La protéine 1 contenant les domaines SAM et SH3 (SASH1) est identifiée comme un régulateur clé de l'apoptose et de l'inflammation des trophoblastes dans la prééclampsie (PE). Les exosomes d'origine placentaire (P-EXOS) atténuent les lésions induites par l'hypoxie en supprimant l'expression de SASH1. Ces résultats révèlent un mécanisme nouveau sous-jacent à la pathogenèse de la PE et suggèrent que SASH1 pourrait constituer une cible thérapeutique potentielle.
Article de recherche
Les exosomes dérivés du placenta atténuent l'apoptose des trophoblastes et la progression inflammatoire induites par l'hypoxie via SASH1
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
SASH1 est une protéine adaptatrice de signalisation impliquée dans la croissance cellulaire, l'apoptose et la régulation immunitaire, et a été de plus en plus étudiée dans les cellules tumorales et immunitaires. Des données récentes suggèrent que SASH1 joue un rôle important dans les réponses inflammatoires et l'homéostasie cellulaire, des processus étroitement associés au développement de la prééclampsie (PE). Cette étude visait à déterminer si SASH1 contribue à l'apoptose des trophoblastes et aux réponses inflammatoires dans la PE, et si les P-EXOS exercent des effets protecteurs par la régulation de SASH1. Dans cette étude, trois jeux de données transcriptomiques liés à la PE (GSE75010, GSE10588 et GSE60438) ont été analysés afin d'identifier les gènes différentiellement exprimés (DEG) communs, suivis d'analyses d'enrichissement par l'Ontologie génétique (GO) et par l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG). Des algorithmes d'apprentissage automatique ont ensuite été appliqués pour sélectionner les gènes candidats clés, et des données de séquençage de l'ARN monocellulaire ont été utilisées pour caractériser l'hétérogénéité cellulaire dans le tissu placentaire et déterminer les profils d'expression spécifiques à chaque type cellulaire. SASH1 a été identifié comme un gène candidat consensuel et était significativement surexprimé dans les cellules trophoblastiques provenant d'échantillons de PE. In vitro, un modèle de cellules trophoblastiques HTR-8/SVneo traitées à l'hypoxie a été établi, combiné à une inhibition de SASH1, une surexpression de SASH1 et une co-culture avec des P-EXOS. Des expériences fonctionnelles ont montré qu'une inhibition de SASH1 supprimait significativement l'apoptose des trophoblastes induite par l'hypoxie et réduisait la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, notamment IL-6, IL-1β et TNF-α, tandis qu'une surexpression de SASH1 favorisait l'apoptose et les réponses inflammatoires. De plus, un traitement par P-EXOS réduisait nettement l'expression de SASH1 aux niveaux d'ARNm et protéique et atténuait les lésions trophoblastiques induites par l'hypoxie, alors qu'une surexpression de SASH1 abolissait largement ces effets protecteurs. Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que SASH1 joue un rôle essentiel dans l'apoptose des trophoblastes et les réponses inflammatoires dans la PE. Les P-EXOS pourraient atténuer les lésions trophoblastiques induites par l'hypoxie en supprimant l'expression de SASH1, offrant ainsi de nouvelles perspectives sur les mécanismes moléculaires et les cibles thérapeutiques potentielles de la PE.
Introduction
L'éclampsie est un trouble multisystémique spécifique à la grossesse qui survient typiquement après 20 semaines d'aménorrhée et se caractérise cliniquement par une hypertension, une protéinurie et un dysfonctionnement multiviscéral. Elle demeure une cause majeure de morbidité et de mortalité maternelle et périnatale dans le monde entier1. Malgré des progrès continus dans la prise en charge clinique, le traitement définitif de l'éclampsie reste l'accouchement du placenta, ce qui souligne l'insuffisance de la compréhension de sa pathogenèse et la nécessité urgente d'identifier de nouveaux mécanismes moléculaires et cellulaires ainsi que des cibles thérapeutiques potentielles2,3.
Une invasion adéquate des cellules trophoblastiques et la promotion d'un développement placentaire normal sont des mécanismes essentiels sous-jacents à la pathogenèse de la prééclampsie4. Au cours d'une grossesse normale, les cellules trophoblastiques envahissent la décidua utérine et remodelent les artères spirales afin d'établir une circulation à faible résistance et à haute capacité. Une invasion et une migration altérées des cellules trophoblastiques entraînent une perfusion placentaire réduite, provoquant un environnement persistant d'hypoxie et de stress oxydatif. L'hypoxie affecte directement l'apoptose cellulaire, et la libération anormale de médiateurs pro-inflammatoires perturbe l'homéostasie à l'interface mère-fœtus, aggravant davantage le dysfonctionnement placentaire5. L'inflammation est également un facteur important dans la prééclampsie. Des taux nettement élevés d'IL-17, d'IL-6 et de TNF-α ont été observés dans le placenta et le sang périphérique des patientes atteintes de prééclampsie6. L'hypoxie et l'inflammation s'alimentent mutuellement, créant un cercle vicieux qui amplifie l'inflammation systémique, provoque des lésions endothéliales et contribue aux anomalies placentaires. Les réseaux moléculaires sous-jacents régulant l'apoptose trophoblastique et les réponses inflammatoires restent largement inconnus.
SASH1 est un membre de la famille des protéines d'échafaudage intracellulaires SLy/SASH1 qui fonctionne comme un adaptateur de signalisation7. SASH1 a été principalement caractérisé comme un suppresseur de tumeur qui inhibe la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), la migration cellulaire et l'invasion par des interactions avec des partenaires de signalisation tels que CRKL et la voie PI3K-Akt-mTOR8,9. Outre ses rôles de suppression tumorale, des preuves émergentes suggèrent que SASH1 participe à la signalisation inflammatoire et à la régulation immunitaire7. Toutefois, l'expression et la fonction de SASH1 dans le placenta, en particulier dans le contexte de la biologie des trophoblastes et de la prééclampsie (PE), n'ont pas encore été étudiées.
Les exosomes se sont imposés comme des médiateurs cellulaires importants et font l'objet d'études de plus en plus nombreuses dans le contexte de la grossesse10. Les exosomes transportent diverses cargaisons bioactives, notamment des protéines, des lipides et des ARN non codants, afin de moduler la fonction des cellules réceptrices. Des preuves croissantes suggèrent que les P-EXOS jouent un rôle essentiel dans la régulation immunitaire pendant la grossesse, et que leur activité ainsi que leur cargaison sont significativement modifiées dans la prééclampsie (PE), pouvant potentiellement aggraver l'état inflammatoire11. Les exosomes ont également été impliqués dans la régulation du stress oxydatif12 et de l'angiogenèse13, exerçant ainsi des effets potentiellement bénéfiques dans les complications liées à la grossesse. Toutefois, leurs cibles moléculaires et leurs mécanismes d'action dans la prééclampsie restent incomplètement élucidés.
On a émis l'hypothèse que SASH1 est régulé de manière anormale dans le placenta de la prééclampsie (PE) et qu'il exerce une fonction clé dans l'apoptose des trophoblastes et les réponses inflammatoires, et que les EXOS-P pourraient exercer des effets protecteurs contre les lésions des trophoblastes en modulant l'expression de SASH1. Afin de tester cette hypothèse, plusieurs jeux de données transcriptomiques de PE ont été intégrés, ainsi que des données de séquençage ARN monocellulaire combinées à un apprentissage automatique multi-algorithmes, afin d'identifier les gènes candidats clés. À l'aide d'un modèle cellulaire de trophoblaste HTR-8/SVneo soumis à un traitement en condition d'hypoxie et d'expériences d'intervention basées sur les exosomes, le rôle fonctionnel de SASH1 dans le dysfonctionnement du trophoblaste ainsi que le potentiel thérapeutique des EXOS-P dans la PE ont été étudiés.
