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Article de recherche

Dysfonctionnement de la barrière intestinale médiée par NEAT1 par liaison à miR-29b-3p dans les cellules Caco-2 endommagées par le lipopolysaccharide

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DOI :

10.3791/71021

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14 août 2026

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1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude a évalué NEAT1 comme marqueur diagnostique et régulateur de la dysfonction de la barrière intestinale dans le syndrome de l'intestin irritable prédominant avec diarrhée. NEAT1 était augmenté dans le sérum des patients, se liait à miR-29b-3p, et sa diminution a amélioré les paramètres de la barrière, de l'apoptose et de l'inflammation dans des cellules Caco-2 endommagées par le lipopolysaccharide.

Résumé

La pathogenèse du syndrome de l'intestin irritable avec diarrhée (SII-D) n'est pas bien comprise, et les thérapies disponibles restent limitées. Cette étude a évalué la valeur diagnostique de NEAT1 dans le SII-D et exploré son mécanisme régulateur potentiel. Au total, 116 patients atteints de SII-D et 116 témoins sains ont été inclus. Les niveaux sériques de NEAT1 et de miR-29b-3p ont été mesurés par PCR quantitative en temps réel après transcription inverse (RT-qPCR), et des courbes caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) ont été utilisées pour évaluer la valeur diagnostique. Pour les études mécanistiques, un modèle de cellules épithéliales intestinales Caco-2 traitées par un lipopolysaccharide (LPS) a été établi. La viabilité cellulaire a été évaluée par test au kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8), l'apoptose par cytométrie en flux, l'intégrité de la barrière par la résistance électrique transepithéliale (TEER), et les niveaux d'ARNm de ZO-1, d'occludine et de claudine-2 par RT-qPCR. Des tests de rapporteur double luciférase (DLR) et d'immunoprécipitation de l'ARN (RIP) ont été utilisés pour confirmer la relation d'interaction entre NEAT1 et miR-29b-3p. NEAT1 était fortement exprimé, et miR-29b-3p faiblement exprimé chez les patients atteints de SII-D, et leurs niveaux présentaient une forte corrélation négative. L'extinction de NEAT1 augmentait les niveaux de miR-29b-3p, améliorait la viabilité cellulaire et la TEER, réduisait l'apoptose, augmentait les niveaux d'ARNm de ZO-1 et d'occludine, diminuait les niveaux d'ARNm de claudine-2, et atténuait les paramètres associés aux lésions de la barrière dans les cellules Caco-2 traitées au LPS. Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que NEAT1 sérique constitue un biomarqueur candidat pour le SII-D et que l'axe NEAT1/miR-29b-3p pourrait être impliqué dans le dysfonctionnement de la barrière intestinale.

Introduction

Le syndrome de l'intestin irritable avec diarrhée (IBS-D) est un trouble fonctionnel gastro-intestinal courant, caractérisé par des douleurs abdominales, une distension abdominale et des habitudes intestinales modifiées1. À l'heure actuelle, le mécanisme physiopathologique de l'IBS-D n'est pas entièrement élucidé2. Les méthodes de traitement consistent principalement en un soulagement symptomatique, dont l'efficacité est limitée et le taux de récidive élevé3. On considère généralement que l'IBS-D implique l'interaction de plusieurs facteurs, tels qu'une dysrégulation de l'axe cerveau-intestin, une hypersensibilité viscérale, une inflammation intestinale de bas grade et une dysfonction de la barrière intestinale4,5. Bien que ces critères aient partiellement standardisé le diagnostic, ils sont subjectifs et peuvent entraîner des retards diagnostiques ou des erreurs de classification, notamment lorsque les symptômes des patients se chevauchent avec ceux de la maladie inflammatoire de l'intestin ou d'autres maladies organiques. En pratique clinique courante, aucun biomarqueur objectif validé n'existe actuellement pour l'IBS-D. Par conséquent, explorer une nouvelle cible moléculaire pouvant servir à la fois de support diagnostique et de valeur thérapeutique potentielle est devenu un besoin urgent dans le domaine actuel de la recherche sur l'IBS-D.

