protocole

Cette étude a été menée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par les comités d’éthique institutionnels. Des tissus pulpaires dentaires humains ont été prélevés à partir de troisièmes molaires ou prémolaires orthodontiques jetées à l’hôpital de stomatologie de Ningbo, conformément aux directives éthiques institutionnelles (Protocole n° NBKQYY2025LS-04 ; date d’approbation : 30 mai 2025). Des tissus cutanés humains ont été prélevés à partir d’échantillons de prépuce abandonnés lors des procédures de circoncision de routine au département d’urologie de l’Hôpital Populaire affilié de l’Université de Ningbo, conformément aux directives éthiques institutionnelles (Protocole n° 2024104 ; date d’approbation : 30 octobre 2024). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les donneurs ou de leurs tuteurs légaux avant la collecte des échantillons.

1. Isolement des exosomes dérivés des cellules souches de la pulpe dentaire

1. Isolement, culture et identification des DPSC
   1. Collecte et transport d’échantillons
      1. Prélèvez les troisième molaires humaines intactes de donneurs âgés de 18 à 25 ans ou les prémolaires de donneurs âgés de 12 à 16 ans après extraction orthodontique.
      2. Placez immédiatement les dents extraites dans une solution séline phosphate tamponnée (PBS) pré-refroidie, complétée avec 100 U/mL de pénicilline-G et 100 μg/mL de streptomycine.
      3. Transportez les échantillons au laboratoire à 4 °C et traitez dans les 6 heures suivant l’extraction.
   2. Exposition de la pulpe dentaire et dissociation tissulaire
      1. Immergez dans 70 % d’éthanol pendant 30 secondes ; laver trois fois avec 1× PBS contenant 3 % de P/S (30 s chacun). Retirez soigneusement les tissus gingivaux et parodontaux résiduels de la dent à l’aide de ciseaux stériles ou d’un scalpel.
      2. Enveloppez la dent dans une gaze stérile, puis fendez délicatement la couronne à l’aide d’un marteau stérilisé pour exposer la chambre pulpaire.
      3. Séparez doucement le tissu pulpar de la dentine, réduisez-le en petits fragments (<1^{mm 3}) à l’aide de lames chirurgicales stériles.
      4. Transférez les fragments de tissu dans un tube centrifuge de 1,5 mL contenant une solution digestive de 2,5 mg/mL de dispase II et 2,5 mg/mL de collagénase de type I.
      5. Incubez le mélange à 37 °C dans un incubateur pendant 30 à 45 minutes avec une légère agitation.
         REMARQUE : La durée de la digestion enzymatique a été déterminée en fonction du volume et du degré d’homogénéisation du tissu pulpar dentaire.
   3. Terminaison de la digestion et culture cellulaire primaire
      1. Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant un volume équivalent de Médium Eagle Modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec un sérum bovin fœtal (FBS) à 10 %.
      2. Centrifugez la suspension cellulaire à 200 × g pendant 5 minutes pour pelleter les cellules et les fragments de tissu.
      3. Jetez le surnageant et resuspendez le pellet dans 1 mL de milieu de culture complet (α-MEM avec 20 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine).
      4. Semez les cellules et explants en suspension dans un bol de culture de 60 mm et ajoutez le milieu de culture complet à un volume final de 5 mL.
      5. Incubez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
   4. Entretien cellulaire et sous-culture
      1. Renouvelez le milieu culturel tous les 2 à 3 jours.
      2. Surveillez les cellules quotidiennement.
         REMARQUE : Les DPSC primaires migrent généralement à partir des explantes tissulaires et atteignent une confluence de 80 à 90 % en 7 à 14 jours.
      3. Pour la sous-culture, détacher les cellules à l’aide d’acide tripsine-éthylénédiamine tétraacétique (EDTA) à 0,05 % lorsqu’elles atteignent une confluence de 80 à 90 %.
         ATTENTION : La trypsine est un irritant. Portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et des lunettes de sécurité.
      4. Les cellules du passage sont à un ratio de 1:3 en utilisant le milieu de culture complet (avec 20 % de FBS).
      5. Utilisez les DPSC aux passages 2, 4 et 6 pour tous les tests d’isolation et de fonctionnement des exosomes en aval.
   5. Caractérisation des DPSC par cytométrie en flux
      1. Détacher les DPSC au passage souhaité en utilisant 0,05 % de trypsine-EDTA, neutraliser avec un milieu de culture complet, puis collecter la suspension cellulaire.
      2. Centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes à température ambiante et jetez le surnageant. Resuspendez la pellete cellulaire dans le PBS et comptez les cellules. Ajustez la densité cellulaire à environ 1 × 10⁶ cellules/mL.