Protocole
Déclaration éthique
Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'Hôpital numéro quatre de Shijiazhuang (numéro d'approbation : 20200031). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les donneurs de tissu placentaire avant le prélèvement des échantillons. Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été menées conformément à la Déclaration d'Helsinki. Une liste complète des réactifs, consommables, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole est fournie dans le Tableau des matériaux.
Collecte des données
Les données d'ARN-séquençage ont été obtenues à partir de la base de données GEO. Les jeux de données comprennent GSE75010, qui contient des données d'expression génique provenant de 157 placentas PE et de 173 placentas non-PE (N = 330). GSE10588 contient des données d'expression génique provenant de 26 placentas normaux et de 17 placentas sévères avec PE (N = 43). GSE60438 contient des données de profilage transcriptomique du décidual basal provenant de patientes prééclamptiques et de grossesses normotensives (N = 125). Les données de transcriptome unicellulaire ont été obtenues à partir du jeu de données GEO GSE183338. Celui-ci inclut des échantillons de noyaux uniques provenant des villosités choriales/du site mère-fœtus de grossesses avec PE et de grossesses saines.
Analyse des gènes différentiellement exprimés
Les gènes différentiellement exprimés (DEG) associés à la PE ont d'abord fait l'objet d'un prétraitement et d'une normalisation à partir des jeux de données GSE75010, GSE10588 et GSE60438. Ensuite, une analyse différentielle a été réalisée à l'aide du package R « limma »14, en se basant sur les informations de regroupement des échantillons. Les gènes présentant une valeur p < 0,05 et un |log2FC| > 0,5 ont été sélectionnés. Les diagrammes en volcan des DEG ont été générés à l'aide du package R ggplot2. Les cartes thermiques des 20 premiers DEG ont été réalisées à l'aide du package R pheatmap. Par la suite, l'intersection des DEG sélectionnés à partir des trois jeux de données a été déterminée, et un réseau d'interactions protéine-protéine (PPI) a été construit pour les gènes candidats à l'aide de la plateforme en ligne STRING, avec un score d'interaction ≥ 0,15. Les 20 principaux gènes centraux ont ensuite été identifiés dans ce réseau PPI selon leur degré de connectivité, classés à l'aide du logiciel Cytoscape. Les résultats du réseau PPI ont été visualisés à l'aide du logiciel Cytoscape ou de la plateforme STRING.
Analyse d'enrichissement
Une analyse d'enrichissement génique a été réalisée à l'aide des packages ClusterProfiler et DOSE en combinaison avec le site web Metascape. Les bases de données ont été obtenues à partir de GO et KEGG. L'analyse d'enrichissement a été effectuée à l'aide de la fonction « EnrichGO ». Les voies métaboliques avec une valeur p < 0,05 ont été considérées comme significativement enrichies. Les résultats d'enrichissement ont été visualisés à l'aide des packages « ggplot2 » et « ggpubr ».
Apprentissage automatique
Afin d'identifier des gènes différentiellement exprimés (GDE) robustes et biologiquement significatifs associés à l'éclampsie, une analyse de sélection de caractéristiques par apprentissage automatique multi-modèle a été réalisée à partir du jeu de données transcriptomiques publiquement disponible GSE60438 (plateforme : GPL6884). Ce jeu de données contient le profil d'expression d'échantillons de décidue basalis prélevés lors de grossesses éclamptiques et normotensives au moment d'une césarienne. Les GDE préfiltrés ont été normalisés, et la matrice d'expression, conjointement aux informations de regroupement clinique correspondantes, a été utilisée comme entrée pour quatre algorithmes d'apprentissage automatique distincts afin de réduire les biais du modèle et d'améliorer la stabilité de la sélection des caractéristiques.
Les quatre algorithmes ont été appliqués simultanément, sans ordre particulier. La régression LASSO a été effectuée à l'aide du package « glmnet » afin de réaliser une analyse de régression et de sélectionner les gènes caractéristiques importants. Un terme de régularisation L1 a été ajouté à la fonction de perte, ce qui réduit à zéro les coefficients des caractéristiques moins importantes, permettant ainsi la sélection de variables. SVM-RFE a été mis en œuvre à l'aide du package « e1071 » pour construire une machine à vecteurs de support avec élimination récursive des caractéristiques. Un classificateur a d'abord été entraîné par SVM, puis les caractéristiques les moins informatives ont été supprimées itérativement en fonction de leurs poids, produisant un sous-ensemble optimal de caractéristiques. XGBoost a été utilisé avec le package « xgboost » pour construire plusieurs arbres de décision. Chaque arbre s'ajuste aux résidus de l'arbre précédent, et les sorties pondérées sont cumulées pour obtenir la prédiction finale. Boruta a été appliqué à l'aide du package « randomForest », générant des caractéristiques fantômes qui rivalisent avec les caractéristiques réelles lors de l'entraînement d'une forêt aléatoire. Les caractéristiques dont les valeurs d'importance sont significativement supérieures au bruit aléatoire ont été conservées.
Analyse des données de transcriptome unicellulaire
Des données de transcriptome unicellulaires ont été obtenues à partir de la base de données GEO, et la matrice brute de comptage a été récupérée à partir de GSE183338. La matrice de comptage a été importée à l'aide de la fonction « Read10X » du package Seurat et convertie au format dgCMatrix. Des objets individuels ont été fusionnés en un objet agrégé unique à l'aide de la fonction « merge », et les étiquettes des cellules ont été rendues uniques à l'aide de « RenameCells ». Les cellules de faible qualité ont été filtrées selon les critères suivants : les gènes exprimés dans moins de trois cellules ont été supprimés, et les cellules exprimant moins de 200 gènes ont été exclues. Les cellules ayant subi un contrôle qualité ont été normalisées et les gènes hautement variables ont été identifiés. Une normalisation par mise à l'échelle globale a été appliquée à l'aide de « LogNormalize » (facteur d'échelle = 10 000), les gènes hautement variables (n = 2 000) ont été sélectionnés à l'aide de « FindVariableFeatures », et les données ont été mises à l'échelle à l'aide de « ScaleData ». Une analyse en composantes principales a été réalisée sur les caractéristiques hautement variables, et les 30 premières composantes principales ont été conservées. Les effets de lot entre les échantillons ont été corrigés à l'aide de la méthode Harmony. Les cellules ont été visualisées et réduites à l'aide de UMAP. Des graphes de voisins les plus proches partagés ont été construits à l'aide de « FindNeighbors » et « FindClusters », selon l'algorithme de Louvain. Le paramètre de résolution dans « FindClusters » a été optimisé entre 0,1 et 1. L'arbre de regroupement a été visualisé à l'aide de la fonction « clustree », et une résolution de 0,9 a été choisie pour définir les groupes cellulaires. Les doublests potentiels ont été éliminés à l'aide de l'algorithme Scrublet. Les groupes cellulaires ont été annotés en identifiant les gènes marqueurs différentiellement exprimés à l'aide de la fonction « FindAllMarkers ». Le test non paramétrique de Wilcoxon par rangs a été appliqué avec correction de Bonferroni. Les identités cellulaires ont été attribuées en fonction des marqueurs d'expression membranaire, de la littérature pertinente et de la Base de données de classification cellulaire15.
