Dysfonctionnement de la barrière intestinale médiée par NEAT1 par liaison à miR-29b-3p dans les cellules Caco-2 endommagées par le lipopolysaccharide

Résumé

Cette étude a évalué NEAT1 comme marqueur diagnostique et régulateur de la dysfonction de la barrière intestinale dans le syndrome de l'intestin irritable prédominant avec diarrhée. NEAT1 était augmenté dans le sérum des patients, se liait à miR-29b-3p, et sa diminution a amélioré les paramètres de la barrière, de l'apoptose et de l'inflammation dans des cellules Caco-2 endommagées par le lipopolysaccharide.

Résumé

La pathogenèse du syndrome de l'intestin irritable avec diarrhée (SII-D) n'est pas bien comprise, et les thérapies disponibles restent limitées. Cette étude a évalué la valeur diagnostique de NEAT1 dans le SII-D et exploré son mécanisme régulateur potentiel. Au total, 116 patients atteints de SII-D et 116 témoins sains ont été inclus. Les niveaux sériques de NEAT1 et de miR-29b-3p ont été mesurés par PCR quantitative en temps réel après transcription inverse (RT-qPCR), et des courbes caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) ont été utilisées pour évaluer la valeur diagnostique. Pour les études mécanistiques, un modèle de cellules épithéliales intestinales Caco-2 traitées par un lipopolysaccharide (LPS) a été établi. La viabilité cellulaire a été évaluée par test au kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8), l'apoptose par cytométrie en flux, l'intégrité de la barrière par la résistance électrique transepithéliale (TEER), et les niveaux d'ARNm de ZO-1, d'occludine et de claudine-2 par RT-qPCR. Des tests de rapporteur double luciférase (DLR) et d'immunoprécipitation de l'ARN (RIP) ont été utilisés pour confirmer la relation d'interaction entre NEAT1 et miR-29b-3p. NEAT1 était fortement exprimé, et miR-29b-3p faiblement exprimé chez les patients atteints de SII-D, et leurs niveaux présentaient une forte corrélation négative. L'extinction de NEAT1 augmentait les niveaux de miR-29b-3p, améliorait la viabilité cellulaire et la TEER, réduisait l'apoptose, augmentait les niveaux d'ARNm de ZO-1 et d'occludine, diminuait les niveaux d'ARNm de claudine-2, et atténuait les paramètres associés aux lésions de la barrière dans les cellules Caco-2 traitées au LPS. Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que NEAT1 sérique constitue un biomarqueur candidat pour le SII-D et que l'axe NEAT1/miR-29b-3p pourrait être impliqué dans le dysfonctionnement de la barrière intestinale.

Introduction

Le syndrome de l'intestin irritable avec diarrhée (IBS-D) est un trouble fonctionnel gastro-intestinal courant, caractérisé par des douleurs abdominales, une distension abdominale et des habitudes intestinales modifiées¹. À l'heure actuelle, le mécanisme physiopathologique de l'IBS-D n'est pas entièrement élucidé². Les méthodes de traitement consistent principalement en un soulagement symptomatique, dont l'efficacité est limitée et le taux de récidive élevé³. On considère généralement que l'IBS-D implique l'interaction de plusieurs facteurs, tels qu'une dysrégulation de l'axe cerveau-intestin, une hypersensibilité viscérale, une inflammation intestinale de bas grade et une dysfonction de la barrière intestinale^4,5. Bien que ces critères aient partiellement standardisé le diagnostic, ils sont subjectifs et peuvent entraîner des retards diagnostiques ou des erreurs de classification, notamment lorsque les symptômes des patients se chevauchent avec ceux de la maladie inflammatoire de l'intestin ou d'autres maladies organiques. En pratique clinique courante, aucun biomarqueur objectif validé n'existe actuellement pour l'IBS-D. Par conséquent, explorer une nouvelle cible moléculaire pouvant servir à la fois de support diagnostique et de valeur thérapeutique potentielle est devenu un besoin urgent dans le domaine actuel de la recherche sur l'IBS-D.

Ces dernières années, les ARN non codants longs, en tant que molécules clés dans la régulation épigénétique, ont démontré un fort potentiel en tant que marqueurs diagnostiques et cibles thérapeutiques dans diverses maladies^6,7. La cause principale du SII-D est un dysfonctionnement de la barrière intestinale⁸. La destruction des protéines des jonctions serrées entraîne une "fuite intestinale", ce qui active en retour la réponse immunitaire muqueuse^9,10. L'activation du système immunitaire libère de nombreux facteurs pro-inflammatoires capables de provoquer un dysfonctionnement intestinal en activant le système immuno-nerveux intestinal. Des études ont indiqué que certains ARNlnc peuvent réguler la barrière épithéliale intestinale^11,12. On a signalé que NEAT1 est surexprimé dans les tissus muqueux coliques de patients atteints de colite¹³. L'inhibition de l'ARNlnc NEAT1 peut atténuer le dysfonctionnement des cellules épithéliales intestinales (CEI) dans la colite ulcéreuse¹⁴. Toutefois, le profil d'expression de NEAT1 dans le SII-D et sa valeur diagnostique n'ont pas encore été étudiés. De plus, NEAT1 pourrait présenter un potentiel en tant que biomarqueur diagnostique¹⁵. Si NEAT1 est exprimé de façon anormale dans le sérum de patients atteints de SII-D, cela pourrait compléter les critères actuels de Rome IV en fournissant un outil moléculaire de diagnostic. Par ailleurs, le profil d'expression des miARN a également changé de manière significative chez les patients atteints de SII. Par exemple, la diminution de l'expression de miR-29b-3p a été associée à la pathogenèse du SII¹⁶. Toutefois, les mécanismes régulateurs en amont qui contrôlent l'expression de miR-29b-3p dans le SII-D restent totalement inexplorés. En particulier, le rôle de NEAT1 en tant qu'ARN endogène compétitif (ceARN) de miR-29b-3p dans le contexte du SII-D n'a jamais été étudié, bien que ce mécanisme soit bien établi dans d'autres maladies^17,18. En outre, bien que les études antérieures se soient principalement concentrées sur l'expression au niveau tissulaire, le potentiel de NEAT1 circulant en tant que biomarqueur sérique non invasif pour le diagnostic du SII-D demeure totalement inconnu.

Nous émettons l'hypothèse que l'ARNl NEAT1 pourrait participer à la régulation de la fonction de la barrière intestinale dans le SII-D en agissant comme un ARN compétitif (ceRNA) piégeant le miR-29b-3p. Sur la base de ce contexte de recherche, cette étude vise à : (1) évaluer les niveaux de NEAT1 et de miR-29b-3p dans le sérum des patients atteints de SII-D et leur valeur diagnostique ; (2) valider l'interaction directe de liaison entre NEAT1 et miR-29b-3p ; et (3) élucider le rôle fonctionnel de l'axe NEAT1/miR-29b-3p dans la régulation de l'intégrité de la barrière intestinale et de l'inflammation, en utilisant un modèle de cellules Caco-2 traitées par du LPS.

