Association de l’ARNC1 sérique CASC11 avec la gravité des blessures et l’inflammation dans les lésions de la moelle épinière

Résumé

Chez les patients atteints de lésions de la moelle épinière (LME), la régulation à la hausse du CASC11 est associée à la gravité de la blessure. In vitro, la régulation à la baisse du CASC11 a atténué l’apoptose et l’inflammation, suggérant une association avec l’axe miR-130b-5p/SPP1 . Ces résultats suggèrent le rôle potentiel de CASC11 en tant que candidat biomarqueur dans la pathogenèse des LME.

Résumé

La lésion de la moelle épinière (LME) est un traumatisme sévère du système nerveux central. Cette étude monocentrique, observationnelle et in vitro , a étudié le potentiel diagnostique de CASC11 et son mécanisme de régulation possible dans les LM à l’aide d’échantillons sérumiques cliniques et de modèles cellulaires stimulés par des lipopolysaccharides. Les niveaux de CASC11, miR-130b-5p et SPP1 ont été mesurés par réaction en chaîne quantitative de polymérases en temps réel (RT-qPCR). Les fonctions cellulaires et les relations de ciblage ont été évaluées via le kit de comptage cellulaire 8 (CCK-8), la cytométrie en flux, le western blot, le test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA), le rapporteur dual-luciférase et les tests d’immunoprécipitation ARN (RIP). CASC11 était fortement exprimée dans les LME et associée à l’inflammation comme biomarqueur diagnostique potentiel. Dans les cellules PC-12 traitées au lipopolysaccharide (LPS), le silence de CASC11 a atténué l’activité cellulaire supprimée, l’apoptose et l’inflammation, qui ont été inversées par l’inhibiteur de miR-130b-5p. Ces résultats suggèrent que le CASC11 est associé à la sévérité des LME, tandis que les données in vitro indiquent son implication dans les réponses inflammatoires et apoptotiques via les axes CASC11/miR-130b-5p/SPP1 . Cette étude est limitée par sa conception à centre unique et l’absence de validation in vivo .

Introduction

La lésion de la moelle épinière (LME) désigne un trouble systémique temporaire ou permanent résultant de lésions de la moelle épinière causées par des forces ou maladies externes, entraînant une altération des fonctions motrices, sensorielles, réflexes et des systèmes nerveux^{autonome 1,2}. Les patients rencontrent fréquemment des déficits et complications fonctionnels physiques tout au long de leur vie, imposant d’importantes souffrances et fardeaux aux individus et aux familles. L’étiologie de la LM est globalement classée en origines traumatiques et non^{traumatiques 3}. Les blessures traumatiques, principalement résultant de fractures de la colonne vertébrale dues à des forces externes telles que les accidents de la route, les chutes de hauteur et les incidents liés au sport, représentent un défi croissant dans la prise en charge clinique de la LM⁴. Par contre, la cascade de lésions secondaires initiée après la blessure primaire, en particulier la dysrégulation de la réponse inflammatoire et l’apoptose neuronale, sont considérées comme des facteurs cruciaux contribuant à la détérioration continue de la fonction neurologique. Des études récentes ont mis en lumière le rôle crucial de la neuroinflammation, de la régénération et de la récupération fonctionnelle dans la physiopathologie et la réparation de la LM⁵. En tant que réponse secondaire centrale, la neuroinflammation joue un double rôle dans le processus de lésion et de réparation des tissus. Compte tenu de la capacité régénérative limitée de la moelle épinière lésée, une approche thérapeutique synergique combinant traitement anti-inflammatoire, transplantation cellulaire, rééducation et interventions moléculaires est^nécessaire. Bien qu’une gamme de stratégies diagnostiques et thérapeutiques aient été mises en place pour les LME, la pratique clinique actuelle repose principalement sur des examens^{d’imagerie.} Cependant, ces techniques sont limitées par leurs exigences élevées en équipements avancés, des exigences strictes pour les patients et des coûts financiers^{importants 8}. Par conséquent, il existe un besoin urgent et non satisfait d’un biomarqueur de laboratoire pratique, précis et non invasif. L’identification d’un tel marqueur permettrait un diagnostic précoce des LME sans perturber les protocoles de traitement conventionnels, facilitant ainsi le développement d’interventions thérapeutiques plus rapides et efficaces.