Culture cellulaire
Les cellules de la lignée de trophoblastes HTR-8/SVneo ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine. Les conditions d’hypoxie ont été établies en cultivant les cellules à 1 % de O₂, 5 % de CO₂ et 94 % de N₂ pendant 24 heures ; les témoins normoxiques ont été maintenus à 20 % de O₂ et 5 % de CO₂16. Toutes les manipulations de culture cellulaire doivent être effectuées dans une hotte de sécurité biologique de classe II en utilisant une technique aseptique. Les milieux de culture, les réactifs de transfection et les déchets cellulaires doivent être éliminés conformément aux directives institutionnelles de biosécurité.
Transfection des cellules
Des plasmides contenant sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 et OE-NC ont été synthétisés. Les cellules HTR-8/SVneo ont été ensemencées à une densité de 5 × 105 cellules par puits dans des plaques à six puits. Les cellules ont ensuite été transfectées avec 2 µg de plasmide sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 ou OE-NC par puits à l’aide d’un réactif de transfection, conformément aux instructions du fabricant. Brièvement, l’ADN plasmidique et le réactif P3000 ont été dilués dans du Opti-MEM, mélangés avec du Lipofectamine 3000 dilué séparément dans du Opti-MEM, incubés pendant 15 minutes à température ambiante, puis ajoutés aux cellules ayant atteint une confluence de 70 à 80 %. Quarante-huit heures après la transfection, l’expression de SASH1 a été évaluée par RT-qPCR et immunoblotting. Les séquences cibles de l’ARNsi utilisées pour l’extinction de SASH1 sont indiquées dans le Tableau supplémentaire 1.
PCR quantitative en temps réel
L'ARN total a été extrait des cellules HTR-8/SVneo et rétrotranscrit en ADNc à l'aide d'un kit de transcription inverse à 42 °C pendant 30 min, suivi de 85 °C pendant 5 min. Une PCR quantitative en temps réel (qPCR) a été réalisée à l'aide d'un mélange maître SYBR Green avec les conditions de cyclage suivantes : 95 °C pendant 10 min, suivies de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min. L'expression relative des ARNm a été calculée selon la méthode ΔΔCt, en utilisant β-actine comme référence interne. Les séquences des amorces utilisées dans cette expérience sont indiquées dans le Tableau supplémentaire 2.
Dosage par immunotransfert
Des protéines totales ont été extraites à partir de cellules HTR-8/SVneo à l'aide d'un tampon de lyse. Les lysats cellulaires ont été recueillis, incubés sur de la glace, puis centrifugés à 12 000 × g pendant 30 min à 4 °C afin d'éliminer les débris insolubles. La concentration en protéines a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre. Des quantités équivalentes de protéines (50 µg) ont été séparées par électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, puis transférées sur des membranes en PVDF. Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % et incubées avec les anticorps primaires toute la nuit à 4 °C. Après lavage, les membranes ont été incubées avec les anticorps secondaires correspondants, et les bandes protéiques ont été visualisées à l'aide d'un système de détection par chimiluminescence améliorée.
Pour la détection des protéines, les anticorps primaires utilisés comprenaient anti-SASH1 et β-actine. Des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) appropriés — chèvre anti-lapin et chèvre anti-souris — ont été employés. La β-actine a été utilisée comme témoin interne de chargement afin de garantir une quantité égale de protéines chargées. L'intensité des bandes protéiques a été mesurée et quantifiée à l'aide du logiciel ImageJ.
Isolation des P-EXOS
Les P-EXOS ont été isolées à partir de tissu villositaire placentaire obtenu à partir de placentas à terme provenant de femmes en bonne santé subissant une césarienne programmée. Le tissu villositaire placentaire a été soigneusement lavé avec du PBS stérile, puis haché en fragments d'environ 1 mm3 fragments, et mis en culture dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10 % de SFB dépourvu d'exosomes, à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO₂2 pendant 48 h. Le milieu conditionné a été soumis à une centrifugation différentielle selon le protocole suivant : 300 × g pendant 10 min pour éliminer les cellules et les débris tissulaires ; 2 000 × g pendant 20 min pour éliminer les débris cellulaires ; et 10 000 × g pendant 30 min pour éliminer les microvésicules, le tout à 4 °C. Le surnageant obtenu a été soumis à une ultracentrifugation à 120 000 × g pendant 70 min à 4 °C pour former un culot d'exosomes. Le culot a été lavé une fois avec du PBS et re-soumis à une ultracentrifugation à 120 000 × g pendant 70 min à 4 °C. Le culot final a été resuspendu dans du PBS. Les exosomes isolés ont été caractérisés par analyse en immunotransfert pour les marqueurs d'exosomes (PLAP, CD63 et TSG101, avec GM130 comme témoin négatif) et examinés ultérieurement par microscopie électronique en transmission pour l'observation morphologique.
Expérience d'absorption cellulaire des P-EXOS
Pour confirmer l'internalisation cellulaire des P-EXOS, les exosomes ont été marqués de manière fluorescente à l'aide du colorant membranaire lipophile PKH67 selon le protocole du fabricant. Brièvement, les P-EXOS ont été incubés avec le PKH67 (4 µM) dans le diluant C pendant 5 min à température ambiante, puis la réaction a été arrêtée par l'ajout d'un volume équivalent d'albumine de sérum bovin (BSA) à 1 %. Les exosomes marqués ont été ré-isolés par ultracentrifugation (120 000 × g, 70 min, 4 °C) afin d'éliminer le colorant non lié. Les P-EXOS marqués au PKH67 (50 µg/mL) ont ensuite été ajoutés aux cellules HTR-8/SVneo et co-incubés pendant 24 h dans des conditions normoxiques ou hypoxiques (1 % O₂). Les cellules ont ensuite été lavées trois fois au PBS, fixées pendant 15 min avec du paraformaldéhyde à 4 %, et les noyaux ont été contre-colorés avec le DAPI (1 µg/mL). L'internalisation des exosomes marqués au PKH67 a été visualisée par microscopie à balayage laser confocale (CLSM ; excitation 490 nm, émission 502 nm). Pour les expériences fonctionnelles de co-culture, les cellules HTR-8/SVneo ont été traitées avec les P-EXOS à une concentration de 50 µg/mL (équivalent protéique) dans un milieu RPMI-1640 complet supplémenté avec 10 % de SFB dépourvu d'exosomes, dans des conditions hypoxiques (1 % O₂) pendant 24 h.
Dosage immuno-enzymatique (ELISA)
Les surnageants de culture cellulaire ont été recueillis, et les concentrations de IL-6, IL-1β et TNF-α ont été mesurées à l'aide respectivement du kit ELISA pour IL-6, du kit ELISA pour IL-1β et du kit ELISA pour TNF-α, conformément aux instructions du fabricant. L'absorbance à 450 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques, et les concentrations réelles ont été déterminées à partir des courbes standards.
Marquage par terminaison nick-end TdT-médiée de dUTP (TUNEL)
Les cellules apoptotiques ont été détectées à l'aide du kit de dosage TUNEL conformément aux instructions du fabricant. Brièvement, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min à température ambiante, perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS pendant 5 min sur de la glace, puis incubées avec le mélange réactionnel TUNEL pendant 60 min à 37 °C à l'abri de la lumière. Les noyaux ont été contre-colorés avec le DAPI, et les cellules positives au TUNEL ont été visualisées à l'aide d'un microscope à fluorescence et quantifiées en dénombrant le pourcentage de cellules positives au TUNEL dans au moins cinq champs sélectionnés aléatoirement par échantillon.