Protocole

Inclusion des patients

Tous les participants ont donné leur consentement éclairé par écrit après avoir pleinement compris le contenu de la recherche. Le comité d'éthique de l'hôpital populaire de la nouvelle zone de Pudong à Shanghai a examiné et approuvé ce protocole de recherche (n° 2024k007). La taille de l'échantillon a été calculée à l'aide de G*Power : le test sélectionné était un test t, et le test statistique a été conçu pour détecter des différences entre deux échantillons indépendants. Avec une taille d'effet d = 0,5, α = 0,05 et une puissance = 0,9, le calcul a indiqué qu'au moins 86 sujets devaient être inclus dans chaque groupe. Afin de tenir compte d'éventuelles circonstances imprévues durant l'essai, 116 patients ont été inclus dans chaque groupe. Au total, 116 patients souffrant de SII-D ayant consulté l'hôpital populaire de la nouvelle zone de Pudong à Shanghai entre juillet 2024 et juillet 2025 ont été inclus dans cette étude en tant que groupe expérimental. Les critères d'inclusion étaient les suivants : (1) SII-D répondant aux critères diagnostiques de Rome IV ; (2) une coloscopie indiquant l'absence de lésions organiques de la muqueuse. Critères d'exclusion : (1) patients atteints de maladie inflammatoire de l'intestin (MII), de cancer colorectal, etc. ; (2) patients diabétiques ; (3) patients ayant récemment subi une chirurgie abdominale ; et (4) patients présentant une insuffisance sévère du cœur, du foie ou des reins. Parallèlement, 116 volontaires sains appariés aux patients selon les caractéristiques démographiques telles que l'âge et le sexe ont été recrutés comme groupe témoin. Les témoins sains se sont avérés ne pas avoir d'antécédents de maladies gastro-intestinales chroniques ni de symptômes cliniques correspondants. Cinq millilitres de sang veineux périphérique ont été prélevés chez tous les sujets. Le surnageant a ensuite été transféré dans un réfrigérateur à ultra-basse température à -80 °C pour être congelé en vue d'une extraction ultérieure d'ARN.

Un questionnaire de 10 jours a été rempli par chaque participant afin de recueillir les manifestations cliniques suivantes : (a) évaluation de la gravité des douleurs abdominales à l’aide d’une échelle visuelle analogique sur 10 points ; (b) fréquence des douleurs abdominales pendant la période d’enquête (nombre de jours douloureux) ; (c) fréquence des selles (nombre maximal de selles par jour) ; (d) échelle des caractéristiques fécales de Bristol pour évaluer les caractéristiques des selles. L’état émotionnel des sujets a été évalué à l’aide de l’échelle Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS).

Culture cellulaire et modélisation

Les cellules Caco-2 ont été cultivées habituellement dans un milieu de type Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (SVF) et 1 % de pénicilline-streptomycine, dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO₂. La lignée cellulaire Caco-2 se différencie spontanément en une monocouche polarisée de cellules dotées de jonctions serrées et de microvillosités, présentant des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles similaires à celles des cellules épithéliales intestinales matures. Le LPS déclenche une réponse inflammatoire et perturbe les jonctions serrées dans l'épithélium intestinal, augmentant ainsi la perméabilité intestinale — un processus très proche des caractéristiques pathologiques du SII-D. De plus, étant donné que les cellules Caco-2 traitées au LPS ont été largement utilisées dans des études antérieures^19,20,21 pour modéliser les dysfonctionnements de la barrière intestinale et l'inflammation liés au SII, le traitement des cellules Caco-2 par le lipopolysaccharide (LPS) a été choisi dans cette étude afin d'établir un modèle in vitro du SII-D. Une fois que les cellules ont atteint une confluence d'environ 80 %, le milieu de culture a été remplacé par un milieu complet contenant 5 µg/ml de LPS²², et les cellules ont été stimulées pendant 24 heures. Les cellules cultivées de manière conventionnelle sans LPS ont servi de groupe témoin.

Transfection cellulaire

Afin d'étudier les rôles de NEAT1 et du miR-29b-3p dans les cellules Caco-2, des cellules Caco-2 ont été transfectées. Les cellules ont été réparties en six groupes comme suit : 1. groupe témoin (sans traitement) ; 2. groupe LPS ; 3. groupe LPS + si-NC ; 4. groupe LPS + si-NEAT1 ; 5. groupe LPS + si-NEAT1 + inhibiteur NC ; et 6. groupe LPS + si-NEAT1 + inhibiteur de miR-29b-3p. Deux ARN interférents courts (si-NEAT1) ciblant NEAT1 ont été conçus et synthétisés : si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) et si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Un ARN interférent court à séquence aléatoire non ciblante (si-NC) a été utilisé comme contrôle négatif. Parallèlement, l'inhibiteur de miR-29b-3p et son contrôle négatif ont également été synthétisés. Inhibiteur de miR-29b-3p : 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Contrôle négatif : 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Les cellules Caco-2 ont été ensemencées dans des plaques de 24 puits et transfectées une fois que les cultures ont atteint une confluence de 60 à 70 %, conformément au protocole du fabricant. Brièvement, 1,25 µL de siRNA ont été dilués dans 25 µL de milieu à faible teneur en sérum afin d'obtenir une concentration finale de siRNA de 50 nM. Pour l'inhibition des miARN, 2 µL de l'inhibiteur de miR-29b-3p ou de son contrôle négatif ont été dilués dans 25 µL de milieu à faible teneur en sérum pour atteindre une concentration finale de 100 nM. Indépendamment, 1,5 µL du réactif de transfection ont été mélangés avec 25 µL de milieu à faible teneur en sérum. Le siRNA dilué (ou l'inhibiteur/le contrôle négatif) a ensuite été mélangé au réactif de transfection dilué afin de former le complexe de transfection, qui a été ajouté goutte à goutte aux cellules. Six heures après la transfection, le mélange de transfection a été remplacé par un milieu complet frais, et les cellules ont été maintenues pendant 48 heures supplémentaires avant les tests fonctionnels ultérieurs. L'efficacité de l'extinction ou de l'inhibition a été confirmée par RT-qPCR avant toute autre expérience.

PCR quantitatif en temps réel par transcription inverse (RT-qPCR)

L'ARN total a été isolé à partir d'échantillons de sérum et de cellules Caco-2 soumises aux traitements indiqués. Brièvement, chaque échantillon a été lysé avec 1 mL de réactif d'extraction d'ARN et mélangé avec 200 µL de chloroforme. Après une centrifugation à 12 000 × g pendant 15 min à 4 °C, la phase aqueuse supérieure a été transférée dans un tube propre, mélangée avec 500 µL d'isopropanol et conservée à −20 °C pendant 30 min. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 12 000 × g pendant 10 min à 4 °C. Le culot d'ARN obtenu a été lavé deux fois avec de l'éthanol 75 %, séché à l'air, puis repris dans 20 µL d'eau exempte de RNase. Le rendement et la pureté de l'ARN ont été mesurés à l'aide d'un micro-spectrophotomètre, et seuls les échantillons présentant un A₂₆₀/A₂₈₀ des valeurs comprises entre 1,8 et 2,0 ont été utilisées. L'ARN a été rétrotranscrit en ADN complémentaire (ADNc) selon le protocole du fabricant. Pour la détection de NEAT1, ZO-1, occludine, claudine-2, et GAPDH, 1 µg d'ARN total a été utilisé pour chaque réaction de transcription inverse de 20 µL contenant 1× tampon RT, 0,5 mM de dNTPs, 0,5 µM d'amorce oligo(dT), 200 U de transcriptase inverse et de l'eau sans RNase. La réaction a été effectuée à 37 °C pendant 15 min, suivie d'une inactivation enzymatique à 85 °C pendant 5 s.