L’ARN long non codant (ARNnc) représente une catégorie majeure de molécules d’ARN fonctionnelles qui, bien qu’elles manquent de potentiel codant pour les protéines, sont essentielles à un large éventail de fonctions biologiques, notamment la régulation de l’inflammation et de l’apoptose9. Les LncRNA agissent comme des éponges moléculaires pour les microARN (miARN), empêchant ainsi ces miARN de se lier et de faire taire leurs ARNm^{ciblés 10}. Par exemple, l’ARNlnc MAGI2-AS3 médie le miR-223-3p pour accélérer la cicatrisation de la^{fracture 11}. Cibler le réseau d’ARNlnc OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 présente une approche thérapeutique prometteuse pour améliorer la récupération dans la SCI¹². CASC11, caractérisé par un transcript de 872 pb situé sur le chromosome 8q24.21, est reconnu comme une molécule à expression déréglée dans divers cancers humains¹³. CASC11 présente une expression positive chez les patients atteints d’ostéoporose postménopausée et a la capacité de différencier les personnes atteintes des témoins^{sains 14}. De plus, CASC11 présente un schéma de régulation à la hausse et un potentiel thérapeutique similaires chez les patients^{fracturés 15}. Sur la base de ces rapports, CASC11 pourrait réguler les réponses inflammatoires et l’activité cellulaire. Malgré ces observations, le schéma d’expression et le rôle biologique de CASC11 dans les LM restent totalement inconnus. Étant donné que l’hyperinflammation et l’apoptose sont des facteurs majeurs de la LME secondaire, nous avons émis l’hypothèse que CASC11 pourrait être un biomarqueur candidat et un facteur régulateur dans la LME. Cette étude a étudié l’association clinique et le potentiel de biomarqueurs de CASC11 dans les LM en analysant les cohortes de patients et les modèles cellulaires in vitro (Figure 1). De plus, nous avons exploré un mécanisme moléculaire possible de CASC11, y compris son rôle potentiel dans la modulation de la réponse inflammatoire après la LME.

Protocole

Inscription des matières

Les patients atteints d’un traumatisme épidien aigu (n = 300) traités à l’hôpital de janvier 2023 à mai 2025 ont été sélectionnés et classés dans le groupe des lésions complètes de la moelle épinière (CSCI) (grade A, n = 98), le groupe lésions incomplètes de la moelle épinière (ISCI) (grades B, C et D ; n = 95) et le groupe fonction neurologique normale (NNF) (grade E, n = 107) selon l’échelle d’incapacité de l’American Spinal Injury Association (classification AIS). Pour les patients du groupe NNF, des preuves radiologiques de LME, telles que l’œdème, une contusion ou une compression, ont été confirmées par imagerie par résonance magnétique (IRM), mais aucun déficit sensoriel ou moteur n’a été démontré. 90 autres participants en bonne santé recrutés durant la même période ont été sélectionnés comme groupe témoin. Les critères d’inclusion étaient : (1) diagnostic de LME confirmé par imagerie (IRM ou scanner), conformément aux directives de gestion clinique^{établies 16} ; (2) traumatisme subi dans les 24 heures précédant l’admission à l’hôpital ; et (3) participants adultes disposant de données cliniques complètes. Les critères d’exclusion étaient : (1) antécédents de chirurgie antérieure liée à une fracture ou une LME ; (2) maladie coronarienne sévère ou cardio-pulmonaire importante ; (3) lésions crâniocérébrales aiguës sévères ; et (4) tumeurs malignes, maladies cardiovasculaires/cérébrovasculaires ou maladies immunitaires. L’approbation de cette étude a été obtenue par le Comité d’éthique du Quatrième Hôpital Populaire de Shenzhen, et le consentement éclairé a été obtenu des sujets. Les procédures utilisées dans cette étude respectaient les principes de la Déclaration d’Helsinki.

Collection de spécimens

Des échantillons de sang veineux (5 mL) ont été prélevés sur les participants à l’admission à l’aide de tubes séparateurs sérumiques dans les 24 heures suivant la blessure. Le sang a été laissé coaguler à température ambiante pendant 30 minutes, puis centrifugé à 3 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Le sérum surnageant a été soigneusement séparé, aliquoté dans des microtubes sans RNase, et stocké à -80 °C jusqu’à une analyse ultérieure.

Culture cellulaire et induction LPS

Les cellules de phoeochromocytome de rat (PC-12) et les cellules microgliales murines (BV-2) ont été cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco, complété avec 10 % de sérum fœtal bovin à 37 °C. Pour établir des modèles de lésion inflammatoire in vitro , les cellules PC-12 et BV-2 ont été exposées au lipopolysaccharide (LPS) à des concentrations de 0, 1, 5 et 10 μg/mL pendant 12 h¹⁷. Chaque concentration a été testée sur trois réplications biologiques indépendantes.

