Un modèle murin de lésions cérébrales fermées et rotatives simples et répétitives

Résumé

Un modèle murin reproductible de lésions cérébrales concussives rotationnelles est décrit, offrant une méthode polyvalente pour étudier les sous-jacences fonctionnelles et biologiques subtiles – y compris les changements neurovasculaires, inflammatoires et comportementaux – après un impact unique ou répétitif en l’absence de lésions structurelles cérébrales évidentes.

Résumé

La lésion cérébrale commotionnelle (ICC), substrat physiopathologique sous-jacent à la commotion clinique, est une affection fréquente mais insuffisamment comprise, présentant un potentiel de trouble neurologique à long terme chez un sous-ensemble de patients. En particulier, la CBI répétitive, c’est-à-dire dans les sports de contact, a été associée à des déficits cognitifs durables et à une neurodégénérescence progressive (par exemple, encéphalopathie traumatique chronique, CTE). Pour combler cette lacune de connaissances, un modèle murin reproductible de la lésion cérébrale rotationnelle à tête fermée qui reproduit des caractéristiques biomécaniques et pathologiques clés de la CBI a été établi. Un impacteur électromagnétique guidée stéréotatiquement était utilisé pour porter un coup standardisé au crâne intact. Pour réduire la tension focale sur le crâne et le tissu cérébral adjacent, la pointe de l’impacteur a été équipée d’un capuchon en silicone sur mesure. Cette configuration induisait de manière fiable la rotation de la tête avec une faible variabilité entre les animaux tout en évitant les fractures du crâne ou les lésions microscopiques des tissus. Pour préserver l’activité physiologique neuronale et vasculaire et éviter les effets potentiellement neuromodulateurs d’une anesthésie profonde, une lésion cérébrale a été induite chez des souris conscientes sous sédation légère à l’aide de l’agoniste α2 médétomidine. Les impacts induits provoquaient un mouvement de rotation reproductible de la tête, avec une variabilité mineure attribuable à la position de la tête. L’intégrité structurelle du cerveau a été évaluée à l’aide d’imagerie par résonance magnétique pondérée T2 in vivo et confirmée par des analyses histologiques ex vivo , qui n’ont révélé aucune trace de perturbation tissulaire, de contusion ou de microsaignements, mais ont montré une perturbation légère et étendue de l’interface microvasculaire. Ce modèle novateur de lésions cérébrales cérébrales tournantes fermées offre une base expérimentale solide pour des études longitudinales sur des altérations subtiles neurovasculaires, inflammatoires et de barrière hémato-encéphalique qui surviennent en l’absence de pathologie structurelle manifeste. Son application permet d’obtenir des connaissances mécanistes sur la physiopathologie de la commotion cérébrale clinique et les conséquences neurodégénératives potentielles des blessures répétitives, facilitant ainsi le développement de biomarqueurs cliniques urgents.

Introduction

Le traumatisme crânien (TCC) reste une cause importante d’invalidité de longue durée dans tous les groupes d’âge, les adolescents et les jeunes adultes étant touchés^{de manière disproportionnée 1,2,3}. La grande majorité des TCC sont classés comme légers (TCL), communément appelés commotions cérébrales au niveau clinique. Bien que la commotion ne soit par définition pas associée à des lésions structurelles cérébrales manifestes détectables par la neuroimagerie conventionnelle, de plus en plus de preuves suggèrent que le mécanisme sous-jacent de la lésion — ici appelé lésion cérébrale commotionnelle (CBI) — représente une entité pathophysiologique distincte et cliniquement pertinente.

En particulier, la CBI répétitive, surtout lorsqu’elle se produit en succession temporelle rapprochée, comme c’est fréquemment rencontré dans les sports de contact et les milieux militaires, a été associée à un déclin cognitif persistant, à des symptômes neuropsychiatriques et au développement d’une encéphalopathie traumatique chronique (ECT^)1,2,3. Cette apparente divergence entre la nature bénigne de la lésion initiale et le risque de séquelles neurologiques à long terme pose un défi majeur tant pour le diagnostic clinique que pour la recherche mécanistique.