La PCR quantitative a été réalisée en utilisant de l'ADNc comme matrice, au moyen d'un système de PCR en temps réel basé sur le SYBR Green. NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludine, et Les niveaux d'expression de la claudine-2 ont été mesurés à l'aide d'amorces spécifiques au gène. U6 a servi de gène de référence pour le miR-29b-3p, tandis que GAPDH a été utilisé pour la normalisation NEAT1 et les gènes liés aux jonctions serrées. L'expression relative a été calculée selon la méthode 2−ΔΔCt. Les séquences des amorces sont indiquées dans Tableau 1.

Test de viabilité cellulaire

Des cellules Caco-2 en phase logarithmique ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à raison de 1 × 10⁴ cellules par puits. Un groupe témoin blanc (contenant uniquement le milieu de culture), un groupe contrôle (cellules non traitées) et un groupe expérimental (cellules Caco-2 soumises à différentes conditions de traitement) ont été mis en place, avec 5 à 6 puits par groupe. Les cellules ont été réparties en quatre points temporels : 0, 24, 48 et 72 h. Une plaque de culture distincte a été préparée pour chaque point temporel afin d'éviter d'ouvrir à répétition l'incubateur pendant les mesures. À la fin de la période de culture, 10 µL de solution CCK-8 ont été ajoutés dans chaque puits, en évitant la formation de bulles. Par la suite, la plaque de culture a été replacée dans un incubateur à 37 °C et 5 % CO₂ et incubée à l'abri de la lumière pendant 2 h. L'absorbance de chaque puits a été mesurée immédiatement à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques. Finalement, la viabilité cellulaire a été exprimée en pourcentage.

Dosage de l'apoptose cellulaire

L'apoptose a été quantifiée par cytométrie en flux après coloration par l'Annexine V-FITC/PI. Les cellules Caco-2 de chaque groupe de traitement ont été récoltées et rincées deux fois avec du PBS froid. Une centrifugation a été effectuée à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Le culot cellulaire a ensuite été resuspendu dans 100 µL de tampon de liaison 1×, puis 5 µL d'Annexine V-FITC et 5 µL de PI ont été ajoutés successivement. Après un mélange doux, les échantillons ont été incubés 15 min à température ambiante à l'abri de la lumière. Ensuite, 300 µL de tampon de liaison 1× ont été ajoutés, et la suspension a été soigneusement mélangée avant d'être transférée dans un tube de cytométrie en flux de 5 mL. Les échantillons ont été analysés par cytométrie en flux dans l'heure suivant leur préparation.

Résistance électrique transépithéliale (TEER)

La perméabilité a été évaluée en mesurant les valeurs de résistance transépithéliale (TEER) des cellules Caco-2²³. Les cellules Caco-2 ont été inoculées dans des compartiments Transwell et cultivées pendant 21 jours afin de former une monocouche dense. Six réplicats biologiques indépendants ont été réalisés pour chaque condition expérimentale, ainsi que cinq réplicats techniques pour chaque condition. Avant et après le traitement expérimental, les valeurs de TEER de chaque groupe ont été mesurées à l’aide d’un appareil de mesure de la résistance transmembranaire, en utilisant des électrodes stérilisées à l’éthanol et équilibrées avec du PBS. En bref, la tige longue de l’électrode a été immergée dans le milieu de culture basolatéral, et la tige courte dans le milieu de culture apical, afin d’éviter tout contact avec la membrane filtrante. Après stabilisation, la valeur de résistance (Ω) a été relevée, et les mesures ont été répétées jusqu’à l’obtention de trois lectures cohérentes. La résistance des filtres Transwell vides (sans cellules) a été mesurée dans les mêmes conditions, et cette valeur a été soustraite de toutes les lectures expérimentales. TEER (Ω·cm²) = (résistance de l’échantillon – résistance du blanc) × surface effective de la membrane. Les données sont exprimées selon la formule : (groupe expérimental/groupe témoin) × 100 %.

Dosage immuno-enzymatique (ELISA)

Les surnageants de cellules Caco-2 provenant de différents groupes de traitement ont été recueillis après 24 heures de culture. Les concentrations de cytokines pro-inflammatoires, notamment le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-α), l'interleukine-6 (IL-6), l'interleukine-8 (IL-8) et l'interleukine-1β (IL-1β), ont été mesurées à l'aide de réactifs ELISA commerciaux conformément aux instructions du fabricant. Le test a été réalisé strictement selon les instructions. Les échantillons et les standards ont été ajoutés dans des puits prérecouverts d'anticorps, puis incubés et lavés. Ensuite, l'anticorps de détection biotinylé a été ajouté. Après une nouvelle incubation et un lavage, la streptavidine marquée à la peroxydase de raifort a été ajoutée. Enfin, le substrat TMB a été ajouté pour le développement de la couleur, et la réaction a été arrêtée à l'aide de la solution d'arrêt. L'absorbance de chaque puits a été mesurée immédiatement à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.

Immunotransfert

Les protéines ont été isolées à partir de cellules Caco-2 après les traitements indiqués à l'aide d'un tampon RIPA contenant des inhibiteurs de protéases. Les concentrations protéiques ont été mesurées par un dosage à l'acide bicinchoninique (BCA). Pour chaque échantillon, 30 µg de protéine ont été chargés par puits, séparés sur des gels de SDS-PAGE à 10 %, puis transférés sur des membranes en PVDF. Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5 % pendant 1 h à température ambiante, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps dirigés contre ZO-1 (1:1 000), l'occludine (1:500), la claudine-2 (1:1 000) et la GAPDH (1:5 000). Après lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) pendant 1 h à température ambiante. Les bandes ont été révélées par chimiluminescence améliorée (ECL), et l'intensité des bandes a été analysée à l'aide du logiciel ImageJ. La GAPDH a servi de contrôle de chargement.

Dosage du luciférase double (DLR)

Les sites de liaison potentiels de miR-29b-3p à la NEAT1 la séquence a été prédite à l'aide de la base de données ENCORI (https://rnasysu.com/encori/). Par la suite, NEAT1 des fragments contenant des sites de liaison de type sauvage (WT) ou mutés (MUT) ont été clonés dans le vecteur rapporteur pmirGLO. Le plasmide recombinant ainsi construit a été co-transfecté dans les cellules avec des mimiques de miR-29b-3p (Brin sens : 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’ ; Brin antisens : 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) ou des inhibiteurs, ainsi que leurs contrôles négatifs respectifs (mimique NC, Brin sens : 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’ ; Brin antisens : 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’). Quarante-huit heures après la transfection, les cellules ont été récoltées et les activités de la luciférase de luciole et de la luciférase de *Renilla* ont été mesurées à l’aide d’un réactif de détection double luciférase. L’activité de la luciférase de *Renilla* a servi de référence interne pour la normalisation.

Dosage d'immunoprécipitation de l'ARN (RIP)

Pour le dosage RIP, les cellules Caco-2 ont été récoltées, rincées au PBS, puis incubées sur de la glace pendant 15 min dans 200 µL de tampon de lyse RIP supplémenté avec des inhibiteurs de protéase et d'ARNase. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à 16 000 × g pendant 10 min à 4 °C, et 10 µL de chaque surnageant ont été conservés comme témoin d'entrée. Pour l'immunoprécipitation, 40 µL de billes magnétiques Protéine A/G ont été agitées avec 5 µg d'anticorps anti-Ago2 ou d'IgG normal dans 200 µL de tampon de lavage RIP pendant 30 min à température ambiante. Après trois lavages avec 500 µL de tampon de lavage RIP, 100 µL de la suspension de billes ont été mélangés à 100 µL de lysat, ajustés à un volume final de 1 mL avec le tampon de lavage RIP, puis incubés toute la nuit à 4 °C sous agitation. Les billes ont ensuite été lavées cinq fois avec 500 µL de tampon de lavage RIP et resuspendues dans 150 µL du même tampon. La digestion des protéines a été réalisée en ajoutant 15 µL de protéinase K (20 mg/mL) et 15 µL de SDS à 10 %, suivie d'une incubation à 55 °C pendant 30 min sous agitation. Le surnageant a été récupéré, puis l'ARN a été isolé à l'aide du réactif d'extraction et précipité toute la nuit. L'enrichissement de NEAT1 et de miR-29b-3p a ensuite été évalué par RT-qPCR.

