Une méthode intégrée pour la modélisation photothrombotique de l’AVC et l’enregistrement in vivo des optrodes de l’activité neuronale et astrocytaire chez des souris en comportement

Résumé

Ce protocole fournit une méthode intégrée incluant la délivrance virale, l’implantation d’optrodes, l’induction photothrombotique, l’enregistrement simultané de l’activité des astrocytes et des neurones, ainsi que la stimulation optogénétique des astrocytes. Cette méthode intégrée vise à fournir une étude simultanée de la relation astrocyte-neurone à travers les stades aigus à chroniques de l’AVC ischémique.

Résumé

Étudier la dynamique astrocyte-neurone après un AVC ischémique est essentiel pour comprendre les mécanismes de récupération post-AVC. Cependant, les méthodologies actuelles ne capturent souvent pas les interactions en temps réel entre neurones et astrocytes chez des animaux exécutant des tâches comportementales spécifiques, limitant notre capacité à étudier la phase aiguë de la pathologie de l’AVC. Ce protocole présente une méthode intégrée qui combine la modélisation photothrombotique de l’AVC avec l’enregistrement simultané de l’électrophysiologie multicanal et la photométrie des fibres chez des souris éveillées et comportantes, utilisant un optrode fabriqué sur mesure. Le protocole inclut l’induction d’ischémie focale via photothrombose suivie d’un enregistrement simultané des pics neuronaux et des transitoires calciques astrocytiques. L’optrode permet la délivrance simultanée de photothrombose, d’enregistrement du signal calcique et de manipulation optogénétique sans nécessiter de procédures chirurgicales séparées. Des résultats représentatifs valident le succès dans l’enregistrement simultané du signal calcique astrocytaire et des pics neuronaux. La manipulation optogénétique des astrocytes produit des changements mesurables dans les schémas de tir neuronaux (réduction de la fréquence d’activation des neurones pyramidaux de 1,55 ± 0,45 Hz et de l’interneurone de 3,64 ± 1,37 Hz par rapport à la stimulation préoptogénétique, n = 2), confirmant que le système est capable d’étudier les interactions astrocyte-neurone. Cette approche intégrée répond aux lacunes critiques dans la méthodologie de recherche sur l’AVC en fournissant des enregistrements multimodaux en temps réel, du stade aigu au stade chronique de l’AVC chez les animaux en pleine forme.

Introduction

L’AVC ischémique reste un défi principal de santé mondiale, représentant une cause majeure à la fois de mortalité et d’incapacité acquise de longue durée dans^{le monde 1,2,3}. Le taux élevé d’invalidité associé à l’AVC ischémique est associé à une grande variété de symptômes cliniques, allant de la paralysie motrice et de la perte sensorielle à la déficience cognitive ^4,5,6. Il est urgent de mieux comprendre les mécanismes pathologiques et de récupération de l’AVC ischémique durant la phase de réparation. Au-delà de la défaillance neuronale, la défaillance catastrophique des astrocytes a été mise en lumière récemment ^7,8. Les astrocytes, les cellules gliales les plus abondantes, sont un élément essentiel du système nerveux central ainsi que de la synapse tripartite. À chaque phase de la cascade ischémique, les astrocytes jouent un rôle indispensable et influencent profondément la récupération neuronale et^{fonctionnelle 9,10,11}. Dans un cerveau sain, les astrocytes et les neurones sont fonctionnellement couplés via la synapse tripartite, où les processus astrocytaires couvrent les terminaux pré- et post-synaptiques et participent activement à la transmission^{synaptique 7,8}. Les astrocytes régulent les concentrations extracellulaires de glutamate via des transporteurs d’acides aminés excitateurs, maintiennent l’homéostasie du potassium via les canaux Kir4.1, et modulent la force synaptique via la libération de gliotransmetteurs via une exocytose dépendante du^{calcium 7,8}. Dans ce contexte, les transitoires intracellulaires intracellulaires de calcium astrocytaires représentent une activité astrocytaire et sont étroitement liés à la décharge^{neuronale 7}. Lors de l’AVC ischémique, cette relation finement affinée est rapidement perturbée. L’effondrement des gradients ioniques après une défaillance énergétique déclenche une libération massive de glutamate et une dépolarization en expansion, entraînant une lésion neuronale excitotoxique et la prolifération d’astrocytes^{réactifs 12}. Les astrocytes situés dans et autour du noyau de l’infarctus subissent une cascade de changements pathologiques, notamment une surcharge calcique, une altération de la réabsorption du glutamate, une perte du couplage synapsé et une défaillance de la libération du^{gliotransmetteur 13}. Parallèlement, l’activité de pic neuronal est profondément supprimée car les neurones perdent leur viabilité et l’intégrité du potentiel^{membranaire 14,15}. Dans la zone péri-infarctus, les neurones survivants et les astrocytes réactifs participent à des interactions dynamiques considérées comme déterminantes pour déterminer le résultat de la récupération post-AVC ; Cependant, les corrélations électrophysiologiques et calciques en temps réel de cette interaction chez les animaux éveillés et comportants restent peu^{caractérisés 13,16}. Par conséquent, comprendre l’activité astrocytaire parallèlement aux signaux neuronaux est considéré comme une pierre angulaire pour la récupération fonctionnelle neuronale après une lésion ischémique.