Ces dernières années, les ARN non codants longs, en tant que molécules clés dans la régulation épigénétique, ont démontré un fort potentiel en tant que marqueurs diagnostiques et cibles thérapeutiques dans diverses maladies6,7. La cause principale du SII-D est un dysfonctionnement de la barrière intestinale8. La destruction des protéines des jonctions serrées entraîne une "fuite intestinale", ce qui active en retour la réponse immunitaire muqueuse9,10. L'activation du système immunitaire libère de nombreux facteurs pro-inflammatoires capables de provoquer un dysfonctionnement intestinal en activant le système immuno-nerveux intestinal. Des études ont indiqué que certains ARNlnc peuvent réguler la barrière épithéliale intestinale11,12. On a signalé que NEAT1 est surexprimé dans les tissus muqueux coliques de patients atteints de colite13. L'inhibition de l'ARNlnc NEAT1 peut atténuer le dysfonctionnement des cellules épithéliales intestinales (CEI) dans la colite ulcéreuse14. Toutefois, le profil d'expression de NEAT1 dans le SII-D et sa valeur diagnostique n'ont pas encore été étudiés. De plus, NEAT1 pourrait présenter un potentiel en tant que biomarqueur diagnostique15. Si NEAT1 est exprimé de façon anormale dans le sérum de patients atteints de SII-D, cela pourrait compléter les critères actuels de Rome IV en fournissant un outil moléculaire de diagnostic. Par ailleurs, le profil d'expression des miARN a également changé de manière significative chez les patients atteints de SII. Par exemple, la diminution de l'expression de miR-29b-3p a été associée à la pathogenèse du SII16. Toutefois, les mécanismes régulateurs en amont qui contrôlent l'expression de miR-29b-3p dans le SII-D restent totalement inexplorés. En particulier, le rôle de NEAT1 en tant qu'ARN endogène compétitif (ceARN) de miR-29b-3p dans le contexte du SII-D n'a jamais été étudié, bien que ce mécanisme soit bien établi dans d'autres maladies17,18. En outre, bien que les études antérieures se soient principalement concentrées sur l'expression au niveau tissulaire, le potentiel de NEAT1 circulant en tant que biomarqueur sérique non invasif pour le diagnostic du SII-D demeure totalement inconnu.

Nous émettons l'hypothèse que l'ARNl NEAT1 pourrait participer à la régulation de la fonction de la barrière intestinale dans le SII-D en agissant comme un ARN compétitif (ceRNA) piégeant le miR-29b-3p. Sur la base de ce contexte de recherche, cette étude vise à : (1) évaluer les niveaux de NEAT1 et de miR-29b-3p dans le sérum des patients atteints de SII-D et leur valeur diagnostique ; (2) valider l'interaction directe de liaison entre NEAT1 et miR-29b-3p ; et (3) élucider le rôle fonctionnel de l'axe NEAT1/miR-29b-3p dans la régulation de l'intégrité de la barrière intestinale et de l'inflammation, en utilisant un modèle de cellules Caco-2 traitées par du LPS.

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Protocole

Inclusion des patients

Tous les participants ont donné leur consentement éclairé par écrit après avoir pleinement compris le contenu de la recherche. Le comité d'éthique de l'hôpital populaire de la nouvelle zone de Pudong à Shanghai a examiné et approuvé ce protocole de recherche (n° 2024k007). La taille de l'échantillon a été calculée à l'aide de G*Power : le test sélectionné était un test t, et le test statistique a été conçu pour détecter des différences entre deux échantillons indépendants. Avec une taille d'effet d = 0,5, α = 0,05 et une puissance = 0,9, le calcul a indiqué qu'au moins 86 sujets devaient être inclus dans chaque groupe. Afin de tenir compte d'éventuelles circonstances imprévues durant l'essai, 116 patients ont été inclus dans chaque groupe. Au total, 116 patients souffrant de SII-D ayant consulté l'hôpital populaire de la nouvelle zone de Pudong à Shanghai entre juillet 2024 et juillet 2025 ont été inclus dans cette étude en tant que groupe expérimental. Les critères d'inclusion étaient les suivants : (1) SII-D répondant aux critères diagnostiques de Rome IV ; (2) une coloscopie indiquant l'absence de lésions organiques de la muqueuse. Critères d'exclusion : (1) patients atteints de maladie inflammatoire de l'intestin (MII), de cancer colorectal, etc. ; (2) patients diabétiques ; (3) patients ayant récemment subi une chirurgie abdominale ; et (4) patients présentant une insuffisance sévère du cœur, du foie ou des reins. Parallèlement, 116 volontaires sains appariés aux patients selon les caractéristiques démographiques telles que l'âge et le sexe ont été recrutés comme groupe témoin. Les témoins sains se sont avérés ne pas avoir d'antécédents de maladies gastro-intestinales chroniques ni de symptômes cliniques correspondants. Cinq millilitres de sang veineux périphérique ont été prélevés chez tous les sujets. Le surnageant a ensuite été transféré dans un réfrigérateur à ultra-basse température à -80 °C pour être congelé en vue d'une extraction ultérieure d'ARN.

