Maturation in vitro des ovocytes de souris, fécondation et culture des embryons préimplantatoires

Résumé

Ce protocole décrit les procédures de maturation in vitro des ovocytes de souris, la fécondation in vitro et la culture embryonnaire subséquente jusqu’au stade de blastocyste.

Résumé

La maturation in vitro des ovocytes de souris, combinée à la fécondation in vitro et à la culture embryonnaire subséquente, permet la génération d’embryons préimplantatoires dans des conditions définies. Ces procédures facilitent l’étude des fonctions biologiques et des mécanismes moléculaires sous-jacents à la maturation, à la fécondation et au développement embryonnaire précoce des ovocytes. Cependant, la réussite de cette approche dépend d’une manipulation attentive des ovocytes et des spermatozoïdes, des conditions de culture appropriées et d’une évaluation précise de la progression du développement à chaque étape. Ici, nous décrivons des méthodes pour isoler les complexes cumulus et ovocytes (COC) immatures des ovaires de souris, la maturation in vitro des ovocytes, la fécondation in vitro et la culture in vitro d’embryons jusqu’au stade blastociste. Ces procédures incluent la préparation et l’équilibrage des milieux et des plats de culture, l’isolement et la sélection des COC après la dissection ovarienne, la collecte et la capacitation des spermatozoïdes, la réalisation de l’insémination dans des conditions standardisées, puis la culture des embryons pour une évaluation du développement. La progression du développement est évaluée selon des critères morphologiques, notamment la formation des pronoyaux mâles et femelles, la clivage vers le stade bicellulaire et la formation des blastocystes. Ce protocole peut être intégré dans des études sur la maturation des ovocytes et la fonction des facteurs maternels, fournissant un outil précieux pour la recherche fondamentale en biologie reproductive des mammifères.

Introduction

Comprendre la qualité des ovocytes et la compétence développementale sont essentiels pour une fécondation réussie et un développement embryonnaire^{ultérieur 1,2}. La maturation des ovocytes nécessite non seulement une ségrégation chromosomique précise lors de la maturation nucléaire, mais aussi une maturation cytoplasmique, incluant la redistribution des organites et l’accumulation d’ARNm et de protéines^{maternelles 3}. Le développement embryonnaire précoce dépend des ARNm et des protéines fournis par la mère, et les réserves maternelles dans l’ovocyte soutiennent le développement préimplantatif. Cependant, l’identité et les fonctions de nombreux régulateurs maternels de l’embryogenèse chez les mammifères restent incomplètement^{comprises 4}. Par conséquent, des études systématiques supplémentaires sont nécessaires pour élucider les mécanismes sous-jacents à la maturation, à la fécondation et au développement embryonnaire des ovocytes.

La souris est un système modèle largement utilisé pour étudier le développement embryonnaire avant l’implantation. La maturation in vitro (IVM) désigne la collecte d’ovocytes immatures de l’ovaire et leur maturation dans des conditions de laboratoire^{contrôlées 5}. Par la suite, la fécondation in vitro (FIV) permet aux ovocytes matures d’être co-incubés avec des spermatozoïdes capables afin de générer des zygotes pour des études précoces sur le développement embryonnaire. Cependant, par rapport à la FIV conventionnelle utilisant des ovocytes mûris in vivo, les ovocytes dérivés de la MIV présentent souvent des taux de maturation et de fécondation plus faibles ainsi qu’une compétence développementale^{réduite 6}. Ces limitations sont en grande partie attribuées à l’asynchronie entre la maturation nucléaire et cytoplasmique sous des conditions de culture in vitro . De plus, la stabilité du fuseau méiotique dans les ovocytes de souris est sensible aux variations de pH et de température lors de la FIV, et la perturbation du fuseau peut contribuer à l’arrêt de la^{maturation 7}. Par conséquent, la compétence réduite des ovocytes dérivés de la MIV reste un obstacle majeur, limitant la production efficace d’embryons pour les études développementales et mécanistiques.

Les embryons de préimplantation chez la souris peuvent également être obtenus en collectant des zygotes dérivés in vivo et en les cultivant in vitro (IVC). Les zygotes dérivés in vivo prélevés des oviducs fournissent un point de départ relativement synchronisé pour des expériences axées sur les événements^{post-fécondation 8}. Cependant, la maturation des ovocytes et l’accumulation des facteurs maternels se produisent avant la fécondation in vivo ; Ainsi, les zygotes dérivés in vivo sont moins susceptibles de manipuler expérimentalement les conditions de maturation ou les réserves maternelles afin d’évaluer leurs effets sur le développement embryonnaire^{ultérieur 4}. Par conséquent, optimiser les protocoles de MIV et FIV et adopter des procédures opérationnelles standardisées avec un contrôle qualité rigoureux (par exemple, une gestion stricte de la température, du pH et des pratiques de manipulation) sont essentiels pour minimiser la variabilité liée à la procédure et protéger la compétence en développement des ovocytes et des embryons.