      3. Aliquote 100 μL de la cellule en suspension dans chaque tube de cytométrie en flux. Incubez les cellules avec des anticorps conjugués au fluorochrome contre CD44, CD90, CD105, CD45, CD19 et CD14 à une dilution de 1:100 dans PBS pendant 30 minutes à 4 °C dans l’obscurité.
      4. Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de PBS à chaque tube, puis centrifugez à 300 × g pendant 5 minutes. Écartez soigneusement le surnageant et resuspendez la pellete cellulaire dans 300–500 μL de PBS pour analyse.
      5. Inclure des anticorps de contrôle isotype appropriés à des concentrations correspondantes pour chaque fluorochrome afin de permettre la correction de fond et la mise en valeur.
      6. Analyser les échantillons à l’aide d’un cytomètre en flux équipé de lasers et filtres appropriés pour les fluorochromes sélectionnés. Acquérir au moins 10 000 événements par échantillon.
      7. Effectuer une analyse des données à l’aide d’un logiciel de cytométrie en flux. Premièrement, des cellules viables par la porte basées sur la diffusion directe (FSC) et la diffusion latérale (SSC) pour exclure les débris. Ensuite, appliquez un dégagement de joints pour enlever les doublets.
      8. Déterminer l’expression des marqueurs en comparant l’intensité de fluorescence avec les contrôles isotypes correspondants afin de définir les populations positives et négatives.
2. Isolement et purification de DPSC-Exos
   1. Préparation d’un milieu conditionné
      1. Cultivez des DPSC dans une cuve de culture de 10 cm jusqu’à atteindre 70–80 % de confluence.
      2. Retirez le substrat usé puis lavez doucement la monocouche de cellules deux fois avec du PBS pré-chauffé.
      3. Ajoutez 10 mL de milieu complet complété par un FBS appauvri en exosomes à 10 %.
      4. On incube ensuite la culture à 37 °C jusqu’à ce que la confluence cellulaire atteigne 90–100 % (un processus généralement supérieur à 24 heures).
   2. Collection de milieux conditionnés
      REMARQUE : Gardez toutes les étapes suivantes sur glace ou à 4 °C.
      1. Transférez le milieu conditionné dans un tube centrifugeuse.
      2. Centrifugez le milieu à 4 °C et 3 000 × g pendant 10 minutes pour éliminer les cellules et les gros débris.
      3. Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube centrifugeuse sans déranger la boule.
      4. Centrifugez le surnageant à 4 °C et 10 000 × g pendant 10 minutes pour pelleter les particules plus petites et les corps apoptotiques.
      5. Filtrez le surnageant à travers un filtre à seringue de 0,22 μm dans un tube centrifugeuse propre de 50 mL.
      6. Traiter immédiatement le milieu clarifié pour l’isolation des exosomes, ou aliquote, et le stocker à -80 °C.
         REMARQUE : Le milieu clarifié et conditionné peut être conservé à -80 °C pendant plusieurs mois. Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
   3. Isolation des exosomes par précipitation à base de polymères
      1. Décongelez le milieu clarifié et conditionné sur de la glace s’il était congelé.
      2. Dans un tube stérile sur glace, combinez le milieu avec une solution de concentration d’exosomes à un rapport volumique de 4:1 (par exemple, milieu de 20 mL : solution de 5 mL). Faites passer le mélange en vortex pendant 1 minute pour assurer l’homogénéité.
      3. Laisser le mélange intact à 4 °C pendant 16 à 18 heures pour permettre la précipitation des exosomes.
         REMARQUE : Le temps d’incubation peut être prolongé de manière appropriée pour potentiellement augmenter le rendement, mais ne doit pas dépasser 24 heures.
      4. Centrifugez le mélange à 4 °C et 10 000 × g pendant 75 à 80 minutes pour pelleter les exosomes. Aspirez soigneusement et jetez le surnageant sans déranger la pellete.
      5. Centrifugez à nouveau le tube à 4 °C et 10 000 × g pendant 2 minutes. Enlève tout surnageant résiduel avec une pipette.
      6. Resuspendez la pellete d’exosome dans 1x PBS (utilisez 200 μL de PBS par milieu conditionné de 20 mL).
      7. Transférer la resuspension dans un nouveau tube centrifugeuse de 1,5 mL et centrifuger à 4 °C et 12 000 × g pendant 2 minutes, en conservant le surnageant, qui est enrichi en particules d’exosome (répéter si nécessaire).
   4. Purification des exosomes
      1. Appliquez la suspension d’exosome sur une colonne de filtration de purification d’exosomes placée dans un tube de collecte.
      2. Centrifugez la colonne à 4 °C et 3 000 × g pendant 10 minutes.
