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Article de méthode

Imagerie intravitale de Mycobacterium tuberculosis auxotrophe atténué dans le poumon murin lors d’une infection intravasculaire précoce

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DOI :

10.3791/71019

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30 juin 2026

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1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 2Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine, 6Cancer Dormancy Institute, Albert Einstein College of Medicine, 7Montefiore Einstein Comprehensive Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour l’imagerie intravitale d’un Mycobacterium tuberculosis atténué approuvé par BSL-2. Souche dans le poumon murin utilisant une fenêtre pulmonaire permanente. Cette approche permet une analyse longitudinale à résolution unicellulaire des interactions précoces hôte-pathogène, y compris la localisation bacillaire, la dynamique vasculaire et l’absorption des macrophages dans le même microenvironnement pulmonaire.

Résumé

La microscopie intravitale permet la visualisation directe des processus cellulaires dynamiques à l’intérieur de tissus intacts. Cependant, son application à Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a été limitée par les exigences de confinement de niveau de biosécurité 3 (BSL-3) et les défis techniques liés à la stabilisation du poumon pour l’imagerie à haute résolution. Ici, nous présentons un protocole qui combine la fenêtre thoracique pour l’imagerie à haute résolution du poumon murin (WHRIL) avec mc27902, une souche de MTB triple auxotrophe génétiquement définie, approuvée pour une utilisation dans des conditions BSL-2. Nous décrivons également la génération de mc28471, un dérivé exprimant tdtomato de mc27902, sa préparation à l’infection intraveineuse et son application à l’imagerie intravitale chez la souris reporter. Ce système permet la visualisation en temps réel de la dynamique précoce de l’infection, incluant l’entrée rapide des bactéries dans la vasculature pulmonaire, l’agrégation, la diffusion dans le parenchyme pulmonaire et l’absorption des macrophages dans le même microenvironnement pulmonaire pendant les trois premiers jours après l’infection. En permettant l’imagerie longitudinale des bacilles et des interactions hôte-pathogène à résolution unicellulaire, cette approche surmonte les principales limites associées aux modèles conventionnels d’imagerie et à haute confinement. Ce protocole offre une plateforme pratique compatible BSL-2 pour l’imagerie intravitale en temps réel des mycobactéries atténuées dans le poumon et établit une base pour des études mécanistes de la physiologie bactérienne, de la reconnaissance de l’hôte et de l’élimination par le système immunitaire.

Introduction

La microscopie intravitale à haute résolution a transformé l’étude du comportement cellulaire dynamique au sein des tissus intacts en permettant la visualisation directe de la migration cellulaire, des interactions vasculaires et de la surveillance immunitaire à la résolutionunicellulaire 1,2,3,4. Bien que ces approches soient largement utilisées dans la recherche surle cancer 3,5, leur application aux infections pulmonaires a été limitée par la mobilité respiratoire, la fragilité tissulaire et les contraintes de biosécurité. Les avancées récentes dans les plateformes d’imagerie thoracique, y compris les fenêtres optiques stabilisées sous vide et implantées de façon permanente, ont permis de résoudre bon nombre de ces défis techniques en fournissant une imagerie stable et sans mouvement du microenvironnement pulmonaire sur de longuespériodes 6,7,8,9,10 . Les fenêtres implantables de façon permanente, en particulier, sont des outils puissants car elles permettent une visualisation répétée du flux vasculaire, de la dynamique des cellules immunitaires et du comportement unicellulaire pendant des heures à des semaines, et ont joué un rôle déterminant dans la définition des mécanismes de la métastase cancéreuse, de la perméabilité vasculaire et de la surveillanceimmunitaire 11,12.

