Un algorithme d’analyse de forme quantifie la morphologie spatiale et le contexte de la culture cellulaire 2D à 3D pour une quantification novatrice des phénotypes

Summary

Cet article explique comment de nouvelles caractéristiques morphologiques dans les cellules et les organoïdes peuvent être quantifiées à l’aide de la transformée polaire comprimée linéarisée (LCPC), un algorithme spatial qui capture des propriétés que les métriques traditionnelles, telles que la surface, le volume et la surface, ne peuvent pas. Les meilleures pratiques pour l’orientation et l’alignement des formes sont discutées.

Abstract

De nombreuses études ont montré que le phénotype morphologique d’une cellule ou d’un organoïde est corrélé à sa susceptibilité aux agents anticancéreux. Cependant, les méthodes traditionnelles de mesure du phénotype reposent sur des métriques spatiales telles que la surface, le volume, le périmètre et l’intensité du signal, qui fonctionnent mais sont limitées. Ces approches ne peuvent pas mesurer de nombreuses caractéristiques cruciales du contexte spatial, telles que la chiralité, une propriété de la gauchère et de la droitière. Le volume ne peut pas être utilisé pour enregistrer la chiralité car les chaussures gauche et droite ont le même volume. Bien que le contexte spatial sous forme de chiralité, de direction gravitationnelle et d’axe de polarité soit intuitif pour l’humain, les métriques traditionnelles utilisées jusqu’à présent par les biologistes cellulaires, pathologistes, radiologistes et praticiens de l’apprentissage automatique ne peuvent pas saisir ces notions fondamentales. La transformée polaire comprimée linéarisée (LCPC) est un algorithme novateur capable de capturer un contexte spatial comme aucune autre métrique. La transformée LCPC traduit un contour bidimensionnel (2D) en une onde sinusoïdale discrète en superposant un système de grille qui suit les points d’intersection entre le contour et les lignes de la grille. Elle transforme le contour en une suite de paires de coordonnées discrètes, la coordonnée indépendante (coordonnée x) correspondant à des positions consécutives dans l’espace 2D. Chaque coordonnée dépendante (coordonnée y) consiste en la distance entre une intersection entre le contour et la ligne de grille jusqu’à l’origine ou la ligne de base du système de grille. Sous la forme d’une onde sinusoïde discrète, la transformée rapide de Fourier est ensuite appliquée aux données. Ainsi, les formes des cellules en culture cellulaire 2D et 3D sont représentées de manière systématique et multidimensionnelle, permettant une stratification quantitative robuste qui révélera des informations sur la résistance au traitement.

Introduction

La culture organoïde tridimensionnelle (3D) s’est avérée supérieure à la culture cellulaire bidimensionnelle (2D) en imitant la biologie in ^{vivo 1,2}. Les organoïdes sont devenus indispensables dans la recherche sur le cancer pour le dépistage de traitements efficaces et pour obtenir des informations sur la progression de la maladie 3,4,5,6. Bien qu’il soit bien connu en biologie du cancer que les distinctions morphologiques corrèlent avec un comportement biologique distinct des cellules et des tissus, ce domaine repose sur des métriques de forme traditionnelles qui sont limitées en portée. Cette étude décrit un nouvel algorithme spatial qui quantifie objectivement des caractéristiques morphologiques subtiles avec une précision sans précédent, surpassant les approches traditionnelles telles que la surface, le volume et la surface.

La transformée des coordonnées polaires comprimées linéarisées (LCPC) a été inventée pour décrire objectivement et quantitativement des morphologies complexes observées en histopathologie tissulaire, dans le but d’améliorer le gradage des polypes^{du côlon 7}. Le désir d’élargir ensuite cette approche pour capturer les caractéristiques spatiales basées sur l’IRM macroscopique dans les pathologies cérébrales, telles que le trouble bipolaire et la maladie d’Alzheimer, a conduit à des augmentations qui l’ont encore renforcée. Cette étude décrit le protocole étape par étape et les meilleures pratiques pour appliquer deux versions de la transformée LCPC : le système à grille parallèle et le système à grille radiale, qui disposent tous deux de scripts open source et de vidéos tutoriels.

Outre les méthodes géométriques traditionnelles, il existe plusieurs abstractions qui ont été efficaces pour mesurer les formes complexes des cellules et des organes. Cela inclut la mesure de l’excentricité, de l’asie, du contraste et de la kurtose, ainsi que des moments de Zernike pour capturer la circularité, l’asymétrie, l’irrégularité des arêtes et la structure globale^{des contours 8,9,10}. L’analyse fractale a également été utile pour réduire des contours complexes en valeurs scalaires, telles que la dimension fractale, qui mesure l’irrégularité du contour, et la lacunarité, qui mesure à quel point les espaces apparaissent hétérogènement irréguliers dans le contour^11,12. Pour mesurer la texture, la méthode de la matrice de cooccurrence des niveaux de gris (GLCM) est populaire pour mesurer le contraste, l’énergie, l’homogénéité, la corrélation et^{l’entropie 13,14}. Bien que toutes ces méthodes soient bénéfiques, aucune n’a été conçue pour capturer le contexte spatial, tel que la direction de la gravité, la position gauche ou droitière, ou la position de la structure centrale de soutien qui influence la direction du changement de forme. De plus, beaucoup d’entre eux produisent une seule valeur scalaire ou seulement quelques valeurs scalaires pour représenter des informations spatiales, c’est pourquoi les études citées les utilisent souvent en combinaison pour évaluer des formes complexes.

La transformée LCPC a été conçue pour produire de nombreuses caractéristiques à partir d’une seule mesure et permettre l’ajout de marqueurs spatiaux qui codent le contexte spatial dans la forme, comme la direction de gravité. La méthode la plus proche de la transformée^{LCPC 7} a été publiée un an après¹⁵, partageant la même idée centrale comme point de départ : appliquer la transformée de Fourier aux contours de cellules pour mesurer la forme sous forme d’un spectre de fréquences. Cependant, la transformée LCPC a été développée indépendamment pour être appliquée via des systèmes de grille distincts destinés à être utilisés en conjonction avec la connaissance du contexte spatial en dehors de la forme mesurée. De plus, l’inventeur de la transformée LCPC explique dans ce manuscrit que le spectre de fréquences résultant contient d’immenses quantités d’informations spatiales cachées. Le Fichier Supplémentaire 1 contient une discussion approfondie sur les contextes spatiaux en biologie souvent négligés lors de l’utilisation des méthodes citées et sur la manière dont la transformée LCPC peut être appliquée pour capturer ce contexte. Pour les lecteurs dont les données de forme ne montrent aucune différence entre les groupes témoins et expérimentaux, que leurs yeux puissent voir ou non une différence dans les formes, ou dont les données de forme montrent très peu de différence, même s’ils soupçonnent qu’il devrait y avoir une différence plus importante, ils devraient essayer la transformée LCPC.