Analyse statistique
Toutes les données ont été analysées à l'aide de R et de GraphPad Prism. Les variables continues sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Les comparaisons entre deux groupes ont été effectuées à l'aide du test t de Student, tandis que les comparaisons entre plusieurs groupes ont été réalisées à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie du test post hoc de Tukey. La signification statistique des variables catégorielles a été évaluée par le test du Chi-deux ou par le test exact de Fisher. Sauf indication contraire, les corrélations entre les molécules ont été calculées à l'aide d'une analyse de corrélation de Spearman. Les expériences de caractérisation des exosomes ont été réalisées à l'aide de P-EXOS isolés à partir de trois donneurs placentaires indépendants. Les expériences cellulaires ont été effectuées en trois réplicats biologiques indépendants, représentant des expériences indépendantes réalisées à des moments distincts avec des cellules HTR-8/SVneo à des passages différents, chaque réplicat utilisant des P-EXOS isolés d'un donneur placentaire différent. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
Résultats
Analyse transcriptomique de patients sains et de patients atteints de PE
Pour les différences d'expression génique entre le groupe témoin (Normal) et les patients atteints de PE, l'expression différentielle a été analysée à l'aide du package R limma sur les jeux de données fusionnés. Un total de 89 gènes différentiellement exprimés (DEG) a été identifié (p < 0,05 et |log2FC| > 0,5), dont 69 gènes surexprimés et 20 gènes sous-exprimés pour GSE75010 (Figure 1A). On observe 2 097 gènes différentiellement exprimés, dont 1 121 surexprimés et 976 sous-exprimés (Figure 1B). Pour le jeu de données GSE60438, on compte 7 633 DEG, dont 3 371 gènes surexprimés et 4 262 gènes sous-exprimés (Figure 1C). Les différences importantes du nombre de DEG entre les trois jeux de données reflètent probablement des variations de taille d'échantillon, d'origine tissulaire (villosités placentaires contre decidua basalis) et de classification de la gravité de la PE, ce qui souligne davantage l'intérêt d'analyser l'intersection entre les jeux de données afin d'identifier des DEG communs et robustes.
Analyse d'enrichissement fonctionnel des gènes différentiellement exprimés
Pour l'identification systématique des gènes différentiellement exprimés (DEG) clés associés à l'éclampsie (PE), une analyse de Venn a été réalisée sur les DEG provenant des jeux de données PE GSE75010, GSE10588 et GSE60438, permettant d'identifier finalement 56 DEG communs (Figure 2A). Un réseau d'interactions protéine-protéine (PPI) a été construit pour ces 56 DEG communs à l'aide de la plateforme en ligne STRING (score d'interaction ≥0,15), et les 20 principaux gènes centraux ont été identifiés en fonction de leur degré de connectivité dans le réseau, classés à l'aide du logiciel Cytoscape (Figure 2B). À partir de ces gènes, une analyse d'enrichissement GO a également été effectuée afin d'explorer les fonctions potentielles dans les catégories Biologie Moléculaire (BP), Compartiment Cellulaire (CC) et Fonction Moléculaire (MF) (Figure 2C). Les DEG étaient principalement enrichis dans la sécrétion hormonale et la régulation de la signalisation par récepteur transmembranaire de sérine/thréonine kinase. Au niveau cellulaire, les gènes étaient principalement localisés dans les adhérences focales, les jonctions cellule-substrat, ainsi que dans divers gènes liés aux vésicules et aux lysosomes. En ce qui concerne les fonctions moléculaires, les termes enrichis incluaient l'activité de prolyl hydroxylase, l'activité hormonale et le transport transmembranaire de molécules liées aux lipides. Ces résultats suggèrent que les DEG pourraient jouer un rôle important dans la signalisation cellulaire placentaire, l'interaction cellule-matrice et le maintien de fonctions liées à l'endocrinologie. Par ailleurs, l'analyse d'enrichissement des voies KEGG a révélé que les DEG étaient principalement enrichis dans l'interaction cytokine–récepteur de cytokine, l'interaction des molécules d'adhésion cellulaire, ainsi que dans les voies de signalisation TGF-β et HIF-1 (Figure 2D). L'enrichissement de certains termes liés aux virus (par exemple, virus de l'hépatite, Ebolavirus) reflète probablement un chevauchement non spécifique avec des gènes régulateurs immunitaires communs, plutôt qu'une association biologique directe avec la PE ; l'interprétation se concentre donc sur les voies liées à l'inflammation, à l'adhésion et à l'hypoxie. Ces voies sont associées à la réponse inflammatoire, à la signalisation médiée par l'adhésion cellulaire et aux processus liés à l'hypoxie, et pourraient influencer la progression de la PE en modulant l'état immuno-inflammatoire et la communication entre cellules dans le microenvironnement placentaire.
Un apprentissage automatique identifie SASH1 comme un gène clé dans la PE
Pour identifier les gènes pronostiques clés, quatre méthodes d'apprentissage automatique ont été appliquées pour la sélection de caractéristiques. La régression LASSO avec validation croisée a montré que le modèle atteignait l'erreur de validation croisée minimale lorsque log(λ.min) = -3,8075. Les gènes présentant des coefficients non nuls à cette valeur de λ ont été sélectionnés comme caractéristiques clés identifiées par LASSO (Figure 3A–B). L'algorithme Boruta évalue l'importance des caractéristiques en les comparant à des caractéristiques fantômes. Les gènes dont les valeurs d'importance dépassent shadowMax ont été étiquetés comme Confirmés et considérés comme des gènes candidats clés, tandis que ceux dont les valeurs d'importance sont inférieures à shadowMin ont été étiquetés comme Rejetés et considérés comme n'ayant aucune contribution significative. Les gènes situés entre ces deux seuils ont été étiquetés comme Provisoires, indiquant une importance potentielle mais incertaine (Figure 3C). L'analyse SVM-RFE a démontré que lorsque 40 à 50 caractéristiques étaient conservées, la précision de validation croisée atteignait son niveau le plus élevé ou proche du maximum, suggérant une performance prédictive optimale à cette échelle de caractéristiques (Figure 3D). La précision modérée de validation croisée (~0,6) indique qu'aucun algorithme unique ne s'est comporté de manière optimale sur ce jeu de données ; une stratégie d'intersection multi-algorithme a donc été adoptée afin d'améliorer la robustesse de la sélection des caractéristiques. XGBoost a quantifié l'importance relative des gènes à l'aide des valeurs de Gain, permettant ainsi d'identifier les caractéristiques ayant une contribution plus importante à la prédiction du modèle (Figure 3E). Une analyse d'intersection de type diagramme de Venn des résultats des quatre méthodes a identifié SASH1 comme le seul gène commun. Bien que SASH1 ait été classé comme Provisoire par l'algorithme Boruta, sa sélection cohérente dans les trois autres algorithmes soutient sa désignation comme gène candidat par consensus (Figure 3F).
Analyse à l'échelle cellulaire unique
L'hétérogénéité cellulaire et les processus moléculaires dans les tissus placentaires de la PE ont été étudiés. Les cellules ont été filtrées selon leur qualité en fonction du nombre de gènes détectés, du nombre de lectures d'ARN et du pourcentage d'expression des gènes mitochondriaux. Les cellules de faible qualité (moins de 200 gènes détectés ou un contenu mitochondrial supérieur à 20 %) ont été éliminées afin d'obtenir un échantillon unicellulaire de haute qualité destiné aux analyses en aval. Les métriques de contrôle de qualité et l'identification des gènes hautement variables sont présentées dans la figure supplémentaire 1A–B. Après la normalisation et l'identification des gènes hautement variables, une analyse en composantes principales (ACP) a été réalisée en utilisant les 2 000 gènes les plus variables ainsi que les composantes principales significatives, déterminées par l'analyse JackStraw et l'analyse ElbowPlot (figure supplémentaire 2A–B).
