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Article de recherche
* These authors contributed equally
La protéine 1 contenant les domaines SAM et SH3 (SASH1) est identifiée comme un régulateur clé de l'apoptose et de l'inflammation des trophoblastes dans la prééclampsie (PE). Les exosomes d'origine placentaire (P-EXOS) atténuent les lésions induites par l'hypoxie en supprimant l'expression de SASH1. Ces résultats révèlent un mécanisme nouveau sous-jacent à la pathogenèse de la PE et suggèrent que SASH1 pourrait constituer une cible thérapeutique potentielle.
SASH1 est une protéine adaptatrice de signalisation impliquée dans la croissance cellulaire, l'apoptose et la régulation immunitaire, et a été de plus en plus étudiée dans les cellules tumorales et immunitaires. Des données récentes suggèrent que SASH1 joue un rôle important dans les réponses inflammatoires et l'homéostasie cellulaire, des processus étroitement associés au développement de la prééclampsie (PE). Cette étude visait à déterminer si SASH1 contribue à l'apoptose des trophoblastes et aux réponses inflammatoires dans la PE, et si les P-EXOS exercent des effets protecteurs par la régulation de SASH1. Dans cette étude, trois jeux de données transcriptomiques liés à la PE (GSE75010, GSE10588 et GSE60438) ont été analysés afin d'identifier les gènes différentiellement exprimés (DEG) communs, suivis d'analyses d'enrichissement par l'Ontologie génétique (GO) et par l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG). Des algorithmes d'apprentissage automatique ont ensuite été appliqués pour sélectionner les gènes candidats clés, et des données de séquençage de l'ARN monocellulaire ont été utilisées pour caractériser l'hétérogénéité cellulaire dans le tissu placentaire et déterminer les profils d'expression spécifiques à chaque type cellulaire. SASH1 a été identifié comme un gène candidat consensuel et était significativement surexprimé dans les cellules trophoblastiques provenant d'échantillons de PE. In vitro, un modèle de cellules trophoblastiques HTR-8/SVneo traitées à l'hypoxie a été établi, combiné à une inhibition de SASH1, une surexpression de SASH1 et une co-culture avec des P-EXOS. Des expériences fonctionnelles ont montré qu'une inhibition de SASH1 supprimait significativement l'apoptose des trophoblastes induite par l'hypoxie et réduisait la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, notamment IL-6, IL-1β et TNF-α, tandis qu'une surexpression de SASH1 favorisait l'apoptose et les réponses inflammatoires. De plus, un traitement par P-EXOS réduisait nettement l'expression de SASH1 aux niveaux d'ARNm et protéique et atténuait les lésions trophoblastiques induites par l'hypoxie, alors qu'une surexpression de SASH1 abolissait largement ces effets protecteurs. Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que SASH1 joue un rôle essentiel dans l'apoptose des trophoblastes et les réponses inflammatoires dans la PE. Les P-EXOS pourraient atténuer les lésions trophoblastiques induites par l'hypoxie en supprimant l'expression de SASH1, offrant ainsi de nouvelles perspectives sur les mécanismes moléculaires et les cibles thérapeutiques potentielles de la PE.
L'éclampsie est un trouble multisystémique spécifique à la grossesse qui survient typiquement après 20 semaines d'aménorrhée et se caractérise cliniquement par une hypertension, une protéinurie et un dysfonctionnement multiviscéral. Elle demeure une cause majeure de morbidité et de mortalité maternelle et périnatale dans le monde entier1. Malgré des progrès continus dans la prise en charge clinique, le traitement définitif de l'éclampsie reste l'accouchement du placenta, ce qui souligne l'insuffisance de la compréhension de sa pathogenèse et la nécessité urgente d'identifier de nouveaux mécanismes moléculaires et cellulaires ainsi que des cibles thérapeutiques potentielles2,3.