Ici, nous décrivons un protocole IVM–IVF–IVC détaillant la préparation du milieu, l’isolement et la sélection des COC, les procédures de FIV et FIV, ainsi que la culture embryonnaire in vitro (Figure 1). Le protocole intègre des points de contrôle pratiques spécifiques à chaque étape pour le contrôle qualité de routine, incluant l’extrusion du premier corps polaire (PB1), la formation de pronoyaux mâles et féminins (2PN), la clivage en deux cellules et la formation de blastocystes. Ce protocole permet une génération reproductible et efficace d’embryons préimplantatoires dans des conditions définies, soutenant les études mécanistes, l’optimisation des cultures et les applications en aval en biologie du développement et de la reproduction.

Protocole

Toutes les expériences animales ont été approuvées par le Comité de Soins et d’Utilisation Institutionnelles des Animaux de l’Université Northwest A&F, Chine (numéro de permis : 20230503).

1. Entretien animal

1. Procurez-vous des femelles de type sauvage C57BL/6 et des mâles DBA/2 et maintenez-les dans des conditions spécifiques sans agents pathogènes (SPF), avec un cycle clair-obscur de 12 h à une température de 20–22 °C et 55 % ± 10 % d’humidité. Fournissez un régime alimentaire de reproduction et de l’eau à libitum. Les souris mâles de maison individuellement (un mâle par cage).

2. Préparation des médias

1. Pour préparer une solution de travail PMSG à 50 UI/mL, dissoudez 5 000 UI de gonadotropine sérique de jument enceinte (PMSG) dans 100 mL de solution physiologique stérile tamponnée phosphate (PBS).
   REMARQUE : Adivisez la solution en portions à usage unique de 1 mL et stockez-les à –20 °C. Décongelez chaque aliquote à température ambiante juste avant utilisation.
2. Pour préparer un milieu de culture IVM, ajoutez les ingrédients listés dans le tableau 1 à 100 mL de base Medium 199 (M199). Ajustez le pH à 7,3–7,4, puis filtrez le milieu stérile à travers un filtre de 0,22 μm dans des flacons de médium stériles. Étiquetez la bouteille « IVM » avec les initiales, la date de fabrication et la date d’expiration, et conservez à 4 °C pendant jusqu’à 1 mois.
3. Pour préparer une solution d’hyaluronidase à 0,1 % (p/v), dissoudez 10 mg d’hyaluronidase dans 10 mL de milieu M2.
   REMARQUE : Conserver dans des aliquotes à usage unique de 1 mL à –20 °C et chauffer jusqu’à 37 °C avant utilisation.

3. Préparation des plats (Figure 2)

REMARQUE : Ajustez le nombre de gouttes de IVM, FIV et IVC en fonction du nombre attendu de COC et d’embryons, en utilisant 20 à 30 COC par goutte de 100 μL pour la FIV et la FIV et 20 à 30 embryons par goutte de 100 μL pour la culture embryonnaire.