RT-qPCR

L’ARN total a été isolé à partir des échantillons à l’aide d’un protocole d’extraction phénol-chloroforme, suivi d’une précipitation avec de l’isopropanol. La pureté de l’ARN a été évaluée par spectrophotométrie, et des échantillons avec un rapport A_{de 260/280 nm} dans la plage 1,8–2,1 ont été utilisés pour l’analyse en aval. L’ARN a été transcrit en ADNc inversement selon le protocole du kit de transcription inverse, et l’ADNc résultant a été utilisé comme modèle pour les réactions RT-qPCR avec un prémix SYBR Green sur un instrument PCR. La glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) a été utilisée comme gène de référence pour les ARNm CASC11 et SPP1 , et un petit ARN nucléaire (U6) a été utilisé comme gène de référence pour miR-130b-5p. Pour les échantillons sériques, du cel-miR-39 synthétique a été injecté dans le sérum avant l’extraction d’ARN afin de contrôler les variations dans la récupération de l’ARN. Les amorces étaient les suivantes : CASC11 avant 5'-ACCCTATGGAGAACCAGAC-3' et arrière 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAAT-3' ; miR-130b-5p avant 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3' et 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3' ; et SPP1 ARNm en avant 5'-GTTAAACAGGCTGATTCTGG-3' et en arrière 5'-CATGGTCATCATCATCTTCA-3'. L’expression a été calculée à l’aide de la méthode ^2-ΔΔCt . Chaque réaction RT-qPCR a été réalisée en triple réplication technique avec trois réplications biologiques.

Transfection

Le silence CASC11 (si-CASC11), le mimétique/inhibiteur miR-130b-5p, le plasmide de surexpression SPP1 (ov-SPP1) et leurs témoins négatifs respectifs (NC) ont été synthétisés et transfectés dans les cellules PC-12 et BV-2 à l’aide d’un réactif de transfection. L’efficacité de la transfection a été évaluée 48 heures après la transfection dans des réplications biologiques tripliquées.

Essai de prolifération et d’apoptose

Pour l’essai de viabilité cellulaire, les cellules ont été ensemées en plaques de 96 puits à 5 × 10³ cellules par puits et cultivées pendant 24 heures pour permettre l’attachement. Après cette incubation, 10 μL de réactif CCK-8 ont été injectés dans chaque puits, suivis d’une incubation de 2 h à 37 °C. La densité optique était alors enregistrée à 450 nm avec un lecteur de microplaques. Pour la détection de l’apoptose, les cellules ont été détachées de trypsina, rincées deux fois avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS), puis suspendues dans un tampon de liaison jusqu’à une concentration finale de 1 × 10⁶ cellules/puits. Ensuite, 100 μL de la suspension ont été placés dans un tube de cytométrie à flux de 5 mL, suivis de l’ajout de 5 μL d’annexine V-FITC et de 5 μL de solution colorante d’iodure de propidium (PI). Les échantillons ont été délicatement mélangés et conservés pendant 15 minutes à température ambiante, protégés de la lumière. Un tampon de liaison a ensuite été ajouté à un volume supplémentaire final de 400 μL par tube, et les cellules apoptotiques ont été quantifiées par cytométrie en flux. Toutes les conditions ont été analysées à l’aide de trois répliques techniques dans trois expériences biologiques indépendantes.

Analyse d’activité à double luciferase

Les cibles en aval de CASC11 et miR-130b-5p ont été prédites via des sites de bioinformatique (lncRNASNP2 et TargetScan). Des fragments contenant les séquences complémentaires de type sauvage (wt) ou mutants (mut) ont été synthétisés et clonés en un vecteur rapporteur double luciférase pour construire des plasmides rapporteurs wt et mut. Les cellules PC-12 ont été ensemencées et co-transfectées avec le miR-130b-5p mimic/inhibiteur et les plasmides wt/mut construits à l’aide d’un réactif de transfection à base de lipides. Après 48 heures, l’activité de la luciférase a été quantifiée pour évaluer l’interaction. Chaque groupe se composait de trois répliques techniques et trois répliques biologiques.

Essai d’immunoprécipitation à ARN (RIP)

Le DEP a été réalisé à l’aide d’un kit d’immunoprécipitation de protéines liant l’ARN. Les cellules ont été lysées avec un tampon de lyse et incubées avec un anticorps anti-Ago2 ou un anticorps IgG normal. Les complexes ARN-protéine ont été enrichis à l’aide de billes magnétiques. Après lavage, les protéines liées étaient retirées et l’ARN immunoprécipité isolé. Les niveaux d’enrichissement de CASC11 et miR-130b-5p ont été quantifiés par RT-qPCR. Chaque groupe se composait de trois répliques techniques et trois répliques biologiques.