Une invasion adéquate des cellules trophoblastiques et la promotion d'un développement placentaire normal sont des mécanismes essentiels sous-jacents à la pathogenèse de la prééclampsie4. Au cours d'une grossesse normale, les cellules trophoblastiques envahissent la décidua utérine et remodelent les artères spirales afin d'établir une circulation à faible résistance et à haute capacité. Une invasion et une migration altérées des cellules trophoblastiques entraînent une perfusion placentaire réduite, provoquant un environnement persistant d'hypoxie et de stress oxydatif. L'hypoxie affecte directement l'apoptose cellulaire, et la libération anormale de médiateurs pro-inflammatoires perturbe l'homéostasie à l'interface mère-fœtus, aggravant davantage le dysfonctionnement placentaire5. L'inflammation est également un facteur important dans la prééclampsie. Des taux nettement élevés d'IL-17, d'IL-6 et de TNF-α ont été observés dans le placenta et le sang périphérique des patientes atteintes de prééclampsie6. L'hypoxie et l'inflammation s'alimentent mutuellement, créant un cercle vicieux qui amplifie l'inflammation systémique, provoque des lésions endothéliales et contribue aux anomalies placentaires. Les réseaux moléculaires sous-jacents régulant l'apoptose trophoblastique et les réponses inflammatoires restent largement inconnus.
SASH1 est un membre de la famille des protéines d'échafaudage intracellulaires SLy/SASH1 qui fonctionne comme un adaptateur de signalisation7. SASH1 a été principalement caractérisé comme un suppresseur de tumeur qui inhibe la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), la migration cellulaire et l'invasion par des interactions avec des partenaires de signalisation tels que CRKL et la voie PI3K-Akt-mTOR8,9. Outre ses rôles de suppression tumorale, des preuves émergentes suggèrent que SASH1 participe à la signalisation inflammatoire et à la régulation immunitaire7. Toutefois, l'expression et la fonction de SASH1 dans le placenta, en particulier dans le contexte de la biologie des trophoblastes et de la prééclampsie (PE), n'ont pas encore été étudiées.
Les exosomes se sont imposés comme des médiateurs cellulaires importants et font l'objet d'études de plus en plus nombreuses dans le contexte de la grossesse10. Les exosomes transportent diverses cargaisons bioactives, notamment des protéines, des lipides et des ARN non codants, afin de moduler la fonction des cellules réceptrices. Des preuves croissantes suggèrent que les P-EXOS jouent un rôle essentiel dans la régulation immunitaire pendant la grossesse, et que leur activité ainsi que leur cargaison sont significativement modifiées dans la prééclampsie (PE), pouvant potentiellement aggraver l'état inflammatoire11. Les exosomes ont également été impliqués dans la régulation du stress oxydatif12 et de l'angiogenèse13, exerçant ainsi des effets potentiellement bénéfiques dans les complications liées à la grossesse. Toutefois, leurs cibles moléculaires et leurs mécanismes d'action dans la prééclampsie restent incomplètement élucidés.
On a émis l'hypothèse que SASH1 est régulé de manière anormale dans le placenta de la prééclampsie (PE) et qu'il exerce une fonction clé dans l'apoptose des trophoblastes et les réponses inflammatoires, et que les EXOS-P pourraient exercer des effets protecteurs contre les lésions des trophoblastes en modulant l'expression de SASH1. Afin de tester cette hypothèse, plusieurs jeux de données transcriptomiques de PE ont été intégrés, ainsi que des données de séquençage ARN monocellulaire combinées à un apprentissage automatique multi-algorithmes, afin d'identifier les gènes candidats clés. À l'aide d'un modèle cellulaire de trophoblaste HTR-8/SVneo soumis à un traitement en condition d'hypoxie et d'expériences d'intervention basées sur les exosomes, le rôle fonctionnel de SASH1 dans le dysfonctionnement du trophoblaste ainsi que le potentiel thérapeutique des EXOS-P dans la PE ont été étudiés.