La transformée LCPC offre un niveau de précision sans précédent dans la mesure de l’information spatiale car elle représente des formes en plusieurs dimensions. Contrairement aux méthodes traditionnelles, comme la surface et le volume, qui ne donnent qu’une seule valeur scalaire par forme (c’est-à-dire 25^{cm 2}), les résultats de la transformée LCPC peuvent donner plusieurs indices, chacun corrélé à un aspect morphologique différent d’une forme (c’est-à-dire rondeur vs. netteté des coins, lissage vs. dentelage des arêtes). La transformée LCPC décrit une forme 2D en superposant une grille de lignes droites qui croisent son contour. Chaque système de grille possède une origine (Figure 1) ou une ligne de base (Figure 2) à partir de laquelle mesurer la distance linéaire. Voir les figures 1B et 2B pour des organigrammes simplifiés décrivant l’algorithme. Chaque point d’intersection entre les lignes de grille et la courbe de niveau de la forme est détecté. La distance de chaque intersection est ensuite calculée par rapport à une ligne de base ou à l’origine. De cette manière, la transformation LCPC convertit des formes 2D en une série de paires de coordonnées x-y consécutives. La coordonnée x représente la position de la ligne de grille de zéro à infini, tandis que la coordonnée y représente la distance de l’intersection à la ligne de base ou à l’origine. Dans cette forme, qui est une onde sinusoïde discrète, la transformée rapide de Fourier (FFT) est ensuite appliquée pour convertir les données du « domaine de position » vers le domaine fréquentiel. Si la coordonnée x représentait le temps, alors le « domaine de position » serait équivalent au « domaine temporel » dans les applications standard de la FFT.

Alors que le système de grille radiale mesure la distance de chaque intersection depuis l’origine de la grille radiale (Figure 1A), le système de grille parallèle mesure toujours la distance des intersections par rapport à une droite imaginaire située à gauche de la forme (Figure 2A). Le script open source détermine la position de cette ligne imaginaire en trouvant le pixel le plus à gauche du contour, puis en déplaçant 10 pixels à gauche de cette position. Ici, la coordonnée x de cette position devient la ligne de référence à partir de laquelle toutes les intersections sont calculées. Cette règle des 10 pixels est arbitraire, mais c’est pourquoi tous les contours analysés par le script open source pour le système de grille parallèle doivent comporter au moins 15 pixels d’espace blanc sur les quatre côtés.

Pour les formes 2D avec plis ou plusieurs couches, les lignes de grille peuvent croiser le contour plus d’une fois. Dans ce cas, les distances de toutes les intersections le long d’une ligne de grille sont additionnées en une seule valeur. Ainsi, chaque ligne de grille n’a qu’une seule coordonnée x et une coordonnée y. Cette somme est représentée par le terme « compressé » dans le nom de transformation LCPC. Le rendu d’une forme 2D non linéaire en une onde sinusoïde discrète est représenté par le terme « linéarisé » dans le nom de l’algorithme. Enfin, le terme « coordonnées polaires » figure dans le nom de l’algorithme car le premier système de grille conceptualisé était une grille radiale à 180 degrés de coordonnées^{polaires 7}. Même après avoir réalisé que les coordonnées polaire et cartésienne sont interchangeables, le nom de l’algorithme est resté tel quel. La section remerciements décrit les raisons personnelles qui ont motivé l’invention et l’augmentation de la transformation LCPC.

Le protocole 1 était la séquence pour obtenir les données illustrée à la figure 3B, tandis que le protocole 2 était la séquence pour obtenir les données illustrées à la figure 3C–D. Les étapes de ces protocoles sont implémentées dans des scripts Python individuels disponibles dans le dépôt GitHub « Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform ^»16. Le protocole 1 est un exemple des étapes de prétraitement pour dériver la « forme pure » en préparation de la transformation LCPC. Le protocole 2 est un exemple d’étapes de prétraitement pour mesurer des formes « à l’échelle », c’est-à-dire à leurs échelles d’origine les unes par rapport aux autres.

La segmentation peut être réalisée manuellement dans des logiciels de traitement d’image, tels que Preview Mac ou Microsoft Paint, ou en utilisant des méthodes basées sur des seuils. Si cela se fait manuellement, l’une des quatre couleurs suivantes doit être choisie : bleu, vert, rose/magenta ou rouge. Le dépôt GitHub appelé « Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform ^»16 contient un dossier appelé « color extraction scripts ». Ce dossier contient quatre fichiers Jupyter Notebook avec du code Python qui extraient les quatre couleurs mentionnées précédemment et les convertissent en masques bleus sur fond blanc. Ce processus peut également être réalisé en faisant un seuil de la couleur du contour dans un logiciel de traitement d’image tel que Fiji/ImageJ. Pour les images contenant des contours avec des bordures en contact ou des bords qui se chevauchent (par exemple, un diagramme de Venn), elles devront être séparées à l’aide d’un logiciel de traitement d’image, afin qu’elles deviennent des objets indépendants dans l’image masque composite contenant plusieurs contours organoïdes. Cela ne s’applique pas aux images qui ne contiennent qu’un seul organoïde ou plusieurs organoïdes qui ne se touchent pas.

Protocol

Les cellules humaines primaires utilisées dans cette étude ont été prélevées et cultivées selon des approbations éthiques et des procédures de consentement éclairé précédemment^{rapportées 17}. Les images présentées ici ont été générées à partir de ces cultures cellulaires approuvées et sont publiées pour la première fois. Des échantillons de tissus ont été prélevés à l’hôpital Brigham and Women’s et à l’Université de Californie à San Francisco dans le cadre de protocoles approuvés par l’Institutional Review Board (IRB) auprès de patients ayant donné leur consentement éclairé pour l’utilisation en recherche de leurs tissus, comme décrit^{précédemment 17}. Aucune collecte supplémentaire de spécimens humains n’a été réalisée pour cette étude.

1. Extraction de la forme pure des contours organoïdes 2D pour la transformée LCPC

1. Segmentez le bord extérieur de chaque organoïde à l’aide de n’importe quel logiciel de traitement d’image, tel que Paint de Microsoft, Preview de MacOS ou Fiji/ImageJ.
2. Extraire les contours des organoïdes sous forme de masques ouverts qui sont des lignes bleues sur fond blanc.
3. Isoler chaque contour bleu sur sa propre toile blanche.
   REMARQUE : Cette étape n’est nécessaire que si une image contient plus d’un contour.
4. Recadrez chaque contour pour qu’il ait une marge d’un pixel sur les quatre côtés de l’objet bleu.
5. Ajoutez 100 pixels d’espace blanc sur les quatre côtés pour créer de nouvelles marges.
6. Faites pivoter les objets de façon à ce que la plus longue longueur interne soit horizontale.
   REMARQUE : Cette étape transforme la ligne interne la plus longue à l’intérieur de chaque objet en largeur de l’objet. Deux scripts sont disponibles à cet effet. Pour les formes fermées, utilisez le carnet Jupyter nommé « Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length_v2.ipynb ». Pour les formes ouvertes ou les formes avec plusieurs composants, utilisez le Jupyter Notebook nommé « Rotate Green Line_v3.ipynb ». L’outil Rotate Green Line propose un tutoriel vidéo qui est lié dans le fichier ReadMe contenu dans le même dossier que le fichier .ipynb.
7. Recadrez chaque image pour qu’elle ait une marge d’un pixel sur les quatre côtés de l’objet bleu.
   REMARQUE : C’est la même chose que l’étape 1.4. Le but de la découpe cette fois, cependant, est que l’étape de redimensionnement qui suit redimensionne toute la toile, pas seulement l’objet bleu qu’elle contient. Ainsi, en rendant l’objet bleu presque de la même largeur et hauteur que la toile elle-même, en redimensionnant la toile à 400 pixels de large, l’objet est aussi proche de 400 pixels de large. Il existe un Jupyter Notebook nommé « Trim margin to 1-pixel border.ipynb ».
8. Redimensionnez la largeur de la toile de chaque image à 400 pixels tout en limitant le format d’aspect.
   REMARQUE : Cette étape fait en sorte que chaque objet ait la même largeur. Limiter le rapport d’aspect empêche de déformer l’objet lors du redimensionnement. Il existe un Jupyter Notebook nommé « Redimensionner la largeur à 400 pixels mais limiter le format d’aspect.ipynb ».
9. Ajoutez 100 pixels d’espace blanc sur les quatre côtés pour créer de nouvelles marges.
10. Faites pivoter chaque image soit de 90 degrés dans le sens horaire, soit dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour obtenir la plus longue longueur interne, en étant cohérent avec le choix pour toutes les images.
    REMARQUE : Dans la séquence ci-dessus, la forme pure est obtenue en implémentant séquentiellement les étapes 1.6, 1.7, 1.8 et 1.9. Ajouter de l’espace de marge à l’étape 1.9 est nécessaire pour éviter les erreurs dans les scripts de transformation LCPC qui seront effectués ensuite, mais cela n’implique pas l’extraction de la forme pure. Les utilisateurs souhaitant mesurer des formes « à l’échelle » n’ont pas besoin d’effectuer les étapes 1.6, 1.7 et 1.8 dans la séquence ci-dessus, bien qu’ils doivent tout de même prétraiter leurs images de masque pour obtenir une orientation optimale avant d’appliquer la transformation LCPC.
11. Effectuez la transformation LCPC sur chaque contour. Utilisez des scripts Python fournis pour la méthode¹⁸ de la grille radiale ou la méthode¹⁹ de la grille parallèle.