La photothrombose est un modèle ischémique largement utilisé ; Il utilise un colorant photosensible et une lumière localisée pour induire des lésions ischémiques dans des zones ciblées^{spécifiques 17}. Les protocoles actuels de modélisation et d’enregistrement de l’AVC entravent l’étude de l’interaction astrocyte-neurone post-AVC en raison de trois principaux goulots d’étranglement techniques^{17, 18, 19}. La séparation entre modélisation et enregistrement est un inconvénient courant de la plupart des protocoles actuels, provoquant un écart de temps entre l’établissement du modèle et l’enregistrement en temps^{réel du signal 20,21}. Cependant, les minutes à quelques heures après un AVC ischémique constituent une période essentielle durant laquelle neurones et astrocytes subissent des fluctuations drastiques^12,22. Sans surveillance simultanée de l’interaction astrocyte-neurone immédiatement après l’incident ischémique, l’investigation d’une intervention précoce efficace lors de l’AVC ischémique sera profondément entravée. Une autre limitation des protocoles actuels réside dans l’isolement des modalités d’enregistrement ; La plupart des méthodologies actuelles sont optimisées pour un seul type de signal. Par exemple, l’électrophysiologie multicanale permet de détecter la décharge neuronale et les potentiels de champ local (LFP) mais ignore les états de signalisation des cellules^{gliales 15,16}. Inversement, la surveillance de la dynamique astrocytaire par le biais in vivo. L’imagerie calcique capture les fluctuations astrocytaires mais ne dispose pas de données de déclenchement neuronal. Le dernier goulot d’étranglement des protocoles actuels semble être le statut d’enregistrement de l’animal ; Dans la plupart des protocoles, l’animal est anesthésié ou en mouvement libre. Cependant, la dysfonction motrice est considérée comme l’une des séquelles les plus problématiques de l’AVC ; Comprendre le lien entre certains comportements et les événements astrocytes-neurones est essentiel. Il est donc urgent de trouver une méthode intégrée capable de réaliser un modèle photothrombotique de l’AVC tout en capturant simultanément les signaux astrocytes et neuronaux chez des souris éveillées effectuant certains tests comportementaux. Les méthodologies existantes ne répondent chacune qu’à un sous-ensemble de ces exigences. L’imagerie calcique à deux photons offre une résolution spatiale exceptionnelle de la dynamique des microdomaines astrocytiques dans le cerveau intact, mais nécessite que les animaux soient fixés sur la tête ou anesthésés, ce qui empêche une évaluation comportementale naturaliste, et ne peut pas capturer simultanément des données de pics neuronaux^{multicanaux 13}. La photométrie autonome des fibres permet la surveillance astrocytaire du calcium chez les animaux en pleine agitation mais reste aveugle aux schémas de déclenchement neuronal, n’offrant aucune lecture électrophysiologique de la fonction^{du circuit 16}. L’électrophysiologie extracellulaire multicanale résout l’activité de pic des unités neuronales et des potentiels de champ locaux avec une haute résolution temporelle, mais ne fournit aucune information sur l’état de signalisation des^{astrocytes 15}. Cependant, aucune de ces approches ne peut simultanément induire un AVC photothrombotique précisément localisé et effectuer un enregistrement multimodal à partir du même site anatomique sans interruption.

