Mécanismes de la décoction de Shengxian Quyu dans l’insuffisance cardiaque utilisant une approche non ciblée de métabolomique et de pharmacologie en réseau chez les rats

Résumé

Cette étude a confirmé l’effet thérapeutique de la décoction de Shengxian Quyu sur l’insuffisance cardiaque grâce à des expériences animales. La chromatographie liquide ultra-performance, la spectrométrie de masse et les analyses de pharmacologie en réseau ont identifié des cibles et mécanismes thérapeutiques potentiels.

Résumé

La décoction de Shengxian Quyu (SXQY) a été suggérée comme une stratégie thérapeutique potentielle pour l’insuffisance cardiaque (IC), mais ses mécanismes thérapeutiques restent incertains. Cette étude a étudié les effets thérapeutiques et les mécanismes sous-jacents de SXQY dans l’IC. Un modèle de rat de HF a été induit par la constriction aortique transversale (TAC) et traité avec SXQY. La fonction cardiaque a été évaluée par échocardiographie transthoracique, et la structure du myocarde ainsi que la fibrose ont été évaluées à l’aide d’hématoxyline et d’éosine ainsi que de la coloration trichrome de Masson. Les échantillons séromiques ont été analysés par métabolomique non ciblée à l’aide de chromatographie liquide ultra-performance–spectrométrie de masse tandem. Les composants entrant dans le sang ont été cartographiés vers des cibles, et les cibles intersectantes liées à l’IC ont été analysées à l’aide d’analyses de réseaux d’interaction protéine-protéine (IPP), suivies par des analyses de Gene Ontology et de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG). SXQY a significativement amélioré la fonction cardiaque chez les rats TAC, comme en témoignent la diminution du diamètre interne du ventricule gauche dans la diastole et l’épaisseur de la paroi postérieure du ventricule gauche dans la diastole ainsi qu’une augmentation de la fraction d’éjection du ventricule gauche, et a soulagé l’hypertrophie myocardique, l’inflammation et la fibrose. Un total de 563 composés d’entrée dans le sang ont été identifiés (367 prototypes et 196 métabolites), dont 5 composés actifs clés identifiés dans la base de données des systèmes de pharmacologie de médecine traditionnelle chinoise correspondant à 63 cibles. L’analyse des réseaux a révélé 44 gènes qui se chevauchent, avec la formononétine, la timosaponine BII et la sinensétine comme composants centraux, et PTGS2, PPARG et HSP90AA1 comme cibles centrales. L’analyse des IPP a également identifié des gènes clés, notamment ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN et 15 gènes supplémentaires. L’analyse KEGG a indiqué que SXQY agit principalement via Ca²⁺, phosphatidylinositol 3-kinase kinase protéine B, adénosine monophosphate cyclique, ainsi que via les voies liées à l’inflammation et aux hormones. En conclusion, SXQY exerce des effets protecteurs contre l’IC en améliorant la fonction cardiaque et en atténuant le remodelage myocardique grâce à des mécanismes multicomposants, multicibles et multivoies.

Introduction

L’insuffisance cardiaque (IC) est un syndrome clinique caractérisé par un obturation ventriculaire altérée et une capacité d’éjection dues à des anomalies structurelles ou fonctionnelles cardiaques, entraînant une constellation de signes et de symptômes^{cliniques 1}. En tant que stade terminal de diverses maladies cardiaques, l’IC compromet considérablement la qualité de vie des patients et entraîne une forte mortalité ainsi que des réadmissions fréquentes à l’hôpital, imposant ainsi un fardeau important de la maladie tant aux familles qu’à la société ^2,3. Dans la prise en charge clinique, la pharmacothérapie pour l’IC constitue la base et la pierre angulaire du traitement, comprenant principalement des classes clés de médicaments telles que les diurétiques, les inhibiteurs du système rénine-angiotensine, les bêta-bloquants, les antagonistes des récepteurs minéralocorticoïdes et les inhibiteurs du cotransporteur sodium-glucose 2 3,4,5,6 . Bien que ces médicaments aient partiellement amélioré le pronostic des patients atteints d’IC, ils comportent chacun certaines limitations et effets indésirables, tels que des troubles électrolytiques, une bradycardie et des infections des voies^{urinaires 7}. Par conséquent, les thérapies pharmacologiques pour l’IC nécessitent encore des recherches supplémentaires.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) a acquis une vaste expérience clinique dans la prise en charge à long terme de l’IC. Mettant l’accent sur la régulation holistique et l’intervention multicible, elle propose une approche distinctive du^{traitement 8}. Ces dernières années, plusieurs essais contrôlés randomisés (ECR) ont démontré l’efficacité thérapeutique des formules à base de plantes chinoises pour l’IC 9,10,11,12,13,14,15. La décoction de Shengxian Quyu (SXQY) a déjà commencé à subir des ECR rigoureux pour confirmer son efficacité thérapeutique, mais ses mécanismes thérapeutiques spécifiques nécessitent encore une investigation plus^{approfondie et approfondie 16}. La pharmacologie des réseaux, en tant que discipline émergente intégrant la biologie des systèmes, la polypharmacologie et l’analyse computationnelle, offre un outil puissant pour élucider les mécanismes d’action holistiques des formules herboristes^chinoises 17,18,19. Par conséquent, cette étude utilise une stratégie intégrée combinant métabolomique non ciblée et pharmacologie en réseau afin d’identifier les composants absorbés par le sang de SXQY et d’élucider ses mécanismes thérapeutiques potentiels. Ce travail vise à fournir une base pour l’application clinique ultérieure de SXQY.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique et de bien-être animal de l’Hôpital de l’amitié Chine–Japon (approbation n° zryhyy21-23-01-09) et ont été menées conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement afin de minimiser l’utilisation et la souffrance animales. Les chercheurs effectuant l’acquisition et l’analyse des données (y compris les mesures d’échocardiographie et l’évaluation histologique) ont été aveugles à l’allocation des groupes.