2. Extraction de la forme à l’échelle des contours organoïdes 2D pour la transformée LCPC

REMARQUE : La méthode étape par étape pour extraire la forme à l’échelle des objets est similaire à celle pour extraire la forme pure dans le Protocole 1 ci-dessus. Les étapes sont nommées de la même manière dans les deux protocoles pour faciliter la mise en relation des étapes de la correspondance. Veuillez consulter les notes du Protocole 1 pour chaque étape. La principale différence entre la forme pure et la forme à l’échelle est que la forme à l’échelle ne nécessite pas les étapes 1.6, 1.7 et 1.8, qui sont les étapes de redimensionnement.

1. Segmentez le bord extérieur de chaque organoïde. Utilisez une approche computationnelle ou faites-le manuellement via un logiciel d’édition d’image basique, comme Paint de Microsoft, Preview de MacOS ou Fiji/ImageJ.
2. Extraire les contours des organoïdes sous forme de masques ouverts qui sont des lignes bleues sur une toile blanche. Utilisez Fiji/ImageJ pour extraire des masques ou le script Python^{fourni 16}.
3. Isoler chaque contour bleu sur sa propre toile blanche. Utilisez Fiji/ImageJ pour extraire des masques ou le script Python^{fourni 16}.
4. Recadrez chaque contour pour qu’il ait une marge d’un pixel sur les quatre côtés de l’objet bleu. Utilisez Fiji/ImageJ ou le script Python^{fourni 16}.
5. Ajoutez 100 pixels d’espace blanc sur les quatre côtés pour créer de nouvelles marges. Utilisez Fiji/ImageJ ou le script Python^{fourni 16}.
6. Faites pivoter chaque courbe de niveau de façon à ce que sa ligne interne la plus longue soit verticale. Utilisez Fiji/ImageJ ou le script Python^{fourni 16}.
7. Effectuez la transformation LCPC sur chaque contour. Utilisez des scripts Python fournis pour la méthode¹⁸ de la grille radiale ou la méthode¹⁹ de la grille parallèle.

Results

La transformée LCPC en grille radiale appliquée aux organoïdes atteints du cancer du sein

Les organoïdes et tumeurs 3D peuvent adopter une variété de formes, dont certaines sont manifestement différentes à l’œil humain, même si les métriques traditionnelles donnent des différences statistiquement insignifiantes. En revanche, les organoïdes peuvent aussi présenter des formes qui paraissent hétérogènes, et donc insignifiantes, à l’œil humain, masquant des morphologies subtiles récurrentes qui représentent des sous-types distincts. Des organoïdes primaires mammaires humaines ont été extraits de patientes et cultivés en 3D selon un protocole^{publié précédemment 17, 20, 21}. La figure 3A montre trois catégories morphologiques accessibles sur la base de l’inspection visuelle : un phénotype kystique, un phénotype polykystique et un phénotype polykystique dense. La figure 3B montre que les contours extérieurs de ces organoïdes étaient segmentés manuellement et que leur forme pure était extraite, ce qui supprime l’effet de la taille sur leur forme. Comme les courbes de niveau étaient circulaires, la transformée LCPC de grille radiale a été appliquée aux formes pures, suivie de PCA. Notez que les contours superposés sur la Figure 3B ont été tournés de sorte que la ligne interne la plus longue soit verticale, ce qui signifie que leurs orientations ne sont pas les mêmes que dans leurs images sources. La figure 3B montre un diagramme de points des deux premiers composants principaux (PC), et le regroupement K-means a identifié trois groupes : 0, 1 et 2. Les scores silhouette (SS) ont confirmé l’existence probable de deux clusters distincts entre les Clusters 0 vs. 1 (SS = 0,68) et les Clusters 1 vs. 2 (SS = 0,69), tout en indiquant une faible séparation entre les Clusters 0 vs 2 (SS = 0,27). Malgré le faible score de silhouette entre les clusters 0 et 2, l’étiquetage des points de données avec la forme pure de chaque point justifie que le cluster 2 représente le phénotype le plus distinct : des contours hautement asymétriques, non circulaires (l’épaisseur des contours importe peu dans ce cas).

Alors que la forme pure élimine l’effet de la taille sur la forme, ce qui est impossible pour mesurer la surface et le volume, mesurer les contours organoïdes à l’échelle révèle également des informations intéressantes. La figure 3C montre un diagramme de points 3D des trois premiers PC résultant de la transformation LCPC à grille radiale effectuée sur les courbes de niveau au fur et à mesure qu’ils étaient segmentés des images sans aucun redimensionnement. Cette approche signifie que la transformée LCPC mesure simultanément la forme et la taille des organoïdes. La figure 3C montre que les organoïdes polykystiques et polykystiques denses sont moins densément compactés que les organoïdes kystiques. Pour quantifier cette expansion, la Figure 3D montre la dispersion de chaque phénotype dans son espace PCA partagé. La distance moyenne K-plus proche voisin (KNND) est calculée pour chaque phénotype, ce qui permet d’évaluer visuellement la densité décroissante des points allant des organoïdes kystiques (KNND = 1,061) aux organoïdes polykystiques (KNND = 1,575) puis aux organoïdes polykystiques denses (KNND = 2,247) ; Cette diminution de la densité de points peut également être interprétée comme une hétérogénéité morphologique accrue des contours extérieurs. Enfin, pour comparer la transformée LCPC à la métrique traditionnelle de surface, la Figure 3E montre que, bien qu’il existe une signification statistique entre la surface des organoïdes kystiques et celle des organoïdes polykystiques denses (p = 0,016, test Wilcoxon Rank-Sum Test), il n’y a aucune indication basée sur la surface qu’il existe trois groupes morphologiques distincts à travers les phénotypes, tels qu’identifiés par le clustering K-means après analyse LCPC purement en forme (Figure 3B)) ou qu’il existe une hétérogénéité morphologique croissante, comme le montre l’analyse LCPC à l’échelle (Figure 3C–D). La figure 3E montre une dispersion décroissante des points de données allant des organoïdes kystiques aux organoïdes polykystiques puis polykystiques denses, ce qui est l’opposé de ce que l’analyse LCPC à l’échelle (Figure 3C), soulignant que l’information spatiale captée par la transformée LCPC diffère de celle capturée par la zone.