Malgré ces avancées, l’imagerie intravitale n’a jamais été appliquée auparavant à l’infection par Mycobacterium tuberculosis (Mtb) dans le poumon mammifère in vivo à résolution unicellulaire. Les précédents les plus proches proviennent des images intravitales d’infections mycobactériennes dans d’autres contextes. L’imagerie en temps réel de l’infection par Mycobacterium marinum chez les embryons de poisson-zèbre13 a révélé des interactions précoces avec les macrophages et l’initiation du granulome, tandis que l’imagerie à deux photons des granulomes induits par BCG dans le foiede souris 14,15 a révélé la dynamique des macrophages et des lymphocytes T lors du développement du granulome, ainsi qu’une présentation limitée de l’antigène ainsi qu’une fonction effectrice des lymphocytes T dans les lésions granulomateuses. Ces études ont établi des connaissances fondamentales sur les interactions mycobactériennes hôte-pathogène mais n’ont pas accédé au poumon intact desmammifères 8,16.

Des approches d’imagerie intravitale ont également été appliquées au poumon dans d’autres contextes infectieux et biologiques, notamment l’imagerie pulmonaire générale8, des études révélant que la patrouille des macrophages alvéolaires peut dissimuler des bactéries du systèmeimmunitaire 17 et caractérisant la réponse myéloïde immédiate à l’infection par le SARS-CoV-2 dans le poumonhumain 16. L’imagerie intravitale a également été appliquée aux poumons infectés par la grippe, permettant une visualisation directe du comportement dynamique des cellules immunitaires dans le tissu pulmonaireinfecté 18,19.

Les approches d’imagerie optique corporelle entière, utilisant la technologie d’excitation microendoscopiquepar fibre optique 20 et la fluorescence enzymatiquerapporteuse 21,22, ont permis une détection sensible du MTB dans les poumons de souris, mais ne peuvent pas détecter individuellement ou de petits groupes de bacilles, suivre la dynamique de l’agrégation bactérienne ou visualiser les interactions directes entre les mycobactéries et les cellules hôtes dans le tissu pulmonaire intact. Des approches d’imagerie intravitale à haute capacité de confinement ont été mises en œuvre pour les poumons infectés dans des contextes BSL-3, y compris les plateformes d’imagerie multiphotonique axées sur le SARS-CoV-223 et les plateformes d’imagerie multiphotonique axées sur le MTB. Ces études démontrent la faisabilité d’imager les poumons infectés en confinement, mais de tels systèmes restent techniquement exigeants et ne sont pas largement accessibles. Le travail avec le MTB virulent nécessite un confinement BSL-3, posant d’importants défis d’ingénierie et de biosécurité pour l’imagerieintravitale 23,24. En conséquence, la plupart des études sur l’infection précoce à la MTB reposent sur des tests de point final statiques qui ne peuvent pas capturer la dynamique spatiale et temporelle du comportement bactérien dans le poumon.

Le développement de souches de MTB triple-auxotrophes définies génétiquement et approuvées par BSL-2 offre une opportunité unique de surmonter ces limites. La souche mc2 7902, dérivé de l’auxotrophe Mtb pantothénate-leucine-arginine du H37Rv, est entièrement atténuée, ne se réplique pas chez les souris immunodéprimées, conserve la coloration acide classique à l’acide rapide, présente une susceptibilité normale aux phages et peut être manipulée en toute sécurité en dehors des installationsBSL-325. Ces propriétés font dumc27902 un substitut idéal pour établir des approches d’imagerie intravitale et sonder les interactions précoces hôte-pathogène sous un confinement réduit de la biosécurité.

Ici, nous appliquons la fenêtre pour l’imagerie à haute résolution du poumon (WHRIL) avec mc28471, un dérivé fluorescent exprimant tdtomato de la souche triple auxotrophe de Mtb mc27902, afin de visualiser une infection précoce à MTB dans le poumon murin intact. Des expériences ont été menéessur des souris Rag2-/- immunodéprimées croisées avec des sourisMacBlue 27, dans lesquelles le promoteur Csf1r favorise l’expression de la protéine fluorescente cyan améliorée (ECFP) dans les monocytes, les microglies et les sous-ensembles de cellules dendritiques et macrophages. Le transgène MacBlue permet une visualisation claire des populations de phagocytes mononucléaires lors des premières infections à Mtb. Nous avons choisi d’utiliser des souris déficientes en Rag2 pour concentrer le système sur les premières interactions innées hôte-pathogène et pour éviter la complexité supplémentaire des réponses immunitaires adaptatives durant la courte fenêtre d’imagerie examinée ici. Il est important de noter que cette technique ne se limite pas aux souris déficientes en Rag2 et peut également être réalisée chez des animaux immunocompétents.