Préparation de l’échantillon SXQY

SXQY est composé des composants à base de plantes suivants : Astragalus membranaceus (Huangqi) (30 g), Codonopsis pilosula (Dangshen ; 20 g), Cornus officinalis (Shanyurou ; 15 g), Sparganium stoloniferum (Sanleng ; 12 g), Curcuma zedoaria (Erzhu ; 15 g), Cimicifuga heracleifolia (Shengma ; 10 g), Bupleurum chinense (Chaichu ; 10 g), Platycodon grandiflorus (Jiegeng ; 10 g), Anemarrhena asphodeloides (Zhimu ; 15 g), et Leonurus japonicus (Yimu ; 15 g), avec un poids total d’herbes brutes de 152 g par prescription. Tous les matériaux à base de plantes étaient achetés auprès du Département de Pharmacie de l’Hôpital de l’Amitié Chine–Japon et authentifiés par un pharmacien en chef selon les méthodes standard d’identification pharmacognostique. Cliniquement, SXQY est administré à une dose d’une ordonnance (152 g) par jour. En supposant un poids corporel moyen adulte de 70 kg, la dose humaine correspondante est de 2,17 g (herbe brute)/kg. Sur la base de la normalisation de la surface corporelle entre humains et rats, la dose équivalente pour les rats a été calculée à 13,67 g (herbe brute)/kg. Pour la préparation de la décoction, une prescription de SXQY a été trempée dans de l’eau distillée au ratio de 10 mL par gramme d’herbes brutes (p/v, basé sur le volume initial de solvant sans ajustement après trempage) pendant 1 heure, suivie d’une ébullition à l’aide d’un manteau électrique chauffant et maintenue à 100°C sous ébullition continue pendant 1 heure. L’extrait a ensuite été filtré à travers de la gaze (taille de pore de 200 à 300 μm). Le résidu a ensuite été extrait deux fois de plus dans des conditions identiques. Les filtrats regroupés ont été concentrés sous pression réduite à l’aide d’un évaporateur rotatif à 60°C pour un volume final de 111 mL, obtenant une concentration de 1,37 g (médicament brut)/mL. La décoction concentrée a été filtrée à nouveau à travers une compresse (pore de 200 à 300 μm) et stockée à 4°C et utilisée dans un délai de 24 à 48 heures. Pour l’administration, la solution a été utilisée directement, et le volume de la vavage a été calculé sur la base d’une concentration de 1,37 g/mL, ce qui donne un volume d’administration d’environ 10 mL/kg pour atteindre la dose cible de 13,67 g/kg.

Modèle animal

Dix-huit rats mâles de Sprague–Dawley (SD) âgés de 8 semaines ont été logés dans un environnement conditionné standard (23°C ± 2°C, 50 ± 5 % d’humidité relative et un cycle clair/obscurité de 12 heures) avec libre accès à la nourriture et à l’eau. Les animaux ont été assignés au hasard à trois groupes (n = 6 par groupe) à l’aide d’un tableau de nombres aléatoires : un groupe opéré par simulateur (Sham), un groupe de constriction aortique transversale (TAC) et un groupe traité par SXQY (SXQY). Les rats des groupes TAC et traités par SXQY ont été anesthésés par inhalation d’isoflurane (induction 4 %, entretien 2 %) et placés en position allongée sur une bouillotte thermostatique maintenue à 37°C. Une anesthésie adéquate a été confirmée par l’absence de réflexes au pincement de patte, ainsi qu’un rythme respiratoire stable et l’absence de mouvement spontané. Une pommade ophtalmique a été appliquée sur les deux yeux pour éviter la sécheresse cornéenne. Après l’intubation endotrachéale, les animaux étaient connectés à un respirateur de petits animaux avec un volume tidal de 4 à 6 mL pour 200 g de poids corporel, un rythme respiratoire de 70 respirations par minute et un ratio inspiration/expiratoire de 1:1.

Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées dans des conditions aseptiques. Les instruments chirurgicaux ont été stérilisés par autoclavage, et la zone opératoire a été préparée par un rasage et une désinfection avec de la povidone-iode suivie d’un taux d’éthanol à 70 %. Après la préparation du site chirurgical, une incision cutanée thoracique gauche a été réalisée, et les grands pectoraux ainsi que les petits muscles ont été disséqués de façon brutale pour exposer les côtes. Une incision horizontale d’environ 1,0 cm a été réalisée au deuxième à troisième espace intercostal adjacent à la bordure sternale gauche. Les vaisseaux sanguins et le fascia étaient séparés de façon brutale, et le thymus était doucement rétracté pour exposer complètement l’arc aortique.

L’arc aortique a été soigneusement soulevé entre l’artère innominate droite et l’artère carotide commune gauche à l’aide de pinces courbées stériles, et une suture en soie 2-0 a été passée en dessous. Une aiguille courbe à pointe émoussée de calibre 16 (diamètre extérieur 1,6 mm) était modifiée manuellement en émoussant la pointe et en la pliant à une courbure appropriée avant utilisation, suivie d’une stérilisation par autoclavage. L’aiguille courbe à pointe émoussée préparée était ensuite positionnée parallèlement à l’arc aortique, après quoi la suture était nouée fermement autour de l’aorte et de l’aiguille. L’aiguille a été immédiatement retirée pour créer une constriction standardisée, et le thymus a été repositionné. Après confirmation de l’absence de saignement actif, la paroi thoracique et la peau ont été refermées en couches. Après l’opération, la ventilation mécanique a été poursuivie pendant environ 10 minutes jusqu’à ce que la respiration spontanée soit rétablie, comme l’indique un rythme respiratoire stable et régulier ainsi que la capacité à maintenir une respiration spontanée sans soutien ventilatoire. À ce moment-là, la trompe endotrachéale a été retirée. Les animaux opérés par simulacre subissaient les mêmes interventions chirurgicales, sauf que l’arc aortique n’était pas ligaté.

Après l’opération, le site de l’incision a été désinfecté et les animaux placés dans des cages de récupération propres afin de réduire le risque d’infection. Les rats étaient ensuite ramenés à l’établissement pour la récupération et le logement de routine. L’analgésie a été administrée à l’aide de buprénorphine (0,05 mg/kg, par voie sous-cutanée). Des rats ont été observés toutes les 12 heures pendant les 72 premières heures pour des signes de douleur, de détresse ou de complications chirurgicales, notamment une mobilité réduite, une piloérection, une posture anormale, une respiration laborieuse ou une déhiscence de la plaie.

Trois jours après l’opération, les rats du groupe traité par SXQY ont été injectés par voie orale avec 1 mL/100 g de poids corporel de la décoction SXQY pendant 9 semaines. Pendant ce temps, les rats des groupes à opération simulée et TAC recevaient un volume égal (1 mL/100 g de poids corporel) d’eau distillée par gavage.

Échocardiographie transthoracique

À la fin de la période de traitement, une échocardiographie transthoracique a été réalisée dans tous les groupes. Les rats étaient anesthésés par inhalation d’isoflurane et placés en position couchée sur une plateforme d’imagerie dédiée. La poitrine antérieure a été soigneusement rasée et recouverte d’une généreuse couche de gel à ultrasons. L’imagerie par ultrasons a été réalisée à l’aide d’un système d’échographie haute résolution pour petits animaux équipé d’un transducteur haute fréquence (18–40 MHz) en mode B et M. Le transducteur était positionné délicatement sur la zone recouverte de gel, avec une profondeur réglée à 12,29 mm et un gain de 22 dB ; La mise au point a été ajustée pour optimiser la qualité de l’image. Des images et des boucles vidéo ont été acquises pour une analyse quantitative ultérieure. Le diamètre interne du ventricule gauche (LVIDd) et l’épaisseur de la paroi postérieure du ventricule gauche à la diastole terminale (LVPWd) ont été mesurés, et la fraction d’éjection du ventricule gauche (LVEF) a été calculée à l’aide de la formule de Teichholz basée sur les mesures en mode M. Pour chaque paramètre, les mesures ont été effectuées en moyenne sur 3 à 5 cycles cardiaques consécutifs. Toutes les acquisitions et analyses échocardiographiques ont été réalisées par un opérateur certifié avec une formation formelle en échocardiographie, conformément aux protocoles échocardiographiques standardisés.

Collecte et traitement des échantillons

Après l’échographie, les rats ont été anesthésés avec de l’isoflurane. Les animaux étaient placés en position couchée, et la cavité thoracique était ouverte pour exposer le cœur. Les cœurs étaient rapidement excisés, rincés dans une solution séline froide tamponnée de phosphate, puis sectionnés le long du plan sagittal. Les tissus cardiaques ont été immédiatement fixés dans 4 % de paraformodéhyde à 4°C pendant 24 heures, suivies d’une déshydratation par une série éthanol graduée (70 %, 80 %, 90 %, 95 % et 100 %) pendant 1 heure à chaque étape, période durant laquelle les tissus devenaient progressivement translucides sans rétrécissement visible. Les échantillons étaient éliminés dans le xylène, infiltrés avec de la paraffine en fusion à 60°C pendant 3 heures, puis laissés solidifier à température ambiante (RT ; 20°C–25°C). Les blocs de tissu cardiaque incrustés dans la paraffine ont été coupés et sectionnés à une épaisseur de 4 à 6 μm à l’aide d’un microtome. Les sections étaient flottées sur un bain-marie maintenu à 45°C, montées sur des lames en verre, et séchées à 37°C–40°C pendant la nuit. Les lames étaient stockées à RT dans des conditions de faible humidité et utilisées en moins d’une semaine pour la coloration histologique.

Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE)

Les sections intégrées en paraffine ont été traitées comme suit. Les sections ont d’abord été déparaffinées par immersion dans le xylène I, II et III pendant 5 minutes chacune, suivies d’une hydratation à travers une série d’éthanol anhydre I et II et de solutions d’éthanol graduées (95 %, 90 %, 80 %, 70 % et 50 %) pendant 5 minutes chacune, puis enfin rincées dans de l’eau distillée, sans résidus de cire visibles. Les sections ont ensuite été teintées à l’hématoxyline Harris pendant 5 minutes et rincées sous l’eau courante du robinet pendant 1 à 2 minutes. La différenciation a été réalisée dans une solution acido-alcoolisée pendant environ 1 à 2 secondes, le point final étant déterminé par inspection visuelle lorsque le fond paraissait pâle tandis que la coloration nucléaire restait clairement définie. Cela était suivi d’un bluissement dans de l’eau à 37°C–45°C puis d’un rinçage à l’eau distillée. Par la suite, les sections ont été contre-colorées avec de l’éosine soluble en alcool pendant 40 s, lavées à l’eau distillée, déshydratées à l’éthanol gradué, dégagées au xylène, puis finalement montées avec une résine neutre.

Coloration en maçonnerie

Les sections incorporées en paraffine ont été déparaffinées séquentiellement dans le xylène I, II et III pendant 5 minutes chacune, suivies d’une hydratation à l’aide d’éthanol anhydre I et II et de solutions éthanoliques graduées (95 %, 90 %, 80 %, 70 % et 50 %) pendant 5 minutes chacune, puis enfin rincées dans de l’eau distillée. Les coupes ont été immergées dans de l’acide acétique à 0,5 % (pré-refroidi à 4°C) pendant 1 seconde, suivies d’une coloration avec la solution de fuchsine d’un kit commercial de coloration trichrome de Masson’s pendant 10 minutes, puis d’une différenciation dans de l’acide phospholybdique pendant 5 minutes et d’une contre-coloration avec du bleu d’aniline pendant 3 minutes. Tous les réactifs faisaient partie du même kit commercial et étaient utilisés selon les instructions du fabricant. Après la coloration, les sections étaient rincées trois fois à l’acide acétique pré-refroidi à 4°C (environ 30 s par rinçage), déshydratées par de l’éthanol gradué, dégagées au xylène, puis montées avec de la résine neutre.

Collecte d’échantillons séromiques pour l’analyse métabolomique

Six rats mâles SD âgés de 8 semaines ont été hébergés dans les mêmes conditions que ceux de l’expérience in vivo mentionnée ci-dessus. Les animaux ont été assignés au hasard à un groupe traité par SXQY et à un groupe témoin véhicule (eau distillée ; n = 3 par groupe) à l’aide d’une méthode de randomisation générée par ordinateur. Les rats du groupe SXQY ont reçu une dose orale de SXQY à une dose de 1 mL/100 g de poids corporel, tandis que le groupe témoin du véhicule a reçu un volume équivalent d’eau distillée. Après sept jours de gargouille quotidienne, la dose finale du septième jour a été doublée. Après la dernière administration, les animaux étaient à jeûne pendant 12 heures. Les rats ont été anesthésés avec de l’isoflurane jusqu’à ce que la perte du réflexe de retrait pédalier soit confirmée comme indicateur d’une anesthésie adéquate. Des échantillons sanguins ont été prélevés dans le plexus veineux rétro-orbitaire à l’aide de tubes capillaires stériles et immédiatement transférés dans des tubes microcentrifuge de 1,5 mL sans anticoagulant. Le sang entier a ensuite été laissé à température réactive pendant 1 h et centrifugé à 1000 × g pendant 15 minutes à 4°C pour obtenir le sérum. Lorsqu’une séparation claire entre la couche supérieure transparente du sérum et le caillot apparaissait, le sérum surnageant était soigneusement aspiré et transféré dans des tubes propres de microcentrifuge. Les échantillons sérumiques étaient conservés à −80°C jusqu’à l’analyse des composants entrant dans le sang.