La même approche s’applique aux formes 2D individuelles de la Figure 3, et la Figure 1 supplémentaire s’applique également au contour des cellules dans la culture cellulaire 2D : cellules uniques (comme les globules rouges) ou grappes de cellules (comme lors des frottis cervical). Les études pilotes pour chacun de ces cas sont décrites en vidéos : analyse de forme des organoïdes cérébraux présentant des degrés variables de repli dans leur contour externe²² ; analyse de forme des alvéoles pulmonaires in situ, les mêmes principes peuvent être appliqués à l’analyse de la culture cellulaire^{2D 2D 23} ; analyse de forme du tissu cervical à partir de frottis dans lesquels le contour du noyau et de la membrane cellulaire sont quantifiés simultanément via la transformation 24 de la grille^radiale LCPC ; analyse de la forme des globules rouges infectés par le paludisme et des cellules adjacentes aux cellules infectées mais qui ne le sont pas^{elles-mêmes 25} ; analyse de la forme des globules rouges affectés par la drépanocytose²⁶.

Le système de grille parallèle pour mesurer la densité ou la texture comme indice d’information spatiale

L’information spatiale implique plus que les notions habituelles de forme, telles que la carrure, la rondeur et la courbure, car elle englobe des concepts tels que la texture et la densité. Les réseaux tubulaires complexes, tels que les vaisseaux sanguins, ou les réseaux ramifiés, tels que les filaments cytosquelettiques, ne correspondent pas à la notion de forme au même sens que notre intuition géométrique des formes, telles que les cercles et les polygones. Cependant, la densité et la texture sont des notions très utiles de l’information spatiale pour comprendre la structure et la fonction des cellules, organoïdes et tumeurs. En travaillant sur la manière de quantifier les réseaux complexes en imagerie à fluorescence, les biologistes cellulaires mesurent des caractéristiques telles que l’intensité moyenne du signal dans une image ou le pourcentage de la surface totale d’une image contenant un signal. Ces approches reconnaissent qu’il y a plus dans l’information spatiale que ce qui est décrit en termes de motifs géométriques.

Le motif des réseaux vasculaires au sein des tissus, tumeurs et organes sur une puce n’est pas facilement défini par les motifs géométriques traditionnels, mais bénéficie de cette interprétation comme texture et densité. Le remodelage vasculaire dans le développement tumoral et la résistance au traitement est une caractéristique bien établie du cancer (revue dans²⁷). Des sections histopathologiques de 458 tumeurs neuroblastiques primaires ont été^{analysées 28}, caractérisant la densité, la taille et la forme des vaisseaux sanguins totaux et des segments vasculaires. Ils ont constaté que les vaisseaux sanguins étaient plus gros, plus abondants et de forme plus irrégulière chez les tumeurs de patients présentant de faibles facteurs pronostiques par rapport aux tumeurs de la cohorte favorable. Fait intéressant, un terme appelé « vaisseaux qui encapsulaient des amas tumoraux » (VETC)²⁹ a été inventé pour décrire un schéma de vaisseaux sanguins entourant des groupes de petites tumeurs au sein d’un carcinome hépatocellulaire plus large et associé à des taux plus élevés de métastases et de récidive. Le même groupe qui a inventé le terme a ensuite découvert que le carcinome hépatocellulaire positif au VETC était corrélé à une réponse positive au traitement par inhibiteur de la kinase Sorafenib³⁰. Ainsi, la capacité à quantifier les schémas vasculaires est cruciale pour le pronostic et la compréhension des mécanismes de résistance.

Pour quantifier les réseaux denses de tubes, d’îlots et de branches, le système de grille parallèle de la transformée LCPC est utile pour mesurer ce que l’on peut appeler la densité de texture, plutôt que la forme. À titre d’exemple de la transformation LCPC en grille parallèle peut faire cela, la Figure 4A montre les motifs de microvascularisation cardiaque issus d’une étude de la vascularisation cardiaque³¹ : à l’œil nu, distinguer objectivement et quantitativement les motifs entre les zones infarctées et celles situées dans une région éloignée du site de la blessure est très difficile. En extrayant le masque des vaisseaux sanguins (Figure 4A Étape 1) et en appliquant la transformée LCPC en grille parallèle, on observe des différences quantitatives. Premièrement, pour améliorer la propreté des données, chaque image a été recadrée avec un cercle de diamètre uniforme, centré au centre de l’image carrée (Figure 4A Étape 2), ce qui garantit que chaque image a la même hauteur et largeur indépendamment des rotations. Ensuite, les images recadrées sont tournées de sorte que l’axe principal des vaisseaux (flèches doubles rouges dans la Figure 4A Étape 1) soit vertical (Figure 4A Étape 3). Ensuite, une ligne bleue est appliquée à la circonférence de l’image afin de s’assurer que même les images avec des motifs vasculaires clairsemés aient le même diamètre en termes de pixels bleus (Figure 4A Étape 4). Les étapes 3 et 4 ont été réalisées à l’aide du logiciel Fiji/ImageJ (v2.14.0). Enfin, la transformée LCPC en grille parallèle est appliquée (Figure 4A Étape 5). L’analyse des résultats via PCA et le tracé des trois premiers PC révèle que les régions infarctuées se regroupent séparément des régions éloignées (Figure 4B). Les calculs de la distance de chanfrein (CD) quantifient les motifs visuels présentés par les graphiques. Un jour après la blessure, le site infarcté présente un schéma vasculaire plus éloigné de la condition basale (basal vs. 1Day_infarct : CD = 83,89) que le site non blessé (Basal vs 1Day_remote : CD = 53,95). Au jour suivant la blessure, le site isolé non blessé est plus proche du site blessé (1Day_remote contre 1Day_infarcxt : CD = 34,48) que de l’état basal. Trois jours après la blessure, les schémas vasculaires du site blessé et du site distant non blessé associé présentent une déviation drastique de l’état basale et l’un de l’autre (basal vs. 3Days_Infarct : CD = 240,63 ; Basal vs. 3Days_Remote : CD = 67,28 ; 3Days_Remote contre 3Days_Infarct : CD = 168,35). Fait très intéressant, 7 jours après la blessure, les schémas vasculaires du site blessé et du site isolé non blessé occupent un espace 3D approximativement orthogonal à la condition basale, tout en étant alignés à une distance plus proche qu’à un jour après la blessure (CD = 24,76 pour le 7e jour contre 34,48 pour le premier jour). Les données suggèrent deux choses : (1) au fur et à mesure que la guérison progresse, le schéma vasculaire du site blessé et du site éloigné non blessé adopte des schémas distincts de la condition basale ; (2) le programme de reconstruction activé sur le site blessé déclenche également des changements morphologiques similaires sur leurs sites isolés non blessés associés.