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Déclaration éthique
Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'Hôpital numéro quatre de Shijiazhuang (numéro d'approbation : 20200031). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les donneurs de tissu placentaire avant le prélèvement des échantillons. Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été menées conformément à la Déclaration d'Helsinki. Une liste complète des réactifs, consommables, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole est fournie dans le Tableau des matériaux.
Collecte des données
Les données d'ARN-séquençage ont été obtenues à partir de la base de données GEO. Les jeux de données comprennent GSE75010, qui contient des données d'expression génique provenant de 157 placentas PE et de 173 placentas non-PE (N = 330). GSE10588 contient des données d'expression génique provenant de 26 placentas normaux et de 17 placentas sévères avec PE (N = 43). GSE60438 contient des données de profilage transcriptomique du décidual basal provenant de patientes prééclamptiques et de grossesses normotensives (N = 125). Les données de transcriptome unicellulaire ont été obtenues à partir du jeu de données GEO GSE183338. Celui-ci inclut des échantillons de noyaux uniques provenant des villosités choriales/du site mère-fœtus de grossesses avec PE et de grossesses saines.
Analyse des gènes différentiellement exprimés
Les gènes différentiellement exprimés (DEG) associés à la PE ont d'abord fait l'objet d'un prétraitement et d'une normalisation à partir des jeux de données GSE75010, GSE10588 et GSE60438. Ensuite, une analyse différentielle a été réalisée à l'aide du package R « limma »14, en se basant sur les informations de regroupement des échantillons. Les gènes présentant une valeur p < 0,05 et un |log2FC| > 0,5 ont été sélectionnés. Les diagrammes en volcan des DEG ont été générés à l'aide du package R ggplot2. Les cartes thermiques des 20 premiers DEG ont été réalisées à l'aide du package R pheatmap. Par la suite, l'intersection des DEG sélectionnés à partir des trois jeux de données a été déterminée, et un réseau d'interactions protéine-protéine (PPI) a été construit pour les gènes candidats à l'aide de la plateforme en ligne STRING, avec un score d'interaction ≥ 0,15. Les 20 principaux gènes centraux ont ensuite été identifiés dans ce réseau PPI selon leur degré de connectivité, classés à l'aide du logiciel Cytoscape. Les résultats du réseau PPI ont été visualisés à l'aide du logiciel Cytoscape ou de la plateforme STRING.
Analyse d'enrichissement
Une analyse d'enrichissement génique a été réalisée à l'aide des packages ClusterProfiler et DOSE en combinaison avec le site web Metascape. Les bases de données ont été obtenues à partir de GO et KEGG. L'analyse d'enrichissement a été effectuée à l'aide de la fonction « EnrichGO ». Les voies métaboliques avec une valeur p < 0,05 ont été considérées comme significativement enrichies. Les résultats d'enrichissement ont été visualisés à l'aide des packages « ggplot2 » et « ggpubr ».
Apprentissage automatique
Afin d'identifier des gènes différentiellement exprimés (GDE) robustes et biologiquement significatifs associés à l'éclampsie, une analyse de sélection de caractéristiques par apprentissage automatique multi-modèle a été réalisée à partir du jeu de données transcriptomiques publiquement disponible GSE60438 (plateforme : GPL6884). Ce jeu de données contient le profil d'expression d'échantillons de décidue basalis prélevés lors de grossesses éclamptiques et normotensives au moment d'une césarienne. Les GDE préfiltrés ont été normalisés, et la matrice d'expression, conjointement aux informations de regroupement clinique correspondantes, a été utilisée comme entrée pour quatre algorithmes d'apprentissage automatique distincts afin de réduire les biais du modèle et d'améliorer la stabilité de la sélection des caractéristiques.