Sur la base des composantes principales, l'approximation de variété uniforme et la projection (UMAP) ont été utilisées pour réduire la dimensionnalité et effectuer un regroupement non supervisé, permettant de classer toutes les cellules en 22 clusters, ce qui met en évidence l'hétérogénéité cellulaire élevée du tissu placentaire (Figure 4A). En étudiant l'expression des gènes marqueurs spécifiques à chaque cluster et en visualisant les gènes différentiellement exprimés (DEG) dans une carte thermique (Figure 4B), chaque cluster a été annoté selon un marqueur canonique puis projeté à nouveau sur l'incorporation UMAP (Figure 4C). D'après ces principaux types cellulaires placentaires, des cellules B/cellules plasmatiques, des cellules endothéliales, des fibroblastes/cellules stromales, des macrophages/cellules dendritiques, des cellules tueuses naturelles, des cellules T et des cellules trophoblastiques ont été identifiés. La comparaison entre les groupes témoin et PE révèle que plusieurs types cellulaires présentent une distribution relative importante dans les placentas atteints de PE, suggérant un remaniement du microenvironnement placentaire (Figure 4D).
L'origine tissulaire et le statut pathologique ont été utilisés pour suivre les cellules dans le même repliement UMAP selon la source tissulaire (décidua par rapport à villosités) et le regroupement pathologique (témoin par rapport à PE) (Figure 4E). La répartition du nombre de cellules était partiellement séparée selon l'origine tissulaire, tandis que les cellules provenant de différents groupes pathologiques étaient fortement interconnectées. Cela suggère que la PE n'entraîne pas de réorganisation majeure de l'ensemble de la structure transcriptomique, mais pourrait avoir des effets sur certaines populations cellulaires ou sur des caractéristiques moléculaires spécifiques. L'expression de SASH1 a été cartographiée sur le UMAP afin d'explorer sa répartition parmi les populations cellulaires placentaires (Figure 4F–G). SASH1 présente une expression fortement spécifique aux types cellulaires, avec des différences notables entre les populations cellulaires déciduales et villotrophoblastiques. La comparaison statistique de l'expression de SASH1 entre les groupes PE et témoins à travers les types cellulaires (test de Wilcoxon-Mann-Whitney) a révélé des différences significatives dans plusieurs populations cellulaires placentaires, l'augmentation la plus marquée étant observée dans les cellules trophoblastiques issues des échantillons PE (Figure 4H). Cette découverte fournit une preuve au niveau cellulaire unique qu'une régulation altérée de SASH1 est particulièrement prononcée dans le compartiment trophoblastique, soutenant ainsi l'utilisation de la lignée cellulaire trophoblastique HTR-8/SVneo pour les expériences fonctionnelles ultérieures.
L'extinction de SASH1 inhibe l'apoptose des trophoblastes induite par l'hypoxie et les réponses inflammatoires
Afin de valider les prédictions bioinformatiques, un modèle cellulaire de trophoblaste associé à la prééclampsie a été établi dans des conditions d'hypoxie (1 % O2). Des analyses par qPCR et immunoblotting ont été réalisées pour évaluer l'expression de SASH1 (Figure 5A–B). Par rapport aux cellules HTR-8/SVneo en conditions normoxiques, les cellules traitées en hypoxie présentaient des niveaux d'expression de l'ARNm et de la protéine SASH1 significativement augmentés, fournissant ainsi une première validation expérimentale des résultats bioinformatiques. Afin d'évaluer l'effet de l'extinction de SASH1 sur les processus pathologiques liés à la prééclampsie, l'expression de SASH1 a été silencée dans les cellules HTR-8/SVneo exposées à l'hypoxie. Les analyses par PCR quantitative et immunoblotting (Figure 5C–D) ont montré que l'expression de SASH1 était significativement réduite dans tous les groupes sh-SASH1 par rapport au groupe sh-NC. Parmi eux, le sh-SASH1#3 a montré l'efficacité d'extinction la plus élevée et a donc été sélectionné pour les expériences ultérieures. Une coloration TUNEL et un dosage ELISA ont été réalisés dans trois conditions : contrôle normoxique (Normal), hypoxie avec ARNsh contrôle négatif (Hypoxie + sh-NC) et hypoxie avec extinction de SASH1 (Hypoxie + sh-SASH1). Comparé au groupe Normal, le groupe Hypoxie + sh-NC présentait une augmentation significative de l'apoptose ainsi qu'une sécrétion accrue des cytokines pro-inflammatoires IL-1β, IL-6 et TNF-α, confirmant ainsi une lésion trophoblastique induite par l'hypoxie. L'extinction de SASH1 a fortement atténué ces effets, réduisant l'apoptose (Figure 5E) et les niveaux de cytokines (Figure 5F) à des valeurs proches de celles du groupe Normal, suggérant que l'extinction de SASH1 peut en grande partie corriger l'apoptose trophoblastique et les réponses inflammatoires induites par l'hypoxie. Afin de confirmer le rôle causal de SASH1, des expériences de gain de fonction ont été menées. La qPCR et l'immunoblotting ont confirmé une surexpression efficace de SASH1 dans les cellules HTR-8/SVneo (Figure 5G–H). En conditions normoxiques, la surexpression de SASH1 (OE-SASH1) a significativement augmenté l'apoptose trophoblastique et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par rapport au groupe OE-NC, reproduisant ainsi le phénotype induit par l'hypoxie (Figure 5I–J). Dans leur ensemble, les données de perte et de gain de fonction établissent que SASH1 est à la fois nécessaire et suffisant pour induire l'apoptose trophoblastique et les réponses inflammatoires, confirmant son rôle causal dans la pathologie associée à la prééclampsie.
Les P-EXOS suppriment l'apoptose des trophoblastes induite par l'hypoxie et les réponses inflammatoires en modulant SASH1
On considère que les P-EXOS possèdent une valeur thérapeutique potentielle dans la PE. Dans cette étude, une analyse bioinformatique a suggéré que SASH1 est associé à des voies de signalisation liées aux exosomes (comme indiqué par l'enrichissement GO et KEGG, Figure 2C–D), ce qui nous a conduit à émettre l'hypothèse que les P-EXOS pourraient exercer un effet protecteur dans la PE en régulant SASH1. Avant d'entreprendre des études fonctionnelles, les P-EXOS isolés ont d'abord été caractérisés. Une analyse par immunoblot a confirmé la présence de protéines marqueurs des exosomes, PLAP, CD63 et TSG101, sans expression détectable du marqueur du Golgi GM130, indiquant une haute pureté des vésicules isolées. La microscopie électronique en transmission a en outre révélé des structures vésiculaires typiques en forme de tasse (Figure 6A–B). Afin de vérifier si les P-EXOS pouvaient être internalisés efficacement par les cellules cibles, une coloration en immunofluorescence a été réalisée pour évaluer l'absorption cellulaire des P-EXOS. Par rapport au groupe témoin, les cellules HTR-8/SVneo traitées avec les P-EXOS ont montré des signaux de co-localisation marqués sur les images fusionnées, indiquant que les P-EXOS étaient effectivement internalisés par les cellules HTR-8/SVneo (Figure 6C).