À titre de référence pour la polyvalence de la transformée LCPC, les métriques traditionnelles de la surface en pourcentage (Figure 5A) et du périmètre total (Figure 5B) des vaisseaux sanguins ont été calculées. Bien que la zone et le périmètre révèlent des changements entre les points du cours temporel, ils ne fournissent pas une quantification cohérente des agencements spatiaux distincts des vaisseaux. La surface et le périmètre sont des abstractions qui peuvent représenter de nombreux arrangements vasculaires différents et ne sont donc pas instructifs sur la façon dont l’agencement spatial des vaisseaux évolue au fil des conditions de traitement et au cours du temps. Avec n = 3 pour chaque groupe, le test t et le test de Wilcoxon sont peu fiables. Le Delta de Cliff est non paramétrique et fonctionne bien pour montrer un changement de taille de l’effet. La principale différence révélée en mesurant le pourcentage de surface des vaisseaux sanguins se situe entre la condition basale et les points de temps sur 7 jours ; Pour le périmètre total des vaisseaux sanguins, les différences sont entre la condition basale vs. 1 jour et la condition basale vs. 7 jours. Cependant, la zone et le périmètre ne montrent aucune indication qu’il existe des différences entre les sites infarctus et leurs sites isolés non blessés, ce qui est très surprenant étant donné que le site infarctus a été volontairement blessé. C’est ici que la polyvalence de la transformation LCPC se distingue par rapport aux métriques traditionnelles. Pour chaque échantillon, les résultats de la FFT dans le cadre de la transformée LCPC produisent un ensemble de grandeurs associées à un ensemble de fréquences. Les magnitudes de chaque bine de fréquence peuvent être moyennées puis comparées entre les groupes de traitement (Figure supplémentaire 1). Cela permet une évaluation simple des bacs de fréquence présentant les plus grandes différences entre les groupes traités. La figure 5C montre six bacs présentant des différences nettes de taille d’effet entre différents groupes de traitement, en particulier entre les sites infarctus et leurs sites éloignés non blessés associés, la zone et le périmètre indiqués n’ayant aucune différence. Les valeurs indépendantes dans ces six bacs fournissent plusieurs indices qui montrent des différences quantitatives entre les conditions de traitement. Fait intéressant, le motif entre les groupes pour le Bin 1 des résultats de la transformée LCPC est similaire à celui obtenu en mesurant le périmètre total. Les autres indices, cependant, révèlent des différences quantitatives cachées à la fois dans la zone et en périmètre. Indices uniques à la condition basale : Bin 49, Bin 56, Bin 21. Indices uniques entre les groupes du jour 1 : Bin 1, Bin 6, Bin 49. Indices uniques aux groupes du jour 3 : Bin 6, Bin 112, Bin 49. Indices uniques aux groupes du jour 7 : Bin 6, Bin 49, Bin 112. Ces données soulignent la polyvalence et la précision de la transformation LCPC par rapport aux approches traditionnelles de zone et de périmètre.

