Identification des constituants anti-paralysique cérébrales ciblant l’AChE chez Coptis chinensis par ultrafiltration d’affinité et validation expérimentale

Résumé

Le but de cette étude était d’identifier les principaux composants actifs de Coptis chinensis et d’élucider son action dans l’intervention de la paralysie cérébrale (PC) par l’ultrafiltration d’affinité et la vérification expérimentale.

Résumé

L’objectif de cette étude était d’identifier les principaux composants actifs de Coptis chinensis et d’élucider ses mécanismes d’action dans l’intervention de la paralysie cérébrale (PC) par l’ultrafiltration d’affinité. En utilisant l’acétylcholinestérase (AChE) comme cible, la coptisine a été éliminée de l’extrait de C. chinensis comme composant ayant la plus forte capacité de liaison, qui a montré un taux de liaison de 21,9 % et une activité inhibitrice significative in vitro (IC₅₀ = 3,24 μg/mL). Des simulations d’amarrage moléculaire et de dynamique moléculaire ont démontré que la coptisine pouvait se lier de manière stable à la poche active d’AChE. Par la suite, des expériences de vérification ont été menées sur un modèle néonatal de rat présentant des lésions cérébrales hypoxiques-ischémiques (HIBD). Les résultats ont montré que l’intervention avec la coptisine (10 mg/kg) a significativement amélioré l’apprentissage spatial et les déficits de mémoire chez les animaux modèles, augmenté le flux sanguin cérébral dans l’hémisphère blessé, soulager les lésions pathologiques des tissus cérébraux et inhibé l’activation anormale de l’AChE dans le cerveau. En résumé, cette étude a combiné la technologie d’ultrafiltration d’affinité et a confirmé que la coptise, identifiée à partir de l’extrait de C. chinensis, peut inhiber l’AChE et exercer des effets neuroprotecteurs ainsi que des effets améliorant le flux sanguin cérébral. Il sert de base matérielle clé pour C. chinensis afin d’atténuer les déficits neurologiques de type CP, fournissant ainsi des molécules candidates et des preuves scientifiques pour le développement de médicaments apparentés.

Introduction

La paralysie cérébrale (PC) est un syndrome permanent causé par des lésions non progressives du cerveau en développement chez les fœtus ou les nourrissons, caractérisé principalement par des dysfonctions motrices et des anomalies posturales. Bien que plusieurs approches de traitement cliniques soient actuellement disponibles pour la PC (PC), il subsiste un manque de médicaments idéaux capables de réparer fondamentalement les déficits neurologiques avec des effets secondaires minimes. Contrairement aux médicaments synthétisés chimiquement, qui agissent généralement sur des cibles uniques et présentent un potentiel de toxicité relativement élevé, les médecines traditionnelles chinoises (MTC), avec leurs avantages de régulation multi-composantes, multi-cibles et holistiques ainsi que les profils de sécurité favorables démontrés dans la pratique clinique à long terme, apportent de nouvelles perspectives et constituent un réservoir de candidats médicamenteux pour le traitement des troubles cérébraux^{complexes 1,} 2,3,4,5,6. Par conséquent, l’exploration de composants chimiques hautement efficaces et à faible toxicité issus des MTC revêt une importance scientifique et une valeur clinique^{significatives 7}.

Parmi les mécanismes pathologiques complexes de la paralysie cérébrale, le dysfonctionnement du système nerveux cholinergique joue un rôle central ^8,9. L’acétylcholinestérase (AChE) est une enzyme clé qui hydrolyse le neurotransmetteur acétylcholine (ACh). Une activité excessivement élevée de cette enzyme entraîne une déplétion de l’ACh, altère la transmission du signal cholinergique, et aggrave par conséquent le contrôle moteur et les dysfonctions cognitives. Par conséquent, l’AChE est devenue une cible importante et bien établie pour le développement d’agents neuroprotecteurs. Inhiber l’activité de l’AChE pour augmenter les niveaux d’ACh dans la fente synaptique est reconnu comme l’une des stratégies efficaces pour atténuer les déficits neurologiques liés à la PC. Dans le contexte des lésions cérébrales hypoxique-ischémiques, la perturbation de la neurotransmission cholinergique peut aggraver davantage les dysfonctionnements neuronaux, contribuant ainsi à des troubles moteurs et cognitifs liés à la PC. Ainsi, l’AChE a été sélectionnée dans cette étude non seulement comme cible neurofonctionnelle classique, mais aussi comme un point d’entrée mécaniquement pertinent pour le dépistage de composés bioactifs présentant des effets potentiels anti-PC.