Un questionnaire de 10 jours a été rempli par chaque participant afin de recueillir les manifestations cliniques suivantes : (a) évaluation de la gravité des douleurs abdominales à l’aide d’une échelle visuelle analogique sur 10 points ; (b) fréquence des douleurs abdominales pendant la période d’enquête (nombre de jours douloureux) ; (c) fréquence des selles (nombre maximal de selles par jour) ; (d) échelle des caractéristiques fécales de Bristol pour évaluer les caractéristiques des selles. L’état émotionnel des sujets a été évalué à l’aide de l’échelle Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS).

Culture cellulaire et modélisation

Les cellules Caco-2 ont été cultivées habituellement dans un milieu de type Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) et 1 % de pénicilline-streptomycine, dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂. La lignée cellulaire Caco-2 se différencie spontanément en une monocouche polarisée de cellules dotées de jonctions serrées et de microvillosités, présentant des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles similaires à celles des cellules épithéliales intestinales matures. Le LPS déclenche une réponse inflammatoire et perturbe les jonctions serrées dans l'épithélium intestinal, augmentant ainsi la perméabilité intestinale — un processus très proche des caractéristiques pathologiques du SII-D. De plus, étant donné que les cellules Caco-2 traitées au LPS ont été largement utilisées dans des études antérieures19,20,21 pour modéliser les dysfonctionnements de la barrière intestinale et l'inflammation liés au SII, le traitement des cellules Caco-2 par le lipopolysaccharide (LPS) a été choisi dans cette étude afin d'établir un modèle in vitro du SII-D. Une fois que les cellules ont atteint une confluence d'environ 80 %, le milieu de culture a été remplacé par un milieu complet contenant 5 µg/ml de LPS22, et les cellules ont été stimulées pendant 24 heures. Les cellules cultivées de manière conventionnelle sans LPS ont servi de groupe témoin.

Transfection cellulaire

Afin d'étudier les rôles de NEAT1 et du miR-29b-3p dans les cellules Caco-2, des cellules Caco-2 ont été transfectées. Les cellules ont été réparties en six groupes comme suit : 1. groupe témoin (sans traitement) ; 2. groupe LPS ; 3. groupe LPS + si-NC ; 4. groupe LPS + si-NEAT1 ; 5. groupe LPS + si-NEAT1 + inhibiteur NC ; et 6. groupe LPS + si-NEAT1 + inhibiteur de miR-29b-3p. Deux ARN interférents courts (si-NEAT1) ciblant NEAT1 ont été conçus et synthétisés : si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) et si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Un ARN interférent court à séquence aléatoire non ciblante (si-NC) a été utilisé comme contrôle négatif. Parallèlement, l'inhibiteur de miR-29b-3p et son contrôle négatif ont également été synthétisés. Inhibiteur de miR-29b-3p : 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Contrôle négatif : 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Les cellules Caco-2 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits et transfectées une fois que les cultures ont atteint une confluence de 60 à 70 %, conformément au protocole du fabricant. Brièvement, 1,25 µL de siRNA ont été dilués dans 25 µL de milieu à faible teneur en sérum afin d'obtenir une concentration finale de siRNA de 50 nM. Pour l'inhibition des miARN, 2 µL de l'inhibiteur de miR-29b-3p ou de son contrôle négatif ont été dilués dans 25 µL de milieu à faible teneur en sérum pour atteindre une concentration finale de 100 nM. Indépendamment, 1,5 µL du réactif de transfection ont été mélangés avec 25 µL de milieu à faible teneur en sérum. Le siRNA dilué (ou l'inhibiteur/le contrôle négatif) a ensuite été mélangé au réactif de transfection dilué afin de former le complexe de transfection, qui a été ajouté goutte à goutte aux cellules. Six heures après la transfection, le mélange de transfection a été remplacé par un milieu complet frais, et les cellules ont été maintenues pendant 48 heures supplémentaires avant les tests fonctionnels ultérieurs. L'efficacité de l'extinction ou de l'inhibition a été confirmée par RT-qPCR avant toute autre expérience.