Exemple de prétraitement pour l’analyse métabolomique

Les échantillons de sérum ont été décongelés sur glace après leur retrait de la réserve à −80°C et brièvement mélangés en vortex (10 s) pour garantir l’homogénéité. Un aliquote de 100 μL de sérum a été transféré dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL, suivi de l’ajout de 500 μL de solvant d’extraction (20 % d’acétonitrile–méthanol contenant 2-chloro-L-phénylalanine comme standard interne à une concentration finale de 1 μg/mL) pour induire la précipitation des protéines. Le mélange a été vigoureusement tourbillonné pendant 3 minutes puis centrifugé à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4°C. Une portion de 470 μL du surnageant résultant a été transférée dans un nouveau tube et évaporée jusqu’à la sécheresse à l’aide d’un évaporateur d’azote sous un faible débit contrôlé d’azote. Après reconstitution à 200 μL de 70 % de méthanol et eau et vortex pendant 1 minute, les échantillons ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4°C, et 180 μL du surnageant clarifié ont été transférés dans des flacons d’autoéchantillonnage pour l’analyse chromatographie liquide–spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS).

Une aliquote de 200 μL d’échantillon SXQY a ensuite été transférée dans un tube centrifuge pré-marqué de 1,5 mL. La solution d’extraction standard interne était ajoutée à chaque échantillon à un rapport de volume de 1:1 (v/v). Le mélange a été mélangé en vortex pendant 15 minutes puis centrifugé à 12 000 × g pendant 3 minutes à 4°C. Le surnageant obtenu a été soigneusement collecté et filtré à travers une membrane microporeuse de 0,22 μm, obtenant un filtrat transparent sans particules visibles. Le filtrat a été transféré dans des fioles d’autoéchantillonneur et stocké à 4°C avant l’analyse LC-MS/MS (UPLC–MS/MS) en ultra-performance.

Préparation de solutions internes standard

La solution standard interne (2-chloro-L-phénylalanine) a été préparée en dissolvant 1 mg de l’étalon de référence dans 1 mL de méthanol–eau à 70 % (v/v), obtenant une concentration de 1 000 μg/mL. Cette solution standard a été diluée avec le même solvant pour obtenir une solution standard interne fonctionnelle avec une concentration finale de 1 ppm, fraîchement préparée, stockée à 4°C, et utilisée dans les 48 à 72 heures.

Conditions de l’UPLC–MS/MS

La séparation chromatographique était réalisée à l’aide d’un système UPLC couplé à un spectromètre de masse tandem. La séparation a été réalisée sur une colonne C18 maintenue à 40°C, avec un débit de 0,35 mL/min et un volume d’injection de 4 μL. La phase mobile était composée d’eau ultrapure contenant 0,1 % (v/v), d’acide formique (A) et d’acide formique (B) contenant 0,1 % (v/v). L’élution du gradient a été appliquée comme suit : 5 % B à 0,0 min ; la B augmentée linéairement à 25 % de B à 2,0 min, 35 % de B à 3,0 min, 60 % de B à 5,0 min et 99 % B à 6,0 min ; est resté à 99 % B pendant 1,5 minute ; est revenu à 5 % B à 7,6 min ; et s’est équilibrée à 5 % B jusqu’à 10,0 min.

La détection par spectrométrie de masse était réalisée à l’aide d’un spectromètre de masse haute résolution équipé d’une source d’ionisation par électropulvérisation fonctionnant en modes ions positifs et négatifs. Les tensions de pulvérisation étaient réglées à 3500 V en mode positif et 3200 V en mode négatif. Le gaz de gaine et le gaz auxiliaire étaient réglés respectivement à 30 et 5 unités arbitraires (définies par instrument). La température du tube de transfert d’ions et celle du vaporisateur étaient maintenues respectivement à 320°C et 300°C. Les balayages MS complets ont été obtenus sur une plage m/z de 84–1250 à une résolution de 35 000 avec un objectif de contrôle automatique du gain (AGC) de 1,0 × 10⁶, suivis d’une acquisition MS/MS dépendante des données (top 10) à une résolution de 17 500 avec un objectif AGC de 2,0 × 10⁵ et une fenêtre d’isolement de 1,0 à 1,5 m/z. Des énergies de collision normalisées par palier de 30, 40 et 50 ont été appliquées. Les 10 ions précurseurs les plus intenses ont été sélectionnés pour la fragmentation avec une durée d’exclusion dynamique de 3 s.

Traitement brut des données

Les données brutes de spectrométrie de masse ont été converties au format mzML à l’aide de ProteoWizard. Pour garantir la fiabilité analytique, des échantillons de contrôle qualité (QC) regroupés ont été préparés en mélangeant des volumes égaux de tous les échantillons sériques. Des échantillons de contrôle qualité ont été injectés à intervalles réguliers (une injection de contrôle qualité tous les 5 à 10 échantillons analytiques) tout au long de l’analyse UPLC–MS/MS pour surveiller la stabilité de l’instrument, la cohérence du temps de rétention et la reproductibilité du signal. La reproductibilité a été évaluée sur la base de l’écart type relatif des intensités de pic dans les échantillons de QC.

