Article de méthode

Une plateforme microfluidique pour étudier la précipitation microbienne des oxydes métalliques dans des milieux poreux

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DOI :

10.3791/71047

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12 juin 2026

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1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente un système microfluidique pour étudier la précipitation microbienne des minéraux d’oxyde de manganèse. La formation biominérale est mesurée in situ par microscopie optique et analyse d’image. Cette approche peut être adaptée pour étudier la précipitation d’autres minéraux biogéniques distinctivement colorés dans des environnements poreux.

Résumé

Les micro-organismes précipitent couramment des nanoparticules d’oxyde métallique dans les sols, les sédiments et d’autres milieux poreux écologiquement pertinents. Cependant, la formation et la réactivité des oxydes de manganèse (Mn) et de fer (Fe) restent peu caractérisées dans des environnements physiquement complexes. Bien que les systèmes de laboratoire puissent incorporer des milieux poreux comme substrat, ils nécessitent un échantillonnage destructeur et ne sont pas facilement adaptés à des analyses à l’échelle des pores. La nature dynamique mais inaccessible des milieux poreux exige donc la capacité de résoudre les précipitations minérales médiées par les microbes in situ et en temps réel. Pour combler cet écart, une plateforme microfluidique est développée pour évaluer la précipitation microbienne d’oxydes métalliques dans un espace poreux modèle. Cette plateforme est validée avec la bactérie oxydante de Mn Pseudomonas putida GB-1. Le développement du biofilm et la précipitation associée d’oxydes de Mn sont visualisés sous flux continu grâce à une microscopie en champ clair couleur en accéléré. Un algorithme de soustraction d’image est ensuite combiné avec des mesures de masse finale pour estimer le taux de précipitation d’oxyde de Mn. Cette approche fournit un outil permettant de tester systématiquement comment la précipitation microbienne des oxydes métalliques varie en réponse à l’évolution des conditions physiques et chimiques.

Introduction

Les minéraux d’oxydes métalliques jouent un rôle crucial dans le cyclebiogéochimique 1. Les oxydes de manganèse (Mn) et de fer (Fe) sont chargés négativement à pH circumneutre et absorbent facilement les métaux cationiques 2,3,4,5,6,7,8, régulant la disponibilité des micronutriments et la mobilité des contaminants dans la rhizosphère et la zone hyporhhéique. Ces minéraux influencent la stabilité et la dégradation de la matièreorganique 9,10,11,12, déterminant l’absorption du carbone par les plantes et les microbes du sol. Dans les systèmes conçus (par exemple, filtres de traitement de l’eau, zones humides construites), la précipitation d’oxydes métalliques est directement utilisée pour l’élimination du Mn ou du Fe et la dépollution des contaminantscoexistants 13,14,15,16,17. Ces oxydes métalliques se reconnaissent à leurs couleurs caractéristiques, qui vont de l’ocre au brun foncé enpassant par le noir 18,19.

La précipitation des oxydes métalliques est généralement facilitée par des micro-organismes dans un processus appelé biominéralisation 20,21,22. De nombreuses bactéries et champignons oxydants Mn synthétisent des oxydases et peroxydases multicuivre qui catalysent le transfert d’électrons de Mn(II) à Mn(III) et Mn(IV) dans des conditions aérobies, entraînant la précipitation de minéraux oxydés de Mn(III, IV) similaires àla birnessite 2,23,24. De plus, diverses bactéries oxydant le Fe oxydent enzymatiquement Fe(II) à Fe(III) dans des environnements circumneutres ou acides limités en oxygène, produisant des oxydes de Fe(II, III), notamment la ferrihydrite etla magnétite 25,26,27,28. Ces minéraux biogéniques précipitent à proximité des surfaces cellulaires et s’accumulent sur des polymères extracellulaires, des gaines et d’autres structures cellulaires, formant des assemblages microbeset minéraux 2,23,25,27,29,30.

Malgré l’omniprésence de la biominéralisation du Mn et du Fe dans des environnements complexes, les connaissances à l’échelle des pores font défaut. Les espaces poreux sont structurellement hétérogènes, présentant un écoulement préférentiel des fluides et un transport non uniforme des réactifs qui dictent la distribution des réactionsbiogéochimiques 31,32,33,34,35. De plus, l’activité microbienne peut générer des gradients géochimiques locaux qui favorisent ou limitent la biominéralisation, tandis que les fluctuations de la chimie des fluides poreux (par exemple, pH, oxygène dissous, potentiel redox) peuvent augmenter la précipitation minérale ou faciliter la dissolution34,35. Les études de biominéralisation du Mn et du Fe reposent généralement soit sur des conditions de batch bien mélangées 30,36,37,38,39,40 ou sur lescolonnes 41,42,43,44 pour quantifier la cinétique d’oxydation ou caractériser les précipités biominéraux. Cependant, les expériences en batch manquent de l’hétérogénéité spatiale inhérente aux systèmes poreux. Les colonnes contenant des milieux granulaires compacts offrent une architecture physique pertinente mais sont limitées dans leur utilité car elles nécessitent un échantillonnage destructeur à des moments statiques, ce qui arrête la progression de l’expérience et empêche des observations non perturbées à l’échelle des pores. Par conséquent, de nouvelles approches expérimentales sont nécessaires pour étudier la précipitation microbienne des oxydes métalliques dans des milieux poreux.

Les systèmes microfluidiques sont un outil permettant d’étudier les réactions biogéochimiques in situ et en temps réel. Les réacteurs microfluidiques peuvent être fabriqués rapidement et à faible coût grâce à des géométries reproductibles et personnalisables qui simulent des milieux poreux naturels ouidéalisés 45. Les dispositifs résultants sont optiquement transparents, facilitant la visualisation non destructive et la quantification des processus à l’échelle des pores, notamment la formation de biofilms 46,47,48,49, le développement de points chauds 50,51, la précipitation abiotiquede métaux 52,53 et la biominéralisation de la calcite 34,54,55,56. De plus, les systèmes microfluidiques permettent aux utilisateurs de contrôler et de varier systématiquement les conditions aux limites, notamment la concentration des métaux, la présence ou l’absence d’oxygène dissous, et le débit du fluide. Enfin, selon le matériau du substrat du réacteur, des mesures directes des interactions microbe-minéral-fluide peuvent être obtenues à l’aide de la spectroscopie aux rayons X, de Raman ou infrarouge57. Le développement d’une telle plateforme basée sur la microfluidique pour étudier la précipitation microbienne des oxydes métalliques offre ainsi une voie à de nouvelles recherches sur la formation et la réactivité des phases minérales Mn ou Fe qui entraînent le cycle du carbone, des nutriments et des contaminants dans des environnements poreux.

Ce travail utilise la biominéralisation du Mn comme étude de cas pour quantifier la précipitation microbienne des oxydes métalliques dans un environnement dynamique poreux. Le protocole suivant démontre comment fabriquer et inoculer un réacteur microfluidique avec Pseudomonas putida GB-1, une bactérie modèle connue pour oxyder Mn(II) en Mn(III, IV) à sa phase stationnaire de croissance58,59. À l’aide d’un système de contrôle de flux basé sur la pression, un milieu de croissance riche en nutriments et une solution de sel minimale sont injectés séquentiellement pour favoriser la formation de biofilms et induire respectivement la précipitation d’oxydes de Mn. Des images couleur en champ clair haute résolution de l’espace poreux microfluidique sont collectées à intervalles réguliers, capturant le contraste de couleur entre les biofilms GB-1 de P. putida et l’accumulation d’oxydes de Mn. À la fin de chaque expérience, tous les oxydes de Mn contenus dans le réacteur sont digérés, et la masse totale est mesurée par spectrométrie de masse plasma couplée inductivement (ICP-MS). Le taux de précipitation de l’oxyde de Mn est estimé en fonction du temps en intégrant ces mesures de masse finale avec un algorithme de soustraction d’image. Ce flux de travail peut être facilement adapté pour étudier d’autres organismes ou les processus de précipitation d’oxydes métalliques dans diverses conditions environnementales.