Pour répondre aux limites techniques existantes, nous proposons ce système intégré. Ce système répond aux trois limitations au sein d’un seul dispositif implanté chroniquement, permettant l’induction simultanée de la photothrombose, l’enregistrement astrocytaire du calcium par photométrie des fibres, et l’électrophysiologie neuronale multicanal chez des souris éveillées et en comportement libre — du moment de l’apparition de l’AVC jusqu’aux phases chroniques de l’AVC. La faisabilité de cette méthode est validée par l’implantation chronique d’un optrode fabriqué sur mesure dans le cerveau de souris exprimant un indicateur de calcium spécifique aux astrocytes et un vecteur viral optogénétique. Grâce à cette méthode, les transitoires calciques astrocytiques et les activités de déclenchement neuronal sont simultanément enregistrés et analysés lors des tâches comportementales et sous modulation optogénétique.

Protocole

Ce protocole a reçu l’approbation du Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine chinoise de Guangzhou (00379474) et a été mené conformément aux directives et règlements élaborés par le Guide des National Institutes of Health pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les mesures possibles ont été mises en place pour minimiser le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.

1. Livraison par vecteur viral

REMARQUE : Cette section décrit l’injection stéréotaxique de vecteurs AAV spécifiques aux astrocytes dans le cortex moteur (M1FL). L’objectif est d’obtenir une expression stable et spécifique aux astrocytes à la fois de l’indicateur calcique GCaMP6s et de la construction opto-vTRAP optogénétique avant l’implantation de l’optrode. Équipement principal requis : cadre stéréotaxique, système de vernier numérique, micropipette en verre et pompe à micro-infusion.

1. Placez la souris dans la chambre d’induction ; Commencez l’induction par anesthésie avec 3 % à 4 % d’isoflurane et la concentration d’isoflurane peut être augmentée jusqu’à un maximum de 5 % dans la première minute jusqu’à ce que la souris ne réponde plus.
   ATTENTION : L’isoflurane est un agent anesthésiant volatil. Effectuer toutes les interventions sous ventilation active. Évitez une exposition personnelle prolongée.
2. Transférez la souris dans le cadre stéréotaxique équipé d’un masque anesthésique et utilisez 1 à 2 % d’isoflurane pour maintenir un plan anesthésique profond.
3. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie toutes les 10 minutes grâce au rythme respiratoire, au réflexe palpébral et à la pincée de l’orteil. Maintenez la température corporelle de la souris entre 36 et 37,5 °C avec un tapis chauffant contrôlé par rétroaction.
4. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter les dommages cornéens lors de l’opération.
5. Fixez la souris à un cadre stéréotaxial avec des barrettes d’oreilles et une barre buccale. Ajustez les barres d’oreilles pour garantir que la tête de la souris est fixée de façon symétrique. Assurez-vous que la tête est immobilisée par un sondage doux.
6. Enlever soigneusement les poils avec une crème dépilatoire et effectuer une incision médiane avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer le crâne. Nettoyez le périoste à l’aide de solution saline et de coton pour exposer le Bregma et le Lambda.
7. Abaissez la micropipette en verre pour toucher successivement Bregma et Lambda ; notez la coordonnée Z sur le vernier numérique. Ajustez la barre buccale pour vous assurer que la différence est de <0,04 mm.
8. Baissez la micropipette en verre pour toucher Bregma et réinitialisez le vernier numérique à zéro. Déplacez la micropipette de 2,3 mm à gauche et à droite de Bregma successivement ; notez la coordonnée Z sur le vernier numérique. Ajustez les barres d’oreilles pour vous assurer que les différences bilatérales sont de <0,04 mm.
9. Réinitialisez le vernier numérique à zéro au niveau de Bregma et marquez le cortex moteur (M1FL ; AP : +1,5 mm, ML : +0,74 mm). Utilisez un microperceuse avec des mèches de 0,5 mm (pointe ronde) pour percer un petit trou d’environ 0,5 mm de diamètre à l’emplacement indiqué. Percer soigneusement pour éviter les saignements et les dommages aux tissus cérébraux ; Laissez tomber du sérum salé glacé pour compenser la chaleur générée lors du forage.
10. Abaissez la micropipette en verre attachée à une pompe micro-perfusion vers le site cible (DV : -0,94 mm de la surface du cerveau). Avant le chargement, mélangez AAV9-GfaABC1D-GCaMP6 et AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP en volumes égaux pour préparer un mélange viral. Infusez 400 nL du mélange (200 nL de chaque vecteur) à un taux de 50 nL/min.
    REMARQUE : Le cocktail viral contient : 200 nL de l’indicateur calcique spécifique aux astrocytes (AAV-GfaABC1D-GCaMP6s, 1,0 × 10¹³ vg/mL) et 200 nL du vecteur viral optogénétique spécifique aux astrocytes (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 × 10¹³vg/mL). La transduction spécifique aux astrocytes réussie a été vérifiée chez un sous-ensemble d’animaux par coloration immunofluorescence pour GFAP, confirmant la co-localisation du rapporteur fluorescent avec les cellules GFAP-positives et l’absence d’expression dans les cellules GFAP-négatives.
    ATTENTION : Les vecteurs AAV sont des agents biologiques recombinants ; Gérer tous les vecteurs viraux et déchets selon les directives de biosécurité de l’institution.
11. Laissez la pipette en place pendant 10 minutes après la fin de l’infusion pour permettre une meilleure diffusion virale et éviter le reflux. Retirez lentement la pipette, suturez le cuir chevelu (4-0, 20 mm, 3/8 de cercle), puis placez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle guérisse complètement.
    REMARQUE : Une période de 3 à 4 semaines est nécessaire pour une expression virale optimale. La chronologie détaillée du protocole est illustrée à la Figure 1A.