Des recherches modernes ont montré que les plantes médicinales présentent une large gamme de valeurs d’activité pharmacologique. En tant que médecine traditionnelle chinoise classique pour éliminer la chaleur et assécher l’humidité, Coptis chinensis constitue un système complexe abondant en divers alcaloïdes isoquinolines. En plus de la célèbre berbérine, elle contient également une série de composants aux structures similaires et aux activités pharmacologiques variées, telles que la coptise, l’épibérine, la palmatine et la jatrorrhizine¹⁰. Ces alcaloïdes forment collectivement la base matérielle des effets pharmacologiques de C. chinensis. Des études antérieures ont démontré que C. chinensis et ses alcaloïdes possèdent des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes et potentiellement neuroprotectrices. Cependant, étant donné un système de composants aussi complexe, il est difficile d’identifier rapidement et précisément les principaux composants actifs qui ciblent directement l’AChE, ce qui limite fortement l’élucidation approfondie des mécanismes sous-jacents aux effets de C. chinensis sur la lésion^{cérébrale 11}.

Comparé à l’isolation guidée par activité conventionnelle, qui nécessite généralement des fractionnements répétés, des tests de bioactivité et une purification et peut entraîner la perte ou la négligence de composés à faible abondance mais à forte affinité, l’ultrafiltration d’affinité permet un criblage rapide des ligands de liaison à la cible directement à partir de mélanges complexes. Cette technique permet une « pêche » efficace et rapide des ligands actifs qui se lient à des cibles spécifiques (par exemple, AChE) directement à partir des extraits de brut multicomposantes des MTC. Il convient particulièrement aux systèmes comportant plusieurs composants alcaloïdes, tels que C. chinensis, permettant l’identification précise des composants effectifs qui interagissent directement avec la cible à partir du mélange^{complexe 12}. Combiné à des approches computationnelles incluant le docking moléculaire et les simulations de dynamique moléculaire, il peut prédire intuitivement le mode de liaison, les types d’interactions et la stabilité complexe entre les composants et les protéines cibles au niveau atomique, fournissant ainsi des preuves théoriques solides et des explications mécanistes des résultats du criblage^{expérimental 13}.

Sur la base de ce contexte, cette étude propose l’hypothèse scientifique suivante : parmi les différents alcaloïdes présents chez C. chinensis, il existe des composants actifs capables d’inhiber spécifiquement l’AChE, et ces composants constituent la base matérielle de ses effets potentiels anti-paralysie cérébrales. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons intégré des techniques modernes de dépistage avec des méthodes de validation pharmacologique : d’abord, en utilisant l’AChE comme cible, la technologie d’ultrafiltration d’affinité a été employée pour dépister rapidement les inhibiteurs potentiels à partir de l’extrait multi-alcaloïde de C. chinensis ; De plus, des simulations d’amarrage moléculaire et de dynamique moléculaire ont été utilisées pour clarifier le mécanisme de liaison au niveau atomique ; enfin, des expériences animales in vivo ont été menées pour vérifier les effets améliorants des composants criblés sur le comportement, la pathologie du tissu cérébral et l’activité AChE chez les rats atteints de PC.

Protocole

Toutes les procédures de bien-être animal et expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique du bien-être animal de laboratoire du First People’s Hospital of Zunyi (n° d’éthique 2025-2-362). Pendant la période de modélisation et de traitement, l’état corporel et la survie des animaux étaient enregistrés quotidiennement.