En combinant une fenêtre pulmonaire permanente avec une souche de MTB atténuée fluorescente compatible BSL-2, cette plateforme permet l’imagerie intravitale en série des interactions bacille-cellule hôte dans le même microenvironnement pulmonaire à une seule résolution sur plusieurs jours. Bien que démontrée ici pour une infection précoce, la plateforme elle-même n’est pas intrinsèquement limitée à des points temporels précoces et pourrait, en principe, être appliquée aux stades ultérieurs selon le modèle expérimental et la conception de l’étude. Puisque la réussite de cette plateforme d’imagerie dépend de l’utilisation de la préparation bacillaire fluorescente spécifique décrite ici, nous avons inclus les étapes essentielles nécessaires pour générer et préparer ce réactif dans le cadre du protocole complet. Cette plateforme fournit une imagerie directe et en temps réel du comportement des MTB in vivo et établit une base pour de futures études mécanistes de physiologie bactérienne, de reconnaissance de l’hôte et de décontamination par le système immunitaire.

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Protocole

Toutes les procédures ont été menées conformément aux directives institutionnelles de biosécurité et de soins aux animaux et ont été approuvées par le comité de soins et d’utilisation des animaux du Albert Einstein College of Medicine (IACUC). La souche mc28471 est un transformant pYUB1169 du mc2 7902, unesouche Mtb triple auxotrophe approuvée pour une utilisation BSL-2. Tous les travaux impliquant des bactéries vivantes ont été réalisés selon les précautions standard pour la manipulation des mycobactéries.