      3. Collectez le liquide de passage au fond du tube de collecte. Ce liquide contient les exosomes purifiés.
   5. Stockage des exosomes purifiés
      1. Aliquote la suspension d’exosomes purifiés en volumes à usage unique, adaptés aux expériences en aval.
      2. Stockez les aliquotes à -80 °C.
         REMARQUE : L’aliquotation est essentielle pour éviter les cycles répétés de gel-dégel, qui peuvent dégrader l’intégrité des exosomes et l’activité biologique.
   6. Caractérisation et identification des DPSC-Exo
      1. Effectuer une analyse morphologique par microscopie électronique en transmission (TEM) comme décrit aux étapes 1.2.6.2–1.2.6.6.
      2. Utilisez une pipette, puisez 10 μL de l’échantillon de suspension d’exosome préparé, puis déposez-le sur un parafilm pré-préparé. Placez la grille de cuivre recouverte de formvar/carbone, côté film vers le bas, sur la gouttelette, laissant l’adsorbe naturellement pendant 10 à 15 minutes.
      3. Utilisez une bande de papier filtre pour évacuer l’excès de liquide et laissez sécher à l’air libre un instant.
      4. Utilisez une pipette, extrayez 10 μL de solution acide phosphotungstique à 2 %, puis déposez-le sur le Parafilm. Inversez la grille qui a terminé l’étape d’adsorption pour que son côté film fasse face à la solution de coloration, puis laissez reposer 3 à 5 minutes.
      5. Utilisez une bande de papier filtre pour évacuer l’excès de liquide et laissez la grille sécher sous une lampe à incandescence.
      6. Observez et capturez des images à l’aide d’un microscope électronique à transmission.
      7. Effectuer une analyse de la répartition des tailles et des concentrations par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) comme décrit aux étapes 1.2.6.8–1.2.6.12.
      8. Rincez la chambre d’échantillonnage trois fois avec de l’eau ultrapure.
      9. Calibrez l’instrument à l’aide de billes de polystyrène standard de 100 nm selon les instructions du fabricant. Procédez aux mesures après une calibration réussie.
      10. Rincez la chambre d’échantillonnage avec 1× PBS.
      11. Diluez l’échantillon d’exosome en 1× PBS (dilution 1:500) et chargez-le dans la chambre d’échantillonnage. Surveillez le mouvement des particules en temps réel à l’aide du logiciel de l’instrument.
      12. Recueillez des données et générez le rapport d’analyse correspondant.
      13. Identifier les marqueurs protéiques par analyse Western blot comme décrit aux étapes 1.2.6.14–1.2.6.24.
      14. Lyser les échantillons d’exosome à l’aide d’un tampon de lyse protéique spécifique à l’exosome et quantifier la concentration protéique à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique (BCA).
      15. Préparez des gels résolus et empilés. Chargez des quantités égales de protéines par voie et ajoutez 5 μL de marqueur protéique à chaque gel.
      16. Effectuez l’électrophorèse à une tension constante de 80 V jusqu’à ce que le front de colorant atteigne le gel de résolution, puis augmentez à 120 V et continuez jusqu’à ce que le front de colorant atteigne le fond du gel.
      17. Coupez une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à la taille appropriée et activez-la en la faisant tremper dans le méthanol pendant 5 minutes.
      18. Préparez un tampon de transfert composé de 25 mM de Tris base, 192 mM de glycine et 20 % (v/v) de méthanol (pH = 8,3). Équilibrez tous les composants de transfert dans le tampon de transfert.
      19. Assemblez le sandwich de transfert dans l’ordre suivant, de la cathode à l’anode : éponge – papier filtre – gel – membrane PVDF – papier filtre – éponge. Éliminez les bules d’air et effectuez un transfert de protéines à un courant constant de 300 mA.
      20. Après le transfert, rincez brièvement la membrane PVDF avec du sérum physiologique tamponné à 0,1 % Tween20 (TBST) et bloquez avec 5 % de lait écrémé pendant 1 heure à température ambiante en secouant doucement.
      21. Incubez la membrane avec des anticorps primaires (par exemple, anti-CD63 et anti-TSG101) dilués dans du lait écrémé à 5 % pendant la nuit à 4 °C avec des secousses douces. Lavez la membrane trois fois avec TBST pendant 5 minutes chacune.
      22. Incubez avec l’anticorps secondaire approprié à température ambiante pendant 30 minutes, suivi de trois lavages avec TBST (5 min chacun).
      23. Préparer une nouvelle solution de travail électrochemiluminescence (ECL) (mélanger les solutions A et B à un rapport 1:1), appliquer sur la membrane et détecter les signaux à l’aide d’un système d’imagerie chimiluminescente.