Préparation de l’extrait de C. chinensis
Dans cette étude, un extracteur accéléré de solvants a été utilisé pour l’extraction accélérée de la fraction de n-butanol à partir de matériaux médicinaux de C. chinensis . Un total de 1 g de poudre séchée de C. chinensis a été pesé avec précision et placé dans des cellules d’extraction de 40 mL, respectivement. Des joints métalliques et des membranes filtrantes en fibre de verre étaient placés séquentiellement au-dessus et en dessous de la cellule d’extraction pour filtrer l’échantillon, et l’échantillon était enveloppé de sable de quartz. Lors du processus d’extraction, la température et la pression ont été réglées respectivement à 90 °C et 100 bars. L’extrait accéléré était collecté, et le solvant d’extraction était évaporé jusqu’à la sécheresse à l’aide d’un évaporateur rotatif pour obtenir des extraits séchés de différentes fractions polaires. Le méthanol : l’eau (50:50, v/v) a été choisi comme solvant de reconstitution. L’extrait était filtré à travers une membrane microporeuse de 0,45 μm et stocké à 4 °C. Avant la détection de l’échantillon, l’activité inhibitrice du solvant de reconstitution à blanc sur l’AChE a été étudiée. Les résultats ont montré que son effet inhibiteur était négligeable, indiquant que le choix du solvant de reconstitution dans cette expérience n’affecterait pas les résultats expérimentaux.

Essai d’inhibition de l’acétylcholinestérase
L’expérience a été réalisée sur une plaque à 96 puits. D’abord, le PBS a été ajouté, suivi de la séquence d’échantillons d’AChE (0,1 U/mL) et de C. chinensis . Après incubation à 37 °C pendant 10 minutes, une solution chromogénique de 5,5′-Dithiobis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB) et un substrat ATChI (10 mmol/mL) ont été ajoutés. Le mélange a été incubé à 37 °C pendant encore 10 minutes, et la réaction a été interrompue par l’ajout de 60 μL de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 1 %. L’absorbance a été mesurée à 405 nm. Chaque échantillon de C. chinensis a été constitué avec 4 groupes : groupe témoin a : PBS (120 μL), solution AChE (20 μL), solution DTNB (40 μL), solution ATChI (40 μL) et solution SDS (60 μL) ajoutés séquentiellement ; Groupe de contrôle blanc b : PBS (120 μL), solution DTNB (40 μL), solution ATChI (40 μL) et solution SDS (80 μL) ; Groupe d’échantillon c : PBS (80 μL), extrait de C. chinensis (20 μL), solution AChE (20 μL), solution DTNB (40 μL), solution ATChI (40 μL) et solution SDS (60 μL) ; Groupe blanc d’échantillon : PBS (100 μL), extrait de C. chinensis (20 μL), solution DTNB (40 μL), solution ATChI (40 μL) et solution SDS (60 μL). L’Huperzine A a été utilisée comme témoin positif avec une concentration initiale d’environ 2,5 mg/mL. La concentration initiale de l’extrait de fraction de n-butanol était d’environ 1 mg/mL. Huperzine A et les échantillons ont tous deux été dilués avec un gradient de 60 %. Le taux d’inhibition a été calculé selon la formule suivante : taux d’inhibition ( %) = [1 - (c - d)/(a - b)] × 100 %, où a, b, c et d représentent respectivement les valeurs d’absorbance du groupe témoin a, du groupe témoin blanc b, du groupe d’échantillon c et du groupe blanc d.

Le taux inhibiteur à chaque concentration testée a été calculé selon la formule décrite ci-dessus. Des courbes concentration-inhibition ont ensuite été construites en représentant le taux inhibiteur par rapport au logarithme de la concentration du composé. Les valeurs d’IC20, IC50 et IC80 ont été calculées par ajustement de régression non linéaire à l’aide du logiciel GraphPad Prism basé sur les courbes concentration-réponse ajustées, et ont été définies comme les concentrations nécessaires pour produire respectivement 20 %, 50 % et 80 % d’inhibition de l’activité AChE.