Par la suite, les cellules HTR-8/SVneo ont été cultivées en co-culture avec des P-EXOS dans des conditions d'hypoxie. Les analyses par PCR quantitative et par immunobuvardage ont montré une réduction marquée des niveaux d'ARNm et de protéine SASH1 dans le groupe traité avec des P-EXOS par rapport aux témoins (Figure 6D–E), fournissant ainsi une première preuve d'une interaction régulatoire entre les P-EXOS et SASH1. Conformément à ces modifications moléculaires, la coloration TUNEL a révélé une atténuation importante de l'apoptose induite par l'hypoxie dans les cellules HTR-8/SVneo après traitement par les P-EXOS (Figure 6F). Parallèlement, les dosages par ELISA ont mis en évidence une sécrétion nettement diminuée de cytokines pro-inflammatoires, notamment l'IL-6, l'IL-1β et le TNF-α (Figure 6G).
Afin de déterminer si les effets protecteurs des P-EXOS dépendent mécanistiquement de la suppression de SASH1, une expérience de sauvetage a été réalisée dans des conditions d'hypoxie. Des cellules surexprimant SASH1 (OE-SASH1 + P-EXOS) ont été comparées à des cellules contrôles négatives (OE-NC + P-EXOS). La surexpression de SASH1 a significativement aboli les effets protecteurs des P-EXOS, comme en témoignent une augmentation de l'apoptose (Figure 6H) et une sécrétion accrue de cytokines pro-inflammatoires (Figure 6I), par rapport au groupe OE-NC + P-EXOS. Ces résultats démontrent que l'effet protecteur des P-EXOS est spécifiquement médié par la suppression de SASH1, plutôt que par des voies parallèles, soulignant ainsi le potentiel thérapeutique des P-EXOS dans la PE.
DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Les ensembles de données soutenant les résultats de cette étude sont accessibles publiquement et ont été obtenus à partir de la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), avec les numéros d'accès GSE75010, GSE10588, GSE60438 et GSE183338. L'annotation des types cellulaires a été réalisée en se référant à la base de données de classification cellulaire (https://ngdc.cncb.ac.cn/celltaxonomy/). Les images brutes non recadrées de Western blot et toutes les autres données expérimentales brutes soutenant les résultats de cette étude sont fournies dans le dossier Données brutes supplémentaires.
Figure 1 : Identification des gènes différentiellement exprimés (DEG) dans les tissus placentaires et déciduaux de prééclampsie (PE) à partir de trois jeux de données indépendants. (A) Volcano plot des DEG entre 157 échantillons placentaires de PE et 173 échantillons placentaires non-PE du jeu de données combiné GSE75010. (B) Volcano plot des DEG entre les échantillons placentaires de PE sévère (n = 17) et les échantillons placentaires normaux (n = 26) du jeu de données GSE10588. (C) Volcano plot des DEG entre les échantillons déciduaux de PE et les échantillons déciduaux témoins normotensifs du jeu de données GSE60438. Les DEG ont été identifiés en utilisant un seuil de p < 0,05 et |log2FC| > 0,5. Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Analyse d'enrichissement fonctionnel et analyse des interactions protéine-protéine (PPI) des gènes différentiellement exprimés (DEG) communs associés à la prééclampsie. (A) Diagramme de Venn des gènes différentiellement exprimés (DEG) identifiés à partir des jeux de données liés à la prééclampsie GSE75010, GSE10588 et GSE60438. (B) Réseau d'interactions protéine-protéine (PPI) des 20 principaux gènes centraux sélectionnés parmi les 56 DEG communs, selon leur degré de connectivité, classés à l'aide du logiciel Cytoscape (score d'interaction STRING ≥0,15). (C) Les analyses d'enrichissement GO et KEGG des DEG communs sont présentées sous forme de diagrammes en barres. (D) Analyses d'enrichissement GO et KEGG des DEG communs, présentées sous forme de diagrammes en cordes. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse par apprentissage automatique des gènes centraux candidats associés à la prééclampsie. (A) Analyse par régression LASSO montrant les profils de coefficients des gènes candidats. (B) Sélection du paramètre optimal de régularisation (λ) par régression LASSO à l'aide d'une validation croisée. (C) Algorithme Boruta. (D) Analyse SVM-RFE. (E) Algorithme XGBoost. (F) Diagramme de Venn montrant l'intersection des gènes candidats identifiés par les algorithmes LASSO, Boruta, SVM-RFE et XGBoost. Abréviations : LASSO = least absolute shrinkage and selection operator ; SVM-RFE = support vector machine recursive feature elimination. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L'analyse transcriptomique à une cellule révèle des profils d'expression spécifiques de SASH1 selon les types cellulaires dans la prééclampsie. (A) Regroupement UMAP du jeu de données à une cellule. (B) Analyse des cinq principaux marqueurs annotés du jeu de données transcriptomiques à une cellule de la prééclampsie GSE183338. (C) Annotation des sous-populations cellulaires. (D) Graphique en barres montrant la répartition des proportions cellulaires dans les échantillons témoins et prééclamptiques. (E) Graphique UMAP coloré selon l'origine tissulaire (décidua et villosités) et l'état pathologique (témoin et prééclampsie). (F) Graphique UMAP montrant l'expression de SASH1 dans les populations cellulaires placentaires regroupées par origine tissulaire (décidua et villosités). (G) Graphique UMAP montrant l'expression de SASH1 dans les populations cellulaires placentaires regroupées par état pathologique (témoin et prééclampsie). (H) Graphique en violon montrant la distribution de l'expression de SASH1 selon les différents types cellulaires placentaires. ns p > 0,05 ; *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001. Abréviations : UMAP = uniform manifold approximation and projection ; ns = non significatif. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : SASH1 régule l'apoptose et l'inflammation des trophoblastes induites par l'hypoxie. (A) Analyse par qPCR de l'expression ARNm de SASH1 et quantification densitométrique des niveaux protéiques de SASH1 dans les cellules HTR-8/SVneo en conditions normales et hypoxiques. (B) Images représentatives d'immunobuvardages correspondant aux données densitométriques présentées en (A). (C) Analyse par qPCR de l'expression ARNm de SASH1 et quantification densitométrique des niveaux protéiques de SASH1 dans les cellules HTR-8/SVneo traitées à l'hypoxie et transfectées avec des constructions sh-NC ou sh-SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 et sh-SASH1#3). (D) Images représentatives d'immunobuvardages correspondant aux données densitométriques présentées en (C). (E) Coloration TUNEL des cellules HTR-8/SVneo dans les groupes Normal, Hypoxie + sh-NC et Hypoxie + sh-SASH1(#3). Échelle = 20 µm. (F) Analyse par ELISA des cytokines inflammatoires (IL-1β, IL-6 et TNF-α) dans les groupes Normal, Hypoxie + sh-NC et Hypoxie + sh-SASH1(#3). (G) Analyse par qPCR de l'expression ARNm de SASH1 et quantification densitométrique des niveaux protéiques de SASH1 dans les cellules HTR-8/SVneo transfectées avec des constructions OE-NC ou OE-SASH1. (H) Images représentatives d'immunobuvardages correspondant aux données densitométriques présentées en (G). (I) Coloration TUNEL des cellules HTR-8/SVneo dans les groupes Normal + OE-NC et Normal + OE-SASH1. Échelle = 20 µm. (J) Analyse par ELISA des cytokines inflammatoires (IL-1β, IL-6 et TNF-α) dans les groupes Normal + OE-NC et Normal + OE-SASH1. *p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type à partir de trois réplicats biologiques indépendants (n = 3). Veuillez cliquer ici pour consulter une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Les P-EXOS atténuent les lésions trophoblastiques induites par l'hypoxie par la suppression de SASH1. (A) Analyse par western blot des protéines marqueurs des