Les quatre algorithmes ont été appliqués simultanément, sans ordre particulier. La régression LASSO a été effectuée à l'aide du package « glmnet » afin de réaliser une analyse de régression et de sélectionner les gènes caractéristiques importants. Un terme de régularisation L1 a été ajouté à la fonction de perte, ce qui réduit à zéro les coefficients des caractéristiques moins importantes, permettant ainsi la sélection de variables. SVM-RFE a été mis en œuvre à l'aide du package « e1071 » pour construire une machine à vecteurs de support avec élimination récursive des caractéristiques. Un classificateur a d'abord été entraîné par SVM, puis les caractéristiques les moins informatives ont été supprimées itérativement en fonction de leurs poids, produisant un sous-ensemble optimal de caractéristiques. XGBoost a été utilisé avec le package « xgboost » pour construire plusieurs arbres de décision. Chaque arbre s'ajuste aux résidus de l'arbre précédent, et les sorties pondérées sont cumulées pour obtenir la prédiction finale. Boruta a été appliqué à l'aide du package « randomForest », générant des caractéristiques fantômes qui rivalisent avec les caractéristiques réelles lors de l'entraînement d'une forêt aléatoire. Les caractéristiques dont les valeurs d'importance sont significativement supérieures au bruit aléatoire ont été conservées.
Analyse des données de transcriptome unicellulaire
Des données de transcriptome unicellulaires ont été obtenues à partir de la base de données GEO, et la matrice brute de comptage a été récupérée à partir de GSE183338. La matrice de comptage a été importée à l'aide de la fonction « Read10X » du package Seurat et convertie au format dgCMatrix. Des objets individuels ont été fusionnés en un objet agrégé unique à l'aide de la fonction « merge », et les étiquettes des cellules ont été rendues uniques à l'aide de « RenameCells ». Les cellules de faible qualité ont été filtrées selon les critères suivants : les gènes exprimés dans moins de trois cellules ont été supprimés, et les cellules exprimant moins de 200 gènes ont été exclues. Les cellules ayant subi un contrôle qualité ont été normalisées et les gènes hautement variables ont été identifiés. Une normalisation par mise à l'échelle globale a été appliquée à l'aide de « LogNormalize » (facteur d'échelle = 10 000), les gènes hautement variables (n = 2 000) ont été sélectionnés à l'aide de « FindVariableFeatures », et les données ont été mises à l'échelle à l'aide de « ScaleData ». Une analyse en composantes principales a été réalisée sur les caractéristiques hautement variables, et les 30 premières composantes principales ont été conservées. Les effets de lot entre les échantillons ont été corrigés à l'aide de la méthode Harmony. Les cellules ont été visualisées et réduites à l'aide de UMAP. Des graphes de voisins les plus proches partagés ont été construits à l'aide de « FindNeighbors » et « FindClusters », selon l'algorithme de Louvain. Le paramètre de résolution dans « FindClusters » a été optimisé entre 0,1 et 1. L'arbre de regroupement a été visualisé à l'aide de la fonction « clustree », et une résolution de 0,9 a été choisie pour définir les groupes cellulaires. Les doublests potentiels ont été éliminés à l'aide de l'algorithme Scrublet. Les groupes cellulaires ont été annotés en identifiant les gènes marqueurs différentiellement exprimés à l'aide de la fonction « FindAllMarkers ». Le test non paramétrique de Wilcoxon par rangs a été appliqué avec correction de Bonferroni. Les identités cellulaires ont été attribuées en fonction des marqueurs d'expression membranaire, de la littérature pertinente et de la Base de données de classification cellulaire15.
Culture cellulaire
Les cellules de la lignée de trophoblastes HTR-8/SVneo ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline/streptomycine. Les conditions d’hypoxie ont été établies en cultivant les cellules à 1 % de O₂, 5 % de CO₂ et 94 % de N₂ pendant 24 heures ; les témoins normoxiques ont été maintenus à 20 % de O₂ et 5 % de CO₂16. Toutes les manipulations de culture cellulaire doivent être effectuées dans une hotte de sécurité biologique de classe II en utilisant une technique aseptique. Les milieux de culture, les réactifs de transfection et les déchets cellulaires doivent être éliminés conformément aux directives institutionnelles de biosécurité.
