Cette étude évalue les effets des phases du cycle menstruel sur la libération des facteurs de croissance de la fibrine riche en plaquettes (PRF).
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Article de recherche
Cette étude évalue les effets des phases du cycle menstruel sur la libération des facteurs de croissance de la fibrine riche en plaquettes (PRF).
La fibrine riche en plaquettes (PRF) est largement utilisée en chirurgie dentaire pour les interventions régénératives ; cependant, la variabilité de son contenu biologique reste une limitation majeure de la standardisation. Cette étude visait à mettre en place un flux de travail expérimental strictement contrôlé pour évaluer comment les phases du cycle menstruel influencent la libération des facteurs de croissance à partir du PRF. Des échantillons de sang veineux ont été prélevés auprès de 21 volontaires féminines en bonne santé à trois phases menstruelles prédéfinies (menstruelles : jours 1–5 ; folliculaires : jours 6–14 ; lutéale : jours 15–28), toutes les prélèvements ayant été réalisées dans une fenêtre temporelle fixe (11h00–11h30) afin de minimiser la variation circadienne. Pour chaque phase, des tubes séparés ont été alloués pour la numération sanguine complète, l’analyse hormonale (œstrogène, progestérone, hormone folliculo-stimulante [FSH], et hormone lutéinisante [LH]), ainsi que la préparation de PRF. La PRF était produite par centrifugation immédiate dans des conditions standardisées (708 × g pendant 12 minutes ; rotor à angle fixe, 40 ° ; rayon 88 mm ; pas d’anticoagulant). Les caillots ont été vérifiés macroscopiquement (structure homogène, élastique), soigneusement séparés de la couche de globules rouges et pesés individuellement. Pour standardiser la libération du facteur de croissance, chaque caillot a été incubé dans un milieu RPMI-1640 à l’aide d’un rapport basé sur le poids (1 g PRF : 1 mL de milieu), suivi d’une incubation contrôlée à 37 °C avec agitation orbitale (100 tr/min). Les surnatants ont été collectés et stockés à -80 °C avant analyse. Les facteurs de croissance (IGF-1, PDGF, FGF-2, VEGF et TGF-β1) ont été quantifiés à l’aide d’un dosage immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) dans des conditions d’analyse uniformes. Dans ce protocole standardisé, les niveaux de FGF-2 étaient significativement plus élevés pendant la phase folliculaire par rapport aux phases menstruelle et lutéale. Une corrélation modérément positive a été observée entre FGF-2 et les niveaux d’œstrogènes à cette phase, tandis qu’aucune différence statistiquement significative n’a été détectée pour d’autres facteurs de croissance. Ces résultats indiquent que la phase du cycle menstruel peut contribuer à la variabilité des profils de facteurs de croissance dérivés de la PRF. Le protocole décrit fournit un cadre reproductible pour minimiser la variabilité pré-analytique et analytique dans les études PRF. Les implications cliniques des différences liées aux phases justifient une investigation approfondie dans des études intégrant des cohortes plus larges et des résultats de traitement.
Historiquement, l’utilisation des concentrés de plaquettes a commencé avec le développement des adhésifs de fibrine et a évolué vers diverses formulations et protocoles de préparation. La fibrine riche en plaquettes (PRF), introduite pour la première fois par Choukroun et al. en 2001, est un concentré de plaquettes de deuxième génération largement utilisé endentisterie 1. Ce biomatériau autologue est obtenu par centrifugation sans anticoagulants et forme une matrice de fibrine enrichie en plaquettes, leucocytes et composants immunitairescirculants 2. Le réseau de fibrine fonctionne comme un échafaudage qui permet la libération progressive des facteurs de croissance essentiels à la réparation et à la régénération destissus 3.