1. Préparez un nombre approprié de boîtes de collecte d’ovocytes de 35 mm, chacune contenant 2 mL de milieu M2 complétée avec 0,2 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX). Utilisez une plaque pour la ponction des ovaires et la collecte des COC (une pour deux femmes), et une autre pour laver les COC. Préchauffez la vaisselle à 37 °C avant utilisation.
2. Préparez des plats de FIV.
   1. Dans un plat de 60 mm, préparez cinq gouttes de 100 μL de médium IVM pour le lavage (étiquetez le plat comme « lavage IVM »).
   2. Dans un plat séparé de 60 mm, préparez plusieurs gouttes de 100 μL de milieu IVM pour maturation (étiquetez le plat comme « IVM »).
   3. Ajoutez soigneusement suffisamment d’huile minérale pour recouvrir les gouttes, et équilibrez les plats à 37 °C dans un incubateur à 5 % de_CO2 pendant au moins 2 heures avant de commencer la collecte des ovocytes.
3. Préparez des plats pour FIV.
   1. Dans un plat de 60 mm, préparez une ou deux gouttes de 300 μL de milieu de culture embryonnaire pré-équilibré pour la libération et la capacité du spermatozoïde (étiquetez le plat comme « Capacité du sperme »).
      REMARQUE : La seconde chute de capacité est préparée comme réserve pour les cas où la motilité du spermatozoïde dans la première goutte est insuffisante, un nouvel échantillon épididymale doit être prélevé et capé, ou la concentration de spermatozoïdes doit être ajustée avant l’insémination.
   2. Préparez deux plats séparés de 60 mm, chacun contenant cinq gouttes de 100 μL de milieu de culture pré-équilibré pour le lavage (étiquetez le plat comme « lavage FIV »).
      REMARQUE : Utilisez un bol « FIV lavage » pour laver les COC maturés par IVM avant l’insémination, et utilisez l’autre plat « FIV lavage » pour laver les zygotes présumés après co-incubation afin d’éliminer les cumulus et les spermatozoïdes résiduels.
   3. Dans un plat séparé de 60 mm, préparez plusieurs gouttes de 100 μL de milieu de culture embryonnaire pré-équilibrée pour l’insémination (étiquetez le plat comme « FIV »).
      REMARQUE : Le milieu de culture embryonnaire pré-équilibré est utilisé à la fois pour la capacitation et l’insémination des spermatozoïdes afin de maintenir des conditions constantes lors de la préparation et de la fécondation des spermatozoïdes.
   4. Ajoutez soigneusement suffisamment d’huile minérale pour recouvrir les gouttes, et équilibrez les plats à 37 °C dans un incubateur à 5 % de_CO-2 pendant au moins 12 heures avant de commencer la procédure de capacité des spermatozoïdes.
4. Préparez des plats pour la vaisselle IVC.
   1. Dans un plat de 60 mm, préparez cinq gouttes de 100 μL de milieu de culture embryonnaire prééquilibré pour laver les embryons (étiquetez le plat comme « lavage IVC »).
   2. Dans un plat séparé de 60 mm, préparez plusieurs gouttes de 100 μL de milieu de culture embryonnaire pré-équilibré pour culture embryonnaire (étiquetez le plat comme « IVC »).
   3. Ajoutez soigneusement suffisamment d’huile minérale pour recouvrir les gouttes, et équilibrez les plats à 37 °C dans un incubateur à 5 % de_CO2 pendant au moins 12 heures avant de commencer la culture embryonnaire.

4. Collection d’ovaires

1. Administrez 10 UI de PMSG intrapéritonéalement à des femelles C57BL/6 de 8 à 10 semaines.
2. À 48 heures après l’injection de SPM, euthanasiez la souris par une luxation cervicale et positionnez-la sur le dos. Vaporisez l’abdomen avec 70 % d’éthanol pour humidifier le pelage et empêcher qu’il n’entre dans la cavité abdominale.
3. À l’aide de ciseaux fins à disséquer, faites une petite incision cutanée dans le bas de l’abdomen et ouvrez doucement la peau avec des mains gantées pour exposer la membrane péritonéale.
4. Ouvrez la membrane péritonéale et déplacez doucement les intestins sur le côté. Localisez la corne utérine et suivez-la vers l’ovaire. Identifiez l’ovaire près du rein, généralement entouré d’un coussin adieux.
5. Utilisez des ciseaux fins à disséquer pour séparer l’ovaire de la corne utérine, et coupez l’excès de tissu conjonctif et de graisse.
6. Transférez immédiatement les ovaires dans un milieu M2 pré-chauffé, complété par IBMX. Répétez la procédure pour prélever l’ovaire controlatéral et le transférer dans la même antenne.
7. Placez la plaque sous un stéréomicroscope et procédez à la ponction folliculaire et à la collecte des COC.