Transfection des cellules
Des plasmides contenant sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 et OE-NC ont été synthétisés. Les cellules HTR-8/SVneo ont été ensemencées à une densité de 5 × 105 cellules par puits dans des plaques à six puits. Les cellules ont ensuite été transfectées avec 2 µg de plasmide sh-SASH1, sh-NC, OE-SASH1 ou OE-NC par puits à l’aide d’un réactif de transfection, conformément aux instructions du fabricant. Brièvement, l’ADN plasmidique et le réactif P3000 ont été dilués dans du Opti-MEM, mélangés avec du Lipofectamine 3000 dilué séparément dans du Opti-MEM, incubés pendant 15 minutes à température ambiante, puis ajoutés aux cellules ayant atteint une confluence de 70 à 80 %. Quarante-huit heures après la transfection, l’expression de SASH1 a été évaluée par RT-qPCR et immunoblotting. Les séquences cibles de l’ARNsi utilisées pour l’extinction de SASH1 sont indiquées dans le Tableau supplémentaire 1.
PCR quantitative en temps réel
L'ARN total a été extrait des cellules HTR-8/SVneo et rétrotranscrit en ADNc à l'aide d'un kit de transcription inverse à 42 °C pendant 30 min, suivi de 85 °C pendant 5 min. Une PCR quantitative en temps réel (qPCR) a été réalisée à l'aide d'un mélange maître SYBR Green avec les conditions de cyclage suivantes : 95 °C pendant 10 min, suivies de 40 cycles de 95 °C pendant 15 s et 60 °C pendant 1 min. L'expression relative des ARNm a été calculée selon la méthode ΔΔCt, en utilisant β-actine comme référence interne. Les séquences des amorces utilisées dans cette expérience sont indiquées dans le Tableau supplémentaire 2.
Dosage par immunotransfert
Des protéines totales ont été extraites à partir de cellules HTR-8/SVneo à l'aide d'un tampon de lyse. Les lysats cellulaires ont été recueillis, incubés sur de la glace, puis centrifugés à 12 000 × g pendant 30 min à 4 °C afin d'éliminer les débris insolubles. La concentration en protéines a été déterminée à l'aide d'un spectrophotomètre. Des quantités équivalentes de protéines (50 µg) ont été séparées par électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, puis transférées sur des membranes en PVDF. Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % et incubées avec les anticorps primaires toute la nuit à 4 °C. Après lavage, les membranes ont été incubées avec les anticorps secondaires correspondants, et les bandes protéiques ont été visualisées à l'aide d'un système de détection par chimiluminescence améliorée.
Pour la détection des protéines, les anticorps primaires utilisés comprenaient anti-SASH1 et β-actine. Des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) appropriés — chèvre anti-lapin et chèvre anti-souris — ont été employés. La β-actine a été utilisée comme témoin interne de chargement afin de garantir une quantité égale de protéines chargées. L'intensité des bandes protéiques a été mesurée et quantifiée à l'aide du logiciel ImageJ.
Isolation des P-EXOS
Les P-EXOS ont été isolées à partir de tissu villositaire placentaire obtenu à partir de placentas à terme provenant de femmes en bonne santé subissant une césarienne programmée. Le tissu villositaire placentaire a été soigneusement lavé avec du PBS stérile, puis haché en fragments d'environ 1 mm3 fragments, et mis en culture dans un milieu RPMI-1640 complété avec 10 % de SFB dépourvu d'exosomes, à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO₂2 pendant 48 h. Le milieu conditionné a été soumis à une centrifugation différentielle selon le protocole suivant : 300 × g pendant 10 min pour éliminer les cellules et les débris tissulaires ; 2 000 × g pendant 20 min pour éliminer les débris cellulaires ; et 10 000 × g pendant 30 min pour éliminer les microvésicules, le tout à 4 °C. Le surnageant obtenu a été soumis à une ultracentrifugation à 120 000 × g pendant 70 min à 4 °C pour former un culot d'exosomes. Le culot a été lavé une fois avec du PBS et re-soumis à une ultracentrifugation à 120 000 × g pendant 70 min à 4 °C. Le culot final a été resuspendu dans du PBS. Les exosomes isolés ont été caractérisés par analyse en immunotransfert pour les marqueurs d'exosomes (PLAP, CD63 et TSG101, avec GM130 comme témoin négatif) et examinés ultérieurement par microscopie électronique en transmission pour l'observation morphologique.