1. Construction de la souche MTB tdTomato approuvée par la BSL-2 MC28471

  1. Génération du mc 2 8471 BSL-2-safe exprimant tdTomatepar transformation plasmidique
    1. Transformer la souche triple auxotrophe approuvée par BSL-2 mc27902 avec le plasmide mycobactérien épisomal pYUB1169, qui contient le gène tdTomato exprimé par le promoteur G13, pour générer le dérivé fluorescent mc28471.
    2. Inoculez 100 μL de mc2 7902(densité optique à 600 nm (OD600 nm) de 0,7-1,0) dans 10 mL de Middlebrook 7H9 stérile complétés par un enrichissement OADC (10 % (v/v)), du glycérol (0,2 % (v/v)), du D-pantothénate (24 mg/L), de L-leucine (50 mg/L), de L-arginine (200 mg/L), du propionate de sodium (0,1 mM) et du tyloxapol (0,05 % (v/v)) dans une bouteille d’encrier de 30 mL.
    3. Incubez la culture en secouant lentement (100 tr/min) à 37 °C jusqu’à atteindre un OD600 nm de 0,7-1,0.
    4. Transférez les cellules dans un tube centrifugeuse conique de 15 mL et centrifuge-les pendant 10 minutes à 3 000 x g à température ambiante. Éliminez le surnageant et resuspendez les cellules dans 10 mL de glycérol stérile contenant 0,05 % (v/v) de tyloxapol (lavage #1). Répétez la centrifugation et les lavages deux fois. Résuspendez la granule cellulaire dans 0,175 mL de glycérol à 10 % contenant 0,05 % (v/v) de tyloxapol et ajoutez 2 μL d’ADN pYUB1169 (100-200 ng d’ADN).
    5. Transférez MC27902 et pYUB1169 dans une cuvette à électroporation de 0,2 cm. Attends 10 minutes. Tapez la cuvette 2x à 3x pour éliminer les bulles d’air et électorez à 2 500 mV, 1 000 Ω, 25 μF, constante de temps 20 ms, à température ambiante.
    6. Ajoutez 1 mL de Middlebrook 7H9 stérile complété par un enrichissement OADC (10 % (v/v)), du glycérol (0,2 % (v/v)), du D-pantothénate (24 mg/L), de L-leucine (50 mg/L), de L-arginine (200 mg/L), de propionate de sodium (0,1 mM) et de tyloxapol (0,05 % (v/v)) dans la cuvette, puis transférez le contenu de la cuvette dans un tube centrifugeuse conique de 15 mL. Incubez le tube en secouant à 37 °C pendant la nuit.
    7. Placer 0,1 mL du mélange de transformation sur une plaque agar Middlebrook 7H10 complétée par un enrichissement OADC (10 % (v/v)), du glycérol (0,2 % (v/v)), du D-pantothénate (24 mg/L), de L-leucine (50 mg/L), de L-arginine (200 mg/L), de propionate de sodium (0,1 mM) et de kanamycine (20 mg/L). Centrifugez le mélange de transformation restant, éliminez 0,9 mL du surnageant et remettez la pellete cellulaire en suspension dans le surnageant résiduel. Placez les cellules en suspension sur une seconde plaque agar Middlebrook 7H10 contenant les mêmes compléments et antibiotiques. Couver les plaques à 37 °C pendant 3 à 4 semaines. Les colonies roses indiquent des transformants réussis.
    8. Choisissez une colonie rose isolée et cultivez-la à 37 °C, en secouant lentement, dans 5 mL de Middlebrook 7H9 stérile complétés par un enrichissement OADC (10 % (v/v)), du glycérol (0,2 % (v/v)), du D-pantothénate (24 mg/L), de la L-leucine (50 mg/L), de la L-arginine (200 mg/L), du propionate de sodium (0,1 mM), du tyloxapol (0,05 % (v/v)) et de 20 mg/L de kanamycine dans une bouteille d’encrier de 30 mL.
  2. Préparation du MC28471 pour une infection intraveineuse
    1. Cultivez 10 mL demc28471 à 37 °C, en secouant lentement, dans un Middlebrook 7H9 stérile complété par un enrichissement OADC (10 % (v/v)), du glycérol (0,2 % (v/v)), du D-pantothénate (24 mg/L), de L-leucine (50 mg/L), de L-arginine (200 mg/L), du propionate de sodium (0,1 mM), de tyloxapol (0,05 % (v/v)) et de 20 mg/L de kanamycine dans une bouteille d’encrier de 30 mL jusqu’à la phase mi-logarithmique (OD600 nm doit être entre 0,7 et 1,0).
    2. Transférez les cellules dans un tube centrifugeuse conique de 15 mL et centrifugez pendant 10 minutes à 3 000 x g à température ambiante. Éliminez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans 10 mL de solution stérile tamponnée phosphate contenant 0,05 % (v/v) de tyloxapol (PBS-T, lavage #1). Répétez la centrifugation et les lavages deux fois. Resuspendez la pelote cellulaire dans 4 mL de PBS-T et soniez les cellules à une puissance de 100 W, 2x 1 000 J.
    3. Mesurez la densité optique de la culture et diluez-la en PBS-T pour une concentration finale de 5 x 106 UFC par injection, en utilisant la conversion approximative qu’un OD600 nm de 1 correspond à 1 x 108 UFC/mL. Comme cette relation peut varier selon les conditions de déformation et de croissance, OD600 nm doit être calibré empiriquement selon les valeurs de l’UFC plaquée afin d’assurer la précision et la reproductibilité.