2. Inspection des Optrodes et vérification fonctionnelle

REMARQUE : Avant l’implantation, l’optrode fabriqué sur mesure doit être inspecté physiquement et testé optiquement pour confirmer qu’il est capable de délivrer de la lumière dans les trois modes fonctionnels (photothrombose, stimulation optogénétique et photométrie des fibres). Équipement principal requis : microscope, mesureur optique et sources laser à 532 nm, 488 nm, 470 nm et 405 nm.

1. Inspection physique de l’optrode :
   1. Placez l’optrode fabriqué sous un microscope pour inspecter l’agencement des sites d’enregistrement.
   2. Assurez-vous que les 16 microfils de tungstène sont uniformément regroupés et entourent la fibre optique centrale. Vérifiez s’il y a des fils tordus ou croisés qui pourraient provoquer des courts-circuits électriques.
   3. Confirmez que la pointe de la fibre optique est plus courte que celle des microfils de tungstène (Figure 1B).
      REMARQUE : La pointe de la fibre optique doit être encastrée de 100 à 200 μm à partir des extrémités de^{l’électrode 23}. Ce décalage, adopté de Lee et ^al.22, garantit que le cône lumineux couvre suffisamment la zone d’enregistrement tout en évitant un bruit photoélectrique excessif. Les chercheurs sont encouragés à vérifier empiriquement le décalage approprié sous leur propre optrode.
2. Connectez la fibre optique à la source de modélisation laser et à la source d’enregistrement. Utilisez un photomètre optique pour mesurer la sortie à la pointe de la fibre pour les trois modes fonctionnels suivants (Figure 1B) :
   1. Mode de modélisation photothrombotique : Vérifier que le système peut fournir une lumière à onde continue (CW) d’intensité élevée (532 nm).
      REMARQUE : Une fibre contenant un NA 0,22 est utilisée dans cette expérience. Le diamètre estimé du point lumineux situé à 100–200 μm sous la pointe de la fibre est d’environ 200–400 μm. Assurez-vous que la puissance à l’extrémité atteigne >20 mW pour garantir une activation et une formation de thrombus réussies du Rose Bengal.
   2. Mode de manipulation optogénétique : tester la sortie laser pulsée (par exemple, 488 nm pour opto-vTrap).
      REMARQUE : Calibrez la puissance à 10 mW à la pointe ; celle-ci est optimisée pour une activation opto-vTRAP à la profondeur d’enregistrement de 0,94 mm dans le cortex moteur. Pour d’autres régions cérébrales, une vérification comportementale ou électrophysiologique est recommandée.
   3. Mode photométrie de fibres (enregistrement du calcium) : Tester la lumière d’excitation à faible puissance (par exemple, 470 nm et 405 nm).
      REMARQUE : Assurez-vous que la sortie est stable et maintenue à un niveau très bas (<50 μW) afin de minimiser la phototoxicité et le photoblanchiment de l’indicateur calcium (par exemple, GCaMP6s) lors de l’enregistrement à long terme.