Protocole

REMARQUE : Ce protocole fait plusieurs hypothèses concernant les connaissances préalables des utilisateurs et l’instrumentation disponible. Tout d’abord, les utilisateurs doivent soit avoir accès à une salle blanche et être familiers avec les procédures de photolithographie pour fabriquer un moule microfluidique, soit acheter un moule commercial. Ensuite, les utilisateurs doivent connaître les méthodes de microbiologie de base, telles que l’utilisation de la technique aseptique, la préparation de solutions de stock et le striage des plaques. Les utilisateurs doivent également accéder à un autoclave, une microcentrifugeuse, un incubateur à shakers et un spectromètre de masse. Enfin, les utilisateurs doivent maîtriser la microscopie optique et l’analyse d’images.

1. Fabrication et assemblage de réacteurs microfluidiques

REMARQUE : Les réacteurs microfluidiques utilisés dans ce protocole sont conçus en AutoCAD avec une géométrie de grain de sable adaptée de Wang et al.55. Chaque moule produit six canaux réplicatifs avec un espace poreux de 15 mm × 10 mm, une porosité de 0,41 et un volume porologique de 2,3 μL. À l’exception du traitement par plasma, les réacteurs sont fabriqués dans une cabine à flux laminaire pour maintenir un environnement à faible teneur en poussière.

  1. Foncez les canaux microfluidiques dans le polydiméthylsiloxane (PDMS) à l’aide d’une lithographie souple.
    1. Dans un gobelet en plastique, pèser la base élastomère et l’agent de durcissement dans un rapport de 10:1 (ici, 25 g et 2,5 g, respectivement).
    2. À l’aide d’un couteau en plastique, mélangez soigneusement la base en élastomère et l’agent de durcissement pendant 10 minutes.
    3. Dégazez le PDMS dans la coupe à l’aide d’un dessicateur sous vide pendant 1 heure pour éliminer les bulles d’air.
    4. Versez le PDMS dans le moule et dégazez pendant 30 minutes pour éliminer tout air résiduel.
    5. Placez le moule sur une plaque chauffante et séchez pendant 3 heures à 95 °C.
    6. Une fois durci et refroidi, utilisez un scalpel pour découper le PDMS et décollez-le du moule.
    7. Sur un tapis de découpe, séparez les six canaux microfluidiques avec une lame de rasoir, en laissant 2 à 3 mm autour du bord de chaque canal. Percez les trous d’entrée et de sortie dans chaque canal avec un punch de biopsie.
    8. Couvrez les deux côtés de chaque canal microfluidique avec une bande de ruban transparent pour éviter l’accumulation de poussière et stockez dans une boîte de Petri de 100 mm.
  2. Un jour avant l’expérience, assemblez le réacteur microfluidique final avec du plasma d’air.
    1. Retirez le ruban transparent d’un canal microfluidique, puis rincez le PDMS et une barbe de couvercle en verre avec 70 % d’éthanol et séchez avec de l’azote comprimé.
      ATTENTION : L’éthanol est inflammable. Manipuler et stocker selon la fiche de sécurité.
    2. Placez le canal microfluidique et le couvercle face visible dans un nettoyant plasma. Évacuez la chambre pendant 1 minute, puis appliquez du plasma pendant 1 minute (18 W et ~0,5 torr).
    3. Retirez le canal microfluidique et la gaine de couverture du nettoyant plasma et placez la gaine de couvercle sur le PDMS, en tapotant doucement pour assurer la liaison. Conservez le réacteur assemblé dans une boîte de Petri de 100 mm toute la nuit.

2. Système de contrôle de flux microfluidique

REMARQUE : Un système modulaire d’Elveflow est utilisé pour faciliter l’injection séquentielle de fluide avec un minimum de perturbations de pression et de débit. Les composants du système comprennent un compresseur d’air, un régulateur de débit, une vanne de distribution, un capteur de débit, une crémaillère de réservoir de fluide (pour tubes coniques de 15 mL) et le logiciel Elveflow Smart Interface (ESI) (Figure 1). D’autres systèmes de contrôle de débit, tels que les pompes à seringues, peuvent être utilisés en mode infusion ou en mode prélèvement, avec des seringues ou des réservoirs dédiés pour chaque solution influente et une vanne séparatrice à faible volume mort pour faciliter l’injection séquentielle de fluide via une seule conduite de tuyau. Cependant, il convient de faire attention avec les pompes à seringue pour minimiser les fluctuations de pression qui pourraient déloger les biofilms.

figure-protocol-1
Figure 1 : Système de contrôle de débit et géométrie du réacteur microfluidique. Le système expérimental se compose d’un contrôleur de débit (1) relié par un tuyau pneumatique, (2) à une crémaillère réservoir de fluide, (3) d’une vanne de distribution pour fournir l’injection séquentielle de milieu de croissance (GMMn) et de solution saline (SSMn), (4), d’un capteur de débit (5) connecté au contrôleur de débit pour fournir un retour d’information en temps réel et d’ajustement du débit, (6) d’un tube PEEK d’un petit diamètre intérieur pour fournir une résistance fluidique, (7) d’un piège à bulles (8) en amont du réacteur microfluidique (9). Le schéma du système ne s’étalonnait pas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