2. Implantation permanente de fenêtre pulmonaire chez la souris pour imagerie intravitale

  1. Préparez une souris Rag2KO MacBlue pour l’imagerie intravitale. Dans cette étude, un souris mâle de 10 semaines pesant 30 g a été utilisé. Cependant, les souris de n’importe quel sexe, âgées de 8 à 12 semaines et dans la fourchette de poids attendue pour cet âge, sont adaptées à cette procédure. Cette souche exprime une protéine fluorescente cyan améliorée (ECFP) dans des macrophages sur un fond knockout Rag2 et a été générée en croisant des souris B6.129S6-Rag2tm1FwaN12 (Rag2, Modèle RAGN12) avec des souris Tg (Csf1r-GAL4/VP16, UAS-ECFP)1Hume/J (Stock n° 026051).
  2. Implantez la fenêtre pour l’imagerie haute résolution du poumon (WHRIL) 24 heures avant l’infection bactérienne afin de garantir un accès optique stable au poumon et de permettre la récupération avant l’imagerie.
  3. Induire une anesthésie avec 5 % d’isoflurane dans une chambre d’induction. Confirmez une profondeur d’anesthésie adéquate avant de commencer toute procédure et surveillez l’animal tout au long de l’opération et de l’imagerie afin d’éviter la douleur, la détresse ou la détresse respiratoire.
  4. Administrer une analgésie préopératoire : injecter 10 μL (0,1 mg/kg) de buprénorphine diluée dans 90 μL de PBS stérile par voie sous-cutanée.
  5. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour éviter le dessèchement cornéen pendant l’anesthésie.
  6. Attachez une suture en soie 2-0 autour de la base d’un cathéter 22G, en laissant des queues de ~2 pouces pour fixer le cathéter.
  7. Intubez la souris avec le cathéter lié par suture. Visualisez l’ouverture trachéale par transillumination et confirmez la position à l’aide d’un ampoule d’inflation (élévation thoracique bilatérale).
    REMARQUE : Une intubation inadéquate peut entraîner un traumatisme des voies respiratoires ou une ventilation inadéquate. Ne procéder qu’après avoir confirmé le placement correct par une expansion thoracique bilatérale.
  8. Sécurisez le cathéter d’intubation en attachant la suture de soie 2-0 autour du museau après une intubation réussie. Connectez le cathéter au ventilateur.
  9. Placez la souris dans le décubitus latéral droit sur une plateforme chirurgicale chauffante pour exposer le thorax gauche, puis fixez les membres antérieurs, les membres postérieurs et le dos avec du ruban adhésif pour maintenir une position stable tout au long de l’intervention.
  10. Réduisez l’isoflurane à 3 % pour le reste de l’opération. Enlever les poils du haut gauche du thorax à l’aide d’une crème dépilatoire.
  11. Préparez le champ chirurgical avec une solution antiseptique. Soulevez la peau et réalisez une incision circulaire de 5 à 10 mm avec une pointe de biopsie (33-35-SH) à environ 7 mm à gauche du sternum et 7 mm au-dessus du bord sous-costal, centrée sur la6e à la7e zone intercostale.
  12. Inspectez le champ exposé pour détecter des vaisseaux superficiels. Si une division d’un vaisseau visible est nécessaire, coutérisez les deux extrémités pour maintenir l’hémostasie. Retirez les tissus mous qui le surposent pour exposer clairement les côtes avant d’entrer dans la cavité thoracique.
  13. Saisissez et soulevez la 6e ou 7e côte avec une pince et percez doucement le muscle intercostal entre elles à l’aide de ciseaux micro-disséqueurs émoussés (côté arrondi face au poumon) pour pénétrer dans la cavité thoracique.
    REMARQUE : Pénétrez dans la cavité thoracique doucement et sous visualisation directe afin d’éviter de lacérer le poumon, les vaisseaux intercostaux ou les tissus environnants.
  14. Appliquez de courtes et douces rafales d’air comprimé à l’ouverture intercostale pour dégonfler temporairement la surface pulmonaire adjacente et la séparer de la paroi thoracique avant de créer l’ouverture de la fenêtre.
  15. Positionnez la pointe de biopsie sur l’outil de coupe et guidez l’outil à travers l’ouverture intercostale, en la gardant parallèle à la paroi thoracique. Posez un défaut circulaire de 5 mm dans la cage thoracique.