Les plaquettes jouent un rôle central dans la cicatrisation des plaies et l’hémostasie en libérant des cytokines et des facteurs de croissance lors de leur activation4. Dans la PRF, ce processus entraîne la libération soutenue de médiateurs clés, notamment le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), le facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2), le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), le facteur de croissance insulino-type (IGF) et le facteur de croissance transformant-bêta1 (TGF-β1)5. Malgré son usage clinique généralisé, les résultats concernant l’efficacité régénérative de la PRF restent incohérents dans lesétudes 3,6. Une source majeure de variabilité est l’hétérogénéité des préparations de PRF, influencée à la fois par des facteurs techniques et biologiques.
D’un point de vue méthodologique, les différences dans les protocoles de centrifugation (par exemple, la force centrifuge relative, la durée, le type de rotor), les matériaux des tubes et la manipulation post-collecte peuvent modifier significativement l’architecture PRF et la distributioncellulaire 7. De plus, la variabilité analytique — comme l’absence de standardisation dans le traitement des caillots, des stratégies de normalisation incohérentes et des différences dans les conditions d’incubation avant ELISA — peut entraîner des écarts importants dans les niveaux de facteurs de croissancerapportés 8. Ces incohérences limitent la comparabilité entre les études et réduisent la fiabilité translationnelle des recherches sur les PRF.
La variabilité biologique complique encore l’interprétation. Plusieurs facteurs liés aux patients, dont l’âge, le sexe, le nombre de plaquettes, la largeur de la distribution plaquettaire (PDW) et le volume moyen des plaquettes (MPV), sont connus pour influencer la composition duPRF 9. De plus, des influences hormonales, génétiques et environnementales peuvent moduler le comportement des plaquettes et la libération decytokines 10. Il existe à la fois des preuves directes et indirectes que les hormones sexuelles influencent la biologie desplaquettes 11. L’œstrogène, en particulier, a démontré qu’il améliore la réactivité plaquettaire aux agonistes physiologiques et qu’il augmente l’agrégation induite par la thrombine via des voies médiées parles récepteurs 12. À mesure que les niveaux d’œstrogènes fluctuent au cours du cycle menstruel, la fonction des plaquettes et les sorties biologiques associées peuvent également varier enconséquence 13. Cependant, la littérature reste incohérente, certaines études rapportant une activation accrue des plaquettes tandis que d’autres démontrent des effets neutres ouinhibiteurs 14.
Compte tenu de cette variabilité combinée technique et biologique, il est clairement nécessaire de des flux de travail contrôlés méthodologiquement qui minimisent les biais pré-analytiques et analytiques lors de l’évaluation des facteurs de croissance dérivés des PRF. Contrairement à de nombreuses études précédentes qui reposent sur un échantillonnage à point temporel unique, une manipulation non standardisée des caillots ou une quantification non normalisée des facteurs de croissance, la présente étude utilise un protocole de prélèvement sanguin temporel spécifique à chaque phase, des paramètres de centrifugation fixes et une normalisation des caillots PRF basée sur le poids avant l’incubation et l’analyseELISA 8. Cette approche vise à améliorer la reproductibilité et à permettre une comparaison plus fiable de la libération de facteurs de croissance entre les états physiologiques.
Les approches alternatives à la recherche sur la PRF incluent l’utilisation de formulations avancées telles que la PRFavancée 7 et la PRFinjectable 15, les systèmes de centrifugationhorizontale 7, ou l’implantation directe par membrane sans analyse ex vivo. Bien que ces méthodes puissent améliorer le rendement cellulaire ou l’applicabilité clinique, elles introduisent souvent une variabilité supplémentaire dans la quantification des facteurs de croissance ou limitent la capacité d’isoler des effets biologiques spécifiques. En revanche, le flux de travail actuel privilégie la standardisation analytique et la comparaison contrôlée, ce qui le rend particulièrement adapté à l’étude de modificateurs physiologiques tels que les fluctuations hormonales.