3. Implantation chronique d’optrode

REMARQUE : Cette section traite de la procédure chirurgicale pour implanter chroniquement l’optrode au site d’injection virale. La localisation précise des coordonnées d’injection est essentielle pour garantir que les électrodes d’enregistrement et la fibre optique échantillonnent la région de l’expression des GCaMP6 et de l’opto-vTRAP. Équipement principal requis : cadre stéréotaxique, microperceuse, pinces, vis de cranioplastie, gel d’agarose et ciment dentaire.

1. Pour l’anesthésie, la fixation stéréotaxique, la préparation du crâne et l’équilibrage, suivez la même procédure que celle décrite à la section 1, sauf que lors de l’incision sur le cuir chevelu, retirez 1,5 cm × 1,5 cm du cuir chevelu tout en veillant à ce qu’il reste suffisamment de peau autour des yeux.
2. Nettoie le crâne avec du peroxyde d’hydrogène et une solution saline à 0,9 %. Identifiez Bregma et réinitialisez le vernier numérique à zéro.
3. Utilisez la perceuse (0,8 mm, pointe ronde) pour rugueuse légèrement la surface du crâne afin de mieux adhérer le ciment dentaire.
4. Marquez le cortex moteur avec un marqueur (M1FL ; AP : 1,5 mm, ML : 0,74 mm), puis utilisez-le comme point central pour dessiner un carré de 5 mm × 5 mm (Figure 1C).
   1. Utilisez une microperceuse à une vitesse appropriée (environ 10 000 tr/min) et suivez le carré. Laissez tomber constamment du sérum salé glacé sur le trajet du forage pendant le forage pour compenser la chaleur produite par le forage à grande vitesse et éviter les dommages au tissu cérébral. Arrêtez immédiatement si le lambeau osseux se desserre (Figure 1C).
5. Perçez trois petits trous (0,5 mm de diamètre) au-dessus de l’hémisphère et du cervelet, puis implantez des vis de cranioplastie dans les trous. Assurez-vous que chaque vis atteigne la dure-mère, mais évitez toute pénétration supplémentaire et des dommages supplémentaires au tissu cérébral (Figure 1C).
6. Utilisez des pinces pour retirer le lambeau osseux qui a été desserré plus tôt. Évitez toute force descendante supplémentaire lors du retrait afin d’éviter d’endommager les tissus cérébraux et de préserver la dure-mère intacte.
   REMARQUE : En cas de saignement, une éponge hémostatique peut être utilisée pour arrêter rapidement le saignement.
7. Utilisez des pinces à pointe ultra-fine (<0,03 mm × 0,01 mm) pour retirer la dure-mère au niveau de la fenêtre crânienne. Empêchez la pointe de la pince de pincer directement un tissu cérébral pendant ce processus.
   REMARQUE : Après l’extraction de l’os, il est très important de garder le tissu cérébral humide. Il est recommandé d’utiliser des boules de coton stériles imbibées de solution saline pour couvrir la fenêtre lorsqu’aucune procédure n’a lieu, afin d’éviter le gonflement et les lésions neuronales dues à la sécheresse.
8. Fixez l’optrode au bras micromanipulateur du cadre stéréotaxique et déplacez-le au-dessus de la fenêtre crânienne. Entrelacez solidement les fils de masse argentés et de référence de l’optrode aux trois vis de cranioplastie (Figure 1C).
9. Nettoyez la surface de la fenêtre crânienne avec du sérum physiologique stérile pour éviter les saignements ni caillots sanguins qui pourraient gêner l’insertion des électrodes. Baissez lentement l’optrode à la profondeur désirée (DV : -0,94 mm) à un débit de 1 μm/s.
   REMARQUE : Le tissu cortical exposé doit être humidifié avec du sérum physiologique stérile pendant l’implantation.
10. Appliquez une couche d’agarose sur la fenêtre crânienne après l’implantation pour protéger le tissu cortical du ciment dentaire.
11. Appliquez 3 à 4 couches de ciment dentaire pour recouvrir le crâne exposé, afin de garantir que l’optrode est ancré complètement. Retirez la souris du cadre stéréotaxial une fois que le ciment dentaire devient rigide (Figure 1C).
12. Administrez une analyse analytique pendant 3 à 5 jours et laissez la souris récupérer pendant 1 à 2 semaines avant d’enregistrer et de modéliser.