PCR quantitatif en temps réel par transcription inverse (RT-qPCR)

L'ARN total a été isolé à partir d'échantillons de sérum et de cellules Caco-2 soumises aux traitements indiqués. Brièvement, chaque échantillon a été lysé avec 1 mL de réactif d'extraction d'ARN et mélangé avec 200 µL de chloroforme. Après une centrifugation à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C, la phase aqueuse supérieure a été transférée dans un tube propre, mélangée avec 500 µL d'isopropanol et conservée à −20 °C pendant 30 min. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 12 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Le culot d'ARN obtenu a été lavé deux fois avec de l'éthanol 75 %, séché à l'air, puis repris dans 20 µL d'eau exempte de RNase. Le rendement et la pureté de l'ARN ont été mesurés à l'aide d'un micro-spectrophotomètre, et seuls les échantillons présentant un A260/A280 des valeurs comprises entre 1,8 et 2,0 ont été utilisées. L'ARN a été rétrotranscrit en ADN complémentaire (ADNc) selon le protocole du fabricant. Pour la détection de NEAT1, ZO-1, occludine, claudine-2, et GAPDH, 1 µg d'ARN total a été utilisé pour chaque réaction de transcription inverse de 20 µL contenant 1× tampon RT, 0,5 mM de dNTPs, 0,5 µM d'amorce oligo(dT), 200 U de transcriptase inverse et de l'eau sans RNase. La réaction a été effectuée à 37 °C pendant 15 min, suivie d'une inactivation enzymatique à 85 °C pendant 5 s.

La PCR quantitative a été réalisée en utilisant de l'ADNc comme matrice, au moyen d'un système de PCR en temps réel basé sur le SYBR Green. NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludine, et Les niveaux d'expression de la claudine-2 ont été mesurés à l'aide d'amorces spécifiques au gène. U6 a servi de gène de référence pour le miR-29b-3p, tandis que GAPDH a été utilisé pour la normalisation NEAT1 et les gènes liés aux jonctions serrées. L'expression relative a été calculée selon la méthode 2−ΔΔCt. Les séquences des amorces sont indiquées dans Tableau 1.

Test de viabilité cellulaire

Des cellules Caco-2 en phase logarithmique ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à raison de 1 × 104 cellules par puits. Un groupe témoin blanc (contenant uniquement le milieu de culture), un groupe contrôle (cellules non traitées) et un groupe expérimental (cellules Caco-2 soumises à différentes conditions de traitement) ont été mis en place, avec 5 à 6 puits par groupe. Les cellules ont été réparties en quatre points temporels : 0, 24, 48 et 72 h. Une plaque de culture distincte a été préparée pour chaque point temporel afin d'éviter d'ouvrir à répétition l'incubateur pendant les mesures. À la fin de la période de culture, 10 µL de solution CCK-8 ont été ajoutés dans chaque puits, en évitant la formation de bulles. Par la suite, la plaque de culture a été replacée dans un incubateur à 37 °C et 5 % CO₂ et incubée à l'abri de la lumière pendant 2 h. L'absorbance de chaque puits a été mesurée immédiatement à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. Finalement, la viabilité cellulaire a été exprimée en pourcentage.

Dosage de l'apoptose cellulaire

L'apoptose a été quantifiée par cytométrie en flux après coloration par l'Annexine V-FITC/PI. Les cellules Caco-2 de chaque groupe de traitement ont été récoltées et rincées deux fois avec du PBS froid. Une centrifugation a été effectuée à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Le culot cellulaire a ensuite été resuspendu dans 100 µL de tampon de liaison 1×, puis 5 µL d'Annexine V-FITC et 5 µL de PI ont été ajoutés successivement. Après un mélange doux, les échantillons ont été incubés 15 min à température ambiante à l'abri de la lumière. Ensuite, 300 µL de tampon de liaison 1× ont été ajoutés, et la suspension a été soigneusement mélangée avant d'être transférée dans un tube de cytométrie en flux de 5 mL. Les échantillons ont été analysés par cytométrie en flux dans l'heure suivant leur préparation.