P-EXOS, PLAP, CD63 et TSG101, GM130 servant de contrôle négatif. (B) Analyse par microscopie électronique en transmission (TEM) de la morphologie des P-EXOS. Échelle = 1,0 µm. (C) Images de microscopie confocale à balayage laser montrant l'absorption des P-EXOS marqués au PKH67 (en vert) par les cellules HTR-8/SVneo (en rouge). Les noyaux ont été contre-colorés avec le DAPI (en bleu). Échelle = 20 µm. (D) Analyse par qPCR de l'expression de l'ARNm de SASH1 et quantification densitométrique des niveaux protéiques de SASH1 dans les cellules HTR-8/SVneo des groupes Témoin et P-EXOS. (E) Images représentatives de western blot correspondant aux données densitométriques présentées en (D). (F) Coloration TUNEL des cellules HTR-8/SVneo des groupes Témoin et P-EXOS. Échelle = 20 µm. (G) Analyse par ELISA des cytokines inflammatoires (IL-1β, IL-6 et TNF-α) dans les cellules HTR-8/SVneo traitées à l'hypoxie, dans les groupes Témoin et P-EXOS. (H) Coloration TUNEL des cellules HTR-8/SVneo des groupes OE-NC + P-EXOS et OE-SASH1 + P-EXOS. Échelle = 20 µm. (I) Analyse par ELISA des cytokines inflammatoires (IL-1β, IL-6 et TNF-α) dans les cellules HTR-8/SVneo traitées à l'hypoxie, dans les groupes OE-NC + P-EXOS et OE-SASH1 + P-EXOS. Abréviations : P-EXOS = exosomes d'origine placentaire ; TEM = microscopie électronique en transmission ; PLAP = phosphatase alcaline placentaire ; TSG101 = gène de susceptibilité tumorale 101. *p < 0,05 ; **p < 0,01. Les données sont exprimées comme moyenne ± écart-type à partir de trois réplicats biologiques indépendants (n = 3). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire 1 : Contrôle de qualité des données de séquençage de l'ARN monocellulaire. (A) Graphique en violon des niveaux d'expression génique après contrôle de qualité. (B) Graphique des caractéristiques variables montrant les gènes hautement variables identifiés après contrôle de qualité.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Détermination des composantes principales statistiquement significatives pour le regroupement de cellules uniques. (A) Graphique en points JackStraw utilisé pour identifier les composantes principales statistiquement significatives. (B) Graphique en points du coude montrant la variance expliquée par les composantes principales.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Séquences cibles des ARNh utilisées pour l'extinction de SASH1. Séquences cibles des ARNh (5′–3′) utilisées pour le contrôle négatif (sh-NC) et trois constructions ciblant SASH1 (sh-SASH1#1, sh-SASH1#2 et sh-SASH1#3) dans le cadre de la silenciation génique.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 2 : Séquences d'amorces utilisées pour la PCR quantitative. Séquences d'amorces sens (5′–3′) et antisens pour SASH1 et β-actine (témoin interne de référence) utilisées dans l'analyse par qPCR.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Dans cette étude, SASH1 a été identifié comme un gène clé régulé de manière anormale dans la prééclampsie (PE) grâce à une analyse transcriptomique intégrée, à un séquençage unicellulaire et à un apprentissage automatique multicritères, une approche particulièrement pertinente étant donné que des thérapies ciblées pour la PE restent indisponibles17. Il a été démontré que SASH1 est fortement surexprimé dans les cellules trophoblastiques hypoxiques et spécifiquement augmenté dans le compartiment trophoblastique des placentas atteints de PE à la résolution unicellulaire. Grâce à des expériences de perte et de gain de fonction, il a été établi que SASH1 est à la fois nécessaire et suffisant pour induire l'apoptose des trophoblastes et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. De plus, le traitement par P-EXOS a atténué les lésions trophoblastiques induites par l'hypoxie, et cet effet protecteur a été aboli par la surexpression de SASH1, confirmant ainsi que la cytoprotection médiée par les P-EXOS dépend mécaniquement de la suppression de SASH1.
De plus, des altérations des proportions de plusieurs types cellulaires placentaires ont été observées dans la PE, notamment chez les cellules B/les cellules plasmatiques, les cellules endothéliales, les fibroblastes/les cellules stromales, les macrophages/les cellules dendritiques, les cellules NK, les cellules T et les cellules trophoblastiques. Ces résultats suggèrent que le microenvironnement placentaire subit un remodelage important au cours de la PE. Un tel microenvironnement inflammatoire n'aggrave pas seulement le dysfonctionnement trophoblastique, mais pourrait également accélérer la progression de la maladie par des interactions entre le système immunitaire et la matrice extracellulaire18. Par ailleurs, les pièges extracellulaires des neutrophiles (NETs) ont récemment été mis en cause dans l'aggravation de l'inflammation placentaire dans la PE19. On pense que SASH1 joue un rôle important dans le développement de la PE par son implication dans la signalisation inflammatoire, l'adhésion cellulaire et les processus liés à l'hypoxie. Dans cette étude, les profils d'expression génique ont été extraits à partir d'échantillons placentaires de patientes atteintes de PE et de grossesses normotensives à l'aide du package limma, et plusieurs algorithmes d'apprentissage automatique ont été utilisés pour la sélection de caractéristiques : régression LASSO, SVM-RFE, XGBoost et Boruta. Dans tous les algorithmes, SASH1 est constamment apparu comme un gène candidat consensuel. Au niveau cellulaire unique, SASH1 a montré une expression spécifique au type cellulaire au sein de diverses populations cellulaires placentaires et a conservé une expression élevée dans les échantillons de PE, la différence la plus marquée étant observée dans les cellules trophoblastiques, ce qui suggère qu'il pourrait exercer des effets fonctionnels distincts selon les contextes cellulaires placentaires.
SASH1 est une protéine adaptatrice de signalisation qui a été décrite comme participant à divers processus biologiques, notamment la migration et l'invasion cellulaires, la transition épithélio-mésenchymateuse et la régulation des voies de signalisation en réponse au stress8,9. Afin d'étudier le rôle fonctionnel de SASH1 dans la pathologie associée à l'éclampsie (PE), un modèle de trophoblaste induit par l'hypoxie a été établi à l'aide de cellules HTR-8/SVneo. Nos résultats ont montré que l'exposition à l'hypoxie régule fortement à la hausse l'expression de SASH1, tandis que l'extinction de SASH1 atténue nettement l'apoptose induite par l'hypoxie et réduit la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, notamment l'IL-1β, l'IL-6 et le TNF-α. Inversement, la surexpression de SASH1 dans des conditions normoxiques suffit à reproduire le phénotype induit par l'hypoxie, établissant ainsi le rôle causal de SASH1 dans les lésions trophoblastiques. Ces résultats suggèrent que SASH1 pourrait réguler négativement l'état fonctionnel du trophoblaste en modulant les réponses inflammatoires. Étant donné que les trophoblastes constituent une source majeure de médiateurs inflammatoires placentaires20, une expression anormale de SASH1 pourrait représenter une base moléculaire essentielle de l'amplification de l'inflammation dans l'éclampsie. Notamment, les fonctions pro-apoptotiques et pro-inflammatoires de SASH1 observées dans les cellules trophoblastiques contrastent avec son rôle canonique de suppresseur de tumeur dans les cellules cancéreuses, où elle inhibe généralement la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et la migration8,9. Cette dualité fonctionnelle dépendante du contexte pourrait refléter des différences spécifiques au type cellulaire concernant les partenaires d'interaction de SASH1 et les réseaux de signalisation en aval, et mérite des investigations supplémentaires.