Le protocole proposé est le plus approprié pour des études expérimentales ou translationnelles contrôlées visant à quantifier la libération des facteurs de croissance dans des conditions standardisées. Elle peut être moins applicable dans des contextes axés uniquement sur les résultats cliniques, la préparation simplifiée en cabinet de chaire ou les études où une application immédiate de PRF sans traitement est requise. Les chercheurs devraient envisager d’adopter ce flux de travail lorsque l’objectif principal est de réduire la variabilité et d’améliorer la reproductibilité des mesures liées aux PRF.
Par conséquent, l’objectif de la présente étude était d’évaluer la corrélation entre les niveaux hormonaux à travers différentes phases du cycle menstruel et la libération des facteurs de croissance issus de la PRF en utilisant un cadre méthodologique standardisé et reproductible.
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Cette étude a été menée au Département de Parodontologie, Faculté de Dentisterie, Université Çukurova, Adana, Turquie, avec la participation de 21 bénévoles. Tous les participants ont été informés en détail de l’objectif, de la conception et des procédures de l’étude, et un consentement éclairé écrit a été obtenu avant l’inclusion. Le protocole de l’étude a été examiné et approuvé par le Comité d’éthique de la Faculté de médecine de l’Université Cukurova (Approbation n° : 125/56, datée du 16.09.2022). Toutes les procédures ont été menées conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki pour la recherche impliquant des sujets humains.
Toutes les procédures impliquant le sang humain, y compris les précautions de biosécurité ainsi que la manipulation et l’élimination des déchets bio-dangereux et chimiques, ont été menées conformément aux directives de biosécurité établies telles que définies par les Centers for Disease Control and Prevention et les National Institutesof Health 16. Le personnel utilisait un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, c’est-à-dire des gants, une blouse de laboratoire, des lunettes de protection. Toute la manipulation des échantillons a été effectuée dans des zones de laboratoire désignées afin de prévenir la contamination et l’exposition. Les déchets biologiques (résidus sanguins, résidus de PRF, consommables) ont été éliminés conformément au protocole de gestion des déchets médicaux de l’Université Cukurova et aux réglementations nationales sur les déchets biomédicaux. Les objets tranchants étaient placés dans des récipients résistants aux perforations ; Les déchets liquides étaient désinfectés chimiquement avant leur élimination et les déchets solides biohazardés étaient autoclavés avant leur élimination sous licence.
Sélection des participants
Les individus remplissant les critères suivants ont été inclus dans l’étude : absence de toute maladie systémique, cycle menstruel régulier de 27 à 30 jours et âge entre 18 et 25 ans
Les personnes répondant aux critères suivants ont été exclues de l’étude : présence de maladie systémique, cycle menstruel irrégulier, utilisation de tout médicament ou préparation hormonale, présence de troubles endocriniens ou de saignement et antécédents de saignements excessifs pendant les menstruations
Prélèvement sanguin et répartition des groupes
Les premiers jours du cycle menstruel de chaque participante ont été utilisés pour élaborer un protocole de planification. Selon des classifications physiologiques largement acceptées, le cycle était divisé en trois phases : les jours 1 à 5 comme phase menstruelle (associée à la décharge endométriale), les jours 6 à 14 comme phase folliculaire (caractérisée par une augmentation des niveaux d’œstrogènes et un développement folliculaire), et les jours 15 à 28 comme phase lutéale (marqués par une sécrétion accrue de progestérone après l’ovulation)12,13. Des échantillons de sang ont été prélevés sur chaque participant lors des phases correspondantes. Sur un seul cycle, neuf trompes sanguines ont été prélevées par sujet : trois pour la numération sanguine complète (une par phase), trois pour l’analyse des hormones sexuelles (œstrogène, progestérone, hormone lutéinisante (LH), hormone folliculo-stimulante (FSH), et trois pour la préparation de la PRF et une analyse des facteurs de croissance basée sur ELISA). Tous les échantillons de sang ont été prélevés entre 11h00 et 11h30 à la même heure chaque jour afin de minimiser la variabilité biologique. Des échantillons de sang veineux ont été prélevés dans la veine antentocubitale à l’aide d’un système de collecte stérile à base de vide et d’aiguilles papillon de 21 G pour garantir un échantillonnage non traumatique. Le sang a été directement collecté dans des tubes en verre stériles de 10 mL sans anticoagulant (tubes PRF), conformément aux protocoles standards de préparation PRF. Pour minimiser la variabilité pré-analytique, tous les échantillons ont été prélevés par la même infirmière formée dans des conditions standardisées.