Expérience d'absorption cellulaire des P-EXOS
Pour confirmer l'internalisation cellulaire des P-EXOS, les exosomes ont été marqués de manière fluorescente à l'aide du colorant membranaire lipophile PKH67 selon le protocole du fabricant. Brièvement, les P-EXOS ont été incubés avec le PKH67 (4 µM) dans le diluant C pendant 5 min à température ambiante, puis la réaction a été arrêtée par l'ajout d'un volume équivalent d'albumine de sérum bovin (BSA) à 1 %. Les exosomes marqués ont été ré-isolés par ultracentrifugation (120 000 × g, 70 min, 4 °C) afin d'éliminer le colorant non lié. Les P-EXOS marqués au PKH67 (50 µg/mL) ont ensuite été ajoutés aux cellules HTR-8/SVneo et co-incubés pendant 24 h dans des conditions normoxiques ou hypoxiques (1 % O₂). Les cellules ont ensuite été lavées trois fois au PBS, fixées pendant 15 min avec du paraformaldéhyde à 4 %, et les noyaux ont été contre-colorés avec le DAPI (1 µg/mL). L'internalisation des exosomes marqués au PKH67 a été visualisée par microscopie à balayage laser confocale (CLSM ; excitation 490 nm, émission 502 nm). Pour les expériences fonctionnelles de co-culture, les cellules HTR-8/SVneo ont été traitées avec les P-EXOS à une concentration de 50 µg/mL (équivalent protéique) dans un milieu RPMI-1640 complet supplémenté avec 10 % de SFB dépourvu d'exosomes, dans des conditions hypoxiques (1 % O₂) pendant 24 h.
Dosage immuno-enzymatique (ELISA)
Les surnageants de culture cellulaire ont été recueillis, et les concentrations de IL-6, IL-1β et TNF-α ont été mesurées à l'aide respectivement du kit ELISA pour IL-6, du kit ELISA pour IL-1β et du kit ELISA pour TNF-α, conformément aux instructions du fabricant. L'absorbance à 450 nm a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques, et les concentrations réelles ont été déterminées à partir des courbes standards.
Marquage par terminaison nick-end TdT-médiée de dUTP (TUNEL)
Les cellules apoptotiques ont été détectées à l'aide du kit de dosage TUNEL conformément aux instructions du fabricant. Brièvement, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min à température ambiante, perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,1 % dans du PBS pendant 5 min sur de la glace, puis incubées avec le mélange réactionnel TUNEL pendant 60 min à 37 °C à l'abri de la lumière. Les noyaux ont été contre-colorés avec le DAPI, et les cellules positives au TUNEL ont été visualisées à l'aide d'un microscope à fluorescence et quantifiées en dénombrant le pourcentage de cellules positives au TUNEL dans au moins cinq champs sélectionnés aléatoirement par échantillon.