Essai d’ultrafiltration d’affinité
Une ultrafiltration d’affinité a été réalisée pour cribler les composés liant l’AChE à partir de l’extrait de C. chinensis . En résumé, une solution d’AChE (0,1 U/mL en PBS, pH 7,4) a été utilisée comme enzyme active. Le contrôle enzymatique inactivé a été préparé en chauffant la même solution d’AChE dans un bain-marie bouillante pendant 10 minutes. Pour chaque réaction, 200 μL de solution d’extrait de C. chinensis ont été mélangés avec 200 μL de solution active ou inactivée d’AChE et incubés à 37 °C pendant 30 minutes. Après incubation, le mélange était transféré dans un tube centrifugeuse d’ultrafiltration de 30 kDa et centrifugé à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Le complexe enzyme-ligand conservé a été lavé trois fois avec 200 μL de PBS dans les mêmes conditions de centrifugation afin d’éliminer les composants non liés. Par la suite, 200 μL de méthanol à 90 % ont été ajoutés pour dissocier et éluvoir les ligands liés à l’AChE, suivis d’une incubation pendant 10 minutes et d’une centrifugation à 12 000 × g pendant 10 minutes. L’éluate a été collecté, filtré et analysé par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Les composés enrichis dans le groupe enzymatique actif par rapport au contrôle enzymatique inactivé étaient considérés comme des composants potentiels de liaison^{à l’AChE 14}.

Analyse HPLC des principaux métabolites alcaloïdes
L’analyse chromatographique a été réalisée à l’aide d’un système HPLC équipé d’une pompe quaternaire, d’un autoéchantillonneur, d’un four à colonne et d’un détecteur ultraviolet-visible (UV-Vis). La séparation a été réalisée sur une colonne chromatographique C18 (250 × 4,6 mm, 5 μm) maintenue à 25 °C. La phase mobile était composée d’acétonitrile (A) et d’une solution de bicarbonate d’ammonium de 30 mmol/L contenant 0,7 % d’ammoniac et 0,25 % de triéthylylamine (B), délivrée à un débit de 1,0 mL/min. Le programme d’élution du gradient était le suivant : 0–15 min, 90 % à 75 % B ; 15–25 min, 75 %–70 % B ; 25–50 min, 70 % – 55 % B. Le volume d’injection était de 5 μL, et la détection UV était effectuée à 270 nm.

Pour l’analyse quantitative des principaux alcaloïdes de C. chinensis, chaque échantillon (0,02 g) a été pesé avec précision et extrait par ultrasons avec 10 mL de solution d’acide chlorhydrique–méthanol (1:100, v/v) pendant 30 minutes. Après la filtration, la perte de poids a été compensée par le même solvant d’extraction que le poids initial, et la solution finale a été filtrée à travers une membrane de 0,45 μm avant analyse HPLC. Huit standards de référence authentiques, dont magnoflorine, glaucine, jatrorrhizine, columbamine, épiberbérie, coptisie, palmatine et berbérine, ont été analysés dans les mêmes conditions chromatographiques. Des courbes d’étalonnage ont été construites pour ces analytes à l’aide de solutions de référence. Parce que les niveaux d’abondance et les réponses des détecteurs des huit alcaloïdes différaient considérablement, la plage d’étalonnage pour chaque analyte a été optimisée individuellement en fonction des rapports de littérature et des expériences préliminaires, plutôt que d’appliquer un schéma de pliage-dilution identique à tous les composés. Par conséquent, les rapports de concentration élevés/bas des plages linéaires n’étaient pas censés être identiques entre les huit analytes. Les limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ont été estimées avec des rapports signal/bruit d’environ 3 et 10, respectivement.

Pour l’analyse des éluates d’ultrafiltration d’affinité, les ligands dissociés de l’AChE après ultrafiltration ont été collectés à partir d’expériences répétées et concentrés avant l’analyse HPLC afin d’assurer une intensité de signal adéquate pour la détection. Les éluates concentrés ont ensuite été analysés en utilisant les mêmes conditions HPLC décrites ci-dessus. Les pics chromatographiques dans les éluates ont été attribués par comparaison ciblée avec les huit standards de référence authentiques et avec le profil chromatographique de l’extrait de C. chinensis obtenu dans des conditions analytiques identiques. Par conséquent, la présente analyse ne visait pas à élucider de novo des composés structuraux inconnus, mais à déterminer ciblé si les alcaloïdes majeurs connus de C. chinensis étaient enrichis dans l’enzyme active éluée par rapport à l’enzyme inactivée témoin.