Figure 1 : Description du système de grille radiale de la transformée LCPC. (A) Étape 1 : La forme d’intérêt est segmentée et extraite sous forme de masque bleu. Étape 2 : Une boîte englobante (aussi appelée le plus petit rectangle qui entoure et touche l’objet sur les quatre côtés) est déterminée pour le masque. Un système de lignes de grille radiales partant du centre de la boîte englobante est superposé au masque. La décision de choisir le centre de la boîte englobante au lieu du centroïde de l’objet comme origine était arbitraire. Étape 3 : La distance de chaque intersection entre une ligne de grille et la forme est calculée par rapport à l’origine. Les lignes de grille qui ont plus d’une intersection additionnent toutes ces distances d’intersection en une seule valeur pour cette ligne de grille. Étape 4 : La FFT est appliquée pour convertir les données de l’étape 3 en un diagramme de fréquence, une représentation statique multidimensionnelle (étape 5) de la forme de l’étape 1. Étape 6 : Une valeur scalaire peut être créée à partir de l’étape 5 via un indice. Voir la Figure 10 pour une discussion sur les types d’indices à calculer. (B) Un organigramme montrant une description simplifiée des étapes de la transformée LCPC pour le système de grille radiale. (C) Exemples de thèmes de formes pour lesquels le système de grille radiale est optimal. Les formes ont été dessinées dans Microsoft PowerPoint. Ces images sont créées par des auteurs et ne nécessitent aucune licence de publication ni autorisations de droits d’auteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Description du système de grille parallèle de la transformée LCPC. (A) Étape 1 : La forme d’intérêt est segmentée manuellement et extraite sous forme de masque binaire. Étape 2 : Un système de grille parallèle est superposé à la forme, qui est tournée de façon à ce que la base soit horizontale. Étape 3 : La distance de chaque intersection entre une ligne de grille et la forme est calculée par rapport à la ligne de base. Les lignes de grille qui ont plus d’une intersection additionnent toutes ces distances d’intersection en une seule valeur pour cette ligne de grille. Étape 4 : La FFT est appliquée pour convertir les données de l’étape 3 en un graphique de fréquence, une représentation statique multidimensionnelle de la forme de l’étape 1. Étape 6 : Une valeur scalaire peut être créée à partir de l’étape 5 via un indice. Voir la Figure 10 pour une discussion sur les types d’indices à calculer. (B) Un organigramme fournissant une description simplifiée des étapes de transformation LCPC pour le système de grille parallèle. (C) Exemples de thèmes façonnant pour lesquels le système de grille parallèle est optimal. Les formes ont été dessinées dans Microsoft PowerPoint. Ces images sont créées par des auteurs et ne nécessitent aucune licence de publication ni autorisations de droits d’auteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : La transformée LCPC identifie objectivement les sous-types morphologiques des organoïdes atteints du cancer du sein. (A) Les organoïdes mammaires humains primaires ont été dérivés comme précédemment^{rapporté 17, 20, 21}et décrit dans le Fichier Supplémentaire 1. Trois phénotypes pouvaient être observés et classés sur la base d’une inspection visuelle : kystique, polykystique et polykystique dense. Barre-échelle = 50 μm. (B) Les contours extérieurs des organoïdes étaient segmentés manuellement (Figure Supplémentaire 2 ; critères décrits dans le Fichier Supplémentaire 1), et la forme pure de ces contours a été obtenue. Notez que les contours du diagramme sont tous tournés de sorte que la ligne interne la plus longue soit verticale ; ainsi, elles ne correspondent pas à leur orientation d’origine. La transformée LCPC à grille radiale a ensuite été appliquée, et les résultats ont été analysés via PCA. Le regroupement K-means a identifié trois groupes (0, 1 et 2), et des scores de silhouette (SS) ont été calculés pour confirmer leur existence. Cluster 0 contre 1, SS : 0,68 ; Cluster 0 contre 2, SS : 0,27 ; Cluster 1 contre 2, SS : 0,69. (C) Les contours extérieurs des organoïdes ont également été mesurés à l’aide de la transformée radiale LCPC sur leurs formes à l’échelle, c’est-à-dire les formes telles qu’elles apparaissent dans les images les unes par rapport aux autres, sans aucun redimensionnement. L’encadrement est agrandi pour montrer le regroupement plus lâche des organoïdes polykystiques et denses par rapport aux organoïdes kystiques. Pour B et C : Vert = kystique, Violet = polykyste, Jaune = polykystique dense. (D) Les trois premières valeurs de PC sont tracées séparément pour chaque phénotype, et la moyenne de la KNND est calculée pour montrer que le phénotype kystique est le plus densément rempli, tandis que les phénotypes polykystiques et polykystiques denses présentent une densité moindre (ce qui signifie plus d’hétérogénéité). Bien que tracés séparément, les trois phénotypes partagent le même espace PCA. Pour le phénotype kystique, la KNND moyenne a été calculée à partir de l’ensemble car les valeurs aberrantes présentes uniquement dans ce phénotype faussent le calcul. Taux de KNND moyen : Kystique, 1,061 ; Polykystique, 1,575 ; Polykystiques denses, 2,247. (E) Les diagrammes en boîte de la surface des organoïdes montrent une dispersion décroissante des points de données allant des organoïdes kystiques aux organoïdes polykystiques puis aux organoïdes polykystiques denses, ce qui est l’opposé de ce qui est observé dans l’analyse LCPC à l’échelle (Figure 3C), soulignant que l’information spatiale captée par la transformée LCPC diffère de ce que la zone capture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Mesure de la densité de texture avec la transformée LCPC en grille parallèle. (A) Des photomicrographies de la microvascularisation dans le tissu cardiaque avaient été obtenues précédemment dans une autre étude^31,32. Les images ne sont pas reproduites à proprement parler de ces études ; ils représentent plutôt de nouvelles vues générées à partir du même ensemble de données d’imagerie 3D originale^{rapporté 31} et fourni par Gkontra. Bien que le jeu de données ait déjà été publié, les images spécifiques présentées ici sont publiées pour la première fois. Les images des sites isolés qui n’ont pas été blessés à chaque moment ne sont pas montrées. Étape 1 : Un masque 2D est généré, et l’axe général d’alignement des vaisseaux est déterminé (double flèche rouge). Étape 2 : Une région circulaire centrée sur le point médian de l’image est obtenue afin de forcer chaque image à avoir la même hauteur après que les images aient été tournées à des degrés variables à l’étape suivante (faire tourner les images carrées à des degrés variables modifiera la hauteur de l’image selon le degré de rotation). Étape 3 : Chaque image est tournée de sorte que l’axe général d’alignement déterminé à l’étape 1 soit vertical. Étape 4 : Une bordure bleue uniforme est appliquée autour de chaque image pour garantir que chaque image ait le même diamètre, car les images à densité plus clairsemée peuvent être plus courtes (exemple : voir « 7 jours post-infarctus du myocarde » à l’étape 3). Étape 5 : La transformée LCPC en grille parallèle est appliquée. (B) Diagrammes en points des trois premiers PC de la sortie de la transformée LCPC en grille parallèle (Violet : état basal, Vert : site infarcté, Jaune : site non blessé éloigné du site infarctus). Voir la section résultats pour les calculs de distance de chanfrein à chaque moment entre les trois conditions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : La transformée LCPC mesure les caractéristiques cachées dans la zone et le périmètre. Pour comparaison avec les métriques de forme traditionnelles, (A) la surface en pourcentage et (B) le périmètre total des réseaux vasculaires ont été mesurés. (C) Pour montrer la précision obtenable du résultat de la transformée LCPC, la valeur des bines de fréquence individuelles résultant de la FFT a été comparée (Figure supplémentaire 1). Six bins de fréquence ont été choisis comme indices pour quantifier objectivement les différences entre les groupes traités. Pour tous les panneaux, en raison de la taille d’échantillon limitée de chaque groupe (n = 3), le Delta de Cliff non paramétrique pour la taille de l’effet a été calculé au lieu d’une valeur p du test de somme des rangs de Wilcoxon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : L’importance d’orienter systématiquement les formes pour extraire des données propres. (A) Un exemple de formes identiques qui sont des images miroir les unes des autres, et comment le système de grille parallèle détermine leur orientation distincte, produisant ainsi des résultats différents. (B) Un exemple de comment inverser la Forme 2 horizontalement, de sorte que son orientation corresponde désormais à la Forme 1 et devienne une comparaison plus juste avec la Forme 1. Dans cette configuration, la transformée LCPC en grille parallèle donne les mêmes résultats pour la Forme 1 et la Forme 2. Cette modification de l’orientation ne devrait être effectuée que s’il n’existe aucun contexte spatial suggérant que la Forme 2 ne devrait pas être modifiée. (C) Un exemple de quatre variantes d’objets ressemblant au nombre « 3 », certains étant orientés dans la mauvaise direction. (D) Un exemple de comment orienter chaque objet afin de maximiser la propreté des données résultant de la transformée LCPC en grille parallèle. (E) Un exemple de mesure de la bosse plus large des éléments du Panneau C selon les mêmes règles d’orientation que pour le Panneau D. (F) Un exemple de mesure des grandes ampoules des éléments du Panneau C tout en conservant leur contexte d’alignement comme dans le Panneau D. La motivation de conserver les règles d’alignement dans le panneau D est de disséquer la contribution de l’information spatiale dans le renflement plus large par rapport à la contribution du renflement plus étroit dans ces règles. Voir la Figure 3 complémentaire pour les spectres FFT associés à C–F. Les images de A à B sont des icônes provenant de Microsoft PowerPoint. Les formes dans C-F étaient dessinées dans Microsoft PowerPoint. Ces images sont créées par des auteurs et ne nécessitent aucune licence de publication ni autorisations de droits d’auteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 7 : L’incapacité des métriques de forme traditionnelles à enregistrer un contexte évident. (A) La série de coches a la même forme mais augmente de taille de gauche à droite. Dans cette série, la zone de chaque coche est différente tandis que le concept de forme reste le même : c’est-à-dire qu’elles restent le même style de coche. (B) Un carré est tourné autour de son centre de 45 degrés jusqu’à ce que son concept de forme devienne ce que les humains appellent un losange. Bien que le concept de forme d’un carré soit très distinct de celui d’un losange, les rotations intermédiaires sont subjectivement interprétées soit comme des « carrés inclinés » soit comme des « losanges inclinés ». La transformée LCPC peut mesurer objectivement et précisément la différence à chaque étape de cette série. Les formes ont été dessinées dans Microsoft PowerPoint. Ces images sont créées par des auteurs et ne nécessitent aucune licence de publication ni autorisations de droits d’auteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 8 : Explication de la forme pure vs. de la forme à l’échelle. Mesurer les objets « à l’échelle » signifie mesurer la forme des objets selon leur taille d’origine par rapport aux autres. « Forme Pure », en revanche, signifie mesurer la forme de différents objets à une échelle similaire, ce qui supprime l’effet de la taille sur la forme. Il est important de trouver une manière objective de redimensionner les objets comparés. La ligne interne la plus longue est souvent un choix optimal (Étape 1). Les deux objets sont tournés de sorte que la plus longue ligne interne soit horizontale (Étape 2). Dans ce cas, les deux objets sont également tournés de sorte que le côté en incastration soit orienté vers le bas. Ensuite, la largeur de chaque objet, qui est désormais de la même magnitude que la ligne interne la plus longue de chaque objet, est redimensionnée pour atteindre 400 pixels tout en limitant le rapport d’aspect pour éviter que les objets ne détournent les objets (Étape 3). Enfin, il est optionnel de faire pivoter les objets redimensionnés de 90 degrés (Étape 4) (dans ce cas, dans le sens antihoraire) avant d’appliquer la transformée LCPC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 9 : Exemple de marqueurs spatiaux pour la recherche sur le cancer. (A) Un exemple hypothétique de cellules migrant en culture 2D en étendant leurs lamellipedies dans la direction de la migration. Dans le contexte de la morphologie migratoire des cellules épithéliales, orienter le contour de chaque cellule de sorte que la ligne interne la plus longue qui s’aligne avec l’axe de migration soit verticale est le plus pertinent pour capturer le contexte spatial. (B) Exemples hypothétiques de tumeurs ou de lésions précancéreuses qui se développent dans un enfermement qui ne change pas de forme. La lésion se développe à partir d’une tige, qui constitue la structure centrale de soutien. À mesure que la lésion grandit ou se ratatina, son contour se déplace vers ou s’éloigne de la paroi interne de l’enveloppe. Les lignes pointillées représentent une manière rationnelle et objective de définir la part de l’enveloppe à tracer (ligne orange), de sorte que ni trop peu ni trop d’informations supplémentaires soient ajoutées. (C) L’option 1 montre la transformée LCPC en grille parallèle appliquée au contour des lésions sans contexte de l’emplacement de l’enveloppe. L’option 2 montre la même chose, mais en incluant le contexte spatial de l’emplacement de l’enveloppe. Par exemple, les points rouges représentent les intersections entre la ligne de grille (flèche noire, ligne verte) et le contour. L’option 2 fait que chaque ligne de grille crée une quatrième intersection qui n’existe pas dans l’option 1, ce qui ajoute quantitativement un contexte spatial au résultat de l’option 2, complètement absent dans l’option 1. Les formes ont été dessinées dans Microsoft PowerPoint. Ces images sont créées par des auteurs et ne nécessitent aucune licence de publication ni autorisations de droits d’auteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 10 : Résultats hypothétiques de la FFT et indices communs pouvant en déduire. (A) Le graphique de fréquence résultant de la FFT de deux formes hypothétiques est affiché. Puisque les magnitudes des pochettes 3 et 4 présentent une tendance opposée, un rapport entre ces deux bandes sera un bon indice représentant une différence entre ces deux formes. Les lignes pointillées rouge et verte représentent d’autres bines de fréquence qui pourraient être utilisées pour obtenir de bons indices. (B) Un histogramme de deux formes hypothétiques dont les profils FFT présentent une tendance décroissante par étapes, représentant leurs différences morphologiques. (C) Un histogramme de deux formes hypothétiques dont les profils FFT diffèrent le plus dans la région centrale le long de l’étendue des bines de fréquence. (D) Exemples de caractéristiques morphologiques hypothétiques pouvant fournir des indices corrélés à leur présence. Les formes ont été dessinées dans Microsoft PowerPoint. Ces images sont créées par des auteurs et ne nécessitent aucune licence de publication ni autorisations de droits d’auteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure supplémentaire 1 : Diagrammes en boîte comparant les amplitudes de différentes bandes de fréquence à travers les résultats de la transformation LCPC des réseaux vasculaires. La transformée LCPC des réseaux vasculaires illustrée aux Figures 4 et 5 donne un ensemble de bandes de fréquence et leurs magnitudes représentant chaque image. Des graphiques en boîte moustachue des magnitudes de chaque bac sont utilisés pour comparer tous les groupes de traitement, en identifiant quel bac sert le mieux d’indice pour stratifier la densité de texture mesurée via la transformée LCPC. Chaque graphique boîte-moustache se compose de n = 3 images indépendantes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Exemple d’organoïdes segmentés de tumeurs mammaires. Les organoïdes étaient segmentés manuellement par un expert qui les cultivait régulièrement et les examinait à la microscopie. Cette figure montre des exemples de contours organoïdes segmentés. La barre d’échelle pour toutes les images microscopiques est de 50 μm. Les cellules humaines primaires utilisées dans cette étude ont été obtenues et cultivées selon des approbations éthiques et des procédures de consentement éclairé^{rapportées 21}. Les images présentées ici proviennent de ces cultures cellulaires approuvées et sont publiées pour la première fois. Aucune collecte supplémentaire de spécimens humains n’a été entreprise. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 3 : Spectres FFT pour les formes de la Figure 6. Les résultats des FFT pour les formes de la Figure 6 sont fournis ici afin que les lecteurs puissent comprendre l’effet de la modification de l’orientation de la forme sur leurs informations spatiales. La colonne de gauche des graphes a des axes y non modifiés, tandis que la colonne de droite a des axes tronqués de sorte que les valeurs de bin les plus petites peuvent être visualisées. (A) Les spectres issus de la transformation LCPC en grille parallèle des quatre formes de la Figure 6C telles qu’elles sont affichées, ce qui signifie qu’aucune réorientation n’est faite. (B) Spectres issus de la transformation LCPC en grille parallèle des formes de la Figure 6D, qui ont été réorientées comme décrit dans le texte. (C) Spectres issus de la transformée LCPC en grille parallèle des formes dans la Figure 6E. (D) Spectres issus de la transformée LCPC en grille parallèle des formes dans la Figure 6F pour comparaison avec ceux de la Figure 6E. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Détails détaillés sur les meilleures pratiques pour la transformation LCPC. Ce fichier complémentaire propose une discussion approfondie sur les meilleures pratiques et des notes méthodologiques supplémentaires. Le plan du document est le suivant : Section 1 - Contexte spatial que la surface, le volume, le périmètre et la rugosité ne peuvent pas capturer. Section 2 - Meilleures pratiques pour l’utilisation de la transformation LCPC et l’interprétation des résultats. Section 3 - Comprendre la polarité inhérente de la nature afin de maximiser la transformation LCPC. Section 4 - Interprétation des spectres FFT résultant de la transformée LCPC. Section 5 - Comment orienter les formes avant de les mesurer avec la transformée LCPC. Section 6 - Qu’est-ce que « forme pure » vs. « à l’échelle » ? Section 7 - Notes méthodologiques sur les méthodes statistiques. Section 8 - Notes méthodologiques sur la culture cellulaire et la segmentation des organoïdes. Section 9 - Paramètres de la FFT pour ceux qui codent leur propre transformation LCPC. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Comme pour tout outil informatique, la qualité de la sortie dépend du respect des règles attendues autour desquelles l’outil a été conçu. Les règles suivantes doivent être suivies et utilisées comme contrôles qualité lors de l’utilisation des scripts Python fournis. Tout d’abord, assurez-vous que les masques ouverts soient des lignes bleues sur fond blanc. Le bleu était une décision arbitraire et n’a aucune signification, mais les scripts qui effectuent la transformation LCPC ont été écrits pour rechercher des pixels bleus sur un fond blanc. Deuxièmement, ne lancez pas les scripts de transformation LCPC sur des images ayant moins de 10 pixels d’espace blanc sur les quatre côtés. Regardez cette vidéo pour une explication : « Le paramètre d’épaisseur de marge - Comment préparer les contours de forme ^»33. Troisièmement, ce script suppose que les contours de votre objet sont des pixels bleus sur un fond blanc. L’épaisseur de la ligne doit être comprise entre 5 et 10 pixels. Regardez cette vidéo pour une explication : « Le paramètre d’épaisseur de ligne - Comment préparer les contours de forme ^»34. Quatrièmement, ne lancez pas les scripts de transformation LCPC sur des images vierges. Cela provoquera une erreur dans le script. Cinquièmement, ne faites pas tourner les scripts de transformation LCPC sur des images ne contenant qu’un grain de débris. Cela provoquera une erreur car le système de grille peut ne pas détecter la tache et tenter donc d’analyser une image vide. Sixièmement, ne lancez pas les scripts de transformation LCPC sur des images contenant des particules de débris indésirables. Les débris modifieront la hauteur et la largeur de l’objet masque ouvert et entraîneront ainsi des résultats inexacts. Septièmement, regardez cette vidéo pour comprendre pourquoi il est important de comprendre l’échelle de vos objets avant de les analyser avec la transformée LCPC : « Le paramètre d’échelle - Comment préparer les contours de forme ^»35.