Immédiatement après la collecte, les tubes étaient manipulés avec délicatesse sans agitation et transférés à la centrifugeuse dans les 60 à 90 secondes afin d’éviter une coagulation prématurée et d’assurer une polymérisation constante de la fibrine. Les tubes étaient positionnés symétriquement à l’intérieur du rotor pour maintenir l’équilibre et éviter la variabilité liée aux vibrations lors de la centrifugation. Aucun additif ni anticoagulant n’a été utilisé à aucune étape de la procédure.
En conséquence, trois groupes d’étude ont été créés : Groupe 1 : Échantillons de la phase menstruelle, Groupe 2 : Échantillons de la phase folliculaire, et Groupe 3 : Échantillons de la phase lutéale
Étapes de préparation PRF :
Les échantillons de sang étaient immédiatement centrifugés sans anticoagulants à l’aide d’une centrifugeuse de laboratoire équipée d’un rotor à angle fixe (40 ° ; rayon : 88 mm). La centrifugation a été effectuée dans des conditions standardisées à 708 × g pendant 12 minutes à température ambiante (22°C–24 °C). Les valeurs relatives de la force centrifuge (RCF) ont été calculées à l’aide de la formule standard (RCF = 1,118 × 10⁻5 × r × g2), en tenant compte du rayon du rotor (88 mm), conformément aux protocoles PRF établis décrits par Choukroun et al.17 et aux études de normalisationultérieures 1,3,18. Après centrifugation, trois couches distinctes ont été identifiées : une couche inférieure de globules rouges, une couche supérieure pauvre en plaquettes plasmatiques, et un caillot intermédiaire de PRF. Le caillot de PRF a été délicatement retiré à l’aide d’une pince stérile, évitant ainsi la perturbation de l’interface des érythrocytes. Les composants résiduels des globules rouges ont été soigneusement taillés à l’aide de ciseaux stériles.
Les caillots de PRF ont été évalués macroscopiquement pour une surface lisse et homogène, une structure cylindrique élastique, et une consistance dense et ferme selon les critèresprédéfinis 19,20. Les caillots ne répondant pas à ces critères étaient éliminés, et de nouveaux échantillons sanguins étaient prélevés lorsque nécessaire. Tous les échantillons ont été traités dans des conditions standardisées et congelés à -80 °C dans les 30 minutes suivant la collecte afin de minimiser la dégradation protéolytique. Les échantillons ont été stockés pour une durée contrôlée et uniforme (jusqu’à 4 semaines) avant analyse par lots afin de réduire la variabilité entre les tests et d’assurer la comparabilité des mesures des facteurs de croissance.
Étapes d’analyse ELISA des facteurs de croissance :
Les caillots de PRF ont été soigneusement séparés de la fraction sanguine dans des conditions aseptiques à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles et pesés individuellement à l’aide d’une balance analytique calibrée. Un milieu de culture RPMI-1640 a été ajouté à chaque échantillon à un rapport fixe basé sur le poids du caillot (1 g PRF : 1 mL de milieu) afin de standardiser l’extraction par facteur de croissance et de minimiser la variabilité associée aux différences de masse du caillot. Les échantillons ont été incubés à 37 °C sur un vibrateur orbital à 100 × g afin de faciliter la diffusion homogène des facteurs de croissance solubles de la matrice PRF vers le milieu de culture. Après l’incubation, les surnatants ont été collectés et stockés à -80 °C jusqu’à leur analyse.