5. Collection et culture des COC

1. Sous un stéréomicroscope, perforez doucement les follicules antraux visibles avec une aiguille stérile pour libérer les COC dans le milieu M2.
   REMARQUE : Lors de la collecte des ovocytes de stade GV de souris, poncez préférentiellement les follicules antraux visiblement volumineux à la surface ovarienne, qui paraissent généralement saillants et semi-translucides avec une cavité antrale claire.
2. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre finement tirée, collectez les COC libérés et transférez-les dans une boîte propre de 35 mm contenant un milieu M2 préchauffé, complété par l’IBMX.
3. Lavez les COC par transfert en série dans une zone propre de la plaque de 35 mm selon les besoins pour éliminer les cellules de granulose détachées et les débris tissulaires, laissant des débris à chaque transfert (Figure 3).
   REMARQUE : Utilisez uniquement des COC avec trois couches ou plus compactes de cellules cumulus et un cytoplasme uniformément granulé sans espaces dégagés pour les étapes^{suivantes 9,10}. Les ovocytes GV dénudés et les ovocytes GV partiellement enfermés dans un cumulus sont exclus de ce protocole. Dans nos conditions expérimentales, une moyenne de 26 COC immatures ont été obtenus par souris femelle.
4. Après l’enlèvement des débris, transférez les COC dans la gamelle IVM et lavez-les par transfert séquentiel à travers cinq gouttes de 100 μL de substrat IVM.
   REMARQUE : Lors des transferts, minimisez le volume de transfert afin d’éviter la contamination croisée entre les gouttes.
5. Transférez les COC lavés dans des gouttes de 100 μL de milieu IVM (20–30 COC par goutte) et cultivez à 37 °C dans 5 % de_CO2 pendant 14 heures.
   REMARQUE : Collecter, laver et transférer les COC dans un milieu IVM avec un délai minimal afin de maintenir le potentiel de développement.
6. (Optionnel) Après la FIV, incubez brièvement les COC à 1 mg/mL d’hyaluronidase et pipetez doucement à plusieurs reprises avec une micropipette jusqu’à ce que les cellules cumulus soient complètement retirées.
   REMARQUE : Limitez l’exposition à l’hyaluronidase à un maximum de 3 minutes, car une exposition prolongée peut endommager les ovocytes.
7. (Optionnel) Lavez les ovocytes dénudés dans un milieu M2 frais sur une plateforme chauffée, puis évaluez la maturation des ovocytes sous un stéréomicroscope.
8. (Optionnel) Les ovocytes avec un premier corps polaire extrudé sont considérés comme matures et au stade de métaphase II (MII). Calculer le taux de maturation comme le nombre d’ovocytes avec un premier corps polaire extrudé divisé par le nombre total d’ovocytes cultivés.
   REMARQUE : Les étapes 5.6 à 5.8 sont utilisées pour évaluer la maturation des ovocytes après une IVM en dénudant une cohorte d’évaluation désignée avant le score PB1. Ces étapes ne sont pas nécessaires pour les COC qui passent directement à la FIV.

6. Collecte et préparation du sperme

REMARQUE : Cette section décrit la collecte et la capacitation des spermatozoïdes frais. Avant l’insémination, les spermatozoïdes fraîchement libérés doivent être incubés dans un milieu de culture embryonnaire pré-équilibré à 37 °C pendant 1 h afin de permettre la capacité.

1. Euthanasiez un mâle adulte DBA/2 souris (10–16 semaines) et retirez ses épididymides de la queue de cheval, en évitant autant que possible la graisse, le sang et le liquide tissulaire (Figure 4).
2. Pour chaque homme, transférez les deux épididymides de la queue dans une goutte de 300 μL de milieu G-FIV pré-équilibré pour la libération et la capacité des spermatozoïdes.
3. Immobilisez l’épididyme de la queue de la queue à l’aide d’une paire de pinces, effectuez cinq à sept coupures dans l’épididyme de la caude avec une aiguille de seringue stérile, puis pressez doucement le tissu pour libérer des spermatozoïdes concentrés.
   REMARQUE : Évaluer la motilité des spermatozoïdes et n’agir que lorsque la majorité des spermatozoïdes présentent une motilité progressive (PR), définie comme un mouvement actif vers l’avant, plutôt que par une motilité non progressive (NP) ou une immotilité¹¹.
4. Incubez la plaque à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 1 heure pour permettre la capacité des spermatozoïdes.

7. Fécondation in vitro

1. Après 14 heures de FIV, lavez les COC par transfert séquentiel à travers cinq gouttes de 100 μL de substrat de lessin IVF, puis transférez les COC lavés dans les gouttes d’insémination FIV (20 à 30 COC par goutte de 100 μL).
2. Préincubez la plaque de fécondation contenant les COC à 37 °C dans 5 % de_CO2 pendant 30 minutes avant l’insémination.
3. Après la capacité, déterminez la concentration de spermatozoïdes à l’aide d’un hémocytomètre.
4. En fonction de la concentration de spermatozoïdes, calculez le volume d’inocule requis et ajoutez des spermatozoïdes capables à chaque goutte de FIV pour atteindre une concentration finale de 4 ×^{10 5} –1 × 10⁶ spermatozoïdes/mL.
   REMARQUE : Après l’ajout de spermatozoïdes, vérifiez que des spermatozoïdes mobiles sont présents dans chaque goutte d’insémination.
5. Incubez les plats de FIV contenant les COC et le spermatozoïde à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 4 à 6 heures.