  1. Installez et calibrez tout le matériel selon les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Le réservoir de fluide, la vanne de distribution et le capteur de débit sont installés à l’intérieur d’un incubateur de microscope conçu sur mesure pour maintenir l’expérience à 30 °C.
  2. Réglez le régulateur de pression du compresseur d’air à 3 bars et connectez la sortie du compresseur d’air à l’entrée du contrôleur de débit avec un tuyau pneumatique en polyuréthane.
  3. Fixez un filtre hydrophobe à la sortie du régulateur de débit pour éviter le reflux de fluide, puis connectez le contrôleur de débit à deux orifices d’entrée de la crémaillère de réservoir de fluide avec un tube pneumatique en polyéther polyuréthane à l’aide d’un collecteur et d’adaptateurs barbelés.
  4. Reliez la crémaillère du réservoir de fluide, la vanne de distribution et le capteur de débit avec la tubulure comme suit, en utilisant des raccords sans bride pour un tube extérieur de 1/16 de pouce de diamètre, sauf indication contraire.
    1. Reliez deux orifices de sortie de la crémaillère du réservoir de fluide aux deux premiers orifices d’entrée de la vanne de distribution avec 80 cm de tuyau intérieur en polytétrafluoroéthylène (PTFE) de 1/32 de diamètre intérieur (ID).
    2. Reliez le port de sortie de la vanne de distribution à l’orifice d’admission du capteur de débit avec 15 cm de tube PTFE à 500 μm diamètre et un raccord adaptateur.
    3. Fixez 60 cm de tube polyéther-éther cétone (PEEK) de 63,5 μm diamètre-diatrique (PEEK) à la sortie du capteur de débit à l’aide d’un adaptateur.
      REMARQUE : Pour les expériences nécessitant des débits différents, ajustez la longueur du tube PEEK selon les besoins afin d’assurer une résistance fluide suffisante pour assurer la stabilité de l’écoulement.
    4. Relie le tube PEEK à 10 cm de tube PTFE de 500 μm diamètre intérieur à l’aide d’un raccord à union.
    5. Fixez le tube en PTFE à l’entrée d’un piège à bulles microfluidiques équipé d’un filtre à membrane en PTFE (taille des pores ~10 μm).
    6. Fixez 75 cm de tube PTFE à 200 μm de diamètre intérieur au port de sortie du siphon à bulles pour créer une contre-pression afin d’éliminer efficacement les bulles. Ce tube se fixera au trou d’entrée du microfluidique réacteur.
  5. Avant chaque expérience, stériliser le système de contrôle de débit avec tous les tuyaux et matériels connectés en rinçant une solution d’eau de Javel à 1 % pour trois fois le volume du système (~4 h par conduite de tuyau à 7,0 μL·min-1), suivie d’une eau ultrapure stérile pour la même durée.
  6. Entre les expériences, nettoyez le système de contrôle de débit comme suit.
    1. Rincez la vanne de distribution et le capteur de débit en rinçant à 100 % d’isopropanol et d’eau ultrapure stérile pour éviter l’accumulation de résidus ou de précipités.
      ATTENTION : L’isopropanol est inflammable. Manipuler et stocker selon la fiche de sécurité.
    2. Autoclave : le piège à bulles.
    3. Remplacez le filtre à membrane à piège à bulles et le tube PTFE de 200 μm diamètre intérieur après chaque expérience pour éviter l’obstruction (filtre à membrane) ou la colonisation bactérienne (tubulure).

3. Médias expérimentaux et solutions

  1. Préparez un milieu liquide de bouillon Luria (LB, formulation Miller’s) en autoclavant 2,5 % de poudre dans de l’eau ultrapure à 121 °C pendant 20 minutes. Pour les plaques d’agar LB, autoclave de poudre 2,5 % LB et 1,5 % d’agar dans de l’eau ultrapure à 121 °C pendant 20 minutes, puis versez dans des boîtes de Petri de 100 mm (~20 mL par gamelle) et laissez refroidir jusqu’à ce que cela soit solide.
  2. À partir de solutions de stock stérilisées par filtre préparées avec l’American Chemical Society (ACS) ou de réactifs de qualité bactériologique dans de l’eau ultrapure, on obtient 30 mL de chacun des éléments suivants. La composition de la solution saline et du milieu de croissance est adaptée de Gehin et al.59.
    1. Préparer une solution saline sans Mn(II) (SS0) : 0,4 mM CaCl 2,2H 2O, 0,25 mM MgSO4,7H 2O, 0,25 mM Na2HPO4,2H 2O, 0,15 mMKH 2PO4, 1:2 Fe(III)-EDTA (20 μM FeCl3,6H 2O et 40 μM EDTA ajusté à pH 6,5 avec 1M NaOH), 10 mM de tampon HEPES (ajusté à pH 7,0 avec 1M NaOH), 5 mM (NH4)2SO4, et métaux traces (40 nM CuSO 4,5H2O, 273 nM ZnSO4,7H 2O, 84 nM CoCl2,6H 2O, 53,7 nM Na2MoO4,2H 2O) dans de l’eau ultrapure stérile.
    2. Préparer la solution salée avec Mn(II) (SSMn) : Identique à SS0 avec 50 μM MnCl 2,4H2O ajouté.
    3. Préparer un milieu de croissance sans Mn(II) (GM0) : Identique à SS0 avec 1,5 g· extrait de levure L-1 et 1,5 g· L-1 acide casamino ajouté.
    4. Préparer le milieu de croissance avec Mn(II) (GMMn) : Identique au GM0 avec 50 μM MnCl 2,4H2O ajouté.
      ATTENTION : Les solutions salines et les milieux de croissance contiennent des métaux présentant à la fois des risques pour la santé et pour l’environnement. Manipuler et stocker selon les fiches de sécurité.
  3. Préparez une solution acide contenant 40 mM d’acide oxalique dihydraté et 2 % d’acide nitrique dans de l’eau ultrapure pour la digestion des oxydes de Mn à l’intérieur du réacteur microfluidique.
    ATTENTION : L’acide oxalique dihydraté et l’acide nitrique sont corrosifs, et l’acide nitrique est un puissant oxydant. Manipuler et stocker selon les fiches de sécurité.
  4. Préparez une solution d’acide nitrique à 1 % dans de l’eau ultrapure pour diluer l’échantillon ICP-MS.

4. Culture bactérienne

REMARQUE : La culture bactérienne est réalisée par technique aseptique sur le plan de travail à l’aide d’un bec Bunsen. Les matériaux sont stériles sauf indication contraire. Les durées d’incubation sont spécifiques à P. putida GB-1 et peuvent devoir être ajustées pour d’autres micro-organismes.

  1. À partir d’une crosse à -80 °C, tracez P. putida GB-1 sur une plaque d’agar LB. Incubez la plaque pendant environ 20 heures à 30 °C pour permettre la croissance des colonies bactériennes.
  2. La veille de l’expérience, ajoutez 10 mL de médium LB à un tube conique de 50 mL et inoculez avec une colonie de plaques. Incubez la préculture LB dans un incubateur shaker à 30 °C et 180 tr/min pendant 16 heures pour atteindre la phase stationnaire.
  3. Après 16 h d’incubation, on applique 1 mL de préculture LB dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL et centrifuge pendant 1 minute à 8 000 x g pour pelleter les bactéries.
  4. Lavez l’aliquote trois fois pour retirer le milieu LB usé en jetant le surnageant, en resuspendant la pelote de cellule dans 1 mL de SS0, puis centrifugée pendant 1 minute à 8 000 x g. Resuspendez la dernière pellete dans 1 mL de SS0.
  5. Mesurez la densité optique (OD600) de la suspension cellulaire lavée dans une cuvette non stérile à l’aide d’un densimètre cellulaire. L’ODattendu de 600 pour P. putida GB-1 est de 3,6 à 3,8 à cette étape, donc une dilution au moins 5 fois en SS0 est nécessaire.
  6. Inoculez 20 mL de GM0 avec suspension à cellules lavées à un ODinitial de 600 de 0,01 dans une fiole Erlenmeyer de 50 mL. Incubez à 30 °C et 180 tr/min pendant 6 heures pour atteindre une phase exponentielle moyenne.