La détection des pics, la correction du temps de rétention et l’alignement des pics ont été réalisés à l’aide du package XCMS. Les caractéristiques présentant un taux de manque supérieur à 50 % dans un groupe ont été exclues de l’analyse ultérieure. La correction de la dérive du signal a ensuite été appliquée aux zones de pic à l’aide d’une méthode de normalisation basée sur la régression du vecteur de support (SVR) implémentée dans le logiciel statistique R utilisant la modélisation basée sur la QC pour corriger la dérive du signal tout au long de la série analytique.

L’identification des métabolites a été réalisée en comparant les caractéristiques corrigées à une bibliothèque de référence interne (contenant environ 5 000 composés contenant des données spectrales MS1 et MS2 ; propriétaires et non accessibles publiquement), ainsi qu’à des bases de données spectrales publiques telles que Human Metabolome Database (HMDB), Metabolite and Tandem Mass Spectrometry Database (METLIN), MassBank et Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS). basée sur une correspondance de masse précise, un alignement du temps de rétention et la similarité spectrale MS/MS. L’appariement de masse a été réalisé en utilisant une tolérance de ±25 ppm pour les ions précurseurs (MS1) et fragments (MS2), avec une tolérance de temps de rétention de ±6 s. Pour la recherche de bibliothèque, une tolérance de ±25 ppm a été appliquée aux ions précurseurs (Q1) et ±50 ppm aux fragments MS/MS, avec un score minimal de correspondance MS/MS de 0,3. Seuls les métabolites avec un score d’identification global supérieur à 0,5 ont été conservés pour l’identification non ciblée. Le score final a été calculé comme une somme pondérée de fragments (0,1), de points correspondants avant (0,3) et inversé (0,6). Les données acquises en modes ionisation positive et négative ont été fusionnées au niveau du composé. Pour les annotations dupliquées, l’entrée ayant la plus grande confiance en l’identification et le score le plus élevé étaient sélectionnées. Les annotations finales ont été compilées dans un fichier d’annotation de métabolites.

Critères d’identification des composés absorbés

Les constituants du prototype absorbés ont été définis comme des composés détectés dans l’extrait SXQY et le groupe traité SXQY, avec des temps de rétention correspondants dans une tolérance de ±0,1 min. De plus, ces composés devaient présenter une zone de pic dans le groupe traité SXQY au moins deux fois supérieure à celle du groupe témoin du véhicule ou être absents des échantillons témoins du véhicule.

Les métabolites absorbés ont été identifiés selon un ensemble différent de critères. Ces composés n’ont pas été détectés dans l’extrait SXQY mais étaient présents dans le groupe traité par SXQY. Leurs caractéristiques de spectrométrie de masse devaient être cohérentes avec des transformations métaboliques caractéristiques, incluant l’hydroxylation (Δm/z = +15,9949 Da) et la déméthylation (Δm/z = −14,0157 Da). De plus, la zone de pic dans le groupe traité par SXQY devait être au moins deux fois supérieure à celle du groupe témoin du véhicule, selon les zones de pic normalisées après correction de dérive du signal, ou le signal correspondant devait être indétectable dans les échantillons témoins du véhicule.

Récupération des gènes liés aux composés absorbés

Les composants entrant dans le sang ont été examinés dans la base de données et plateforme d’analyse des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP ; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph ; consultée en janvier ^2026). Les composés documentés dans le TCMSP ont été dépistés comme constituants bioactifs candidats sur la base de seuils pharmacocinétiques établis de biodisponibilité orale ≥ 30 % et de ressemblance du médicament ≥ 0,18²¹. Les cibles supposées correspondant aux composés conservés ont ensuite été récupérées, et tous les identifiants de cible ont été standardisés en symboles géniques officiels à l’aide de la base de données^{UniProt 22}.

Récupération de cibles liées à la maladie et de gènes d’intersection

Les gènes liés à l’IC ont été collectés à partir de la base de données GeneCards (https://www.genecards.org/ ; consultée en janvier 2026) en utilisant « insuffisance cardiaque » comme terme de recherche, et des gènes avec un score de pertinence ≥ 10 ont été sélectionnés pour une analyse approfondie. Les cibles liées au HF ont ensuite été croisées avec des cibles associées aux composés identifiées à partir de TCMSP à l’aide de la plateforme Weishengxin (https://www.bioinformatics.com.cn ; consultée en janvier 2026). Les gènes qui se chevauchent ont été définis comme cibles d’intersection et ont été utilisés pour la construction ultérieure de réseaux protéine-protéine (PPI) et des analyses d’enrichissement fonctionnel.