Essai d’amarrage moléculaire
Dans la présente étude, l’analyse d’amarrage s’est concentrée sur la coptisine car elle a été identifiée comme le constituant de liaison à l’AChE le mieux classé par l’ultrafiltration d’affinité et a également montré l’activité inhibitrice in vitro la plus forte parmi les principaux alcaloïdes. Les cristaux de protéines ont été récupérés à partir de la Protein Data Bank (PDB). Des cristaux protéiques avec des ligands co-cristallisés ont été sélectionnés comme récepteurs d’amarrage finaux, et tous les cristaux protéiques cibles ont été dérivés de l’humain. Le fichier récepteur a été ouvert à l’aide du logiciel PyMOL, et les fichiers récepteur et ligand ont été séparés et sauvegardés ; le récepteur a été ouvert avec le logiciel MGLTools, suivi de la suppression des molécules d’eau, de l’ajout d’atomes et de charges d’hydrogène, de la fusion d’atomes d’hydrogène non polaires, du calcul des charges atomiques locales, etc., puis enregistré au format pdbqt ; le fichier ligand était ouvert avec le logiciel MGLTools, des atomes d’hydrogène et des charges étaient ajoutés, et sauvegardés au format pdbqt ; La boîte de grille a été ouverte, l’espacement a été fixé à 1,000, le nombre de points de grille a été fixé, les coordonnées centrales de la boîte ont été sélectionnées selon le ligand co-cristallisé, et enregistrées sous forme de fichier^{GPF 15,16}.

Les structures des composants chimiques ont d’abord été collectées à partir de la base de données SciFinder et enregistrées au format cdx ; chaque structure moléculaire tridimensionnelle était affichée à l’aide du module ChemBio3D Ultra, l’optimisation de l’énergie était réalisée avec le champ de force MM2, enregistrée au format mol2, et les paramètres de charge étaient supprimés. Grâce à AutoDock, le fichier au format mol2 était ouvert avec le logiciel MGLTools, des atomes d’hydrogène et des charges étaient ajoutés au ligand, des liaisons chimiques rotatives observées, puis enregistrées sous forme de fichier pdbqt. Le modèle AutoDock Vina (version 1.2.5) a été appliqué pour effectuer l’évaluation du docking moléculaire.

Essai de simulation de dynamique moléculaire
Les logiciels Gaussian 16 et GaussView 6 étaient utilisés pour l’optimisation de la structure des ligands. Après avoir importé le fichier mol2 de la structure du ligand dans GaussView 6, le type de tâche a été réglé sur Optimisation, l’état de la molécule cible a été sélectionné comme État fondamental, la méthode de calcul était la théorie de la fonction de densité (DFT), la multiplicité de spin était par défaut sur Spin par défaut, la fonctionnelle utilisée était B3LYP, le modèle solvant était IEFPCM, Et le solvant, c’était de l’eau. Après l’achèvement de l’optimisation de la structure moléculaire, Gaussian 16 a été utilisé pour convertir le fichier chk généré en fichier fch, qui a ensuite été importé dans le logiciel Multiwfn pour calculer la charge RESP du ligand.