  16. Placez une suture en cordon de sac à main en soie 5-0 à ~1 mm du bord du défaut circulaire, passant entre les nervures adjacentes pour entourer l’ouverture.
  17. Placez le cadre de la fenêtre de façon à ce que les bords du défaut de la paroi thoracique s’ajustent dans la rainure du cadre, puis serrez et fixez la suture en forme de cordon pour verrouiller le cadre en place.
  18. Chargez de l’adhésif gel de cyanoacrylate dans une seringue de 1 mL. Soulevez doucement le cadre pour le séparer du poumon, puis appliquez une fine couche d’adhésif au cyanoacrylate sur la surface inférieure du cadre.
  19. Séchez la surface du poumon à l’aide d’un flux continu et doux d’air comprimé jusqu’à ce que la surface paraisse mate.
    REMARQUE : Utilisez seulement un jet d’air doux et évitez un séchage prolongé, car une force excessive ou un séchage excessif peuvent endommager la surface pulmonaire et altuer l’adhérence de la fenêtre.
  20. En utilisant une pression expiratoire positive (PEEP), gonflez le poumon puis collez la fenêtre au cadre. Relâchez le PEEP et maintenez la pression sur le cadre de la fenêtre pendant 20 à 30 secondes.
    REMARQUE : Une pression excessive lors du gonflage ou de la position du cadre peut endommager le poumon ou compromettre l’étanchéité. Appliquez seulement la pression minimale nécessaire pour obtenir une position douce.
  21. Placez une seconde suture en cordon de sac à main 5-0 à <1 mm du bord de l’incision cutanée. Glissez la peau sous le cadre, assurez-vous que tout excès de peau est capturé sous le cadre de la fenêtre ou coupé, puis serrez bien la suture à cordon et nouez solidement.
  22. À l’aide d’un capteur à vide, appliquez une très fine couche d’adhésif sous la toile de 5 mm, en grattant l’excédent sur le bord d’un verre rectangulaire de recouvrement. Encore une fois, séchez la surface pulmonaire avec un jet continu et doux d’air comprimé.
  23. Placez la tobe circulaire dans la cavité du cadre de la fenêtre à un angle peu profond (~15°) au-dessus de la surface pulmonaire. Augmentez brièvement la pression des voies respiratoires pour gonfler le poumon, puis faites pivoter la couche de couverture en position parallèle de sorte que la surface du poumon s’oppose au dessous du verre. Maintenez une pression douce pendant environ 25 secondes pendant que l’adhésif durcit, puis détachez le capteur sous vide de la toile de protection.
    REMARQUE : Évitez de piéger les bulles ou d’appliquer un excès d’adhésif lors de la pose du couvercle, car cela peut réduire la qualité d’image, perturber l’étanchéité ou endommager la surface pulmonaire.
  24. Appliquez une petite quantité de cyanoacrylate liquide à l’interface entre la toile de couverture et le cadre métallique pour renforcer l’étanchéité hermétique.
  25. Fixez une aiguille stérile sur une seringue d’insuline de 1 mL. Insérez l’aiguille juste en dessous du processus xiphoïde et avancez vers l’épaule gauche à travers le diaphragme jusqu’à la cavité thoracique. Aspirez doucement pour éliminer l’air intrathoracique résiduel.
    REMARQUE : Avancez prudemment l’aiguille pour éviter de perforer le poumon, le cœur ou les principaux vaisseaux. Aspirez doucement et seulement jusqu’à ce que l’air résiduel soit éliminé.
  26. Coupez l’isoflurane et continuez la ventilation avec 100 % d’oxygène jusqu’à ce qu’un rythme respiratoire quasi normal soit presque rétabli. Ne laissez pas l’animal sans surveillance pendant la convalescence. Si la respiration spontanée normale ne reprend pas rapidement, il faut fournir des soins de soutien appropriés ou euthanasier selon les directives institutionnelles.
  27. Retirez la suture de fixation, extubez la souris et placez-la dans une cage propre et chaude pour la récupération. Surveillez l’animal jusqu’à ce qu’il soit complètement déambulatoire ; Les souris qui ne retrouvent pas leur respiration normale doivent être euthanasiées selon les directives institutionnelles.
  28. Administrer une analgésie post-opératoire : injecter 10 μL (0,1 mg/kg) de buprénorphine diluée dans 90 μL de PBS stérile par voie sous-cutanée.