Analyse de la localisation subcellulaire

Les cellules Caco-2 ont été séparées en fractions nucléaire et cytoplasmique à l’aide du réactif commercial de séparation nucléocytoplasmique référencé, conformément aux instructions du fabricant. L’ARN total a été extrait de ces deux composants, et la distribution de NEAT1 dans le noyau et le cytoplasme a été détectée par RT-qPCR. L’étalonnage a été effectué à l’aide de U6 (principalement nucléaire) et de l’ARNm de GAPDH (principalement cytoplasmique) comme indicateurs de l’efficacité de la séparation.

Analyse statistique

Pour les échantillons sériques cliniques, une analyse de puissance (test t, d = 0,5, α = 0,05, puissance = 0,9) a indiqué qu'un minimum de 86 sujets par groupe était nécessaire. Afin de tenir compte d'éventuelles circonstances imprévues durant l'essai, 116 patients ont été inclus dans chaque groupe afin de détecter des différences cliniquement significatives. La normalité des données pour les variables continues a été évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk. Comme toutes les données continues étaient distribuées normalement (P > 0,05), des analyses paramétriques ont été appliquées. Les variables catégorielles ont été analysées à l'aide du test du chi-deux. Les expériences cellulaires comprenaient six réplicats biologiques indépendants, avec cinq réplicats techniques pour chaque réplicat biologique. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Les comparaisons entre deux groupes à variables continues ont été effectuées à l'aide du test t de Student, tandis que les comparaisons entre plusieurs groupes ont été analysées par une ANOVA à un facteur suivie du test a posteriori de Tukey. La significativité statistique a été définie comme P < 0,05.

Résultats

Expression de NEAT1 et valeur diagnostique

Par rapport au groupe témoin sain (HC), les niveaux d'expression de NEAT1 chez les patients atteints du SII-D étaient nettement plus élevés (P < 0,0001 ; Figure 1A). La surface sous la courbe (AUC) de NEAT1, telle qu'indiquée par la courbe ROC (courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur), était de 0,867 (IC 95 % : 0,821–0,913). Sa spécificité était de 75,9 %, tandis que sa sensibilité était de 84,5 % (Figure 1B). Cela suggère qu'une expression anormale de NEAT1 dans le sérum des patients atteints du SII-D pourrait servir de biomarqueur diagnostique nouveau pour cette affection.

En outre, les données cliniques des patients des groupes sain et IBS-D ont été comparées. Les résultats n'ont montré aucune différence significative entre les deux groupes concernant l'âge, le sexe ou d'autres caractéristiques (P > 0,05). Cependant, des différences significatives ont été observées pour le HADS, les selles et la forme des selles (P < 0,0001, Tableau 2). En ce qui concerne la fréquence des douleurs abdominales, 69 patients présentaient des symptômes pendant ≥ 5 jours, soit 59,48 % des cas. En ce qui concerne la gravité des douleurs abdominales, 72 patients avaient un score ≥ 5, soit 62,07 % (Tableau 2). Cela signifie que les patients atteints d'IBS-D se distinguent nettement du groupe témoin par leurs symptômes. Étant donné l'association clinique entre l'élévation de NEAT1 et les symptômes d'IBS-D, nous avons ensuite étudié l'impact fonctionnel de NEAT1 sur l'intégrité de la barrière intestinale à l'aide d'un modèle cellulaire Caco-2 traité par des LPS.

Effets de faibles niveaux de NEAT1 sur les lésions de la barrière intestinale et les réponses inflammatoires dans les cellules Caco-2 traitées par le LPS

Pour modéliser le dysfonctionnement de la barrière intestinale et l'inflammation de bas grade observés dans le SII-D, nous avons traité des cellules Caco-2 avec du LPS. Lorsque le LPS a été ajouté aux cellules, NEAT1 les niveaux étaient régulés à la hausse par rapport au groupe témoin. Après transfection avec si-NEAT1, le NEAT1 le niveau a été nettement diminué par rapport au groupe LPS + si-NC (P < 0.0001, Figure 2A). Le traitement par LPS a réduit la viabilité cellulaire et augmenté l'apoptose par rapport au groupe témoin. Après inhibition de NEAT1, la viabilité cellulaire a augmenté et le taux d'apoptose a diminué par rapport au groupe LPS + si-NC (P < 0.001; Figure 2B, C). Après avoir inhibé NEAT1, la TEER réduite par le LPS a été significativement restaurée (P < 0.0001, Figure 2D). Le LPS a diminué l'expression des ARNm de ZO-1 et occludine, et une expression accrue de la claudine-2 par rapport aux témoins, tandis que NEAT1 l'extinction a inversé ces modifications (P < 0.001, Figure 2E- G). Le traitement par le LPS peut déclencher une réponse inflammatoire dans les cellules. Les niveaux des facteurs pro-inflammatoires TNF-α, IL-6, IL-8 et IL-1β dans les cellules étaient plus élevés que dans le groupe témoin. Après l'extinction de NEAT1, la teneur en facteurs pro-inflammatoires dans les cellules était significativement réduite par rapport au groupe si-NC (P < 0.0001, Figure 3A-D). Cela suggère que les faibles niveaux de NEAT1 réduisent la dysfonction de la barrière intestinale induite par le LPS et les réponses inflammatoires, et que NEAT1 peut contribuer à la progression du SII-D.

Liaison directe de NEAT1 et effets sur le miR-29b-3p dans les cellules Caco-2

Dans les cellules Caco-2, NEAT1 se trouve principalement dans le cytoplasme (Figure 4A). Les sites de liaison de NEAT1 et de miR-29b-3p ont été prédits par la base de données ENCORI. Sur cette base, nous avons conçu les séquences WT-NEAT1 et MUT-NEAT1 (Figure 4B). Les résultats de l'essai DLR ont indiqué que les mimiques de miR-29b-3p réduisaient l'activité enzymatique de WT-NEAT1 par rapport au contrôle négatif (mimic NC), tandis que les inhibiteurs augmentaient cette activité par rapport au contrôle négatif (inhibitor NC). En revanche, aucun des traitements n'a eu d'influence sur MUT-NEAT1 (P < 0,0001, Figure 4C). L'essai de précipitation de l'ARN lié aux protéines (RIP) a révélé que NEAT1 et miR-29b-3p étaient nettement plus abondants dans la fraction anti-Ago2 par rapport au groupe anti-IgG, indiquant une interaction spécifique entre les deux (P < 0,0001, Figure 4D). Ces résultats indiquent que NEAT1 se lie spécifiquement à miR-29b-3p. Par ailleurs, le niveau de miR-29b-3p était notablement diminué chez les patients atteints de SII-D par rapport au groupe témoin sain (HC) (P < 0,0001, Figure 4E). L'AUC de sa courbe ROC était de 0,856 (IC à 95 % : 0,808–0,905), avec une sensibilité de 89,7 % et une spécificité de 71,6 % (Figure 4F). Une analyse de corrélation de Pearson a révélé une corrélation inverse entre les niveaux de NEAT1 et l'expression de miR-29b-3p (r = -0,744, P < 0,0001, Figure 4G).