Après le calcul de la charge RESP, le fichier chg généré était importé dans le logiciel sobtop_1.0 (dev5) pour générer le fichier topologique des ligands requis pour la simulation de dynamique moléculaire. La simulation de dynamique moléculaire a été réalisée à l’aide du logiciel GROMACS 2019.6 avec le champ de force AMBER99. Les fichiers structuraux de la molécule protéique et de la petite molécule ont été importés dans le logiciel, une boîte triclinique avec une frontière périodique de 1,0 nm a été établie, et le modèle d’eau TIP3P a été utilisé pour le remplissage. La méthode Particle Mesh Ewald (PME) a été employée pour calculer les interactions électrostatiques à longue portée, et la commande gmx geion a été employée pour introduire un nombre approprié d’ions sodium et d’ions chlorure afin de neutraliser la charge de l’ensemble du système. La simulation a été réalisée à une température constante de 298 K et à une pression atmosphérique standard de 100 kPa. Pour la minimisation de l’énergie, la méthode de la descente la plus raide (raide) a été mise en place. Les commandes gmx grompp et gmx mdrun ont été utilisées pour effectuer 10 000 pas d’équilibre NVT (ensemble isothermique-isochorique) et NPT (ensemble isothermique-isobarique), avec la constante de couplage de température et la constante de couplage de pression fixées respectivement à 0,1 ps et 0,5 ps, et la durée de la simulation d’équilibre étant de 100 ps. Après que le système ait atteint l’équilibre, le pas de temps était fixé à 2 fs, et une simulation de dynamique moléculaire de 10 ns était réalisée sur le complexe, avec des données de trajectoire sauvegardées tous les 2 ps. La série de production de 10 ns a été choisie comme une durée de simulation exploratoire afin de fournir une évaluation dynamique à court délai du complexe coptisie–AChE amarré, plutôt qu’un échantillonnage conformationnel exhaustif. Ce réglage a été utilisé pour évaluer si le complexe amarré pouvait maintenir un mode de liaison relativement stable au fil du temps. Les commandes gmx rms, gmx rmsf, gmx gyrate et gmx hbonds ont également été utilisées pour calculer l’écart quadratique moyen (RMSD), la fluctuation quadratique moyenne (RMSF), le rayon de gyration de la protéine, les liaisons hydrogène et la surface accessible au solvant. QTgrace a été utilisé pour la visualisation des résultats.

Vérification par expériences animales
Dix-huit petits rats Sprague-Dawley (SD) néonatals en bonne santé (7 jours postnatal) de chaque sexe ont été sélectionnés. Tous les animaux expérimentaux étaient hébergés dans une installation expérimentale spécifique sans agents pathogènes (SPF). Cette installation était équipée d’un système de barrière strict, capable de prévenir efficacement l’invasion de micro-organismes et de parasites. Les paramètres environnementaux de la salle d’habitation étaient automatiquement surveillés et régulés par un système de contrôle central : température 22 ± 2 °C, humidité relative 55 % ± 10 %, et cycle lumineux 12 h lumineux / 12 heures sombres. Un modèle néonatal de rat de lésions cérébrales hypoxiques-ischémiques (HIBD) modifié par la méthode classique de Rice-Vannucci a été utilisé pour simuler les caractéristiques pathologiques et comportementales de la PC.

En résumé, les rats postnatals du jour 7 ont été anesthésés avec 2 à 3 % d’isoflurane pour l’induction et 1 à 2 % pour l’entretien. Après une anesthésie adéquate, une incision cervicale du milieu a été réalisée, et l’artère carotide commune gauche a été soigneusement isolée et ligaturée de façon permanente. L’incision a ensuite été suturée, et les chiots ont été laissés récupérer sur un tapis chauffant pendant 1 heure. Par la suite, les petits du groupe modèle et coptisine ont été exposés à l’hypoxie dans une chambre contenant 8 % d’O₂ équilibrée avec 92 % de N₂ pendant 2 heures à 37 °C afin d’induire une lésion cérébrale hypoxique-ischémique. Les animaux opérés par simulacre subissaient la même anesthésie et exposition chirurgicale sans ligature carotide ni traitement hypoxique. Après une hypoxie, les petits étaient ramenés à leurs mères et surveillés quotidiennement pour leur état général, leur survie et leur comportement alimentaire tout au long de la période expérimentale.