3. Imagerie intravitale

  1. Laissez les souris récupérer après l’implantation de la fenêtre avant l’imagerie. Réalisez des examens d’imagerie de 1 à 5 jours après l’opération.
  2. Induire une anesthésie avec 3 % d’isoflurane, puis maintenir 1,5 % pendant toute la durée de l’imagerie.
  3. Insérez l’adaptateur plaque-cadre de fenêtre sur mesure entre la membrane et le bord extérieur du cadre de la fenêtre poumon, puis fixez une plaque de scène standard au microscope à l’aide de ruban adhésif.
  4. Placez la souris avec l’adaptateur de cadre de la platine-fenêtre personnalisé fixé sur l’étage de translation du microscope. Maintenir la température corporelle à ~37 °C à l’aide d’une chambre chauffée par air forcé avec boucle de rétroaction par capteur de température.
  5. Avec la souris sur la plaque de l’étage, tirez doucement la peau autour de l’œil du côté injection pour exposer le canthus médial et injectez du FITC-dextran (150 kDa ; 20 mg/mL, 100 μL) rétro-orbitalement pour étiqueter la vascularisation.
  6. Prenez des images instantanées, z-stack ou en accéléré de la vasculature pulmonaire avant l’injection bactérienne en utilisant les paramètres suivants.
    1. Pour les réglages de microscopie confocale : Profondeur de bits : 12 bits, Fréquence d’images : 2 fps, Taille de l’image : 512 × 512 pixels, Taille des pixels : 0,497 μm/pixel, 0,994 μm/pixel, Taille du pas Z : 2 μm, Profondeur Z totale : 50–70 μm, Moyenne d’images : 3, Vitesse de balayage : 2 μs/pixel (977 lignes/s), Longueurs d’onde d’excitation laser : 405 nm, 488 nm, 559 nm, Puissance laser à l’échantillon : 230 μW (405 nm), 75 μW (488 nm), 40 μW (559 nm), Filtres de détection : 430-470 nm (Bleu), 505-540 nm (Vert), 575-675 nm (Rouge), Gains du détecteur : 800 V pour le Bleu, 650 V pour le Vert, 700 V pour le Rouge, Diamètre du trou d’épinglé : 60 μm ou 1 unité d’air pour 559 nm
    2. Pour la microscopie multiphotonique, on utilise les mêmes paramètres d’imagerie que pour la microscopie confocale, sauf qu’un laser à excitation de 920 nm a été utilisé avec une puissance laser de 25 mW à l’échantillon.
  7. Injecter rétro-orbitalement 5 x 106 UFC td Atomo-expressant mc28471.
    REMARQUE : Effectuez les injections rétro-orbitaires uniquement avec un entraînement et une retenue appropriés, car une mauvaise technique peut entraîner une lésion oculaire, des saignements ou une mauvaise délivrance de l’inoculum.
  8. Acquérir des images instantanées, z-stack et en accéléré de la tuberculose ainsi que des cellules et vasculaires marquées fluorescentement en utilisant les paramètres d’imagerie des 3.6.1 et 3.6.2. Ajustez le gain de tous les détecteurs pour maximiser le signal tout en évitant la saturation du détecteur.
  9. Après l’imagerie, désactivez l’isoflurane et retirez la souris du microscope. Gardez la souris au chaud et surveillez jusqu’à la récupération complète.
  10. Répétez l’imagerie aux moments suivants après l’injection de MC28471 : 0-60 min, 6 h et 3 jours. Pour chaque séance d’imagerie, réinjectez du FITC-dextran (100 μL, rétro-orbitalement) pour visualiser la vascularisation, puis acquérez les images décrites aux étapes 3.8-3.9.