Effets d'une faible expression de NEAT1 sur les lésions de la barrière intestinale dans les cellules Caco-2 traitées à la LPS et sur les niveaux de miR-29b-3p

Dans les cellules Caco-2 traitées par le LPS, l'expression de miR-29b-3p était notablement diminuée par rapport au groupe témoin. La transfection avec le si-NEAT1 a augmenté les niveaux de miR-29b-3p, tandis que la transfection avec l'inhibiteur de miR-29b-3p a de nouveau réduit les niveaux de miR-29b-3p (P < 0,0001, Figure 5A). L'extinction de NEAT1 a augmenté la viabilité cellulaire et diminué l'apoptose, et ces effets ont été abolis par l'inhibiteur de miR-29b-3p (P < 0,01, Figure 5B,C). La réduction induite par le LPS du TEER a été restaurée par l'extinction de NEAT1, et cette restauration a de nouveau été empêchée par l'inhibiteur de miR-29b-3p (P < 0,0001, Figure 5D). Le traitement par le LPS a entraîné une diminution de l'expression des ARNm de ZO-1 et d'occludine et une augmentation de l'expression de l'ARNm de claudine-2 par rapport au groupe témoin. Après l'extinction de NEAT1, les niveaux de miR-29b-3p ont augmenté, les niveaux d'ARNm de ZO-1 et d'occludine ont augmenté, et les niveaux d'ARNm de claudine-2 ont diminué par rapport au groupe LPS + si-NC. Après l'inhibition de miR-29b-3p, les niveaux d'ARNm de ZO-1 et d'occludine ont diminué, et les niveaux d'ARNm de claudine-2 ont augmenté par rapport au groupe LPS + si-NEAT1 + inhibiteur NC (P < 0,001, Figure 5E-G). NEAT1 (principalement le sous-type cytoplasmique NEAT1_1) agit comme une éponge pour miR-29b-3p. L'extinction de NEAT1 libère miR-29b-3p, ce qui entraîne indirectement une surexpression de ZO-1 et d'occludine et une sous-expression de claudine-2, atténuant ainsi la perturbation de la barrière induite par le LPS. Ces résultats suggèrent que, dans ce modèle, miR-29b-3p régule positivement l'expression de ZO-1 et d'occludine et régule négativement celle de claudine-2, et que les effets de l'extinction de NEAT1 sont médiés, au moins en partie, par miR-29b-3p.

Nous avons en outre examiné les niveaux d'expression des protéines des jonctions serrées à l'aide d'une analyse par immunobuvardage. Comme illustré dans la Figure 5H, l'extinction de NEAT1 a augmenté l'expression réduite par le LPS de ZO-1 et de l'occludine, et a supprimé l'expression de la claudine-2 par rapport au groupe LPS + si-NC. Toutefois, une co-transfection avec un inhibiteur de miR-29b-3p a atténué l'effet protecteur de l'extinction de NEAT1 par rapport au groupe LPS + si-NEAT1 + inhibiteur NC. Ces résultats confirment que l'extinction de NEAT1 restaure l'expression des protéines des jonctions serrées, au moins en partie en régulant à la hausse miR-29b-3p, améliorant ainsi la fonction de la barrière intestinale.

Effets de faibles niveaux de NEAT1 sur l'inflammation intestinale dans les cellules Caco-2 traitées par le LPS et sur l'expression de miR-29b-3p

Dans les cellules Caco-2 traitées à l’endotoxine (LPS), le LPS a déclenché une réponse inflammatoire. Les niveaux des facteurs pro-inflammatoires TNF-α, IL-6, IL-8 et IL-1β étaient significativement plus élevés que dans le groupe témoin. Après l’extinction de NEAT1, les niveaux de miR-29b-3p ont augmenté, tandis que les niveaux des facteurs pro-inflammatoires ont diminué de manière significative par rapport au si-NC. Après l’inhibition de miR-29b-3p, les niveaux des facteurs inflammatoires ont de nouveau augmenté (P < 0,0001, Figure 6A-D). Ainsi, l’extinction de NEAT1 supprime la libération de cytokines inflammatoires, du moins en partie, en régulant positivement miR-29b-3p.

Ces résultats indiquent que les niveaux de NEAT1 sont anormalement élevés dans le sérum des patients atteints du SII-D et que NEAT1 présente une aire sous la courbe (AUC) élevée pour distinguer les patients atteints du SII-D des témoins sains. Sur le plan mécanistique, NEAT1 se lie directement à miR-29b-3p et le piège dans le cytoplasme. Dans des modèles cellulaires et des expériences de restauration fonctionnelle, l'extinction de NEAT1 a augmenté l'expression de miR-29b-3p, amélioré la survie cellulaire et la résistance transépithéliale (TEER), réduit l'apoptose et atténué la libération de cytokines pro-inflammatoires. Ces découvertes confirment l'hypothèse selon laquelle NEAT1 régule négativement l'intégrité de la barrière intestinale en inhibant miR-29b-3p, et suggèrent que le ciblage de NEAT1 pourrait constituer une stratégie diagnostique et thérapeutique potentielle pour le SII-D.

Disponibilité des données :

Les données brutes à l'origine des figures et des tableaux sont fournies en tant que Fichier supplémentaire 1 (classeur de données brutes) et Fichier supplémentaire 2 (images de western blot non modifiées).