Résistance électrique transépithéliale (TEER)

La perméabilité a été évaluée en mesurant les valeurs de résistance transépithéliale (TEER) des cellules Caco-223. Les cellules Caco-2 ont été inoculées dans des compartiments Transwell et cultivées pendant 21 jours afin de former une monocouche dense. Six réplicats biologiques indépendants ont été réalisés pour chaque condition expérimentale, ainsi que cinq réplicats techniques pour chaque condition. Avant et après le traitement expérimental, les valeurs de TEER de chaque groupe ont été mesurées à l’aide d’un appareil de mesure de la résistance transmembranaire, en utilisant des électrodes stérilisées à l’éthanol et équilibrées avec du PBS. En bref, la tige longue de l’électrode a été immergée dans le milieu de culture basolatéral, et la tige courte dans le milieu de culture apical, afin d’éviter tout contact avec la membrane filtrante. Après stabilisation, la valeur de résistance (Ω) a été relevée, et les mesures ont été répétées jusqu’à l’obtention de trois lectures cohérentes. La résistance des filtres Transwell vides (sans cellules) a été mesurée dans les mêmes conditions, et cette valeur a été soustraite de toutes les lectures expérimentales. TEER (Ω·cm2) = (résistance de l’échantillon – résistance du blanc) × surface effective de la membrane. Les données sont exprimées selon la formule : (groupe expérimental/groupe témoin) × 100 %.

Dosage immuno-enzymatique (ELISA)

Les surnageants de cellules Caco-2 provenant de différents groupes de traitement ont été recueillis après 24 heures de culture. Les concentrations de cytokines pro-inflammatoires, notamment le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-α), l'interleukine-6 (IL-6), l'interleukine-8 (IL-8) et l'interleukine-1β (IL-1β), ont été mesurées à l'aide de réactifs ELISA commerciaux conformément aux instructions du fabricant. Le test a été réalisé strictement selon les instructions. Les échantillons et les standards ont été ajoutés dans des puits prérecouverts d'anticorps, puis incubés et lavés. Ensuite, l'anticorps de détection biotinylé a été ajouté. Après une nouvelle incubation et un lavage, la streptavidine marquée à la peroxydase de raifort a été ajoutée. Enfin, le substrat TMB a été ajouté pour le développement de la couleur, et la réaction a été arrêtée à l'aide de la solution d'arrêt. L'absorbance de chaque puits a été mesurée immédiatement à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.

Immunotransfert

Les protéines ont été isolées à partir de cellules Caco-2 après les traitements indiqués à l'aide d'un tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases. Les concentrations protéiques ont été mesurées par un dosage à l'acide bicinchoninique (BCA). Pour chaque échantillon, 30 µg de protéine ont été chargés par puits, séparés sur des gels de SDS-PAGE à 10 %, puis transférés sur des membranes en PVDF. Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5 % pendant 1 h à température ambiante, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps dirigés contre ZO-1 (1:1 000), l'occludine (1:500), la claudine-2 (1:1 000) et la GAPDH (1:5 000). Après lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 1 h à température ambiante. Les bandes ont été révélées par chimiluminescence améliorée (ECL), et l'intensité des bandes a été analysée à l'aide du logiciel ImageJ. La GAPDH a servi de contrôle de chargement.

Dosage du luciférase double (DLR)

Les sites de liaison potentiels de miR-29b-3p à la NEAT1 la séquence a été prédite à l'aide de la base de données ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Par la suite, NEAT1 des fragments contenant des sites de liaison de type sauvage (WT) ou mutés (MUT) ont été clonés dans le vecteur rapporteur pmirGLO. Le plasmide recombinant ainsi construit a été co-transfecté dans les cellules avec des mimiques de miR-29b-3p (Brin sens : 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’ ; Brin antisens : 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) ou des inhibiteurs, ainsi que leurs contrôles négatifs respectifs (mimique NC, Brin sens : 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ ; Brin antisens : 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Quarante-huit heures après la transfection, les cellules ont été récoltées et les activités de la luciférase de luciole et de la luciférase de *Renilla* ont été mesurées à l’aide d’un réactif de détection double luciférase. L’activité de la luciférase de *Renilla* a servi de référence interne pour la normalisation.