4. Modélisation photothrombotique et enregistrement simultané

REMARQUE : Cette section décrit l’habituation comportementale, l’enregistrement de base, l’induction de l’AVC par photothrombose et les procédures d’enregistrement longitudinal post-AVC. La photothrombose est administrée via l’optrode implanté tandis que l’électrophysiologie et l’enregistrement simultané de la photométrie des fibres sont maintenus. Équipement principal requis : appareil rotatif (rotarod), mesure de force de préhension, système de photométrie à fibres, système d’enregistrement neuronal multicanal, colorant Rose Bengal et source laser à 530 nm.

1. Faites suivre à la souris un entraînement comportemental avant de modéliser.
   REMARQUE : Tous les animaux ont été hébergés et testés dans des conditions de laboratoire standardisées. Conditions de logement : température ambiante 20–25 °C, humidité relative 50 % à 60 %, sur un cycle lumineux/sombres de 12 h (lumières allumées à 07h00). Les animaux ont eu un accès libre à la nourriture et à l’eau tout au long de l’étude. Tous les tests et interventions chirurgicales ont été réalisés pendant la phase légère. Des séances d’enregistrement comportemental ont été réalisées pendant la phase lumineuse à un moment régulier chaque jour afin de minimiser la variation circadienne de l’activité neuronale et de la dynamique calcique astrocytaire. L’enveloppe d’enregistrement était également maintenue à une température ambiante de 20 à 25 °C.
   1. Pour le test rotativo, faites tourner la souris en continu sur la tige rotative pendant 5 minutes sur 3 essais consécutifs, le rotateur accélérant de 4 à 40 tr/min sur 5 minutes.
   2. Pour le test de force de préhension, faites apprendre à la souris à tirer la barre de test avec ses pattes avant, et réalisez trois essais consécutifs dont les résultats fluctuent inférieurs à 10 %.
2. Définir les paramètres d’acquisition des données pour la photométrie de fibres.
   1. Utilisez un système de photométrie à fibre à double ou triple longueur d’onde pour exciter l’indicateur calcique (par exemple, GCaMP6s). Pour les GCaMP6, réglez le canal du signal à 470 nm et le canal de contrôle à 405 nm pour corriger les artefacts de mouvement et l’autofluorescence.
      REMARQUE : Il est très important de tester à nouveau la puissance du laser d’enregistrement pour s’assurer que la sortie à la pointe de la fibre se situe entre 20 et 40 μW afin d’éviter le photoblanchiment et la phototoxicité.
   2. Régler le taux d’échantillonnage d’acquisition des données à 60–100 Hz, ce qui suffira à capturer les transitoires calciques astrocytiques.
3. Définir les paramètres d’acquisition des données pour l’électrophysiologie multicanale.
   1. Assurez-vous que tous les composants du système d’enregistrement (y compris l’appareil pour le test de force de préhension et la cage) sont correctement mis à la terre pour réduire le bruit. Utilisez une référence médiane commune (CMR) lors de l’enregistrement pour éliminer les artefacts globaux.
      REMARQUE : Il est très important de vérifier la vue du spectrogramme du signal dans le système d’enregistrement afin de s’assurer qu’il n’existe aucune interférence sur la ligne électrique et que le bruit causé par les artefacts de mouvement est minimisé. Les artefacts de mouvement importants peuvent indiquer la défaillance des vis et la fixation du fil de terre lors de la chirurgie d’implantation.