Les preuves émergentes indiquent que des altérations subtiles mais soutenues à l’interface neurovasculaire et neurogliale constituent un mécanisme pertinent^{de la maladie 4}. Ces changements englobent l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BBB), la structure microvasculaire, l’activation gliale, l’excitabilité neuronale et les processus de réparation endogènes, reliant potentiellement la physiopathologie cellulaire aux déficits fonctionnels et comportementaux à long terme observés après, notamment les CBI^répétitifs 5,6,7,8 . Collectivement, de telles modifications sont de plus en plus reconnues comme des facteurs potentiels contribuant aux retards fonctionnels et comportementaux après l’ICC. Cependant, la nature diffuse et multifacette complique la compréhension mécaniste et a jusqu’à présent freiné le développement d’interventions thérapeutiques ciblées.

Les modèles précliniques qui reprennent des aspects clés de la cascade physiopathologique sont des outils cruciaux pour disséquer ces mécanismes et identifier de nouvelles voies thérapeutiques. Bien qu’il existe un large éventail de modèles expérimentaux de TCC, la plupart ont été conçus pour imiter des blessures modérées à graves ou s’appuient sur des dommages structurels^{focaux 9,10,11}. En revanche, il existe un manque étonnant de modèles animaux pour le mécanisme caractéristique des blessures de la^{CBI 5}. La plupart du temps, un traumatisme cérébral qualifié de « léger » est induit par un impact focal sur la tête rigidement fixée, voire par un impact cortical direct après une craniotomie, ce qui contredit fondamentalement le mécanisme diffus de lésions accéléré-décélération qui définit la commotion chez^{l’humain 6,7}. Bien que ces approches permettent un contrôle précis des paramètres de la blessure, leur capacité limitée à reproduire la dynamique des commotions réelles réduit leur pertinence translationnelle.

Pour surmonter ces limitations, plusieurs méthodes existent pour induire une lésion cérébrale fermée reproductible et^diffuse 12,13,14. S’appuyant sur ces concepts et visant à minimiser la complexité technique, un modèle de lésions rotationnelles contrôlées chez la souris utilisant un impacteur électromagnétique commercialement disponible, souvent employé dans d’autres modèles expérimentaux de traumatisme (c’est-à-dire l’impact cortical contrôlé, CCI). En produisant un impact reproductible sur la tête en mouvement libre, cette approche préserve l’intégrité structurelle tout en permettant l’investigation longitudinale des altérations neurovasculaires, neurogliales et fonctionnelles après un CBI simple et répétitif, dans des conditions qui proche étroitement les caractéristiques biomécaniques de la commotion humaine.

Combiné à une évaluation comportementale longitudinale, à l’imagerie in vivo et à l’histologie ex vivo , ce modèle offre une plateforme polyvalente et accessible pour explorer les altérations neurovasculaires, gliales et comportementales après des impacts uniques ou répétitifs. En tant que telle, elle est bien adaptée à l’étude des mécanismes secondaires subtils de la maladie de l’ICC, à l’identification des paramètres de substitut translationnel et à l’évaluation d’interventions thérapeutiques potentielles dans un contexte expérimental cliniquement pertinent.

Protocole

Toutes les procédures animales étaient conformes à la loi allemande sur le bien-être animal et étaient approuvées par les autorités institutionnelles et gouvernementales (LANUV Rhénanie-du-Nord-Westphale ; AZ 81-02.04.2020.A058). Les expériences ont été menées selon les directives ARRIVE. Un flux de travail schématique est détaillé à la Figure 1. Ce protocole induit de manière fiable les lésions cérébrales commotionnelles, comme en témoigne un panel défini de résultats de validation structurels, comportementales et neurovasculaires (Figure 2). Tous les matériaux utilisés dans cette étude sont détaillés dans le tableau des matériaux.

1. Considérations générales

REMARQUE : Les souris étaient hébergées socialement dans des conditions standardisées (cycle lumière/obscurité de 12 heures) avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les souris ont été acclimatées à l’installation expérimentale pendant au moins 7 jours avant l’opération. Un total de 40 souris ont été utilisées dans cette étude pilote, avec 10 animaux attribués à chaque groupe expérimental (simulée en groupe témoin, groupe CBI unique, ICC répétitive en haute fréquence, et CBI répétitive dans le groupe basse fréquence). Installez un système de caméra à grande vitesse à hauteur des yeux, avec la tête de la souris en position fixe devant la souris (par exemple, 10 cm). Pour assurer la cohérence entre les essais, gardez la position et l’orientation de la caméra constantes. Une GoPro Hero6 a été utilisée dans cette étude à 240 images par seconde (fps) avec une résolution de 1080px. Le logiciel open source d’analyse de mouvement Kinovea (version 2025.2.0) est utilisé pour les analyses cinématiques décrites.