8. Culture d’embryons

1. Après 4 à 6 heures d’incubation, utilisez une pipette Pasteur en verre finement tirée avec un diamètre intérieur légèrement supérieur à celui de l’ovocyte pour aspirer les zygotes présumés en un volume minimal et les transférer dans les gouttes de lavage FIV.
2. Lavez les zygotes présomptifs par transfert séquentiel à travers cinq gouttes de lavage FIV, en pipettant doucement à l’intérieur de chaque goutte pour éliminer l’excès de spermatozoïdes et les débris (Figure 5).
3. Transférez les zygotes présomptifs lavés dans la gamelle de lavage de la VCI et lavez-les par transfert séquentiel à travers cinq gouttes de lavage préchauffées pour le milieu de culture embryonnaire, minimisant ainsi le transfert du milieu FIV.
4. Placez les zygotes présumés dans des gouttes de culture pour le milieu d’embryons et la culture à 37 °C dans 5 % de CO₂ (20 à 30 embryons par goutte de 100 μL).
5. À 6 à 8 heures après l’insémination, évaluer la fécondation au stéréomicroscope en notant la présence des pronoyaux mâles et femelles, et éliminer les ovocytes qui ne conservent qu’un seul corps polaire et ne présentent aucun pronoyau visible.
6. À 24 h après l’insémination, comptez le nombre d’embryons à deux cellules et calculez le taux de deux cellules comme (embryons à deux cellules / ovocytes inséminés).
7. Après le comptage, retirez et jetez les embryons non fendus, puis continuez la culture des embryons découpés restants.
   REMARQUE : À ce stade, les embryons peuvent être vitrifiés, transférés aux femelles receveuses ou maintenus en culture jusqu’au stade de blastocyste.
8. Continuez la culture des embryons dans les mêmes conditions d’incubation jusqu’à 96 heures après l’insémination (hpi). Évaluer la formation des blastocystes à 96 hpi selon des critères morphologiques.
   REMARQUE : Aucun autre changement de support n’est nécessaire durant cette période. Un blastocyste normal est identifié par la présence d’une cavité blastocoel visible, d’une masse cellulaire interne distincte et d’une couche trophectodermique intacte.

Résultats

Grâce à ce protocole, les COC de souris ont été traités séquentiellement par maturation in vitro , fécondation in vitro et culture embryonnaire in vitro ultérieure, aboutissant à une génération reproductible d’embryons préimplantatoires et à un développement jusqu’au stade blastociste dans les conditions décrites. Après 14 heures de MIV, les COC présentaient généralement une expansion du cumulus et une morphologie intacte des ovocytes. La maturation méiotique d...

Discussion

Ce protocole prévoit une procédure standardisée pour la maturation in vitro des ovocytes de souris, la fécondation in vitro et la culture in vitro à l’aide de COC immatures, permettant la génération et l’évaluation reproductibles d’embryons préimplantatoires à travers le stade blastocistique dans des conditions in vitro définies. Dans de nombreuses études, les résultats de la MIV sont sensibles aux différences spécifiques au laboratoire en matière de m...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
35 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150255
60 mm Petri dish	Thermo Fisher Scientific	150270
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Breeding diet (rodent breeder chow)	Keao Xieli (Beijing,China)	N/A
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 150i
D-glucose	Sigma-Aldrich	G7021
Disposable Pasteur Pipet	Kimble	DWK63A53WT-1000EA
Epidermal growth factor	Gibco	PHG0313
Fine dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146-1EA
Fine-tip forceps	Rhino	SW14
Follicle-stimulating hormone	Millipore	869001
G-1 PLUS	Vitrolife	10128
G-IVF PLUS	Vitrolife	10136	(prééquilibré) milieu de culture embryonnaire
Hemocytometer	Millicell	MDH-4N1
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4274
IBMX (3-Isobutyl-1-methylxanthine)	Selleck	S5836
KnockOut Serum Replacement	Gibco	A3181501
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
Luteinizing hormone	Millipore	869003
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Medium 199	Gibco	11150-059
Micropipette	Gilson	F167350
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M8410
Phosphate-buffered saline	Gibco	20012027
Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Ningbo Second hormone factory (Ningbo, China)	N/A
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P4562
Stereo microscope	Olympus	SZX10
Sterile medium bottles	Nalgene	46600-586
Sterile syringe needle	BD Biosciences	309623	1 mL, 27G1/2
Syringe Filter Unit	Millipore	SLGP033R
Thermo Plate	Tokai Hit	TPi-SZX2X