Figure 1. Expression et valeur diagnostique de NEAT1 chez les patients atteints de SII-D. (A) Niveaux d'expression de NEAT1 dans le sérum de témoins sains (TS, n = 116) et de patients SII-D (n = 116), mesurés par RT-qPCR ; (B) Analyse de la courbe ROC de NEAT1 pour distinguer les patients SII-D des témoins sains. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type (n = 116 par groupe). **** P < 0,0001. Abréviations : SII-D = syndrome de l'intestin irritable avec diarrhée ; ROC = caractéristique de fonctionnement du récepteur. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Figure 2. Effet de NEAT1 sur les lésions de la barrière intestinale induites par le LPS dans les cellules Caco-2. (A) La transfection par le si-NEAT1 réduit les niveaux de NEAT1 induits par le LPS ; (B) Viabilité cellulaire mesurée par test CCK-8 à 0, 24, 48 et 72 h. L'extinction de NEAT1 améliore la viabilité cellulaire ; (C) Taux d'apoptose déterminé par cytométrie en flux avec coloration Annexin V-FITC/PI. L'inhibition de NEAT1 diminue les taux d'apoptose ; (D) Résistance électrique transepithéliale (TEER) mesurée dans des monocouches de Caco-2. L'inhibition de NEAT1 augmente la TEER cellulaire ; (E-G) Niveaux d'expression des ARNm de (E) ZO-1, (F) occludine et (G) claudine-2 mesurés par RT-qPCR. L'extinction de NEAT1 augmente l'expression des ARNm de ZO-1 et d'occludine, et diminue les niveaux d'ARNm de claudine-2. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type à partir de six expériences indépendantes (n = 6 par groupe). *** P < 0,001 ; **** P < 0,0001, LPS comparé au témoin, LPS + si-NEAT1 comparé à LPS + si-NC. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Figure 3. Effet de l'extinction de NEAT1 sur la libération de cytokines pro-inflammatoires induite par le LPS dans les cellules Caco-2. (A-D) Concentrations de (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 et (D) IL-1β dans les surnageants de culture cellulaire mesurées par ELISA. L'extinction de NEAT1 réduit les niveaux de TNF-α, IL-6, IL-8 et IL-1β induits par le LPS. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type à partir de six expériences indépendantes (n = 6 par groupe). **** P < 0,0001, LPS comparé au témoin, LPS + si-NEAT1 comparé à LPS + si-NC. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 4. Interaction directe de NEAT1 et association avec miR-29b-3p. (A) Localisation subcellulaire de NEAT1 dans les cellules Caco-2 déterminée par fractionnement nucléocytoplasmique (U6 : témoin nucléaire, GAPDH : témoin cytoplasmique). NEAT1 se trouve principalement dans le cytoplasme ; (B) Séquences de liaison prévues de type sauvage (WT) et mutantes (MUT) de NEAT1 pour miR-29b-3p issues de la base de données ENCORI ; (C) Le test DLR a confirmé la relation de liaison entre NEAT1 et miR-29b-3p ; (D) La technique RIP a validé la relation de liaison entre NEAT1 et miR-29b-3p. Les données présentées dans les graphiques A, C et D correspondent à la moyenne ± écart-type obtenue à partir de six expériences indépendantes (n = 6 par groupe). (E) Niveaux d'expression sériques de miR-29b-3p chez des sujets témoins en bonne santé (HC, n = 116) et chez des patients atteints de SII-D (n = 116) ; (F) Courbe ROC de miR-29b-3p permettant de distinguer les patients atteints de SII-D des témoins sains ; (G) Analyse de corrélation de Pearson entre les niveaux de NEAT1 et de miR-29b-3p chez les patients atteints de SII-D. NEAT1 est négativement corrélé à l'expression de miR-29b-3p (r = -0,744, P < 0,0001). Les données du graphique E correspondent à la moyenne ± écart-type (n = 116 par groupe). **** P < 0,0001. Abréviations : WT = type sauvage ; MUT = mutant ; DLR = test du double rapport luciférase ; RIP = immunoprécipitation de l'ARN. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.

Figure 5. Effets de l’extinction de NEAT1 sur la fonction de la barrière intestinale dans les cellules Caco-2 traitées par le LPS et sur le miR-29b-3p. (A) L’extinction de NEAT1 augmente les niveaux de miR-29b-3p, tandis que la transfection avec des inhibiteurs de miR-29b-3p réduit l’expression de miR-29b-3p. (B) Viabilité cellulaire mesurée par le test CCK-8. De faibles niveaux de NEAT1 améliorent la viabilité cellulaire en augmentant le miR-29b-3p ; (C) Taux d’apoptose déterminé par cytométrie en flux. De faibles niveaux de NEAT1 réduisent le taux d’apoptose en augmentant le miR-29b-3p ; (D) De faibles niveaux de NEAT1 augmentent la résistance électrique transepithéliale (TEER) des cellules en élevant le niveau de miR-29b-3p ; (E-G) Expression des ARNm de (E) ZO-1, (F) occludine et (G) claudine-2. De faibles niveaux de NEAT1 augmentent l’expression de ZO-1 et d’occludine et réduisent l’expression de l’ARNm de claudine-2 en renforçant le miR-29b-3p. (H) Images représentatives de western blot montrant l’expression protéique de ZO-1, occludine, claudine-2 et GAPDH dans les conditions de traitement indiquées. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type à partir de six expériences indépendantes (n = 6 par groupe). ** P < 0,01 ; *** P < 0,001 ; **** P < 0,0001, LPS par rapport au témoin, LPS + si-NEAT1 par rapport à LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibiteur par rapport à LPS + si-NEAT1 + inhibiteur NC. Abréviation : miR-inhibiteur = inhibiteur de miR-29b-3p ; TEER = résistance électrique transepithéliale. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 6. Effets de l'extinction de NEAT1 sur l'inflammation dans les cellules Caco-2 traitées par le LPS et sur le miR-29b-3p. (A-D) Concentrations de (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-8 et (D) IL-1β dans les surnageants de culture cellulaire mesurées par ELISA. De faibles niveaux de NEAT1 réduisent la teneur en TNF-α, IL-6, IL-8 et IL-1β dans le surnageant cellulaire en augmentant le miR-29b-3p. Les données sont exprimées comme moyenne ± ÉT provenant de six expériences indépendantes (n = 6 par groupe). **** P < 0,0001, LPS par rapport au témoin, LPS + si-NEAT1 par rapport à LPS + si-NC, LPS + si-NEAT1 + miR-inhibiteur par rapport à LPS + si-NEAT1 + inhibiteur NC. Abréviation : miR-inhibiteur = inhibiteur du miR-29b-3p. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Gène	Séquence des amorces
NEAT1 sens	5’-GTGGCTGTTGGAGTCGGTAT-3’
NEAT1 antisens	5’-TAACAAACCACGGTCCATGA-3’
ZO-1 sens	5’-GCCGCTAAGAGCACAGCAA-3′
ZO-1 antisens	5’-TCCCCACTCTGAAAATGAGGA-3’
Occludine sens	5’-ATGGCAAAGTGAATGACAAGCGG-3’
Occludine antisens	5’-CTGTAACGAGGCTGCCTGAAGT-3’
Claudine-2 sens	5’-GTGACAGCAGTTGGCTTCTCCA-3’
Claudine-2 antisens	5’-GGAGATTGCACTGGATGTCACC-3’
miR-29b-3p sens	5’-GCTCTAGATCAGTTACAGAAAGACCACGA-3’
miR-29b-3p antisens	5’-GCTCTAGATAGTGTCCATGCACGGACC-3’
GAPDH sens	5’-CCAGGTGGTCTCCTCTGA-3’
GAPDH antisens	5’-GCTGTAGCCAAATCGTTGT-3’
U6 sens	5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’
U6 antisens	5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

Tableau 1 :  Séquences des amorces.

Indicateur	Groupe témoin (N=116)	Groupe IBS-D (N=116)	P
Âge, années
< 40	63	54	0,293
≥ 40	53	62
Sexe
Homme	64	66	0,895
Femme	52	50
Tabagisme
NON	58	53	0,599
OUI	58	63
Consommation d'alcool
NON	63	58	0,599
OUI	53	58
HADS, score
< 8	96	26	< 0,0001
≥ 8	20	90
Mouvements intestinaux, nombre/jour
< 4	103	51	< 0,0001
≥ 4	13	65
Forme des selles, score de Bristol
< 5	87	25	< 0,0001
≥ 5	29	91
Fréquence de la douleur abdominale, nombre de jours
< 5	/	47	/
≥ 5	/	69
Intensité de la douleur abdominale, score
< 5	/	44	/
≥ 5	/	72

Tableau 2 : Comparaison des caractéristiques démographiques et cliniques entre les témoins sains et les patients atteints de SII-D. Les valeurs sont exprimées en nombre de participants pour chaque groupe (n = 116/groupe). Les différences entre les groupes ont été évaluées à l’aide du test du chi-deux. Abréviation : HADS = échelle hospitalière d’anxiété et de dépression ; IBS-D = syndrome de l’intestin irritable avec diarrhée.