2. Induction de l’analgésie et de l’anesthésie

1. Préparez le montage, y compris le cadre stéréotaxique et l’attache pour l’impacteur électromagnétique.
2. Administrez du Tramadol (1 mg/mL) à l’aide d’eau boisée deux jours avant l’induction du traumatisme et continuez pendant trois jours après la (précédente) opération.
3. Induire l’anesthésie à l’aide d’isoflurane dans un mélange protoxyde d’azote/oxygène (_O2 30 %,_N2O 70 %), avec 4 à 4,5 % d’isoflurane dans une chambre d’induction.
4. Évaluez la tolérance chirurgicale en utilisant le réflexe de pincement de l’orteil. Procédez dès qu’une réponse de retrait est absente.
5. Retirez la souris de la chambre à induction et placez-la sur une bouillotte à l’intérieur du cadre stéréotaxique. Maintenez la température centrale à 37 ± 1,0 °C à l’aide d’une sonde rectale à fibre optique. Protégez les yeux de la dessiccation en appliquant une pommade ophtalmique.
6. Maintenir l’anesthésie en administrant de l’isoflurane à 2,0–2,5 % via un nez connecté à la configuration stéréotaxique.

3. Préparation du crâne

1. Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique en utilisant des barres d’oreilles spécifiques.
2. Raser le cuir chevelu et désinfecter soigneusement la zone chirurgicale avec un antiseptique à base d’alcool.
3. Appliquer une anesthésie locale par injection sous-cutanée de bupivacaïne (0,1 mg/kg).
4. Réévaluez le réflexe de pincé avant l’incision cutanée. Ne procéder qu’en l’absence de réponse de sevrage afin d’assurer une profondeur d’anesthésie constante.
5. Effectuer une incision cutanée médienne d’environ 7 mm pour exposer le crâne.
6. Exposez soigneusement le crâne au-dessus de l’os pariétal droit entre Bregma et Lambda.
7. Assurez-vous que le cadre stéréotaxique est orienté perpendiculairement au crâne, avec l’axe vertical positionné à un angle de 90° par rapport à la surface de la tête.
8. Montez une goupille de repère dans le support stéréotaxique et centrez-la directement sur Bregma.
9. Zéro toutes les coordonnées stéréotaxis et déplacez la broche marqueuse vers les coordonnées prédéfinies antéropostérieure (AP) et médiolatérale (ML) (dans notre modèle, à AP 0,5, ML -2,5). Marquez le point ciblé avec un feutre résistant à l’eau.

4. Ajustement de l’analgésie

1. Libérez la souris des barres d’oreilles.
2. Injectez de la médétomidine par voie sous-cutanée (0,5 mg/kg) et réduisez progressivement l’isoflurane à <0,5 %.
3. Maintenez l’anesthésie à < 0,5 % d’isoflurane tout en surveillant en continu la respiration et la température corporelle.
4. Laisser l’équilibre dans ces conditions pendant 10 minutes pour atteindre un état stable d’anesthésie tout en préservant l’activité du réseau neuronal. La fréquence respiratoire, l’absence de réflexes et la température corporelle stable (37 ± 1,0 °C) ont été utilisées comme indicateurs standardisés pour garantir une profondeur d’anesthésie comparable chez les animaux.

5. Induction d’impact

REMARQUE : Avant l’expérience, fabriquez un support de tête pour le modèle animal à partir d’une isolation en mousse de polyéthylène (PE) disponible dans le commerce, une mousse polymère à cellules fermées et non réticulée, qui limite l’accélération vers le bas tout en permettant le mouvement de rotation. De plus, fabriquez une pointe sphérique d’impacteur de 5 mm sur mesure en silpuran (rapport 1:1 ; rigidité 830 kPa).