2. Isolement et culture des kératinocytes épidermiques primaires de la peau humaine

1. Collecte et transport d’échantillons
   1. Prélèvez des échantillons de tissu de prépuce auprès de donneurs masculins en bonne santé à l’Hôpital Populaire Affilié de l’Université de Ningbo.
   2. Placez immédiatement le tissu extrait du prépuce dans un PBS à 4 °C, complété avec 100 U/mL de pénicilline-G et 100 μg/mL de streptomycine.
   3. Transporter les échantillons au laboratoire à 4 °C et traiter en 6 heures.
2. Préparation aseptique et fragmentation tissulaire
   1. Immergez le tissu dans un éthanol à 70 % pendant 30 secondes à 3 minutes.
      REMARQUE : Ajustez le temps d’immersion en fonction de la taille des tissus pour la désinfection initiale.
   2. À l’aide de ciseaux stériles ou d’un scalpel, disséquez et retirez la graisse sous-cutanée et le tissu conjonctif de l’échantillon de tissu lavé.
   3. Réduisez-le en petits fragments (taille du fragment <1 mm³) à l’aide de lames chirurgicales stériles.
      REMARQUE : Hacher 3 à 4 échantillons de tissu nécessite généralement moins de 15 minutes. Ajoutez une petite quantité de PBS pendant le hachage si le tissu semble sec.
   4. Transférez la bouillie de tissu haché dans un tube centrifuge de 50 mL contenant une solution digestive de 2,5 mg/mL de collagénase de type I et de 2,5 mg/mL de dispase II. Ajoutez 10 à 20 mL de solution digestive par morceau de tissu haché.
   5. Incubez le mélange dans un incubateur à 37 °C pendant 60 minutes. Maintenez une agitation douce à 80 × g, ou agitez vigoureusement le tube à la main toutes les 20 minutes.
3. Digestion secondaire et traitement de la DNase
   1. Ajoutez 0,25 % de trypsina-EDTA au mélange digestif à un rapport de volume de 1:5. Incubez la sonde à 37 °C pendant 25 minutes avec une légère agitation.
      ATTENTION : La trypsine est un irritant. Portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et des lunettes de sécurité.
   2. Ajoutez la solution de DNase I (10 mg/mL) au mélange avec un rapport de 10 μL par mL du volume total de digestion. Incubez à 37 °C pendant 5 minutes avec une légère agitation.
4. Terminaison de la digestion et culture cellulaire primaire
   1. Arrêtez la digestion enzymatique en ajoutant un volume égal de DMEM complété par 10 % de FBS.
   2. Triturez le mélange soigneusement en pipettant environ 20 fois pour dissocier les fragments de tissu. Filtrez la suspension de cellules à travers un filtre de 100 μm dans un nouveau tube centrifugeuse de 50 mL.
   3. Centrifugez la suspension cellulaire à 200 × g pendant 5 minutes pour pelleter les cellules et les fragments de tissu.
   4. Jetez le surnageant et resuspendez le pellet dans 1 mL de milieu de culture complet (α-MEM avec 20 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine).
   5. Semez les cellules et explantes en suspension dans un bol de culture de 10 cm et ajoutez le milieu de culture complet à un volume final de 6 mL.
   6. Incubez les cellules à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
      REMARQUE : Compléter les cultures de kératinocytes avec Y-27632 à une concentration finale de 5 μM pendant la culture.
5. Entretien cellulaire et sous-culture
   1. Renouvelez le milieu culturel tous les 2 à 3 jours.
   2. Surveillez les cellules quotidiennement.
      REMARQUE : Les kératinocytes épidermiques primaires de la peau migrent généralement depuis les explantes tissulaires et atteignent une confluence de 80 à 90 % en 10 à 14 jours.
   3. Pour la sous-culture, détacher les cellules en utilisant 0,05 % de trypsine-EDTA lorsqu’elles atteignent 80–90 % de confluence.
      ATTENTION : La trypsine est un irritant. Portez un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et des lunettes de sécurité.