Les rats expérimentaux ont été divisés au hasard en 3 groupes : groupe simulé : seule l’artère carotide commune gauche a été séparée sans ligature ni traitement contre l’hypoxie, et un volume égal de solvant a été administré postopératoirement ; Groupe modèle : une chirurgie de modélisation des lésions cérébrales hypoxique-ischémiques a été réalisée, et un volume équivalent de solvant a été administré après l’opération ; Groupe coptisine : après modélisation, la coptisine (10 mg/kg) a été administrée par gavage. La dose de coptisine (10 mg/kg) a été sélectionnée comme dose in vivo sur la base d’études in vivo/pharmacocinétiques précédemment rapportées sur la coptisine¹⁷. Les médicaments ont été administrés une fois par jour à un moment fixe pendant 14 jours consécutifs d’intervention.

Détection des indicateurs animaux
L’équipement de test du labyrinthe d’eau Morris (MWM) consistait en une grande piscine circulaire (diamètre d’environ 150 cm) avec des indices visuels évidents sur la paroi de la piscine. L’eau de la piscine était stratifiée en blanc laiteux opaque, et la température de l’eau était contrôlée à 23 ± 1 °C. Une plateforme transparente a été placée dans le quadrant cible, immergée à 1–2 cm sous la surface de l’eau. La formation était organisée quatre fois par jour : les animaux étaient placés dans l’eau face au mur de la piscine depuis quatre points d’entrée différents sur la paroi de la piscine, et le temps nécessaire pour trouver et grimper sur la plateforme cachée depuis l’entrée dans l’eau, à savoir la « latence d’évasion », était enregistré. Chaque séance d’entraînement était limitée à 60 s. Si l’animal trouvait la plateforme dans les 60 s, il était autorisé à y rester pendant 15 s pour consolider la mémoire. S’il n’était pas trouvé, l’animal était doucement guidé vers la plateforme et laissé rester pendant 15 secondes. Après 7 jours d’entraînement, la plateforme cachée a été retirée. Les animaux étaient placés dans l’eau depuis le point d’entrée opposé à la plateforme d’origine et laissés nager librement pendant 60 secondes, et la trajectoire de nage des animaux était enregistrée par un système vidéo. Lors du test MWM, des indicateurs tels que la latence moyenne d’échappement, le temps passé dans le quadrant cible et le nombre de croisements au-dessus de la position initiale de la plateforme ont été enregistrés.

Pour la détection par imagerie par contraste de taches laser (LSCI) : Après anesthésie, les rats étaient fixés sur un instrument stéréotaxique, et le crâne était exposé et maintenu humide. Un système d’imagerie à flux sanguin par speckle laser était utilisé pour collecter en continu des images brutes pendant 30 secondes directement au-dessus du crâne. Un logiciel professionnel a été utilisé pour convertir le contraste de speckles à variation spatiotemporale en une carte de distribution de l’unité de perfusion du flux sanguin cérébral (PU). Pour l’analyse quantitative, un ROI cortical délimité manuellement a été sélectionné dans l’hémisphère ipsilatéral exposé sur chaque image selon la zone de perfusion corticale pertinente pour la lésion et les repères anatomiques visibles, et la valeur moyenne de perfusion dans ce ROI a été utilisée pour la comparaison intergroupe.

Des tissus cérébraux ont été prélevés, et du PBS pré-refroidi a été ajouté selon le rapport poids-volume. L’homogénéisation mécanique a été réalisée sur la glace, suivie d’une centrifugation à 8000 × g à 4 °C pendant 10 à 15 minutes, et le surnageant a été collecté pour test. Les tissus cérébraux ont rapidement été placés dans 4 % de paraformoldéhyde pour une fixation pendant plus de 24 heures afin de maintenir la morphologie tissulaire. La coloration par hématoxyline-éosine (HE) a été réalisée par des opérations telles que la déshydratation, le nettoyage et l’inclusion de paraffine, et le degré de la lésion cérébrale a été observé au microscope optique.