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Résultats

Après électroporation et sélection de kanamicine, les colonies isolées de MC28471 ont montré une fluorescence rouge vif, confirmant une expression stable de tdTomate. Les bacilles MC28471 ont été étendus, préparés en suspension unicellulaire, et administrés par voie intraveineuse à des souris porteuses de WHRIL implanté chirurgicalement. Des images intravitales ont été réalisées pour visualiser la dynamique précoce de l’infection à MTB dans le microenvironnement pul...

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Discussion

Cette plateforme répond à une véritable lacune dans la recherche sur la tuberculose en permettant la visualisation directe des interactions bacilles et cellule hôte au sein du poumon mammifère intact sous conditions BSL-2. Les stratégies d’imagerie in vivo antérieures, incluant la détection optique corporelle entière utilisant l’excitation microendoscopiqueà fibre optique 20, l’imagerie à fluorescence enzymatiquerapporteure 21, et ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents ni d’autres conflits d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes : AI26170 ; La Fondation familiale Evelyn-Lipper et le Centre Biophotonique Gruss Lipper. Nous reconnons le soutien de l’Analytical Imaging Facility, soutenu par la subvention P30 du NCI Cancer Center CA013330.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
15 ml conical tubeCorning430790
2-0 silk tie Ethicon, IncLA55G
5 mm coverslipElectron Microscopy Sciences72296-05
5 mm disposable biopsy punchIntegra33-35-SH
5-0 silk purse-string suture Ethicon, Inc640G
Blunt micro-dissecting scissorsRobozRS-5980
BuprénorphineHospira0409-2012-32Injection de 10 μL de buprénorphine (solution mère à 0,3 mg/mL) diluée dans 90 μL de PBS stérile (dose finale = 0,1 mg/kg) 
Compressed air canisterFalconDPSJB-12
Cyanoacrylate adhesiveLoctite234790
D-calcium pantothenateAcros243305000
ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety standBTX Harvard Apparatus45-0051
Electroporation cuvetteFisher ScientificFB102
FITC-DextranSigma-AldrichFD150S-1G150 kDa
GlycerolFisher ChemicalsG33-1
Graefe forcepsRobozRS-5135Pour saisir et élever la côte pendant la procédure de fenêtrage pulmonaire
Isoflurane Pivetal78949580
Isoflurane vaporizerSurgiVetVCT302
KanamycinGoldbio.comK-120-25
L-arginine monohydrochlorideSigma-AldrichA5131-100G
L-leucineSigma-AldrichL8000
MacBlue miceJackson LabsStrain #: 026051
Middlebrook 7H10 AgarDifco262710
Middlebrook 7H9 brothDifco271310
Middlebrook OADC EnrichmentBecton Dickinson 212351
Murine ventilatorKent ScientificPS-02PhysioSuite
NairChurch & Dwight Co., Inc.40002957
PBSCorning21-031-CV
PETG media inkwell bottleThermo Scientific342020
PhysioSuiteKent ScientificPS-5623Pour surveiller le volume tidal de la souris via l'intubation pendant la chirurgie
Plasmid pYUB1169Plasmid fait sur mesure
Rag2 KO miceJackson LabsStrain #: 008449
Small animal lung inflation bulbHarvard Apparatus72-9083
Sodium propionateThermo ScientificA17440.36
SonicatorFisher ScientificFB705
Sorval Centrifuge X pro seriesThermo Scientific75009020
Spectrophotometer Genesys 10 UVThermo Spectronic335903
SurgiSuiteKent ScientificSURGI-M02Plateforme chirurgicale multifonctionnelle pour souris, avec réchauffement
Tracheal catheterExelint International2674622G
TyloxapolSigma-AldrichT0307-50G
Vacuum pickup system metal probe Ted Pella, Inc.528-112

Références

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