5. Expérience de biominéralisation

  1. Le matin de l’expérience, activez le système de contrôle de flux.
    1. Préchauffez l’incubateur à 30 °C.
    2. Verser 10 mL de GMMn et SSMn dans deux tubes coniques de 15 mL et relier les tubes à la crémaillère du réservoir de fluide. Flusher SSMn pour environ trois fois le volume système (~4 h à 7,0 μL·min-1), suivi de GMMn pour la même durée.
  2. Saturez le réacteur microfluidique préparé 5 h après inoculation de la culture à exponentielle moyenne.
    REMARQUE : La saturation et l’inoculation du réacteur sont réalisées par technique aseptique sur le plan de travail à l’aide d’un brûleur de Bunsen. Les matériaux sont stériles sauf indication contraire.
    1. Dégazez le réacteur dans un dessicateur à vide pendant 20 minutes.
    2. Pendant le dégazage, aspirez 1 à 2 mL de SS0 dans une seringue plastique de 3 mL, puis fixez une aiguille à pointe émoussée et 20 cm de tube tygon de 0,02 pouce d’angle intérieur. Appuyez sur le déboucheur de la seringue jusqu’à ce que le tube soit complètement saturé.
    3. Retirez le réacteur du dessécateur, puis fixez le tube au trou de sortie du réacteur avec une pince à épiler inclinée et saturez manuellement le réacteur avec la seringue jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme au trou d’entrée du réacteur.
    4. Fixez 20 cm de tuyau Tygon de 0,02 pouce d’intérieur au trou d’entrée du réacteur. Continuez à distribuer du SSMn dans le réacteur jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient éliminées (200–300 μL).
  3. Préparez l’inoculum du réacteur et inoculez le réacteur microfluidique.
    1. Retirez la culture à exponentiel moyen de l’incubateur shaker 6 h après l’inoculation et mesurez leDO 600. L’ODattendu 600 est de 1,6 à 1,8 à cette étape, donc une dilution 4 fois en SS0 est recommandée.
    2. Diluez la culture à exponence moyenne dans 2 mL de SSMn à un ODinitial de 600 de 0,005 dans un tube microcentrifuge de 2 mL. Inversez le tube plusieurs fois pour mélanger.
    3. Placez le tube d’entrée du réacteur dans le tube de la microcentrifuge, en veillant à ce qu’une goutte de liquide entre en contact avec l’inoculum afin d’empêcher l’entrée d’air dans le tube. Fermez partiellement le tube de la microcentrifuge et fixez le couvercle avec du ruban adhésif pour éviter toute contamination.
    4. Retirer 4 à 5 mL de SSMn dans une seringue étanche au gaz de 5 mL pour humidifier le canon, puis administrer jusqu’à ce qu’il reste 0,5 mL dans la seringue. Chargez la seringue dans une pompe à seringue.
    5. Retirez l’aiguille de la seringue en plastique et fixez-la à la seringue en verre, en veillant à ne pas piéger l’air dans le moyeu de l’aiguille.
    6. Inoculez le réacteur avec la pompe à seringue en retirant l’inoculum dans le réacteur pendant 20 minutes à un débit de 8,33 μL·min-1 (~70 volumes de pores).
    7. Après l’inoculation, coupez la pompe à seringue et laissez les bactéries se déposer et s’attacher pendant 1 heure sans écoulement.
    8. Après 1 heure, retirez la seringue de la pompe mais laissez-la connectée au tuyau de sortie.
  4. Connectez le réacteur microfluidique inoculé au système de contrôle du débit.
    1. Déplacez le réacteur et la seringue du laboratoire à l’incubateur de microscope.
    2. Sur l’étage du microscope, retirez le tube d’entrée du réacteur.
    3. Appuyez doucement sur le ventouse de la seringue pour créer une gouttelette au trou d’entrée du réacteur.
    4. Pliez manuellement le tube PTFE du système de contrôle de débit à angle droit (~1 cm de l’extrémité du tube) afin qu’il s’interface perpendiculairement à la surface du PDMS, minimisant ainsi les forces latérales et l’intrusion d’air dans le trou d’entrée du réacteur.
    5. Trempez l’extrémité du tube en PTFE dans une solution de diacrylate de polyéthylène glycol (PEG-DA) à 1 % pour humidifier l’extérieur hydrophobe du tube. Assurez-vous d’avoir une goutte de GMMn à l’extrémité du tube en PTFE, et fixez le tube au trou d’entrée du réacteur.
    6. Déconnectez la seringue et placez le tube de sortie dans un tube de microcentrifuge non stérile de 5 mL pour collecter l’effluent du réacteur.
    7. Réglez le débit à 1,33 μL·min-1 dans le logiciel du système de contrôle de débit. Mettre en place un programme pour fournir duMn GM pendant 15 h (~500 volumes de pores) afin de favoriser la formation de biofilms, suivi de SSMn pendant 28,5 h (~1 000 volumes pores) pour induire la biominéralisation du Mn.
  5. Montez le réacteur microfluidique dans l’insert de l’étage du microscope.
    REMARQUE : Un système d’irradiation ultraviolet-C (UVC) construit sur mesure, fixé à l’insert de l’étage du microscope, est utilisé pour atténuer la croissance bactérienne indésirable et la précipitation minérale en dehors de l’espace poreux microfluidique (Figure 2). Ce design est adapté de Ramos et al.60 et peut être contrôlé par un programme automatisé. Voir Fadely et al.61 pour plus de détails.
    1. Placez un cadre d’échantillon sous le réacteur pour la stabilité, puis montez rigidement le châssis et le réacteur dans l’insert de l’étage, en veillant à ce qu’ils soient complètement immobilisés.
    2. Fixez le tube en PTFE à l’insert de la scène avec un morceau de ruban adhésif pour empêcher le tube de se détacher du trou d’entrée du réacteur.
    3. Alignez les bras UVC à une distance de 3 mm du bord de l’espace poreux côté entrée et de 2 mm côté sortie afin de minimiser la diffusion de la lumière ultraviolette et des dommages au biofilm dans l’espace poreux.
      REMARQUE : Un alignement correct de l’UVC entraînera peu ou pas d’accumulation de biomasse dans la région d’entrée du réacteur (Figure 3A). Un alignement des bras UVC trop éloigné du bord d’entrée de l’espace poreux (Figure 3B) ou une absence d’irradiation (Figure 3C) entraîne des précipitations minérales en amont de l’espace poreux.
    4. Mettre en place un programme d’irradiation des réacteurs. Traiter les régions d’entrée et de sortie du réacteur pendant 5 minutes à t = 0 h pour inactiver les bactéries déposées lors de l’inoculation, puis traiter la région de sortie seulement pendant 5 minutes à t = 17,5 h pour inactiver les biofilms restants.

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Figure 2 : Système d’irradiation ultraviolet-C (UVC) construit sur mesure pour réacteurs microfluidiques. (A). Vue de dessus du système monté sur l’insert de l’étage du microscope montrant des bras articulés (bleus) avec des réseaux de diodes luminogènes UVC (LED) attachés (rectangles jaunes) et un réacteur microfluidique monté sur un cadre d’échantillon (petit rectangle gris). (B). Vue du bas du système montrant des LED UVC (carrés beige) intégrées dans les bras articulés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 3 : Effet de l’irradiation UVC sur la région d’entrée du réacteur microfluidique. (A). Région d’entrée du réacteur avec un traitement UVC de 5 minutes à t = 0 h montrant un alignement correct pour une élimination complète des biofilms indésirables. (B). Région d’entrée du réacteur avec un réseau UVC mal aligné, laissant des biofilms résiduels dans le trou d’entrée et à l’extérieur de l’espace poreux, permettant aux oxydes de Mn de précipiter en amont. (C). Région d’entrée du réacteur sans traitement UVC, entraînant une croissance importante de biofilms et des précipitations minérales. Un ombrage gris délimite l’espace poreux. La barre d’échelle est de 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

6. Microscopie optique en accéléré

REMARQUE : Un microscope à épifluorescence inversée Nikon Ti2 Eclipse équipé d’un appareil photo numérique (2304 x 2304 pixels par champ de vision), d’un moteur à lumière blanche, d’un objectif 4x (1,62 μm·pixel-1) et du logiciel NIS Elements est utilisé pour l’imagerie en champ clair couleur. D’autres microscopes optiques capables d’imagerie en couleur sont également adaptés. L’utilisation de l’imagerie couleur améliore la sensibilité à une faible masse d’oxyde de Mn. Si l’automatisation en accéléré n’est pas une option, les utilisateurs peuvent collecter les images manuellement et les posttraiter sous forme de série chronologique.