Fichier supplémentaire 1 : Données brutes à la base des figures et des tableaux. Ce fichier contient les données numériques brutes utilisées pour produire les résultats quantitatifs présentés dans Figure 1, Figure 2, Figure 3, Figure 4, Figure 5, et Figure 6, et les données démographiques/cliniques résumées dans Tableau 2.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Images brutes des immunotransferts. Ce fichier contient les images brutes des immunotransferts pour ZO-1, l'occludine, la claudine-2 et la GAPDH correspondant au panneau représentatif d'immunotransfert montré dans la Figure 5H.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Le SII-D est un trouble fonctionnel courant du système gastro-intestinal. Son mécanisme pathologique n'a pas encore été entièrement élucidé. Ces dernières années, les ARNl, en tant que molécules clés de la régulation épigénétique, ont montré un fort potentiel dans le domaine du diagnostic et du traitement des maladies. L'ARNl NEAT1 a été étudié dans diverses pathologies, telles que le cancer colorectal²⁴, le gliome²⁵ et l'infarctus du myocarde²⁶. De nombreuses études ont montré que NEAT1 participe à la régulation des réponses inflammatoires¹³, de la prolifération cellulaire²⁷ et de l'intégrité de la barrière intestinale²⁸. Toutefois, l'expression spécifique de NEAT1 dans le SII-D, sa valeur clinique et les mécanismes régulateurs sous-jacents au SII-D n'ont pas encore été explorés en profondeur.

NEAT1 est surexprimé dans diverses affections inflammatoires, telles que la pneumonie²⁹, l'arthrose³⁰, la rhinite³¹ et le sepsis³². Nos résultats sont conformes à ceux rapportés dans ces études : l'expression de NEAT1 est significativement augmentée chez les patients atteints de SII-D. Cela suggère qu'elle pourrait être associée à l'apparition du SII-D. Actuellement, le diagnostic du SII-D repose principalement sur les critères symptomatiques de Rome IV, et aucun biomarqueur de laboratoire objectif n'est disponible. Bien que ces critères se soient révélés efficaces dans la recherche et dans de nombreux contextes cliniques, ils présentent encore des limites, notamment une certaine subjectivité, un chevauchement des symptômes avec d'autres maladies et des retards diagnostiques. Une analyse supplémentaire par courbe ROC indique que NEAT1 possède une valeur diagnostique relativement bonne chez les patients atteints de SII-D. Les niveaux d'expression sérique de NEAT1 permettent de distinguer efficacement les patients atteints de SII-D des témoins sains, avec une AUC de 0,867 ainsi qu'une sensibilité et une spécificité élevées. Cela suggère que NEAT1 pourrait constituer un outil prometteur pour compléter les critères de Rome IV dans le diagnostic ou servir de nouveau marqueur diagnostique pour le SII-D. Par exemple, chez les patients présentant des douleurs abdominales chroniques et des modifications des habitudes intestinales, des taux élevés de NEAT1 pourraient permettre une évaluation plus sûre lorsque les résultats du biomarqueur sont pris en compte conjointement avec les critères de Rome IV. Cela facilite une initiation précoce d'un traitement ciblant les symptômes et évite des examens invasifs inutiles. En revanche, chez les patients dont les résultats du biomarqueur sont normaux mais qui répondent aux critères de Rome IV, une surveillance plus étroite est justifiée afin d'exclure d'autres maladies organiques. Par conséquent, l'intégration de ces biomarqueurs dans la pratique clinique devrait améliorer la précision et l'efficacité du diagnostic, bien qu'une validation prospective en milieu clinique reste nécessaire.

Les symptômes cliniques ressentis par les patients atteints de SII-D pourraient être liés à une fonction altérée de la barrière intestinale³³. Cette fonction est principalement assurée par la structure des jonctions serrées (TJ) entre les cellules épithéliales intestinales, les protéines ZO-1 et occludine jouant un rôle important^34,35. ZO-1 participe au maintien de la barrière mécanique et de la perméabilité de l'épithélium muqueux³⁶. L'occludine est principalement responsable de la formation des jonctions serrées entre les cellules, essentielles au maintien de leur fonction barrière³⁷. La protéine de jonction serrée claudine-2 joue un rôle important dans la formation des canaux paracellulaires, entre autres fonctions³⁸. Chez les patients atteints de SII-D, les niveaux de ZO-1 et d'occludine sont généralement réduits, tandis que la claudine-2 est augmentée, la barrière intestinale est endommagée et la perméabilité accrue. Cette étude a montré qu'un abaissement de NEAT1 augmentait la résistance transépithéliale (TEER) du modèle cellulaire in vitro, ce qui soutient un effet délétère de NEAT1 sur la barrière intestinale dans ce modèle. Au niveau moléculaire, l'inhibition de l'expression de NEAT1 a entraîné un rebond significatif des niveaux d'expression des ARNm des protéines clés des jonctions serrées, ZO-1 et l'occludine, tandis que l'expression de la claudine-2 diminuait. Cela suggère que NEAT1 pourrait réguler négativement l'expression des protéines des jonctions serrées, perturbant ainsi la barrière physique de l'épithélium intestinal et augmentant sa perméabilité. En fin de compte, cela peut conduire au phénomène de « intestin perméable ». De plus, l'inflammation chronique de bas grade, largement présente dans le SII-D, constitue un facteur important aggravant les lésions de la barrière³⁹. De nombreuses études ont confirmé que les ARNl non codants peuvent agir comme des nœuds régulateurs clés dans les voies de signalisation inflammatoire⁴⁰. Nos résultats sont cohérents avec ces observations. L'abaissement de NEAT1 réduit significativement la libération des cytokines pro-inflammatoires TNF-α, IL-6, IL-8 et IL-1β induite par le LPS. Ce mécanisme est très similaire au rôle pro-inflammatoire de NEAT1 observé dans d'autres modèles inflammatoires, indiquant qu'au cours du SII-D, il pourrait exister un cercle vicieux inflammation-lésion de la barrière-inflammation, dans lequel NEAT1 jouerait un rôle central.

Les microARN (miARN) constituent une autre classe importante de facteurs impliqués dans la régulation des maladies. Le miARN-29b-3p est faiblement exprimé dans diverses réponses inflammatoires cellulaires induites par le LPS.^41,42. Conformément à la plupart des études, nous avons constaté que les niveaux de miR-29b-3p étaient nettement diminués dans le sérum des patients atteints de SII-D et présentaient une forte corrélation négative avec NEAT1 surexpression. Nous avons en outre montré que NEAT1 se lie directement à miR-29b-3p et l'absorbe dans le cytoplasme dans ce modèle. L'expérience de sauvetage fonctionnel a en outre montré que NEAT1 affecte la viabilité et l'apoptose des cellules Caco-2, ainsi que les niveaux de ZO-1, occludine, et l'ARNm de la claudine-2, au moins en partie par l'intermédiaire du miR-29b-3p, et influence finalement l'intégrité de la barrière intestinale. Notamment, nos données indiquent que, dans le contexte d'un dysfonctionnement de la barrière intestinale associé au SII, les niveaux de miR-29b-3p sont positivement corrélés avec ZO-1 et les niveaux d'occludine. Cette régulation positive pourrait être indirecte ; par exemple, le miR-29b-3p pourrait supprimer la transcription de protéines des jonctions serrées en ciblant leurs répresseurs transcriptionnels, levant ainsi la répression et favorisant l'expression de ZO-1 et l'occludine. Cette hypothèse est également appuyée par des études antérieures ayant rapporté que le miR-29b-3p joue un rôle protecteur dans les conditions inflammatoires en ciblant des régulateurs négatifs de la fonction barrière⁴².