Tache occidentale

Des lysats protéiques ont été préparés à partir de cellules PC-12 et BV-2 à l’aide d’un tampon de lyse cellulaire, et la teneur totale en protéines a été mesurée à l’aide d’un test BCA. Pour chaque échantillon, 30 μg de protéines étaient chargés sur des gels SDS-PAGE à 12 % et transférés dans les membranes PVDF après séparation électrophorétique. Les membranes ont été bloquées pendant 2 heures à température ambiante dans du lait écrémé à 5 % dilué dans le TBST, puis incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre Bcl-2, Bax, caspase-3 clivée et GAPDH à une dilution de 1:1 000. Après lavage, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à HRP pendant 1 heure à température ambiante. Les signaux protéiques ont été analysés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image, et les densités de bandes ont été utilisées pour évaluer l’expression des protéines liées à l’apoptose. Les expériences Western blot comprenaient trois répliques biologiques, avec trois répliques techniques pour chaque groupe.

ELISA

Les concentrations des cytokines inflammatoires TNF-α, IL-1β et IL-6 dans le sérum du patient ainsi que dans les surnatant cellulaires PC-12 et BV-2 ont été quantifiées à l’aide de kits ELISA selon les instructions du fabricant. Les échantillons ont été incubés dans des puits pré-enduits, et des anticorps de détection ont été ajoutés pour une incubation ultérieure. Des conjugués enzymatiques ont été ajoutés et incubés. Après lavage, des substrats ont été ajoutés pour le développement des couleurs, et les réactions ont été arrêtées. L’absorbance a été mesurée à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques et convertie en concentrations de facteurs inflammatoires selon la courbe standard fournie. Chaque test ELISA a été réalisé en triple réplication technique sur trois réplications biologiques indépendantes.

Analyse statistique

Les variables continues étaient rapportées comme la moyenne ± l’écart-type (DE), et les variables catégorielles étaient présentées comme des nombres et des pourcentages (n, %). Des comparaisons entre deux groupes ont été réalisées à l’aide du test t de Student. Pour les comparaisons impliquant plus de deux groupes, une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) a été appliquée, suivie du test post-hoc de Tukey. La capacité de CASC11 à discriminer entre groupes cliniques a été évaluée à l’aide de l’analyse de la courbe de caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC). Les associations entre deux variables ont été examinées par l’analyse de corrélation de Pearson. Pour les expériences cellulaires, chaque groupe contenait trois réplications biologiques indépendantes, et chaque mesure était répétée dans trois réplications techniques. La signification statistique a été définie comme P < 0,05.

Résultats

Données de base des sujets

Les caractéristiques de base des patients des groupes témoin, NNF, ISCI et CSCI sont présentées dans le tableau 1. L’analyse statistique n’a révélé aucune différence significative entre groupes dans les variables, telles que le sexe, l’âge, l’indice de masse corporelle (IMC), l’étiologie de la blessure et la durée de la blessure (P > 0,05). Des différences significatives ont été observées en...

Discussion

L’LM est une affection dévastatrice du système nerveux central qui entraîne fréquemment des déficits significatifs de la sensation, du contrôle moteur et de la fonction autonome, diminuant ainsi considérablement la qualité de vie et le pronostic à long terme du^{patient 18}. Les patients peuvent présenter une déficience fonctionnelle et une perte sensorielle après un traumatisme vertébral, et des examens d’imagerie (comme l’IRM) peuvent être utilisés pour évaluer la ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BCA protein assay kit	Yeasen, China	P0010
CCK-8 solution	Sigma-Aldrich, USA	96992
Dual-luciferase reporter vector	Promega, USA	E133A	vecteur pmirGLO
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	ATCC, Manassas, VA, USA	30-2002
ELISA kit for IL-1β	R&D Systems, USA	DY401
ELISA kit for IL-6	R&D Systems, USA	HS600B
ELISA kit for TNF-α	R&D Systems, USA	DTA00C
Fetal bovine serum	Gibco, Grand Island, NY, USA	10099141
Flow cytometer	BD FACSCalibur, USA	FACS101
Software d'analyse d'image	NIH, Bethesda, MD, USA	version 1.44p	logiciel ImageJ
Isopropanol	Beijing Chemical Factory, China	32064
Reagent de transfection à base de lipides	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	L3000008	Lipofectamine 3000
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich, USA	L2880
Tampon de lyse	Beyotime, China	P0013D	tampon de lyse RIPA
Microplate reader	Reagen, China	RNE90002
PC-12 et cellules BV-2	ATCC, Manassas, USA
Reagent phénol-chloroforme	Thermo, USA	15596026	reagent Trizol
Kit de transcription inverse	Takara, Japan	RR047A	PrimeScript RT Kit
Kit d'immunoprécipitation de protéines liant l'ARN	Millipore, USA	17-700	Magna RIP Kit
Microtubes sans RNase	Axygen, Corning, NY, USA	MCT-150-C-S
Tubes séparateurs de sérum	Terumo, Tokyo, Japan	VP-AS109K60
Software d'analyse statistique	San Diego, USA	version 9.0	GraphPad Prism
SYBR Green premix	Takara, Japan	RR420A	SYBR Premix Ex Taq