Dosage d'immunoprécipitation de l'ARN (RIP)

Pour le dosage RIP, les cellules Caco-2 ont été récoltées, rincées au PBS, puis incubées sur de la glace pendant 15 min dans 200 µL de tampon de lyse RIP supplémenté avec des inhibiteurs de protéase et d'ARNase. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à 16 000 × g pendant 10 min à 4 °C, et 10 µL de chaque surnageant ont été conservés comme témoin d'entrée. Pour l'immunoprécipitation, 40 µL de billes magnétiques Protéine A/G ont été agitées avec 5 µg d'anticorps anti-Ago2 ou d'IgG normal dans 200 µL de tampon de lavage RIP pendant 30 min à température ambiante. Après trois lavages avec 500 µL de tampon de lavage RIP, 100 µL de la suspension de billes ont été mélangés à 100 µL de lysat, ajustés à un volume final de 1 mL avec le tampon de lavage RIP, puis incubés toute la nuit à 4 °C sous agitation. Les billes ont ensuite été lavées cinq fois avec 500 µL de tampon de lavage RIP et resuspendues dans 150 µL du même tampon. La digestion des protéines a été réalisée en ajoutant 15 µL de protéinase K (20 mg/mL) et 15 µL de SDS à 10 %, suivie d'une incubation à 55 °C pendant 30 min sous agitation. Le surnageant a été récupéré, puis l'ARN a été isolé à l'aide du réactif d'extraction et précipité toute la nuit. L'enrichissement de NEAT1 et de miR-29b-3p a ensuite été évalué par RT-qPCR.

Analyse de la localisation subcellulaire

Les cellules Caco-2 ont été séparées en fractions nucléaire et cytoplasmique à l’aide du réactif commercial de séparation nucléocytoplasmique référencé, conformément aux instructions du fabricant. L’ARN total a été extrait de ces deux composants, et la distribution de NEAT1 dans le noyau et le cytoplasme a été détectée par RT-qPCR. L’étalonnage a été effectué à l’aide de U6 (principalement nucléaire) et de l’ARNm de GAPDH (principalement cytoplasmique) comme indicateurs de l’efficacité de la séparation.

Analyse statistique

Pour les échantillons sériques cliniques, une analyse de puissance (test t, d = 0,5, α = 0,05, puissance = 0,9) a indiqué qu'un minimum de 86 sujets par groupe était nécessaire. Afin de tenir compte d'éventuelles circonstances imprévues durant l'essai, 116 patients ont été inclus dans chaque groupe afin de détecter des différences cliniquement significatives. La normalité des données pour les variables continues a été évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk. Comme toutes les données continues étaient distribuées normalement (P > 0,05), des analyses paramétriques ont été appliquées. Les variables catégorielles ont été analysées à l'aide du test du chi-deux. Les expériences cellulaires comprenaient six réplicats biologiques indépendants, avec cinq réplicats techniques pour chaque réplicat biologique. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Les comparaisons entre deux groupes à variables continues ont été effectuées à l'aide du test t de Student, tandis que les comparaisons entre plusieurs groupes ont été analysées par une ANOVA à un facteur suivie du test a posteriori de Tukey. La significativité statistique a été définie comme P < 0,05.

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Résultats

Expression de NEAT1 et valeur diagnostique

Par rapport au groupe témoin sain (HC), les niveaux d'expression de NEAT1 chez les patients atteints du SII-D étaient nettement plus élevés (P < 0,0001 ; Figure 1A). La surface sous la courbe (AUC) de NEAT1, telle que représentée par la courbe ROC (caractéristique de fonctionnement du récepteur), était de 0,867 (IC à 95 % : 0,821–0,913). Sa spécificité était de 75,9 ...

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Discussion

Le SII-D est un trouble fonctionnel courant du système gastro-intestinal. Son mécanisme pathologique n'a pas encore été entièrement élucidé. Ces dernières années, les ARNl, en tant que molécules clés de la régulation épigénétique, ont montré un fort potentiel dans le domaine du diagnostic et du traitement des maladies. L'ARNl NEAT1 a été étudié dans diverses pathologies, telles que le cancer colorectal24, le gliome25 et l'infarctus du myocarde26