  1. Pour des images de haute qualité, effectuez les étapes suivantes d’alignement et de correction :
    1. Pour garantir un éclairage uniforme, ajustez manuellement l’alignement de Köhler en suivant les instructions du fabricant.
    2. Optimisez l’éclairage du champ clair pour éviter la sous-saturation ou la sursaturation de l’image (Fusion Pad > Couleur > Auto Brightness et Fusion Pad > Couleur > Auto White).
      REMARQUE : Il est préférable d’optimiser l’éclairage en champ clair une seule fois sur un réacteur qui contient déjà des biofilms et des oxydes de Mn, puis d’appliquer le même temps d’exposition et le même équilibre des couleurs à toutes les expériences ultérieures pour une illumination cohérente. Ici, on utilise un éclairage de 5 ms avec le rouge à 97,58 %, le vert à 44,76 % et le bleu à 100 %.
    3. Pour éviter les artefacts de quilting lors de l’acquisition d’images brodées de l’espace poreux microfluidique, appliquez une correction d’ombrage (Acquérir > panneau de correction d’ombrage).
  2. Définissez la coordonnée centrale de l’image assemblée (acquisition ND > XY).
  3. Configurez la zone de balayage de l’image assemblée (ici, 5 x 4 champs de vision) et appliquez un chevauchement de 1 % (acquisition ND > grande image).
  4. Configurez l’acquisition d’images couleur en champ clair avec l’objectif 4x (acquisition ND > λ).
  5. Configurez la fréquence d’imagerie avec des intervalles de 1 h pour 15 h (phase de croissance) et 0,5 h pour 28,5 h (phase de minéralisation) (acquisition ND > Time), puis exécutez le programme en accéléré.
    REMARQUE : La durée des phases de croissance et de minéralisation est spécifique à P. putida GB-1 et peut être ajustée selon les besoins pour d’autres micro-organismes.
  6. Une fois l’expérience terminée, exportez les images en format de fichier d’image balisé (TIFF) (panneau macro > exportez les images en TIFF).

7. Digestion acide et mesure de masse de Mn

REMARQUE : Un ICP-MS est utilisé pour mesurer la masse de Mn retenue dans le réacteur microfluidique, mais d’autres instruments, tels que les spectromètres d’émission optique (ICP-OES), sont également acceptables. Si les instruments d’analyse ne sont pas disponibles, des échantillons digérés à l’acide peuvent être envoyés à un laboratoire commercial.

  1. À la fin de l’expérience, retirez le réacteur de l’insert de l’étage du microscope et déconnectez les tubes d’entrée et de sortie.
  2. Prélever 1,5 mL de solution acide dans une seringue étanche au gaz de 5 mL (séparée de la seringue d’inoculation). Fixez une aiguille à pointe émoussée et 20 cm de tube PTFE de 1/32 pouce diamètre intérieur à la seringue et distribuez manuellement de l’acide jusqu’à ce qu’une gouttelette se forme à l’extrémité du tube.
  3. Sur le plan de travail, chargez la seringue dans une pompe à seringue et connectez le tuyau au trou d’entrée du réacteur, en veillant à ne pas piéger les bulles d’air, qui pourraient empêcher la solution acide d’imprégner tous les pores. Connectez 30 cm de tuyau PTFE de 1/32 de pouce intérieur intérieur au trou de sortie du réacteur et placez l’extrémité du tuyau de sortie dans un tube microcentrifuge de 2 mL.
  4. Injecter une solution acide dans le réacteur pendant 10 minutes à un débit de 100 μL·min-1.
  5. Après l’injection en solution acide, déconnectez l’aiguille à pointe émoussée de la seringue en verre. Remplissez une seringue plastique de 10 mL d’air et connectez-la à l’aiguille à pointe émoussée, puis distribuez manuellement tout l’air de la seringue pour évacuer l’acide restant du réacteur et du tube dans le tube de microcentrifuge de 2 mL.
    REMARQUE : Bien qu’un petit volume de solution acide puisse rester piégé dans l’espace poreux après l’injection d’air, il est négligeable par rapport au volume total injecté. Les utilisateurs travaillant avec des géométries à faible porosité peuvent envisager de rincer des volumes supplémentaires d’air pour éliminer les films de fluide et l’acide résiduel provenant de pores mal connectés.
  6. Diluez l’échantillon digéré dans 1 % d’acide nitrique selon la plage d’étalonnage ICP-MS. Ici, préparez une dilution de 100x (volume total de 5 mL) dans un tube conique de 15 mL.
  7. Mesurez la concentration de Mn dans l’échantillon dilué avec l’ICP-MS. Corrigez la concentration mesurée avec le facteur de dilution et le volume total de l’échantillon pour déterminer la masse de Mn retenue dans le réacteur.

8. Analyse d’image

REMARQUE : MATLAB est recommandé en raison de ses fonctions intégrées pour l’analyse d’images, qui sont incluses dans le texte. Cependant, d’autres outils comme ImageJ ou les bibliothèques d’analyse d’images de Python peuvent également être utilisés pour effectuer des analyses comparables. Les étapes clés de l’analyse d’image sont illustrées à la Figure 4. Tous les scripts d’analyse d’images sont fournis sous forme de fichiers supplémentaires (Fichier Supplémentaire 1, Fichier Supplémentaire 2 et Fichier Supplémentaire 3).

figure-protocol-4
Figure 4 : Flux de travail de soustraction d’image pour isoler les précipités d’oxydes de Mn. À partir d’images en champ clair couleur en accéléré, une image de référence (tref) (1) a été identifiée pour retirer l’intensité des biofilms de phase stationnaire sous-jacentes de toutes les images de points temporels ultérieurs (tn) (2) Des masques binaires de tous les tn ont été générés (3) et multipliés par tref (4) et le tn correspondant (5) pour capturer l’étendue biofilm-biominéral. Enfin, les tn masqués ont été soustraits du tref masqué (6). Les matrices corrigées d’intensité résultantes quantifient la diminution d’intensité (u.a.) due à l’accumulation d’oxyde de Mn à chaque pixel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