L’un des aspects les plus étonnants de la transformation LCPC est sa capacité à capturer le contexte spatial. La biologie regorge de contexte spatial crucial pour comprendre la nature. Par exemple, les cellules épithéliales ont une polarité apicale-basale 36,37,38,39. De plus, la direction de la gravité, qui est modifiée en microgravité, a des effets significatifs à la fois sur la physiologie des^{astronautes 40,41} et la morphologie des cellules^{cancéreuses 42,43,44}. Enfin, la prénéoplasie et la néoplasie in situ peuvent se transformer en lumens via une tige qui sert de structure de soutien centrale, donnant accès à l’apport sanguin. Ainsi, lorsque ces lésions régressent, elles régressent à la fois loin de la cavité luminale et vers la tige^45,46. Parce qu’elle a été conçue pour cela, la transformée LCPC est très sensible au contexte spatial et peut donc introduire une hétérogénéité supplémentaire si l’utilisateur n’est pas prudent. La Figure 6 décrit comment orienter systématiquement les formes avant d’appliquer la transformée LCPC. La figure 7 décrit comment la géométrie traditionnelle ne peut pas mesurer des concepts de forme évidents pour les humains. La figure 8 fournit un diagramme qui visualise la différence entre mesurer la forme pure et la forme à l’échelle. La figure 9 décrit que le contexte spatial est souvent négligé lors de la quantification des formes en culture 2D, en histologie et en tranches 2D issues de l’imagerie 3D. Notez qu’en raison des limitations d’espace, le Fichier Supplémentaire 1 contient une discussion approfondie de la Figure 6 et de la Figure 7 dans la Section 5, ainsi que des Figure 8 et Figure 9 de la Section 6.