1. Retirez la sonde de température rectale et arrêtez l’administration d’isoflurane, puis placez la souris en position allongée sur le support de tête.
2. Fixez le bouchon en silicone sur mesure à la pointe d’impacteur commerciale.
3. Montez l’impacteur électromagnétique dans le support stéréotaxique et assurez-vous que l’appareil est orienté à un angle de 10° par rapport à la surface du crâne.
4. Alignez la pointe de l’impacteur au-dessus de la région cible prédéfinie sur le crâne.
5. Abaissez la pointe de l’impacteur en position allongée jusqu’à ce qu’elle touche légèrement la surface du crâne.
6. Rétractez la pointe de l’impacteur et faites-la avancer à la profondeur d’indentation souhaitée (c’est-à-dire 3 mm dans ces expériences) vers la surface du crâne. Pour les animaux témoins, omettez l’abaissement et augmentez la pointe de la même quantité.
7. Démarrez l’enregistrement vidéo. Délivrer un seul impact concussif rotatif en déclenchant l’éclair électromagnétique via l’interrupteur de commande avec une vitesse de 5 mm/s et une durée d’impulsion de 0,1 ms.
8. Rétractez l’impacteur immédiatement après l’impact.
9. Antagonisez l’anesthésie par médétomidide en utilisant l’antagoniste atipamazole (0,5 mg/kg, s.c.).

6. Évaluation post-impact et fermeture de la plaie

1. Placez la souris en position couchée.
2. Évaluez le réflexe de redressement en notant le temps nécessaire à l’animal pour revenir en position couchée.
3. Réinduire l’anesthésie avec de l’isoflurane dans un mélange protoxyde d’azote/oxygène (_O2 30 %,_N2O 70 %) à 4 % d’isoflurane.
4. Retirez la souris de la chambre à induction et placez-la sur la bouillotte près du cadre stéréotactice. Maintenez la température centrale à 37 ± 1,0 °C à l’aide d’une sonde rectale à fibre optique.
5. Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreilles.
6. Fermez l’incision cutanée à l’aide de sutures interrompues avec des filaments autoabsorbants (par exemple, Polyglactine 910, 6-0).
7. Transférez la souris dans une boîte chauffante et surveillez jusqu’à ce qu’elle reprenne pleinement connaissance.
8. Remis l’animal dans sa cage d’origine.

7. Paradigme d’impact répété

1. Assignez les souris à des groupes de simulation, un ou plusieurs groupes CBI selon le plan expérimental.
2. Pour les groupes à récidive des blessures, planifiez des séances CBI suivantes à des intervalles définis (par exemple, toutes les 48 heures).
3. Avant chaque CBI suivant, administrez des analgésiques préopératoires via tramadol dans l’eau potable comme décrit à la section 3.1.
4. Anesthésie répétée, marquage stéréotaxique et impact suivant la même procédure décrite aux sections 3 à 6, incluant l’anesthésie locale avec bupivacaïne (0,1 mg/kg, s.c.), l’administration de médétomidine (0,5 mg/kg, s.c.) avec maintien de l’isoflurane à < 0,5 %, le ciblage stéréotaxique à AP 0,5 et ML −2,5 par rapport au Bregma, et la délivrance d’un impact concussif rotationnel à l’aide d’un impacteur électromagnétique (profondeur d’indentation 3 mm, vitesse 5 mm/s, durée de l’impulsion 0,1 ms, angle de 10° par rapport à la surface du crâne).
5. Assurez un positionnement cohérent (position prone sur un support de tête en mousse de polyéthylène permettant le mouvement de rotation), des paramètres d’impact identiques (angle, profondeur, vitesse et durée), et des conditions péri- et post-procédurales standardisées, incluant l’antagonisation par médétomidine avec de l’atipamazol (0,5 mg/kg, s.c.), la réinduction de l’anesthésie (4 % d’isoflurane dans O₂ 30 %/N₂O 70 %), et le contrôle de la température à 37 ± 1,0 °C, sur plusieurs séances pour maintenir la reproductibilité chez les animaux et aux moments chronologiques.
6. Assurez-vous d’assurer un positionnement cohérent, des paramètres d’impact et des conditions de récupération sur plusieurs séances afin de maintenir la reproductibilité entre les animaux et les moments précis.
7. Surveillez en continu les animaux pour détecter des déficits comportementaux cumulatifs après des impacts répétés.