  1. Chargez un TIFF haute résolution de la géométrie de l’espace poreux microfluidique (exporté depuis AutoCAD) dans l’espace de travail pour l’utiliser comme masque de grain (imread).
  2. Redressez et enregistrez les images couleur en champ clair pour appliquer efficacement le masque de grain.
    1. Générez un binaire d’enregistrement de la première image de point temporel (t = 0 h).
      1. Chargez le TIFF de champ clair couleur dans l’espace de travail (imread (imread).
      2. Recadrez l’image légèrement plus grand que la taille de l’espace poreux (recrochage).
      3. Nettetez l’image pour améliorer la résolution des limites de grain (accentuation).
      4. Binariser l’image en utilisant un seuil adaptatif qui priorise les caractéristiques sombres (rgb2gray, adaptthresh avec polarité au premier plan = « sombre » et sensibilité ajustée selon les besoins, imbinariser, imcomplementar).
      5. Remplir les grains du binaire d’enregistrement résultant pour créer des caractéristiques solides (remplissage avec des « trous » spécifiés). Notez que tous les grains ne peuvent pas être remplis.
      6. Éroder le binaire d’enregistrement si nécessaire pour éliminer le bruit de fond, puis dilater pour remplacer les pixels perdus aux bords du grain (éroder, imdilater).
    2. Utilisez un algorithme d’enregistrement de transformation de caractéristiques invariante à l’échelle (SIFT) pour calculer la matrice de transformation nécessaire à aligner le binaire d’enregistrement au masque grain (detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d avec type de transformation = « affine »).
    3. Appliquez cette matrice de transformation au binaire d’enregistrement et à la première image de point temporel, puis superposez-les avec le masque de grain pour évaluer l’ajustement (déformation, imshowpaire).
    4. Si un mauvais alignement persiste après l’enregistrement SIFT, appliquer l’enregistrement local si nécessaire (cpselect, fitgeotform2d avec type de transformation = « lwm », imwarp).
    5. Recadrez l’image enregistrée et le masque de grain selon les besoins pour éliminer les artefacts de registre sur les bords de la matrice, puis redimensionnez selon les dimensions de l’espace poreux (15 mm x 10 mm) (recroche, diminue le redimensionnement).
    6. Faites passer en boucle toutes les images couleur en champ clair pour appliquer la même déformation (imwarp).
  3. Identifiez visuellement une image de référence (réf. t, Panneau 1 de la Figure 4) lorsque les biofilms entrent pour la première fois en phase stationnaire, déterminée par un manque de mouvement ou de croissance continue (ici, t = 18,5 h).
  4. Binariser chaque image en un point temporel (tn, Panneau 2 de la Figure 4) (rgb2gray, adaptthresh avec polarité au premier plan = « sombre » et sensibilité ajustée selon les besoins, imbinariser, imcomplémenter) de sorte que les assemblages biofilm-biominéraux = 1 et grains et pores vides = 0. Multipliez chaque masque de point temporel par le masque à grain inversé (imcomplément) pour éliminer les frontières résiduelles de grain.
  5. Multipliez tn par son masque de point temporel correspondant (Panneau 3 de la Figure 4) pour isoler la région biofilm-biominéral d’intérêt (Panneau 5 de la Figure 4), puis multipliez tref par chaque masque de point temporel pour isoler la même région (Panneau 4 de la Figure 4).
  6. Soustrayez tout le tn masqué de laréf. t masquée pour quantifier la diminution de l’intensité des pixels associée à l’accumulation d’oxyde de Mn à chaque moment (imsoustrait), puis convertissez en matrices composites corrigées d’intensité (rgb2gray, Panneau 6 de la Figure 4).
  7. Pour évaluer la distribution spatiale des minéraux à travers l’espace poreux (u.a.), sommez le long des colonnes (somme de dimension = 1) de chaque matrice corrigée en intensité.
  8. Pour estimer le taux de précipitations d’oxyde de Mn dans le temps (μg·h-1) :
    1. Additionner chaque matrice corrigée en intensité (somme avec dimension = « tous ») pour quantifier l’intensité totale corrigée à chaque moment donné.
    2. Divisez l’intensité totale corrigée à chaque moment par l’intensité totale corrigée au dernier point de temps de sorte que le point final = 1 et toutes les valeurs précédentes soient fractionnaires. Re-échelle à μg en multipliant par la masse de Mn mesurée avec l’ICP-MS.
    3. Prenons la dérivée par rapport au temps en divisant l’augmentation de masse (μg) entre les points temporels séquentiels (diff) par l’intervalle de temps entre les images (0,5 h).

Résultats

Ce protocole fournit une plateforme expérimentale pour l’imagerie spatiotemporalement résolue de la formation de biofilms et de la biominéralisation du Mn. Des images en champ clair couleur ont démontré que les biofilms GB-1 de P. putida étaient uniformément répartis dans l’espace poreux microfluidique à t = 18,5 h avant le début de la précipitation d’oxyde de Mn (Figure 5A). Par la suite, les oxydes de Mn se sont accumulés préférentiellement du côté d’entrée de l’espace poreux le plus proche de la source influente de Mn(II) (Figure 5B). La différence entre l’image de référence et les points temporels suivants a révélé la contribution isolée des précipités d’oxyde de Mn à l’intensité globale de l’image (Figure 5C) et a permis la quantification du gradient observé à l’échelle du réacteur dans l’accumulation minérale (Figure 5D). À l’échelle du biofilm, cette approche de soustraction d’image a capturé la précipitation progressive des oxydes de Mn sur les surfaces des biofilms et l’accumulation de minéraux aux bords des biofilms en contact avec le fluide porologique (Figure 6).

Le protocole fournit en outre un flux de travail pour estimer la cinétique de la précipitation d’oxyde de Mn à partir de la soustraction d’image et des mesures ICP-MS. Les réacteurs microfluidiques triplicés contenaient 4,29 ± 0,22 μg Mn au dernier moment expérimental. La digestion acide du contenu du réacteur avait été validée auparavant à l’aide de mesures de masse d’oxyde de Mn basées sur le synchrotron et s’est avérée une erreur61 inférieure à 18 %. Par conséquent, les matrices corrigées en intensité ont été redimensionnées à cette masse finale. Le taux estimé de précipitations d’oxyde de Mn était non monotone, augmentant fortement entre t = 19,5 h et t = 21 h, avant d’atteindre un pic de 0,29 ± 0,04 μg·h-1 et de décélérer progressivement jusqu’à t = 43,5 h (Figure 7). Il convient de noter que ce calcul de taux ne prend en compte aucun oxyde de nanoparticule de Mn inférieur à la résolution du microscope optique ni la perte de masse d’oxyde due au transport sur la durée de l’expérience, qui devrait être minimale. Cette approche tire donc parti de techniques de microscopie accessibles pour évaluer semi-quantitativement les tendances temporelles dans la cinétique de biominéralisation.