3. Vérification fonctionnelle de la fonction anti-inflammatoire des exosomes à partir de différents passages

1. Ensemencement et préparation des cellules
   1. Séminer les kératinocytes épidermiques à une densité de 1,5 ×^10,5 cellules par puits dans une plaque à 12 puits. Ajoutez 1 mL de substrat complet à chaque puits et cultivez les cellules pendant 24 heures.
   2. Lorsque la confluence cellulaire atteint environ 70 %, aspirez soigneusement le milieu, lavez doucement la monocouche cellulaire deux fois avec un PBS préchauffé à 1×.
2. Stimulation inflammatoire et traitement des exosomes
   1. Induire un modèle cellulaire psoriasiforme, stimuler les cellules avec le mélange de cytokines pro-inflammatoires « M5 » (contenant IL-1α, IL-17A, IL-22, Oncostatin M et TNF-α, chacun à une concentration finale de 10 ng/mL).
   2. Pour les groupes traités, co-incubez les cellules stimulées avec DPSC-Exos (50 μg par puits).
   3. Pour le groupe témoin négatif (NC), ajoutez un volume équivalent de PBS au lieu d’exosomes.
      REMARQUE : Effectuer toutes les stimulations et traitements dans un milieu dépourvu de Y-27632 afin d’éviter son interférence potentielle avec les voies de signalisation inflammatoire.
3. Collecte d’échantillons et analyse qRT-PCR (comparaison fonctionnelle entre passages)
   1. Prélèvez les cellules et extrayez l’ARN après 24 heures de traitement.
   2. Analysez l’expression du marqueur inflammatoire clé IL-23A.
      1. Comparez les effets inhibiteurs sur l’expression d’IL-23A parmi les groupes de traitement par exosomes dérivés de différents passages (P2, P4 et P6) à l’aide de la qRT-PCR pour évaluer les changements dépendants du passage dans la fonction des exosomes.
      2. Effectuer la qRT-PCR en utilisant les conditions de cycle suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 minutes, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 10 s et recuit/extension à 60 °C pendant 30 s.
      3. Effectuer une analyse de la courbe de fusion de 65 °C à 95 °C pour confirmer la spécificité de l’amplification.
         REMARQUE : Séquences d’amorces : Human-IL-23A (avant : 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAC-3', arrière : 5'-TATCCGATTAGCAGCTTC-3') ; Human-H36B4 (avant : 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3', arrière : 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3')

Résultats

Identification et caractérisation des cellules souches de la pulpe dentaire
Les cellules souches pulpaires primaires (DPSC) isolées selon le protocole décrit ont montré une croissance stable et une morphologie mésenchymatose typique lors de l’expansion in vitro. Comme montré à la Figure 1, les DPSC aux passages 2, 4 et 6 présentaient une population homogène de cellules en forme de fuse, semblables à des fibrob...

