Un système microfluidique pour modéliser le dysfonctionnement endothélial sous contrainte physiologique de cisaillement pulsatile combinée et hyperglycémie oscillatoire

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer et exploiter un système microfluidique qui expose les cellules endothéliales à une hyperglycémie oscillatoire synchronisée et à une contrainte de cisaillement pulsatile. Cette approche fournit un modèle in vitro physiologiquement pertinent pour étudier le dysfonctionnement endothélial diabétique. Ce protocole permet une mesure quantitative du stress oxydatif et des réponses des cellules endothéliales.

Abstract

Le dysfonctionnement endothélial dans les complications vasculaires diabétiques implique des interactions complexes entre des troubles métaboliques, en particulier le glucose oscillatoire (OG) et la contrainte de cisaillement pulsatile (PSS). Bien que ces facteurs aient été étudiés isolément, les modèles conventionnels restent limités à un taux statique de glucose élevé ou à un flux laminaire simplifié, manquant de capacité à imiter le couplage spatiotemporal intégré observé dans le vasculaire diabétique. En utilisant une plateforme microfluidique programmable, ce protocole offre une plateforme précieuse pour étudier les effets intégrés de l’hyperglycémie oscillatoire synchronisée et du PSS physiologique sur les cellules endothéliales. Ce protocole vise à modéliser le dysfonctionnement endothélial dans des conditions métaboliques et mécaniques couplées physiologiquement pertinentes. L’utilisation d’une puce polydiméthylsiloxane (PDMS) combinée à un système de contrôle basé sur la pression permet une modulation précise et indépendante des formes d’onde d’écoulement et des profils de concentration de glucose. La fidélité hémodynamique du système est validée par la vélocimétrie par image microparticulaire (Micro-PIV), tandis que la réponse cellulaire est caractérisée quantitativement par la surveillance des niveaux d’espèces réactives intracellulaires d’oxygène (ROS) et de la viabilité cellulaire. Les résultats représentatifs démontrent que le PSS physiologique atténue efficacement la lésion oxydative induite par l’OG. Cet effet est démontré par une réduction des niveaux de ROS intracellulaires et une amélioration de la viabilité cellulaire dans des conditions de stimulation combinées. Selon la question de recherche, des paramètres tels que les schémas de contrainte de cisaillement, les fréquences d’oscillation du glucose et les géométries des canaux peuvent être ajustés. Cette méthode sert d’outil polyvalent pour les études mécanistes des voies mécanobiologiques et le dépistage de médicaments pour les interventions thérapeutiques dans les maladies vasculaires diabétiques.

Introduction

Le dysfonctionnement endothélial est un événement critique précoce dans le développement des complications vasculaires diabétiques, provoqué à la fois par des troubles métaboliques et des forces hémodynamiques^{anormales 1,2}. Les niveaux d’OG, plutôt que l’hyperglycémie soutenue seule, sont de plus en plus reconnus comme des inducteurs puissants du stress oxydatif et de la signalisation inflammatoire dans les cellules endothéliales, conduisant à des lésions vasculaires et à une homéostasie^{altérée 3,4,5<....}

Protocol

Déclaration d’éthique :

REMARQUE : Tous les réactifs, dispositifs et logiciels utilisés dans ce protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Fabrication de puces microfluidiques

1. Utilisez un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) pour concevoir la structure de la puce microfluidique (Largeur x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Figure 1A) et fabriquer le moule maître SU-8 via une entreprise commerciale.
2. Mélangez l’agent de durcissement PDMS et le prépolymère à un ratio de 10:....

Results

Validation micro-PIV du champ d’écoulement dans le canal microfluidique
La figure 1D offre un aperçu de la plateforme microfluidique utilisée pour étudier les réponses endothéliales à la stimulation métabolique et mécanique couplée. Le système intègre une puce microfluidique PDMS à canal droit avec un module de contrôle de flux à pression alimenté, permettant l’application de la condition OG ainsi que du PSS physiologique. Une stratégie .......

Discussion

Le système microfluidique décrit ici offre une plateforme robuste et physiologiquement pertinente pour étudier les effets intégrés de l’OG et du PSS sur la fonction des cellules endothéliales. L’avantage principal de cette méthode réside dans sa capacité à contrôler et à découpler précisément les stimuli mécaniques et biochimiques au sein d’un microenvironnement défini. Contrairement aux cultures statiques conventionnelles qui ne disposent pas de forces hémodynamiques ou aux modèles anim.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 % de trypsine-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Dissociation cellulaire
Seringue de 1 mL	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1 mL	Injecter le liquide
Plat de culture de 60 mm	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Culture cellulaire
90°F Connecteur en acier inoxydable incliné	Luoyang Mayer Trading Co., Ltd.	1,3 mm	Dispositif d’étanchéité d’adaptateur
Logiciels AutoCAD	Autodesk	RRID : SCR_014981	Logiciels de conception assistée par ordinateur
Bouteille en verre boronisé	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Double passe 100 mL	Réservoir
Calcein-AM/PI Kit	Beyotime	BYT-c2015	Coloration
Incubateur cellulaire	ESCO	Esco CelMate	Culture cellulaire
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Coloration
D-glucose	Sigma Aldrich	47249	Glucose
D-mannitol	Macklin	M813423	Équilibre de la pression osmotique
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	Logiciel d’analyse PIV
Sérum fœtal bovin (FBS)	Gibco	14190-094	Moyen
Fibronectine	Sigma Aldrich	F-2006	Adhérence cellulaire
Microparticules fluorescentes	Thermo Scientific	G0100	Micro-PIV
Habilet de verre	Citotest Scientific Co., Ltd.	#1	Puce microfluidique
DMEM à taux élevé de glucose	Solarbio	12100	Moyen
Caméra à grande vitesse	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Micro-PIV
ImageJ	NIH	RRID : SCR_003070	Logiciels de traitement d’image
Microscope à fluorescence inversée	Olympe	IX73	Viabilité cellulaire
Microscope à fluorescence inversée	Olympe	IX83	Observation et acquisition
DMEM à faible glucose	Solarbio	31600	Moyen
Origine	OriginLab	RRID : SCR_014212	Logiciels d’analyse et de graphisme des données
PDMS	Dow Inc.	184	Puce microfluidique
Pénicilline/streptomycine (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Moyen
Solution tampon phosphate (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Culture cellulaire
Nettoyeur plasma	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Puce microfluidique
Système de contrôle de pression programmable	Elvesys	OB1 MK4	Contrôle de débit
Tube en silicone	Nankin Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
Moule maître SU-8	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	Puce microfluidique
Contrôleur de vannes	Elvesys	MUX Wire V3	Contrôle de débit