figure-results-1
Figure 5 : Distribution à l’échelle du réacteur des biofilms et des oxydes de Mn. (A). Image couleur en champ clair des biofilms GB-1 de P. putida dans l’espace poreux microfluidique au début de la phase stationnaire (t = 18,5 h,t réf). (B). Image couleur en champ clair de l’oxyde de Mn précipite sur et autour des biofilms GB-1 de P. putida au dernier moment expérimental (t = 43,5 h). (C). Matrice d’accumulation minérale corrigée en intensité au dernier moment expérimental (t = 43,5 h), avec les grains en gris et les pores en blanc. La barre d’échelle est de 1 mm (D). Distribution spatiale unidimensionnelle de l’intensité totale corrigée de l’entrée (gauche) au côté de sortie (droit) de l’espace poreux (t = 43,5 h). La ligne solide représente une moyenne mobile de 1 mm le long de l’espace poreux de l’entrée à la sortie, moyennée sur des expériences tripliquées, et l’ombrage représente l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-2
Figure 6 : Accumulation d’oxydes de Mn à l’échelle du biofilm. (A). Sélectionnez des images en champ lumineux couleur des biofilms représentatifs de P. putida GB-1. Les oxydes de manganèse étaient détectables d’abord par un changement de couleur du gris au brun sur les surfaces du biofilm (montré à t = 20 h et t = 21 h), puis plus tard comme une accumulation de précipités brun foncé aux bords du biofilm (montré à t = 33 h et t = 43 h). (B). Matrices d’accumulation minérale corrigées en intensité avec grains gris foncé, pores blancs et biofilms sous-jacents gris clair. La barre d’échelle est de 150 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Estimation du taux de précipitations d’oxyde de Mn au fil du temps. Le taux (μg·h-1) a été quantifié en redimensionnant l’intensité totale corrigée à chaque point temporel jusqu’à la masse finale Mn mesurée avec ICP-MS, puis en prenant la dérivée par rapport au temps. Les marqueurs représentent la moyenne des expériences tripliquées, et l’ombrage représente l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Fichier supplémentaire 1 : Step1_ImageRegistration h.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Step2_ImageSubtractionVeuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Step3_FiguresVeuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Cette plateforme expérimentale offre des opportunités uniques pour étudier la dynamique spatiotemporelle des processus biogéochimiques dans des environnements poreux dépourvus d’artefacts qui empêchent l’acquisition de données haute fidélité. Cette approche est particulièrement adaptée à la biominéralisation Mn et Fe, qui produisent des précipités minéraux aux teintes caractéristiques d’ocre, de brun et de noir, pouvant être facilement segmentées par microscopie optique et analyse d’image. En utilisant la biominéralisation du Mn comme étude de cas, il est possible d’évaluer les schémas et les taux de précipitations minérales in situ avec une forte résolution spatiale et temporelle.

Plusieurs aspects de ce protocole ont permis la collecte de mesures reproductibles de transformations biogéochimiques. Premièrement, l’utilisation d’une valve d’injection séquentielle avec un faible volume mort a facilité des expériences avec plusieurs fluides sans perturber les biofilms dans l’espace poreux microfluidique. Cette configuration a préservé la distribution spatiale initiale du biofilm en empêchant les surtensions qui peuvent entraîner le déplacement ou le déplacement des biofilms lors du changement de fluide injecté, ce qui peut se produire avec d’autres instruments tels que les pompes à seringues. Ce composant offre en outre à l’utilisateur la flexibilité de personnaliser les conditions géochimiques imposées aux micro-organismes résidents. Enfin, parce qu’elle préserve la distribution initiale du biofilm, cette configuration permet à l’utilisateur de tester systématiquement comment différentes morphologies de biofilm ou quantités de biomasse influencent la distribution et le taux de précipitation de l’oxyde de Mn.

Deuxièmement, atténuer la formation et l’intrusion de bulles dans l’espace poreux microfluidique a permis des expériences de plusieurs jours capturant les échelles temporelles environnementales de la biominéralisation du Mn. Les bulles, un problème courant et souvent inévitable dans les longues expériences au-dessus de la températureambiante 62,63, peuvent fragmenter et bloquer des pores individuels, dérouter l’écoulement du fluide et perturber le déroulement de la réaction. Pour éviter que les bulles ne se retrouvent dans l’espace poreux, le réacteur était entièrement saturé avant l’inoculation. Pour minimiser l’introduction de bulles via le système de contrôle de débit, l’incubateur du microscope a été réglé à 30 °C bien avant l’expérience, et plusieurs volumes de solution influente ont été rincés avant l’attachement du réacteur inoculé. Cette étape a éliminé l’air piégé des tubes et des raccords et a minimisé le risque de dégazage de fluide pendant l’expérience. Un piège à bulles a également été intégré au système de contrôle de débit pour capturer les bulles résiduelles, avec une longueur de tube PTFE de 200 μm diamètre intérieur fixée à la sortie du siphon pour augmenter la résistance et améliorer l’efficacité de l’élimination des bulles. Enfin, pour éviter que l’air ne piége ou ne fuie à l’interface entre le tube influent et le trou d’entrée du réacteur, toutes les connexions ont été réalisées avec des gouttelettes de fluide aux deux extrémités du tube et du trou perforé, le tube PTFE hydrophobe a été recouvert de 1 % de PEG-DA, et l’extrémité du tube inséré a été maintenue perpendiculairement à la surface du PDMS tout au long de l’expérience.

Troisièmement, l’intégration d’un système d’irradiation UVC sur mesure dans la plateforme expérimentale a maintenu une condition limite géochimique définie et une biominéralisation Mn reproductible dans l’espace poreux microfluidique. Des expériences pilotes ont montré que des biofilms superflus dans la région d’entrée du réacteur précipitaient des oxydes de Mn en amont de l’espace poreux, limitant la disponibilité en aval de Mn(II). Une irradiation brève des régions d’entrée et de sortie du réacteur avec un alignement correct après la période sans écoulement empêchait le développement de biofilms à partir de toute bactérie initialement déposée. Un écoulement unidirectionnel continu de fluide a empêché la recolonisation de la région d’entrée du réacteur après ce traitement UVC initial. Irradier la région de sortie du réacteur à t = 17,5 h avant le début de la phase stationnaire et la précipitation visible d’oxyde de Mn a minimisé la quantité d’accumulation minérale en aval de l’espace poreux. Cela a facilité la comparaison directe des données d’images en clair couleur avec la masse de Mn digérée et mesurée avec ICP-MS.

La combinaison de la soustraction d’image et des mesures de masse finale a fourni une méthode semi-quantitative pour évaluer la cinétique des précipitations d’oxyde de Mn in situ. Cependant, il est important de noter que l’intensité des pixels cesse d’être directement proportionnelle à la masse d’oxyde de Mn à une densité minérale très élevée en raison d’une sensibilité limitée de la caméra aux couleurssombres 61. L’évaluation de ce comportement non linéaire pourrait être améliorée en digérant à l’acide des échantillons à des points temporels définis et en comparant la masse digérée à la masse originale mise à l’échelle par le dernier point temporel expérimental. Si une quantification exacte de la masse minérale est nécessaire, les utilisateurs peuvent développer une courbe d’étalonnage à partir d’échantillons minéraux d’intensité et de masse connues, ce qui a déjà été démontré dans Fadely et al.61, ou effectuer des mesures directes avec la fluorescence des rayons X basée sur le synchrotron.