Les concentrations de facteurs de croissance, y compris le facteur de croissance insulino-1 (IGF-1), le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), le facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2), le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1), ont été quantifiées à l’aide de kits d’immunoabsorption enzymatique lié (ELISA) disponibles dans le commerce selon les instructions du fabricant. Les kits suivants ont été utilisés : kit ELISA IGF-1 humain, kit ELISA PDGF humain, kit ELISA FGF-2 humain, kit ELISA VEGF humain et kit ELISA TGF-β1 humain. Tous les échantillons et standards ont été analysés en double, et l’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Des courbes d’étalonnage ont été générées en utilisant la régression logistique à quatre paramètres (4-PL) pour déterminer les concentrationsd’analytes 5.
Étapes ELISA
La dilution de l’échantillon a été déterminée selon la plage de concentration attendue et les instructions du fabricant pour chaque kit ELISA. Les échantillons attendus dans la plage de courbes standard ont été analysés sans dilution. Lorsque les lectures préliminaires ou les concentrations d’analytes attendues dépassaient la limite supérieure de la courbe standard, les échantillons étaient dilués à l’aide du diluant fourni dans le kit et réanalysés. Les concentrations finales ont été calculées en multipliant les valeurs mesurées par le facteur de dilution correspondant.
Des étalons (100 μL), préparés par dilution en série selon les instructions du kit FineTest, ainsi que des échantillons non dilués ou suffisamment dilués ont été ajoutés à chaque puits d’une microplaque pré-revêtue de 96 puits. La plaque a été incubée à 37 °C pendant 90 minutes afin de permettre la liaison des antigènes. Tous les échantillons et standards ont été analysés en double. Après l’incubation, le liquide a été retiré sans lavage, et 100 μL de solution active de détection marquée à la biotine ont été ajoutés à chaque puits. La plaque a été incubée à 37 °C pendant 60 minutes. Après l’incubation, les puits ont été aspirés et lavés trois fois à l’aide de 350 μL de tampon de lavage à 1× par puits. Le tampon de lavage était laissé dans les puits environ 1 minute à chaque cycle de lavage afin d’assurer un retrait adéquat des composants non liés. Ensuite, 100 μL de solution conjuguée de peroxydase de raifort (HRP)–streptavidine ont été ajoutés à chaque puits, et la plaque a été incubée à 37 °C pendant 30 minutes. Les puits ont été lavés cinq fois à l’aide de 350 μL de tampon de lavage par puits afin de minimiser le signal de fond. Ensuite, 90 μL de solution substrat tétraméthylbenzidine (TMB) ont été ajoutés à chaque puits, et la plaque a été incubée à 37 °C pendant 10 à 20 minutes dans l’obscurité pour permettre le développement des couleurs, tandis que la réaction était surveillée visuellement. La réaction enzymatique était interrompue par l’ajout de 50 μL de la solution d’arrêt fournie avec le kit à chaque puits, entraînant un changement de couleur du bleu au jaune.
L’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques dans les 5 minutes suivant l’ajout de la solution d’arrêt. Une courbe standard a été générée à partir des concentrations connues fournies dans le kit, et la courbe a été ajustée à l’aide d’un modèle de régression logistique à quatre paramètres (4-PL). Les concentrations d’échantillons ont été calculées en conséquence et corrigées pour tout facteur de dilution.