Parce que la FFT produit des données spectrales multidimensionnelles, il est important que l’utilisateur se sente à l’aise pour dériver des indices à partir de motifs récurrents dans les spectres. Bien que ce manuscrit fasse référence à la transformée LCPC comme incluant l’étape d’application de la FFT, la transformée LCPC réelle a lieu avant l’étape FFT (Figure 1A–B Step 4, Figure 2A–B Step 3). Cependant, l’application de la FFT révèle des insights objectifs et systématiques issus du domaine fréquentiel de la sortie de la transformée LCPC. Ainsi, la transformée LCPC ne serait pas aussi efficace sans inclure la FFT comme étape finale. Dans la transformée LCPC, la FFT donne une série de bins et leurs magnitudes, tous une représentation statique multidimensionnelle de l’entrée de contour à l’étape 1. Une analogie d’une représentation statique multidimensionnelle de l’information est le numéro de téléphone à neuf chiffres représentant le canal de communication téléphonique d’une personne aux États-Unis. Bien que plus lourdes que les représentations en valeurs scalaires des formes (comme 85 cm de long, 56 degrés de large, etc.), les données multidimensionnelles contiennent beaucoup plus d’informations pour extraire des insights. La figure 10 montre plusieurs motifs spectraux observés lors de l’application de la transformée LCPC et comment en déduire les indices. La section 4 du Fichier Supplémentaire 1 aborde la Figure 10 de manière plus approfondie.

Le domaine fréquentiel de la transformée LCPC révèle des caractéristiques objectives et quantitatives d’une forme 2D que l’œil nu ne peut pas percevoir facilement. Des différences très subtiles de courbure, de déchiqueté et de tortuosité peuvent être quantifiées de manière robuste. Cependant, une fois les sous-types morphologiques identifiés via cette méthode, des thèmes visuellement distincts peuvent être observés et corrélés aux différences quantitatives. Cette caractéristique rend la transformée LCPC interprétable comme méthode d’extraction d’informations spatiales pour les modèles d’apprentissage automatique (ML) et rend les modèles ML résultants eux-mêmes plus interprétables. Bien que les réseaux de neurones soient une méthode puissante d’apprentissage automatique, leurs résultats ne sont souvent pas interprétables par l’humain, ce qui pose un problème important dans le domaine de l’intelligence artificielle (IA) médicale. Les médecins hésitent à utiliser un modèle d’apprentissage automatique pour les décisions cliniques s’ils ne comprennent pas pourquoi ce modèle prend de mauvaises décisions. De plus, si aucun humain ne comprend pourquoi ou comment un modèle a pris une décision biaisée, alors corriger cela devient insoluble.

Il convient d’ajouter à la discussion sur la mesure de la densité de texture (Figures 4 et 5) que l’œil humain est facilement confus par des illusions d’optique ou des motifs désordonnés. Un arrangement aléatoire de motifs complexes est souvent interprété comme aléatoire, non mesurable ou ne valant pas la peine d’être mesuré. La transformée LCPC peut mesurer des différences reproductibles, objectives et quantitatives dans des motifs apparemment aléatoires. Cependant, à moins que l’utilisateur ne soit formé à ne pas se laisser tromper par des schémas chaotiques et désordonnés dans la nature qui se font passer pour du hasard, aucune tentative ne sera faite pour mesurer le trouble afin de découvrir des schémas prévisibles. Les schémas prévisibles indiquent clairement que le système n’est pas complètement aléatoire. La transformée LCPC a été inventée dans le but de mesurer des formes subtilement différentes ou inconcevablement différentes à l’œil nu. Parce que de nombreuses morphologies dans la nature présentent des différences mineures qui ressemblent davantage à une hétérogénéité chaotique dénuée de sens qu’à des sous-types prévisibles de troubles – chacun corrélé à des fonctions biologiques distinctes – le cadre conceptuel suivant en « quatre étapes » a été développé pour être utilisé en conjonction avec la transformée LCPC. Premièrement, résistez à l’idée qu’un système à l’apparence complexe soit aléatoire. Deuxièmement, appelez l’hétérogénéité chaotique un « trouble » puis trouvez un type d’ordre pouvant servir de condition de référence rationnelle. Supposez que le trouble s’écarte de la référence. Troisièmement, trouvez un moyen de mesurer objectivement le motif qui est la référence, comme la transformée LCPC. Quatrièmement, appliquer cette même méthode objective à la mesure de ce qui est considéré comme le désordre dans le système.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Add 100 pixels to margins.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Average K-means Nearest Neighbor via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/modules/generated/sklearn.neighbors.NearestNeighbors.html	Used the NearestNeighbors function within the sklearn.neighbors package
BLUE_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Chamfer Distance via scipy version 1.15.1	SciPy	https://docs.scipy.org/doc/scipy/reference/generated/scipy.spatial.cKDTree.html	Used cKDTree function within scipy.spatial package
Cliff's Delta	Tissue Spatial Geometrics Lab	https://github.com/dh2nguyen/Cliffs-Delta	Created an implementation of Cliff's Delta via the Python language
Enlarge Image Size by 3X.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Fiji/ImageJ v2.14.0	ImageJ.net	https://imagej.net/
Flip images HORIZontally.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Flip images VERTically.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
GREEN_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Isolate Objects Empty Blue.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
MacOS Preview Version 11.0	Apple Inc	https://support.apple.com/guide/preview/welcome/mac
Master Script_Parallel Grid LCPC_DN_071025.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Radial-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Master Script_Radial Grid LCPC_bBoxCentered.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Parallel-Grid-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Microsoft Paint	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/windows/tips/paint	Was mentinoed as a potential useful tool for manual segmentation, but not used in this study
Microsoft Powerpoint Version 16.109.3	Microsoft	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/powerpoint/cfq7ttc0pbmc
PINK_Color Extraction.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Principal Component Analysis (PCA) via sklearn version 1.6.1	SciKit Learn	https://scikit-learn.org/stable/api/sklearn.decomposition.html	Used the PCA function with the sklearn.decomposition package
RED_Color Extraction (Mac).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
RED_Color Extraction (Windows).ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Resize width to 400 pixels but constrain aspect ratio.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate CLOSED Object Horizontal by Longest Internal Length.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate Green Line_v3.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CCW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Rotate images 90CW.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Thicken Blue Lines.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook
Trim margin to 1-pixel border.ipynb	Tissue Spatial Geometrics Lab	GitHub Repo Name: Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform | GitHub Repo Address: https://github.com/dh2nguyen/Pre-Processing-Tools-for-LCPC-Transform	Python Script in a Jupyter Notebook