Discussion

Le protocole standardisé décrit dans cette étude fournit un cadre reproductible pour l’isolement des cellules souches pulpaires dentaires (DPSC), la production d’exosomes dérivés de la DPSC (DPSC-Exos) et la validation fonctionnelle de ces vésicules à travers plusieurs passages cellulaires. La discussion ci-dessous met en lumière des considérations procédurales cruciales, des stratégies d’optimisation, des limites méthodologiques et la pertinence plus large de ce flux de travail pour la ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0.05% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25300054	En raison de sa force digestive, la trypsine est largement utilisée pour la dissociation cellulaire, le passage de routine de la culture cellulaire et la dissociation des tissus primaires.
100 mm Cell and Tissue Culture Dish	Biofil	TCD010100	Surface traitée/non traitée Stérile &Non-Pyrogène DNase/RNase-Free
100 nm PS beads	Thermo Fisher	3100A	Avant de mener des expériences d'analyse de suivi des nanoparticules (NTA), l'instrument doit être calibré à l'aide d'un standard avec une taille de particule précisément connue (100 nm).
15-mL Bulk Conical Centrifuge Tube	KIRGEN	KG2611	Stérile, libre de RNase/Dnase et pyrogène
200-mesh Formvar-carbon-coated copper grid	Zhongjing Scientific Instruments	AZH200	Prend en charge les échantillons d'exosome pour l'imagerie TEM. Le revêtement Formvar-carbon améliore l'adhérence et la conductivité de l'échantillon, tandis que la grille à 200 mailles fournit une zone ouverte adéquate pour une distribution uniforme des particules et une imagerie stable.
37 °C Incubator	Thermo Scientific	51032877	L'incubateur CO2 à 37 degrés fournit un environnement idéal in vitro.
50-mL Bulk Conical Centrifuge Tube	KIRGEN	KG2811	Stérile, libre de RNase/Dnase et pyrogène
Anti-CD63 antibody [MX-49.129.5]	Abcam	ab193349	L'anticorps anti-CD63 [MX-49.129.5] (ab193349) est un anticorps monoclonal de souris détectant CD63 dans Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. Convient pour Human.
Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]	Abcam	ab125011	L'anticorps anti-TSG101 [EPR7130(B)] (ab125011) est un anticorps monoclonal de lapin détectant TSG101 dans Western Blot, Flow Cytometry (Intra), Flow Cytometry, IHC-P, ICC/IF. Convient pour Human, Mouse, Rat.
Automated cell counter	Countstar	IC1000	Compteur de cellules automatisé pour un décompte rapide et précis des cellules
BCA Protein Assay Kit	Beyotime	P0012	A une bonne relation linéaire dans la plage de concentration de 50 - 2000 μg/ml.
Benchtop Centrifuge	BIORIDGE	TD5	Centrifugeuse de table pour une séparation rapide et efficace des échantillons dans les environnements de laboratoire
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1379	L'armoire de sécurité biologique est un dispositif de confinement stérile qui protège les opérateurs, les échantillons et les environnements des risques biologiques en filtrant les agents pathogènes aériens et en empêchant la contamination croisée pendant les travaux microbiologiques.
Cell Culture Plate,12-Well	Eppendorf	0030721110	Traité pour la culture tissulaire,avec couvercle,fond plat Stérile,sans pyrogènes détectables,RNase & DNase,ADN humain & bact. Non-cytotoxique
Cell Culture Plate,96-Well	NEST	701001 0714B	Traité pour la culture tissulaire,Polystyrène,Non-Pyrogenique,Stérile
Cellsaving	NCM	C40100	Sans sérum,sans protéine animale Milieu de congélation cellulaire
Collagenase, Type I, powder	Gibco	17100017	La collagenase est une protéase qui clive la liaison entre un acide aminé neutre (X) et la glycine dans la séquence Pro-X-Gly-Pro, qui se trouve avec une fréquence élevée dans le collagène.
Dispase II, powder	Gibco	17105041	Le Dispase II (protéase neutre) est une amino-endo peptidase qui hydrolyse les liaisons peptidiques N-terminales des résidus d'acides aminés non polaires.
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT	[+]4.5g/L D-Glucose [+]L-Glutamine [+]110mg/L Sodium Pyruvate
Evo M-MLV Reverse Transcription Kit	AG	AG11707	Un réactif de transcription inverse dédié à la RT-PCR en temps réel. Il utilise la transcriptase inverse Evo M-MLV avec une forte capacité d'extension, permettant une synthèse efficace de l'ADNc dans un court laps de temps.
Exosome Concentration Solution	Umibio	UR52111	Extrait les exosomes du surnageant cellulaire
Exosome Depleted Fetal Bovine Serum	Umibio	UR50202	Le sérum bovin fœtal exempt d'exosome a été obtenu en filtrant le sérum bovin fœtal collecté de manière stérile, et ≥99% des exosomes endogènes du sérum bovin fœtal ont été éliminés. Il présentait le même taux de croissance cellulaire et la même morphologie que le sérum bovin fœtal avant le traitement.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia	Gibco	10099141	Taux d'hémoglobine: ≤30 mg/dL (niveaux habituellement ≤25 mg/dL)
Human-H36B4	Sangon Biotech	SB002	Avant: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3'; Arrière: 5'-GCCTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
Human-IL-23A	Sangon Biotech	SB002	Avant: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3'; Arrière: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'
Inverted Biological Microscope	Leica	DMI1	Observer directement les cellules vivantes ou les tissus qui adhèrent aux parois de contenants tels que les flacons de culture et les boîtes de Petri.
Minimum Essential Medium	Gibco	C12571500BT	[+]L-Glutamine [+]Ribonucléosides [+]Déoxyribonucléosides
NcmSpin Rapid RNA Extraction Kit	NCM	M5106	Ce kit peut extraire rapidement l'ARN total jusqu'à 3 000 000 de cellules et jusqu