Analyse statistique
Les variables numériques étaient résumées en moyenne ± écart-type pour les données normalement distribuées, et en médiane avec des valeurs minimales–maximales lorsque les hypothèses de normalité n’étaient pas remplies. Les variables catégorielles étaient exprimées en fréquences et en pourcentages. La normalité des données numériques a été évaluée à l’aide du test de Shapiro–Wilk. Pour la comparaison de mesures numériques répétées obtenues auprès des mêmes individus à différents moments précis, l’analyse de variance par mesures répétées (ANOVA) a été appliquée lorsque les hypothèses paramétriques étaient satisfaites ; sinon, le test de Friedman a été utilisé. Les corrélations entre des variables numériques non distribuées anormalement ont été évaluées à l’aide du coefficient de corrélation de rang de Spearman. Les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide d’un logiciel statistique (IBM SPSS Statistics version 26.0), et une valeur p bilatérale < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
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Aucune donnée manquante n’a été observée, car toutes les participantes ont terminé l’échantillonnage lors des trois phases menstruelles. Les paramètres complets de numération sanguine étaient dans les plages de référence physiologiques pour tous les échantillons, soutenant la cohérence de la qualité de l’échantillon et la fiabilité de la préparation de la PRF.
Évaluation des paramètres sanguins à travers les phases menstruelles
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Le cycle menstruel est un processus physiologique complexe orchestré par des fluctuations hormonales qui entraînent des changements dans divers systèmes du corps féminin. Dans cette étude, nous avons étudié la teneur en PRF obtenue à partir d’échantillons sanguins prélevés lors de différentes phases du cycle menstruel et analysé les niveaux de facteurs de croissance au sein de cette PRF.
Le cycle menstruel était divisé en trois phases selon des classifications...
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Les auteurs n’ont rien à divulguer. Le programme d’IA ChatGPT était utilisé pour la modification linguistique.
Les auteurs souhaitent remercier le département de biochimie de la Faculté de médecine de l’Université Cukurova pour leur soutien dans la réalisation de l’analyse ELISA.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bilan analytique | Équilibre de précision (0,001 g de lisibilité) | Sartorius | Entris |
| Tubes de collecte de sang | Tubes en verre, pas d’anticoagulant (10 mL) | BD | Système de vacutainer |
| Centrifugeuse | Centrifugeuse à table | Hettich | Universal 320R |
| Kit ELISA & ndash ; FGF | Kit ELISA FGF humain | FineTest | EH0541 |
| Kit ELISA & ndash ; IGF-1 | Kit IGF-1 ELISA humain | FineTest | ER0030 |
| Kit ELISA & ndash ; PDGF | Kit ELISA PDGF humain | FineTest | ER1240 |
| Kit ELISA & ndash ; TGF-& bêta ; 1 | TGF et bêta humains ; 1 kit ELISA | FineTest | EH0287 |
| Kit ELISA & ndash ; VEGF | Kit VEGF ELISA humain | FineTest | EH0327 |
| HRP&ndash ; Conjugué de la streptavidine | Réactif ELISA (inclus dans le kit) | FineTest | Inclus dans l’équipement |
| Incubateur | Incubateur à température contrôlée (37 & degrés ; C) | Memmert | &mdash ; |
| Tubes microcentrifuges | Tubes stériles (1,5 & ndash ; 2 mL) | Eppendorf | &mdash ; |
| Lecteur de microplaques | Lecteur d’absorption 450 nm | BioTek | ELx800 |
| Aiguille | Aiguille jetable stérile de 21G | BD | &mdash ; |
| Secoueur orbital | Vibrateur réglable (100 tr/min) | IKA | KS 3000 i contrôle |
| Équipement de protection individuelle | Gants, blouse de laboratoire, lunettes de protection | Divers | &mdash ; |
| RPMI-1640 moyen | Milieu de culture cellulaire | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 11875-093 |
| Logiciels d’analyse statistique | Logiciel d’analyse de données (Version 26.0) | IBM | Statistiques SPSS |
| Solution d’arrêt | Réactif d’arrêt ELISA | FineTest | Inclus dans l’équipement |
| Substrat TMB | Substrat chromogénique pour ELISA | FineTest | Inclus dans l’équipement |
| Tampon de lavage | Tampon de lavage ELISA (1 fois) | FineTest | Inclus dans l’équipement |