   2. Assurez-vous que les signaux large bande et LFP sont sélectionnés dans le logiciel d’enregistrement, et surveillez tout bruit survenu pendant la session.
4. Effectuez un enregistrement de base.
   1. Anesthésie brièvement avec de l’isoflurane (dans les 60 s) ; Connectez l’Optrode à la ligne d’enregistrement via un adaptateur.
   2. Placez la souris dans un environnement ressemblant à une cage pour l’enregistrement, et laissez 10 minutes d’acclimatation après l’éveil.
   3. Effectuez l’enregistrement en même temps que le test de force de préhension, la souris doit tirer la barre de test une fois toutes les minutes pendant 5 minutes.
   4. Assurez-vous que les tests comportementaux sont précisément horodatés dans les systèmes de photométrie multicanal et fibre afin de permettre l’alignement des données (Figure 1D).
5. Établir un modèle photothrombotique.
   1. Administrez une solution de colorant de Bengale rose à 1,5 % par voie intrapéritonéale (i.p.) à une dose de 10 à 20 mg/kg, attendez 5 minutes que le colorant circule dans le vascular cortical.
      ATTENTION : Le Rose Bengal est un colorant photosensibilisant. Protège le réactif de la lumière ambiante vive. Portez des gants et une protection oculaire lors de la manipulation.
   2. Anesthésiez la souris avec de l’isoflurane en suivant les mêmes paramètres d’induction et d’entretien décrits précédemment.
   3. Lorsque la souris est à un plan anesthésique profond et maintenue avec un masque anesthésiant, connectez la sonde optique de l’optrode à la source laser.
   4. Induire une ischémie focale en délivrant un faisceau laser de 530 nm à 15 mW à travers l’optrode implanté pendant 5 à 8 minutes.
      ATTENTION : Le laser 530 nm à 15 mW est dangereux. Tous les chercheurs doivent porter une protection oculaire de sécurité laser. Ne regardez jamais directement la pointe des fibres pendant la photothrombose.
6. Enregistrez après l’AVC.
   1. Placez la souris sur un tapissin chauffant pour récupérer. Une fois que la souris est complètement réveillée (normalement dans les 10 minutes), lance le premier enregistrement aigu post-AVC.
   2. Répétez l’enregistrement chaque jour pour un suivi attentif de l’évolution de la maladie.
7. Effectuer une manipulation optogénétique.
   1. En plus de l’enregistrement des signaux calciques et de l’émission du faisceau laser pour l’induction ischémique, l’optrode est également capable de fournir une stimulation optogénétique, comme le montrent les résultats représentatifs (Figure 4).
   2. Connectez l’optrode à un stimulateur laser optogénétique avec la bonne longueur d’onde et puissance laser (dans ce cas, il est de 488 nm, 10 mW, 5 min pour l’opto-vTrap), puis allumez le stimulateur pour effectuer la manipulation optogénétique.

5. Pipeline d’analyse de données multimodal

REMARQUE : Cette section décrit le flux d’analyse pour le traitement des données d’électrophysiologie multicanal (tri par pics), les signaux calciques astrocytaires (calcul ΔF/F) et l’alignement inter-modal des deux flux de données. Logiciels requis : Plexon Offline Sorter (logiciel de tri de pointes hors ligne), NeuroExplorer (logiciel d’analyse de données neuronales) et logiciel d’analyse OFR (photométrie à fibre) RWD.