Les exosomes sont reconnus comme des médiateurs importants de la communication intercellulaire et ont été impliqués dans la pathogenèse de l'EP21. En particulier, les EXOS-P pourraient jouer un rôle important dans la régulation immunitaire au cours d'une grossesse normale, comme le maintien de la tolérance immunitaire mère-fœtus, ce qui pourrait conférer une protection contre l'EP22. Dans cette étude, une analyse bioinformatique a révélé une association entre SASH1 et des voies de signalisation liées aux exosomes, incitant à approfondir l'étude du rôle des EXOS-P dans la régulation de la fonction des trophoblastes. Des expériences de co-culture ont démontré qu'un traitement par les EXOS-P diminuait significativement les niveaux d'ARNm et de protéine SASH1 dans les cellules trophoblastiques exposées à l'hypoxie, et atténuait de manière marquée l'apoptose et les réponses inflammatoires induites par l'hypoxie. De façon importante, une surexpression de SASH1 abolissait ces effets protecteurs, confirmant ainsi que la cytoprotection médiée par les EXOS-P dépend mécaniquement de la suppression de SASH1 plutôt que d'agir par des voies parallèles.
Les mécanismes moléculaires par lesquels les P-EXOS suppriment l'expression de SASH1 restent à élucider. On sait que les P-EXOS transportent diverses cargaisons bioactives, notamment des microARN, des protéines et des lipides, capables de moduler l'expression génique dans les cellules receveuses10. Une possibilité est que les P-EXOS délivrent des miARN spécifiques ciblant directement ou indirectement SASH1. Autrement, les P-EXOS pourraient moduler des voies de signalisation en amont—telles que NF-κB ou PI3K-Akt—qui convergent vers la régulation transcriptionnelle de SASH1. Étant donné que SASH1 est impliqué dans la voie PI3K-Akt-mTOR dans les cellules cancéreuses8, il est plausible qu'une modulation exosomale de cet axe puisse contribuer à la répression de SASH1 dans les cellules trophoblastiques. Des études futures utilisant le séquençage de la cargaison exosomale et des inhibiteurs spécifiques aux voies concernées seront nécessaires pour déterminer la cascade moléculaire précise par laquelle les P-EXOS régulent l'expression de SASH1.
Dans cette étude, le profilage transcriptomique a été combiné à un séquençage de l'ARN au niveau de la cellule unique afin d'analyser les modifications moléculaires observées dans le tissu placentaire au cours de la prééclampsie (PE). Il a été démontré que SASH1 joue un rôle clé dans l'apoptose des trophoblastes induite par l'hypoxie ainsi que dans les réponses inflammatoires, et que les P-EXOS peuvent exercer un effet protecteur en supprimant l'expression de SASH1, offrant ainsi de nouvelles perspectives sur les mécanismes moléculaires sous-jacents à la PE et suggérant une stratégie thérapeutique potentielle. Toutefois, cette étude présente plusieurs limites. Premièrement, les résultats fonctionnels ont principalement été obtenus à partir de la lignée cellulaire de trophoblastes immortalisée HTR-8/SVneo ; une validation sur des cellules trophoblastiques primaires s'impose. Deuxièmement, l'expression protéique de SASH1 n'a pas été confirmée dans des tissus placentaires cliniques de PE par immunohistochimie, ce qui limite l'interprétation translationnelle des résultats et devrait être abordé dans des études futures. Troisièmement, le classificateur SVM-RFE a montré une précision modérée lors de la validation croisée (~0,6), reflétant l'hétérogénéité intrinsèque du jeu de données ; des cohortes indépendantes plus importantes seront nécessaires pour développer des modèles diagnostiques plus robustes. Quatrièmement, le mécanisme moléculaire précis par lequel les P-EXOS suppriment l'expression de SASH1 reste à élucider. Cinquièmement, des bandes de teinture non spécifiques ont été observées lors de la détection de SASH1 par immunoblotting, ce qui pourrait être dû à une spécificité sous-optimale de l'anticorps. L'anticorps utilisé dans cette expérience est un anticorps polyclonal, qui présente généralement une spécificité moindre en immunodétection comparé aux anticorps monoclonaux. Néanmoins, ces bandes non spécifiques n'affectent ni les résultats relatifs à la protéine SASH1 ni les conclusions de cette étude. Des études futures intégrant des expériences in vivo, une analyse d'échantillons cliniques et une caractérisation du contenu des exosomes seront nécessaires afin de mieux élucider le rôle fonctionnel de l'axe P-EXOS-SASH1 dans la PE et d'évaluer son potentiel translationnel.
Déclarations de divulgation
Il n'y a aucun conflit d'intérêts dans cette étude.
Remerciements
Cette étude a été financée par le programme clé de recherche en sciences médicales de la Commission provinciale de la santé du Hebei, Chine (n° 20210075).
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu RPMI-1640 | Gibco | 11875085 | |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| FBS dépourvu d'exosomes | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Réactif de transfection Lipofectamine 3000 (avec réactif P3000) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Milieu Opti-MEM à faible teneur en sérum | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| Plasmide d'ARNi ciblant SASH1 (HuSH) | origene | TL301836 | |
| Plasmide d'expression d'ORF SASH1 | origene | RC218866 | |
| Vecteur vide témoin | origene | PS100001 | |
| Kit de transcription inverse | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| Amorces SASH1 | Sangon Biotech | Synthèse personnalisée | |
| Amorces β-actine | Sangon Biotech | Synthèse personnalisée | |
| Tampon de lyse cellulaire | Beyotime | P0013B | |
| Spectrophotomètre NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| Mébrane PVDF | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Anticorps anti-SASH1 | ABclonal | A15248 | |
| Anticorps anti-β-actine | Abcam | ab6276 | |
| Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (HRP), caprin anti-lapin/anti-souris | Beyotime | A0208 | |
| Logiciel ImageJ | NIH (domaine public) | ImageJ | |
| Kit PKH67 de marquage fluorescent des cellules (incluant le diluant C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Microscope à balayage laser confocal (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Kit ELISA Quantikine pour l'IL-6 humaine | R&D Systems | D6050B | |
| Kit ELISA DuoSet pour l'IL-1β/IL-1F2 humaine | R&D Systems | DY201 | |
| Kit ELISA Quantikine pour le TNF-α humain | R&D Systems | DTA00D | |
| Lecteur de microplaques | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| Kit de détection in situ de la mort cellulaire (Kit d'essai TUNEL) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldéhyde (4 %) | Beyotime | P0099 | |
| Microscope à fluorescence | Olympus | BX53 | |
| Centrifugeuse réfrigérée (capacité 12 000 × g) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultracentrifugeuse (capacité 120 000 × g) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Logiciel R | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (package R) | Satija Lab (open-source) | v4.0.4 | |
| Harmony (package R, correction de lot) | Open-source | v1.2.0 | |
| Scrublet (package Python, détection des doublets) | Open-source | v0.2.3 | |
| clustree (package R) | Open-source | v0.5.1 | |
| glmnet (package R, LASSO) | Open-source | v4.1.8 | |
| e1071 (package R, SVM-RFE) | Open-source | v1.7-14 | |
| xgboost (package R) | Open-source | v1.7.7.1 | |
| randomForest (package R, Boruta) | Open-source | v4.7-1.1 | |
| Base de données Gene Expression Omnibus (GEO) | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| Base de données STRING | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Logiciel Cytoscape | Cytoscape Consortium | v3.10.4 | |
| ggplot2 (package R) | Open-source | v3.5.1 | |
| limma (package R) | Open-source | v3.58.1 | |
| pheatmap (package R) | Open-source | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (package R) | Open-source | v4.8.3 | |
| DOSE (package R) | Open-source | v3.28.2 | |
| ggpubr (package R) | Open-source | v0.6.0 |
Références
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