8. Analyse cinématique

1. Exportez les vidéos au format standard (par exemple, MP4) pour analyse et chargez-les dans le logiciel Kinovea.
2. Naviguez vers la fenêtre temporelle correspondante contenant les images avant et après l’impact (par exemple, -0,025 à 0,3 s avant l’impact). Assurez-vous de définir un taux d’images par seconde adéquat (par exemple, 240 fps) dans les paramètres du logiciel. Définissons une référence d’échelle (par exemple, la distance entre les yeux).
3. Utilisez l’outil de suivi de Kinovae pour établir un système de suivi à trois points (par exemple, œil droit, œil gauche, nez ; Figure 3A). Commencez à suivre chaque point et corrigez manuellement les erreurs de suivi, en particulier lors de mouvements rapides ou d’occlusion.
4. Exportez les coordonnées suivies sous forme de fichiers CSV ou Excel.
   REMARQUE : Une analyse cinématique supplémentaire a été réalisée à l’aide d’un script MATLAB personnalisé. Les données de suivi à résolution temporelle exportées depuis Kinovea ont été importées et prétraitées pour supprimer les entrées invalides et garantir une échelle temporelle cohérente. La translation de tête a été définie comme le centre-centre des trois points de repère suivis (œil droit, œil gauche et nez), à partir duquel le déplacement linéaire, la vitesse et l’accélération ont été dérivés par différentiation numérique. La rotation de la tête a été estimée à partir de l’orientation de l’axe œil-nez, avec un déplacement angulaire calculé par rapport à une base avant impact et une vitesse angulaire obtenue comme première dérivée. Pour réduire l’amplification du bruit, tous les signaux de position et angulaires étaient lissés à l’aide d’un filtre Savitzky–Golay avant la différenciation. Le paramètre principal de résultat était le déplacement angulaire maximal, tandis que les profils de vitesse et d’accélération ont été analysés comme mesures relatives de la dynamique du mouvement de la tête entre les essais.

Résultats

Considérations générales :

L’application de ce protocole induit de manière reproductible une lésion cérébrale commotionnelle, comme le démontre un ensemble défini de lectures de validation structurelles, comportementales et neurovasculaires (voir Figure 2). L’intégrité structurelle a été préservée après une blessure. Aucune perturbation macroscopique manifeste des tissus ni hémorragie n’a été détectée, indiquant ...

Discussion

Un nouveau modèle murin de CBI à tête fermée basé sur une lésion d’accélération-décélération est caractérisé, présentant une atteinte légère mais répandue de la BBB et un phénotype neuropsychiatrique distinct rappelant une commotion cérébrale clinique. En reproduisant les caractéristiques clés de la CBI de manière contrôlée et cohérente tout en préservant l’intégrité structurelle, le modèle fournit un cadre expérimental utile et bien caractérisé pour étudier les mécanismes sous-jacents à...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Médicament
Antipamezole	Vetoquinol	VM 06043/4004	Antagoniste de la medetomidine (antagoniste des α2-adrénocepteurs), sous-cutané (0,5 mg/kg)
Pommade ophtalmique Bepanthen	Bayer	11809917	Protection oculaire pendant l'anesthésie, topique
Bupivacaïne	Sigma-Aldrich	B1160000	Anesthésie locale, sous-cutanée (0,1 mg/kg)
Isoflurane	CP pharma	1214CN	Anesthésie, inhalation (induction et entretien)
Medetomidine	Vetoquinol	VM 06043/4003	Sédatif/anesthésique adjuvant (agoniste des α2-adrénocepteurs), par voie sous-cutanée (0,5 mg/kg)
Chlorhydrate de tramadol (100 mg/mL)	Grünenthal	6867645	Analgésique administré par l'eau potable, concentration finale de 1 mg/mL pour les souris, de 2 jours avant à 3 jours après la chirurgie
Équipement
Coussin de cou en polyéthylène	Personnalisé		Support pour position couchée ventrale pendant l'impact
Couvre-impacteur stéréotaxique Silupran	Personnalisé		Distribue la charge mécanique, prévient les dommages focaux du crâne, fixé à la pointe de l'impacteur, 830 kPa
Impacteur stéréotaxique	Leica Biosystems	39463923/IM10131	Dispositif d'impact électromagnétique pour une administration d'impact contrôlée
Outils
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		(version 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	NA