Construction de réseaux et analyses d’enrichissement fonctionnel

L’analyse PPI des cibles identifiées a été réalisée à l’aide de la base de données STRING (http://cn.string-db.org/ ; consultée en janvier 2026)²³ avec l’espèce réglée sur Homo sapiens et un seuil de score de confiance de ≥0,7. Les données d’interaction ont été importées dans l’outil de visualisation Cytoscape pour la visualisation du réseau. L’analyse topologique a été réalisée à l’aide du plugin NetworkAnalyzer dans l’outil de visualisation, et les gènes hub ont été identifiés à l’aide du plugin^{CytoHubba 24,25}. L’analyse d’enrichissement de l’ontologie génique (GO) a été réalisée sur les cibles d’intersection, notamment les catégories de processus biologique (BP), composante cellulaire (CC) et fonction moléculaire (MF). Les termes GO avec une valeur P < 0,05 étaient considérés comme significatifs, et les 10 termes enrichis les plus importants de chaque catégorie ont été sélectionnés pour la^{visualisation 26}. Les cibles d’intersection ont ensuite été soumises à une analyse d’enrichissement des voies par la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) à l’aide du package clusterProfiler dans le logiciel statistique. Les voies avec une valeur P < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives, et les 20 voies enrichies les plus reconnues ont été sélectionnées pour visualisation. Ces voies ont ensuite été utilisées pour construire un réseau d’interaction cible–^{voie 27}.

Analyse statistique

Les données sont présentées en moyenne ± DS. La normalité de la distribution des données a été évaluée à l’aide du test de Shapiro–Wilk, et l’homogénéité de la variance a été évaluée à l’aide du test de Levene ou du test de Brown-Forsythe avant l’analyse. Les comparaisons statistiques entre groupes ont été réalisées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance suivie du test post hoc de Tukey utilisant GraphPad Prism. P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Échocardiographie transthoracique

L’analyse échocardiographique a révélé un remodelage cardiaque prononcé et un dysfonctionnement chez les rats TAC (Figure 1). Comparé aux témoins simulés, le TAC a significativement augmenté la LVIDd et la LVPWd, tandis que la LVEF a été nettement réduite. Notamment, l’administration de SXQY a partiellement inversé ces changements pathologiques, comme en témoigne une réduction sig...