Pour la mesure de l’activité AChE, le cortex cérébral de l’hémisphère blessé (ipsilatéral) a été collecté et homogénéisé selon les instructions du fabricant. Les échantillons de tissu ont été homogénéisés dans un tampon d’extraction et centrifugés à 8000 × g pendant 10 minutes à 4 °C, et le surnageant a été prélevé pour analyse. L’activité de l’AChE a été déterminée à l’aide d’un kit commercial de test d’activité acétylcholinestérase (méthode microplaque/colorimétrique). Ce test est basé sur l’hydrolyse de l’acétylcholine par AChE, suivie d’une réaction avec le DTNB pour générer un produit chromogénique, et l’absorbance a été mesurée à 412 nm pour le calcul de l’activité enzymatique. Comme ce kit est un test colorimétrique basé sur l’activité enzymatique plutôt qu’un kit conventionnel d’immunosorbent lié à l’enzyme quantifiant les antigènes (ELISA), une plage de détection standard ni une sensibilité analytique n’ont été fournies par le fabricant. Dans la présente étude, les valeurs mesurées d’activité AChE dans le tissu cortical se situaient approximativement dans la fourchette de 25 à 80 nmol/min/mg de protéines.

Analyse statistique
Toutes les données expérimentales ont été exprimées en moyenne ± écart-type (SD) et analysées à l’aide du logiciel GraphPad Prism. Les comparaisons entre groupes ont été réalisées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivie du test de comparaison multiple de Tukey. Pour le test du labyrinthe d’eau de Morris, le résultat final de l’entraînement et les paramètres de l’essai de sonde ont été analysés à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle, suivis du test de comparaison multiple de Tukey. Une valeur de P < 0,05 était considérée comme statistiquement^{significative 18}. La corrélation entre la perfusion du flux sanguin cérébral dans le ROI et l’activité AChE dans le cortex cérébral ipsilatéral a été analysée à l’aide d’une analyse de corrélation de Pearson. Une valeur de P < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Analyse des composants chimiques dans l’extrait de C. chinensis
Les alcaloïdes sont les principaux composants accumulés ainsi que les principaux composants actifs des matériaux médicinaux de C. chinensis . Dans cette étude, la technologie chromatographique a été utilisée pour analyser les principaux composants chimiques de C. chinensis (Figure 1A). Comme montré dans le tableau 1, les huit analyt...

Discussion

Actuellement, diverses méthodes et technologies ont été développées pour la prévention et le traitement des maladies cérébrales 20,21,22^. Dans cette étude, une stratégie intégrée de dépistage in vitro, de simulation computationnelle et de vérification in vivo a été adoptée afin de clarifier systématiquement la base matérielle et le mécanisme multi-cible de C. chinensis...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid) (DTNB)	CATO Research Chemicals Inc.	416046844	Assay d'inhibition de l'acétylcholinestérase
Acétylcholinestérase (AChE)	Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd	C1682	Assay d'inhibition de l'acétylcholinestérase
Acétylthiocholine iodide (ATChI)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	1037408	Assay d'inhibition de l'acétylcholinestérase
Aetonitrile	Thermo Fisher Scientific Inc	1162577	Phase mobile de chromatographie liquide
AutoDock Vina	AutoDock	Version 1.2.5
Berberine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	110713-201814	Analyse de la composition chimique
Columbamine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180712	Analyse de la composition chimique
Coptisine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	Analyse de la composition chimique
E-916 accelerated solvent extractor	Büchi Labortechnik AG, Switzerland	E916-008	Extraction de la fraction de n-butanol
Epiberberine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180309	Analyse de la composition chimique
Formic acid	Thermo Fisher Scientific Inc	1270563	Phase mobile de chromatographie liquide
GaussView 6	Gaussian	https://gaussian.com/gaussview6/
Glaucine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180615	Analyse de la composition chimique
Jatrorrhizine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180607	Analyse de la composition chimique
Magnoflorine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180205	Analyse de la composition chimique
Methanol	Thermo Fisher Scientific Inc	1162578	Phase mobile de chromatographie liquide
Microporous membrane	Millipore Filter Company	2139547	Filtration des extraits
Palmatine standard	Chengdu Keloma Reagent Co., Ltd	CHB180226	Analyse de la composition chimique
Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
PyMOL	PyMOL	https://pymol.org/
Sodium carbonate	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	15138805	Assay d'inhibition de l'acétylcholinestérase
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Shanghai Adamas Reagent Co., Ltd	11019349	Assay d'inhibition de l'acétylcholinestérase