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont aucune incompatibilité d'intérêts à déclarer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques 24 puitsCorningCLS3524Pour la mise en culture des cellules
Plaques 96 puitsCorningCLS3599Pour la mise en culture des cellules dans les tests CCK-8
Kit d'apoptose Annexine V-FITC/PIInvitrogenV13242Pour la détection des taux d'apoptose
Anticorps monoclonal anti-AGO2Proteintech67934-1-IgPour l'immunoprécipitation des complexes d'ARN liés à Ago2
Anticorps anti-Claudine-2Invitrogen32-5600Anticorps primaire, dilution 1:1000
Anticorps anti-GAPDHCell Signaling Technology5174Anticorps primaire, dilution 1:5000 ; contrôle de chargement
Anticorps anti-IgG humainProteintech10284-1-APUtilisé comme contrôle négatif pour le test RIP
Anticorps anti-OccludineAbcamab31721Anticorps primaire, dilution 1:500
Anticorps anti-ZO-1Proteintech21773-1-APAnticorps primaire, dilution 1:1000
Cellules Caco-2SUNNCELLSNL-068Pour la construction de modèles de barrière épithéliale intestinale
Kit CCK-8SolarbioCA1210Kit de test de prolifération cellulaire
ChloroformeSigma-AldrichC2432Pour la séparation des phases lors de l'extraction d'ARN
Milieu DMEMGibco11965092Pour la culture cellulaire
Kit d'essai Dual-Luciferase ReporterThermoFisher16186Pour la détection de l'activité luciférase
Kit ELISA (pour IL-1β)R&D SystemsDY201Pour la détection de protéines cibles dans les surnageants de culture cellulaire
Kit ELISA (pour IL-6)R&D SystemsD6050BPour la détection de protéines cibles dans les surnageants de culture cellulaire
Kit ELISA (pour IL-8)R&D SystemsNBP3-28022Pour la détection de protéines cibles dans les surnageants de culture cellulaire
Kit ELISA (pour TNF-α)R&D SystemsDTA00DPour la détection de protéines cibles dans les surnageants de culture cellulaire
Substrat chimiluminescent amélioré (ECL)Thermo Fisher32106Pour la visualisation des bandes protéiques
Éthanol (75 %)Sigma-Aldrich459844Pour le lavage du culot d'ARN
Sérum de veau fœtal (FBS)Gibco10099141Pour la culture cellulaire
Cytomètre en fluxBeckman CoulterB53002Pour la détection des taux d'apoptose
Anticorps secondaires conjugués à la peroxydaseCell Signaling Technology7074Catalysent la production d'un signal chimiluminescent à partir de substrats ECL
IsopropanolSigma-Aldrich1133502500Pour la précipitation de l'ARN
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015Réactif de transfection
Lipopolysaccharide (LPS)Sigma-AldrichL2880Pour induire la construction du modèle cellulaire
Lecteur de microplaquesBioTekEpoch 2Pour la détection de l'absorbance des échantillons dans des plaques 96 puits
Micropipette spectrophotomètre NanodropThermo ScientificND-2000CPour déterminer la concentration et la pureté de l'ARN
Lait écrémé en poudreCoolaberCN7861Pour le blocage des membranes (solution à 5 %)
Kit PARISThermo FisherAM1921Pour la fractionnement nucléocytoplasmique
Pénicilline–StreptomycineGibco15140122Pour la résistance à la contamination lors de la croissance cellulaire
Kit d'essai de protéines BCA PierceThermo Fisher23225Pour la détermination des concentrations en protéines
Vecteur pmirGLO Dual-LuciferasePromegaE1330Vecteur de gène rapporteur double luciférase
Kit de réactifs PrimeScript RTTakaraRR047APour la transcription inverse de l'ARN en ADNc
Membrane PVDFMilliporeIPVH00010Pour le transfert des protéines après électrophorèse SDS-PAGE
Appareil de PCR quantitative en temps réel avec fluorescenceApplied Biosystems4365464Pour la détection des gènes cibles
Solution de lyse RIPA (avec inhibiteurs de protéases)Thermo Fisher89901Pour l'extraction totale des protéines à partir des cellules
Kit d'immunoprécipitation de protéines liant l'ARNSigma-Aldrich17-701Test d'immunoprécipitation de protéines liant l'ARN (RIP) utilisant des billes magnétiques A/G
Réactifs SDS-PAGE (gel 10 %)TargetMolC0189Pour la séparation des protéines selon leur masse moléculaire
Master mix SYBR GreenThermo Fisher4309155Pour utilisation dans les tests PCR
Mesureur de résistance transépithéliale (Volt-Ohm Mètre)MilliporeMERS00002Mesureur de résistance transmembranaire, évaluation de l'intégrité monocouche
Chambres TranswellCorning CostarCLS3413Pour la culture de monocouches cellulaires et la mesure de la résistance transépithéliale (TEER)
Réactif TRIzolInvitrogen15596026CNPour l'extraction totale d'ARN

Références

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