1. Tri des pointes neuronales (système plexon) :
   1. Importez les fichiers bruts .pl2 dans le logiciel de tri des pics hors ligne. Appliquer un filtre numérique passe-bande haute (<300 Hz) pour isoler l’activité des pics de haute fréquence.
   2. Fixez un seuil de tension (généralement -5 écarts-types du bruit) pour détecter les pics de potentiel.
   3. Après un criblage manuel et une invalidation des formes d’onde du bruit, utilisez la fonction de balayage dans le logiciel de tri des pics hors ligne pour effectuer une analyse en composantes principales (PCA) afin de regrouper les formes d’onde et de rechercher différents amas de^{neurones 24}.
   4. Inspectez les histogrammes des intervalles inter-pics (ISI). Assurez-vous que chaque « unité unique » ait un taux de violation de l’ISI de <1 % (reflétant la période réfractaire). Le taux de violation de l’ISI est affiché dans le coin supérieur gauche de chaque unité dans le logiciel de tri des pics hors ligne.
   5. Exportez les horodatages triés vers le logiciel d’analyse des données neuronales. Utilisez la fonction histogramme de taux et péri-événement versus temps dans le logiciel d’analyse des données neuronales pour générer des histogrammes de taux et des histogrammes à temps péri-stimulus (PSTH).
   6. Sortez la longueur moyenne de la forme d’onde et la cadence de tir moyenne de chaque unité à partir de la section statistique dans un logiciel d’analyse des données neuronales pour une analyse plus approfondie.
2. Traitement du signal calcique astrocytaire (logiciel d’analyse de photométrie de fibres)
   1. Ouvrez les données brutes de fluorescence (canal 470 nm pour le signal et canal 410 nm pour le contrôle de mouvement) dans le logiciel d’analyse.
   2. Dans la section pré-traitement du système de photométrie à fibre, effectuez 410 nm comme contrôle pour la correction du mouvement, réglez le coefficient de lissage à 8, et choisissez PLS Fit comme correction de base.
   3. Calculez la variation de fluorescence (ΔF/F) en utilisant la^{formule 25} :
      
   4. Effectuer une analyse du signal calcique des astrocytes basée sur les horodatages d’événements, extraire les données péri-événements pour la visualisation (par exemple, cartes thermiques et traces de moyennes), et calculer la surface sous la courbe (AUC).
3. Corrélation synchronisée astrocyte-neurone
   1. Alignez les pics neuronaux et les signaux calciques des astrocytes en utilisant l’horodatage d’événement comportemental partagé comme temps zéro.
   2. Après avoir extrait les données péri-événements, alignez les deux flux de données à ce temps zéro partagé et visualisez la corrélation astrocyte-neurone (Figure 3).

Résultats

Chronologie expérimentale

La Figure 1 résume la chronologie expérimentale et les principaux repères chirurgicaux. Un intervalle de trois semaines entre l’injection virale et l’implantation de l’optrode est essentiel pour obtenir une expression adéquate des GCaMP6s, et des signaux calciques astrocytiques robustes doivent être confirmés en examinant les traces de photométrie des fibres pendant la période d’enregistr...

Discussion

Le protocole intégré décrit ici présente une avancée significative dans l’étude des interactions astrocyte-neurone lors de la progression de l’AVC ischémique. En combinant induction photothrombotique avec une surveillance opto-électrophysiologique en temps réel et une manipulation optogénétique, cette méthodologie fait efficacement le lien entre le début de l’AVC et l’observation de la réorganisation au niveau des circuits des neurones et des astrocytes. Des travaux récents de Boyce et a...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2% TTC Staining Solution	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
Body Temperature Maintenance System / Homeothermic Monitor	RWD life Science	69002
Cranial Screws	Zhongke Huida	23092007
Data Acquisition and Analysis Software(Fiber photometry)	RWD life Science	ORFs
Data Acquisition and Analysis Software(Multi-channel electrophysiology)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
Digital laboratory stereotactic frame	RWD life Science	68804
Forcep	FST	11252-00	Forcep diameter 0.005 mm ´ 0.025 mm
Laser power meter	Sanwa	LP10
Laser Speckle Blood Flow Imaging System	Pericam AB	Pericam PSI NR
Mice	Risemice	C57BL/6J
Miniature handheld cranial drill	RWD life Science	78001
Mouse Viral Micro-injector	RWD life Science	68025
Optrode	Customized	Kedou	Customized with 16 tungsten electrode surrounding 1 optical fiber
Prism	GraphPad	5.01 version
R studio	Posit	version 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	Astrocyte-specific calcium indicator
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	Astrocyte-specific optogenetic viral vector
Rose Bengal Dye	Sigma-Aldrich	198250	Photosensitive dye for thrombus induction/Sigma-Aldrich
Trolley-mounted anesthesia workstation	RWD life Science	R520	Anesthesia machine for controllable inhalation anesthesia for mice