La plateforme microfluidique présentée ici peut être appliquée à l’étude des processus de biominéralisation dans une large gamme de conditions environnementales. Bien que des expériences représentatives aient été optimisées pour P. putida GB-1, cette configuration peut être utilisée pour tester systématiquement une gamme de chimies de solution influente (par exemple, concentration de Mn ou de Fe, source de carbone, présence de métaux co-présents), débits, températures ou la présence d’un consortium microbien. Des conditions acides ou suboxiques spécifiques, telles que celles favorables aux bactéries oxydant le Fe, peuvent être simulées en diminuant le pH influent ou en recouvrant le PDMS d’un polymère imperméable à l’oxygène. Des informations sur les contrôles microbiens de la biominéralisation peuvent être obtenues en mettant en œuvre des souches de fusion de gènes rapporteurs et en suivant la fluorescence optiquerésultante 59,64. Les réacteurs microfluidiques peuvent être repensés pour simuler une gamme d’environnements poreux en modifiant la distribution de la taille des particules, la forme ou la porosité des particules, ou en fonctionnalisant le PDMS pour imiter la charge de surface des particules d’argile ou de la matière organique naturelle. Avec des modifications supplémentaires (par exemple, remplacer le substrat du réacteur en verre par du plastique), les réacteurs peuvent supporter des mesures spectroscopiques directes de l’état d’oxydation des métaux, de la minéralogie, des associations organo-minérales ou de la sorption ou co-précipitation de métaux secondaires. Enfin, cette plateforme expérimentale peut être étendue pour étudier la précipitation d’autres biominéraux métalliques (par exemple, phosphates, carbonates, sulfures), à condition que leurs propriétés optiques soient suffisamment distinctes pour permettre la segmentation de l’image. Ce protocole offre donc un cadre pour étudier de manière exhaustive la biominéralisation et les interactions microbien-minéral-fluide dans des environnements poreux pertinents.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce projet a été soutenu par le Centre américain de la National Science Foundation for Bio-mediated and Bio-inspired Geotechnics (ERC-1449501), la Fondation nationale suisse pour la science (200021_188546) et la National Science Foundation américaine (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849). Une partie de cette étude a été réalisée au Centre de Nano et Micro Fabrication (CNM2) de l’UC Davis. Nous remercions Steven Lucero et la fonderie UC Davis Tech pour la conception et la fabrication de l’incubateur de microscope et du système d’irradiation UVC. Nous remercions également le Dr Yuze Wang et le Dr Jason DeJong pour avoir fourni la géométrie du milieu poreux utilisée pour la fabrication de réacteurs microfluidiques, ainsi que le Dr Arunima Bhattacharjee, le Dr Noah Goshi, le Dr Gregory Girardi et le Dr Hyehyun Kim pour leurs discussions utiles et/ou pour leur formation à la photolithographie et à la lithographie souple. Enfin, nous remercions le Dr Gaitan Gehin, le Dr Tonya Kuhl, le Dr Filippo Miele et le Dr Charles Graddy pour leurs précieuses discussions sur la conception expérimentale et l’analyse d’images.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Adapter fitting (Elveflow, 6-40 to 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Utilisé pour l'interface entre le capteur de débit et les raccords sans bride.
Agar (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744Utilisé pour couler des plaques pour l'étirement des stocks congelés.
Compresseur d'air (Jun-Air)ElveflowKCP-110Utilisé pour mettre sous pression le contrôleur de débit.
Sulfate d'ammonium ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915Utilisé pour les milieux et solutions expérimentaux.
Pince à bécherTDI International7-SAUtilisée pour fixer le tuyau au réacteur microfluidique.
Logiciel AutoCADAutodesk --Utilisé pour concevoir la géométrie du réacteur microfluidique.
AutoclaveSteris--Utilisé pour stériliser les matériaux et les liquides. 
BalanceMettler ToledoME2002TUtilisée pour peser la base d'élastomère PDMS et l'agent de durcissement.
Adaptateur à crémaillère (1/4-28 pivotant à 3/32-pouces à crémaillère)ElveflowKFI-06Utilisé pour connecter le tuyau en polyéther de polyuréthane au collecteur et au support de réservoir de fluide.
Poinçon de biopsie (Rapid-Core, diamètre de 1,2 mm)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25Utilisé pour percer les trous d'entrée/sortie dans les canaux microfluidiques PDMS. 
Eau de Javel (Chlorox)ULINES-19719Utilisée pour stériliser le système de contrôle du débit. Diluer à 1 % dans de l'eau ultrapure.
Aiguille à bout rond (Jensen Global, calibre 21)QSourceJG21-10HPX-J004Utilisée pour connecter le tuyau aux seringues. Stérilisée par autoclavage pendant 30 min.
Brûleur BunsenHumboldtH-5970Utilisé pour maintenir un espace de travail expérimental stérile.
Chlore de calcium dihydraté (CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79Utilisé pour les milieux et solutions expérimentaux.
Acide caséinique (Fisher BioReagents, peptone de caséine acide)Fisher ScientificBP1424Utilisé pour les milieux expérimentaux.
Densitomètre cellulaire (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906Utilisé pour mesurer l'OD600 des cultures bactériennes. 
Ruban adhésif transparent (Scotch Magic)ULINES-10223Utilisé pour empêcher la poussière de coller aux canaux microfluidiques PDMS.
Chlore de cobalt(II) hexahydraté (CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599Utilisé pour les milieux et solutions expérimentaux.
Azote compriméAirgasNIUHP300Utilisé pour sécher les composants du réacteur microfluidique.
Tube conique (Falcon, volume de 15 mL, polypropylène)Fisher Scientific14-959-49BUtilisé pour les solutions d'influx et les échantillons ICP-MS. Pré-stérilisé.
Tube conique (Falcon, volume de 50 mL, polypropylène)Fisher Scientific14-432-22Utilisé pour la préculture LB. Pré-stérilisé.
Sulfate de cuivre(II) pentahydraté (CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027Utilisé pour les milieux et solutions expérimentaux.
Matelas de découpeULINES-18543Utilisé pour découper les canaux microfluidiques PDMS et percer les trous d'entrée/sortie.
Cuve (Fisherbrand, volume de 1,5 mL, polystyrène)Fisher Scientific 14-955-127Utilisé pour mesurer l'OD600 des cultures bactériennes. 
Appareil photo numérique (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115Utilisé pour l'imagerie en temps réel en champ clair coloré des expériences microfluidiques.
Valve de distribution (MUX)ElveflowMUX-D-12Utilisée pour injecter séquentiellement plusieurs fluides.
Logiciel Elveflow Smart Interface (ESI)Elveflow --Utilisé pour contrôler le taux de débit/la pression de rétroaction entre le contrôleur de débit et le capteur de débit et effectuer la commutation de la valve de distribution.
Flacon Erlenmeyer (Fisherbrand, volume de 50 mL)Fisher ScientificFB50050Utilisé pour la culture en phase exponentielle moyenne. Stérilisé par autoclavage pendant 30 min.
Éthanol (Fisher Chemical, alcool réactif, pureté de 90 %, CAS: 64-17-5)Fisher ScientificA962P-4Utilisé pour nettoyer le PDMS et les lamelles de verre pour la fabrication du réacteur. Dilué à 70 % dans de l'eau ultrapure.
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, CAS: 60-00-4)Sigma-AldrichEDSUtilisé pour les milieux et solutions expérimentaux.
Raccord sans bride (1/4-28 pour tuyau de 1/16 po de diamètre extérieur)ElveflowKFI-17Utilisé pour connecter le tuyau aux composants matériels Elveflow. Le kit comprend des bagues et des écrous filetés.
Contrôleur de débit (OB1 MK3+)ElveflowOB1-2000Utilisé pour fournir un retour de débit/pression pour l'injection de fluide contrôlée.
Capteur de débit (MFS2)ElveflowMFS-D-2Utilisé pour maintenir un débit stable pour les expériences microfluidiques en utilisant le retour de pression du contrôleur de débit.
Support de réservoir de fluideElveflowKPT-4SUtilisé pour mettre sous pression les fluides entrants. Compatible

Références

  1. Scheinost, A. C., Singh, B., Goss, M. J., Oliver, M. Metal oxides. Encyclopedia of soils in the environment. , (2023).
  2. Tebo, B. M., et al. Biogenic manganese oxides: properties and mechanisms of formation. Annu Rev Earth Planet Sci. 32, 287-328 (2004).
  3. Droz, B., Dumas, N., Duckworth, O. W., Peña, J. A comparison of the sorption reactivity of bacteriogenic and mycogenic Mn oxide nanoparticles. Environ Sci Technol. 49, 4200-4208 (2015).
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