Cependant, les gènes cibles par lesquels le miR-29b-3p régule l'expression des ARNm de ZO-1 et de l'occludine nécessitent des investigations supplémentaires afin de compléter le réseau ceRNA, ce qui constitue une limite de notre étude actuelle. De plus, notre étude présente d'autres limitations : premièrement, il s'agissait d'une étude monocentrique avec une taille d'échantillon relativement petite (seulement 116 patients atteints de SII-D ont été inclus). La valeur diagnostique clinique de NEAT1 doit encore être validée par des études de cohortes prospectives à grande échelle et multicentriques. Deuxièmement, cette étude repose principalement sur des analyses d'association clinique et sur des modèles cellulaires in vitro. À l'avenir, des modèles animaux seront nécessaires pour confirmer le rôle de cet axe in vivo. Troisièmement, le réseau précis des gènes cibles en aval du miR-29b-3p impliqué dans la pathogenèse du SII-D n'a pas encore été entièrement élucidé. Les études futures devraient se concentrer sur : (1) la validation de la valeur diagnostique de NEAT1 et du miR-29b-3p chez les patients atteints de SII-C et de SII-M ; (2) l'évaluation de l'efficacité thérapeutique d'interventions ciblant NEAT1 dans des modèles animaux ; et (3) l'élucidation du mécanisme moléculaire précis par lequel le miR-29b-3p régule les protéines des jonctions serrées. De tels efforts faciliteront la traduction clinique de nos résultats.

En conclusion, NEAT1 est fortement exprimé chez les patients atteints de SII-D et présente une bonne valeur diagnostique dans ce groupe. De faibles niveaux de NEAT1 peuvent favoriser la viabilité cellulaire, réduire l'apoptose, atténuer les lésions de la barrière intestinale et supprimer les réponses inflammatoires en augmentant les niveaux de miR-29b-3p dans les cellules Caco-2 traitées par le LPS. L'axe NEAT1/miR-29b-3p offre une nouvelle perspective sur les mécanismes physiopathologiques complexes du SII-D. NEAT1 pourrait servir de biomarqueur diagnostique potentiel pour le SII-D, et l'axe NEAT1/miR-29b-3p pourrait représenter une cible thérapeutique potentielle pour cette affection.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques 24 puits	Corning	CLS3524	Pour la mise en culture des cellules
Plaques 96 puits	Corning	CLS3599	Pour la mise en culture des cellules dans les tests CCK-8
Kit d'apoptose Annexine V-FITC/PI	Invitrogen	V13242	Pour la détection des taux d'apoptose
Anticorps monoclonal anti-AGO2	Proteintech	67934-1-Ig	Pour l'immunoprécipitation des complexes d'ARN liés à Ago2
Anticorps anti-Claudine-2	Invitrogen	32-5600	Anticorps primaire, dilution 1:1000
Anticorps anti-GAPDH	Cell Signaling Technology	5174	Anticorps primaire, dilution 1:5000 ; contrôle de chargement
Anticorps anti-IgG humain	Proteintech	10284-1-AP	Utilisé comme contrôle négatif pour le test RIP
Anticorps anti-Occludine	Abcam	ab31721	Anticorps primaire, dilution 1:500
Anticorps anti-ZO-1	Proteintech	21773-1-AP	Anticorps primaire, dilution 1:1000
Cellules Caco-2	SUNNCELL	SNL-068	Pour la construction de modèles de barrière épithéliale intestinale
Kit CCK-8	Solarbio	CA1210	Kit de test de prolifération cellulaire
Chloroforme	Sigma-Aldrich	C2432	Pour la séparation des phases lors de l'extraction d'ARN
Milieu DMEM	Gibco	11965092	Pour la culture cellulaire
Kit d'essai Dual-Luciferase Reporter	ThermoFisher	16186	Pour la détection de l'activité luciférase
Kit ELISA (pour IL-1β)	R&D Systems	DY201	Pour la détection de protéines cibles dans les surnageants de culture cellulaire
Kit ELISA (pour IL-6)	R&D Systems	D6050B	Pour la détection de protéines cibles dans les surnageants de culture cellulaire
Kit ELISA (pour IL-8)	R&D Systems	NBP3-28022	Pour la détection de protéines cibles dans les surnageants de culture cellulaire
Kit ELISA (pour TNF-α)	R&D Systems	DTA00D	Pour la détection de protéines cibles dans les surnageants de culture cellulaire
Substrat chimiluminescent amélioré (ECL)	Thermo Fisher	32106	Pour la visualisation des bandes protéiques
Éthanol (75 %)	Sigma-Aldrich	459844	Pour le lavage du culot d'ARN
Sérum de veau fœtal (FBS)	Gibco	10099141	Pour la culture cellulaire
Cytomètre en flux	Beckman Coulter	B53002	Pour la détection des taux d'apoptose
Anticorps secondaires conjugués à la peroxydase	Cell Signaling Technology	7074	Catalysent la production d'un signal chimiluminescent à partir de substrats ECL
Isopropanol	Sigma-Aldrich	1133502500	Pour la précipitation de l'ARN
Lipofectamine 3000	ThermoFisher	L3000015	Réactif de transfection
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma-Aldrich	L2880	Pour induire la construction du modèle cellulaire
Lecteur de microplaques	BioTek	Epoch 2	Pour la détection de l'absorbance des échantillons dans des plaques 96 puits
Micropipette spectrophotomètre Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000C	Pour déterminer la concentration et la pureté de l'ARN
Lait écrémé en poudre	Coolaber	CN7861	Pour le blocage des membranes (solution à 5 %)
Kit PARIS	Thermo Fisher	AM1921	Pour la fractionnement nucléocytoplasmique
Pénicilline–Streptomycine	Gibco	15140122	Pour la résistance à la contamination lors de la croissance cellulaire
Kit d'essai de protéines BCA Pierce	Thermo Fisher	23225	Pour la détermination des concentrations en protéines
Vecteur pmirGLO Dual-Luciferase	Promega	E1330	Vecteur de gène rapporteur double luciférase
Kit de réactifs PrimeScript RT	Takara	RR047A	Pour la transcription inverse de l'ARN en ADNc
Membrane PVDF	Millipore	IPVH00010	Pour le transfert des protéines après électrophorèse SDS-PAGE
Appareil de PCR quantitative en temps réel avec fluorescence	Applied Biosystems	4365464	Pour la détection des gènes cibles
Solution de lyse RIPA (avec inhibiteurs de protéases)	Thermo Fisher	89901	Pour l'extraction totale des protéines à partir des cellules
Kit d'immunoprécipitation de protéines liant l'ARN	Sigma-Aldrich	17-701	Test d'immunoprécipitation de protéines liant l'ARN (RIP) utilisant des billes magnétiques A/G
Réactifs SDS-PAGE (gel 10 %)	TargetMol	C0189	Pour la séparation des protéines selon leur masse moléculaire
Master mix SYBR Green	Thermo Fisher	4309155	Pour utilisation dans les tests PCR
Mesureur de résistance transépithéliale (Volt-Ohm Mètre)	Millipore	MERS00002	Mesureur de résistance transmembranaire, évaluation de l'intégrité monocouche
Chambres Transwell	Corning Costar	CLS3413	Pour la culture de monocouches cellulaires et la mesure de la résistance transépithéliale (TEER)
Réactif TRIzol	Invitrogen	15596026CN	Pour l'extraction totale d'ARN