Discussion

Le SXQY est largement utilisé en pratique clinique depuis plus de vingt ans, démontrant son efficacité dans le traitement de diverses affections cardiovasculaires. Récemment, son utilisation a été étendue aux patients atteints d’insuffisance cardiaque avec une fraction d’éjection réduite et une fraction^{d’éjection légèrement réduite 16}. Dans la présente étude, un modèle de rat a été établi par chirurgie TAC pour imiter les changements pathologiques de l’IC, et pend...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-chloro-L-phénylalanine	Aladdin	C105993-1g	Norme interne ; &ge ; 98%
Acétonitrile (grade LC-MS)	Aladdin	A120771-1L	Solvant d’extraction
Acide acétique	Solarbio	G1340	Taches de maçonnerie ; pré-refroidi à 4 °C ; C
Fioles d’autoéchantillonneur	Agilent	5190-9590	Pour le chargement d’échantillons LC-MS/MS
Buprénorphine	Cerilliant	B-044S	Analgésique
Colonne C18 (1,8 & mu ; m, 2,1 mm & times ; 100 mm)	Eaux	176001125	Colonne ACQUITY Premier HSS T3
Tubes capillaires, stériles	Fisherbrand	22-362-566	Collecte de sang rétro-orbitale
Centrifugeuse (réfrigérée)	KUBOTA	N61196-F000	Pour le traitement du sérum et des échantillons
Paquet clusterProfiler	Bioconducteur	&mdash ;	R package pour l’analyse d’enrichissement KEGG ; v4.0.2
Pinces courbées, stériles	HL-SQX	HL-JP	Manipulation de l’arc aortique
Logiciel Cytoscape	NHGRI	NIH NHGRI U24 HG012107	Version 6.4.1
Plateforme d’imagerie dédiée	Fujifilm VisualSonics	Système d’imagerie à ultrasons VisualSonics Vevo 1100	Positionnement animal lors de l’échocardiographie
Eau distillée	N/A	N/A	Préparation de la décoction et contrôle du véhicule
Manteau de chauffage électrique	Midea	WK2102	Ébullition par décoction
Tube endotrachéal	CWE Inc., États-Unis	SAR-1000	Intubation endotrachéale ; Le tube endotrachéal utilisé dans cette étude était intégré à la configuration du ventilateur et n’était pas un dispositif séparé ou autonome
Éthanol (absolu)	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd.	64-17-5	Déshydratation et stérilisation
Acide formique	Aladdin	O930702	Additif de phase mobile
Gaze	Solarbio	YA0720	filtration décoction ; 200&ndash ; 300 & mu ; m taille des pores
Base de données GeneCards	GeneCards	&mdash ;	Récupération de cibles liées à la maladie ; consulté en janvier 2026
Base de données GNPS	Université de Californie à San Diego	&mdash ;	Base de données spectrale ; version 1.3.16, données archivées en décembre 2025
Logiciel GraphPad Prism	Logiciel GraphPad	&mdash ;	Version 10.1.2 ; SCR_002798
Bouillotte (thermostatique)	Physitemp	HP-4M	Entretenu au 37 & degré ; C
Hématoxyline et éosine (H& ; E) Kit de teinture	Solarbio	G1120	Coloration histologique
Transducteur haute fréquence	VisualSonics	Vevo F2	18&ndash ; 40 MHz
Spectromètre de masse haute résolution	Thermo Fisher Scientific	Q Exactive	Q HF-X exactif
Système d’échographie haute résolution pour petits animaux	Fujifilm VisualSonics	Système d’imagerie à ultrasons VisualSonics Vevo 1100	Vevo 2100
Base de données HMDB	Groupe de recherche Wishart / Centre d’innovation en métabolomique, Université de l’Alberta	&mdash ;	Base de données spectrale ; HMDB version actuelle 5.0 ; version 5.0 ; Janvier 2022
Bibliothèque de référence standard interne	METWARE	&mdash ;	Composition de la bibliothèque standard de référence interne : La bibliothèque contient un total de 5 000 composés et comprend à la fois des informations MS1 (précurseurs) et des données spectrales MS2 (fragmentation). Déclaration de disponibilité : Le format des données de la bibliothèque est .txt. Condition de stockage : La base de données est stockée sur le serveur interne de l’entreprise. Autorisations d’accès : Cette bibliothèque standard auto-construite est une bibliothèque spectrale propriétaire interne de l’entreprise. Il est utilisé uniquement pour l’identification des métabolites, la vérification des résultats et la traçabilité de la qualité dans les flux de travail analytiques contrôlés de l’entreprise. La bibliothèque n’est pas disponible au téléchargement au public. Les clients peuvent obtenir les résultats d’annotation, les informations de réussite et les descriptions de champs nécessaires générées à partir de cette bibliothèque.
Isoflurane	Sigma-Aldrich	792632	Anesthésique par inhalation
Système de chromatographie liquide (UPLC)	SCIEX	ExionLC AD	ExionLC AD
Base de données MassBank	consortium MassBank ; Société de spectrométrie de masse du Japon / MassBank Europe	&mdash ;	Base de données spectrale ; version 2024.06 ; données archivées en décembre 2025
Masson' s Kit de teinture trichrome	Solarbio	G1340	Coloration histologique
Filtre à membrane (0,22 & mu ; m)	Beyotime	FF362	Polyéthérsulfone (PES)
Base de données METLIN	L’Institut de recherche Scripps / Laboratoire Siuzdak	RRID : SCR_010500	Base de données spectrale ; Cette base de données ne fournit pas de numéro de version annuel fixe ; données téléchargées en 2023
Méthanol (grade LC-MS)	Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd.	67-56-1	Solvant d’extraction
Tubes microcentrifuges (1,5 mL)	Corning Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd.	MCT-150-C	Traitement des échantillons
Microtome	Leica	DSC1	Coupe tissulaire
Résine neutre	Solarbio	G8590	Montage de culasse
Évaporateur d’azote/source gazeuse	Organomation	N-EVAP	Séchage de l’échantillon
Pommade ophtalmique	Aladdin	08-03-8009	Protection oculaire pendant l’anesthésie
Paraffine	Solarbio	YA0010	Incrustation tissulaire
Paraformoldéhyde (4 %)	Solarbio	P1110	Fixation tissulaire
Solution saline tamponnée phosphate	SALUT TOI	DYP1021	Lavage des tissus
Acide phosphomolybdique	Solarbio	G1340	Coloration en maçon
Povidone&ndash ; Iode	Solarbio	IP3800	Désinfection chirurgicale
Logiciel ProteoWizard	Fondation ProteoWizard	&mdash ;	Version 3.0.19254
Logiciel R	Fondation R	&mdash ;	Version 4.2.2
Évaporateur rotatif	QINGDAO JINGCHENG INSTRUMENT CO., LTD	JC-2LZF	Concentration décoction sous pression réduite
Suture en soie (2-0)	PEULS	NL30RH26A-76	Constriction aortique
Ventilateur pour petits animaux	CWE Inc., États-Unis	SAR-1000	Ventilation mécanique
Sprague&ndash ; Rats Dawley (mâle, 8 semaines)	SPF Bio Co., Ltd.	&mdash ;	RGD_70508 ; Permis n° SCXK(jing)2024-0001
Base de données STRING	STRING Consortium	&mdash ;	Analyse des interactions protéiques ; consulté en janvier 2026
Supporte le paquet/script de normalisation de la régression vectorielle	MetNormaliseur	&mdash ;	Correction de la dérive du signal ; v1.3.02
Base de données TCMSP	TCMSP	&mdash ;	Récupération de composés et de cibles ; consulté en janvier 2026
Base de données UniProt	UniProt Consortium	&mdash ;	Standardisation des symboles génétiques
Gel à ultrasons	MAGNAFLUX	25-912	Échocardiographie
Eau ultrapure	Préparé en laboratoire	&mdash ;	Solvant en phase mobile
Mélangeur vortex	Yalin	VM-ST	Mélange d’échantillons
Bain marie	Julabo	PURA22	Section flottante à 45 degrés C
Quai Weishengxin	Weishengxin	&mdash ;	Analyse des intersections cibles ; consulté en janvier 2026
Logiciel XCMS	Fondation R	&mdash ;	Version 3.16.1
Xylène	Aladdin	X775162	Déparaffinisation