Analyse statistique
Toutes les données ont été analysées à l'aide de R et de GraphPad Prism. Les variables continues sont présentées sous forme de moyenne ± écart-type. Les comparaisons entre deux groupes ont été effectuées à l'aide du test t de Student, tandis que les comparaisons entre plusieurs groupes ont été réalisées à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie du test post hoc de Tukey. La signification statistique des variables catégorielles a été évaluée par le test du Chi-deux ou par le test exact de Fisher. Sauf indication contraire, les corrélations entre les molécules ont été calculées à l'aide d'une analyse de corrélation de Spearman. Les expériences de caractérisation des exosomes ont été réalisées à l'aide de P-EXOS isolés à partir de trois donneurs placentaires indépendants. Les expériences cellulaires ont été effectuées en trois réplicats biologiques indépendants, représentant des expériences indépendantes réalisées à des moments distincts avec des cellules HTR-8/SVneo à des passages différents, chaque réplicat utilisant des P-EXOS isolés d'un donneur placentaire différent. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
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Analyse transcriptomique de patients sains et de patients atteints de PE
Pour les différences d'expression génique entre le groupe témoin (Normal) et les patients atteints de PE, l'expression différentielle a été analysée à l'aide du package R limma sur les jeux de données fusionnés. Un total de 89 gènes différentiellement exprimés (DEG) a été identifié (p < 0,05 et |log2FC| > 0,5), dont 69 gènes surexprimés et 20 gènes sous-exprimés pour GSE75010 (
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Dans cette étude, SASH1 a été identifié comme un gène clé régulé de manière anormale dans la prééclampsie (PE) grâce à une analyse transcriptomique intégrée, à un séquençage unicellulaire et à un apprentissage automatique multicritères, une approche particulièrement pertinente étant donné que des thérapies ciblées pour la PE restent indisponibles17. Il a été démontré que SASH1 est fortement surexprimé dans les cellules trophoblastiques hypoxiques et spécifiquement augmenté dans le compartiment tro...
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Il n'y a aucun conflit d'intérêts dans cette étude.
Cette étude a été financée par le programme clé de recherche en sciences médicales de la Commission provinciale de la santé du Hebei, Chine (n° 20210075).
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Milieu RPMI-1640 | Gibco | 11875085 | |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Gibco | 16140071 | |
| FBS dépourvu d'exosomes | System Biosciences | EXO-FBS-50A-1 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Thermo Fisher Scientific, CN | 15140122 | |
| Réactif de transfection Lipofectamine 3000 (avec réactif P3000) | Thermo Fisher Scientific, CN | L3000150 | |
| Milieu Opti-MEM à faible teneur en sérum | Thermo Fisher Scientific, CN | 31985070 | |
| Plasmide d'ARNi ciblant SASH1 (HuSH) | origene | TL301836 | |
| Plasmide d'expression d'ORF SASH1 | origene | RC218866 | |
| Vecteur vide témoin | origene | PS100001 | |
| Kit de transcription inverse | Thermo Fisher Scientific, CN | 4368814 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific, CN | A46110 | |
| Amorces SASH1 | Sangon Biotech | Synthèse personnalisée | |
| Amorces β-actine | Sangon Biotech | Synthèse personnalisée | |
| Tampon de lyse cellulaire | Beyotime | P0013B | |
| Spectrophotomètre NanoDrop | Thermo Fisher Scientific, CN | NanoDrop Ultra | |
| Mébrane PVDF | Thermo Fisher Scientific, CN | 88518 | |
| Anticorps anti-SASH1 | ABclonal | A15248 | |
| Anticorps anti-β-actine | Abcam | ab6276 | |
| Anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (HRP), caprin anti-lapin/anti-souris | Beyotime | A0208 | |
| Logiciel ImageJ | NIH (domaine public) | ImageJ | |
| Kit PKH67 de marquage fluorescent des cellules (incluant le diluant C) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | MINI67 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, CN | 10711454001 | |
| DAPI | Beyotime | C1002 | |
| Microscope à balayage laser confocal (CLSM) | Leica | Leica TCS SP8 | |
| Kit ELISA Quantikine pour l'IL-6 humaine | R&D Systems | D6050B | |
| Kit ELISA DuoSet pour l'IL-1β/IL-1F2 humaine | R&D Systems | DY201 | |
| Kit ELISA Quantikine pour le TNF-α humain | R&D Systems | DTA00D | |
| Lecteur de microplaques | Thermo Scientific | Multiskan FC | |
| Kit de détection in situ de la mort cellulaire (Kit d'essai TUNEL) | Roche | 11684795910 | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096 | |
| Paraformaldéhyde (4 %) | Beyotime | P0099 | |
| Microscope à fluorescence | Olympus | BX53 | |
| Centrifugeuse réfrigérée (capacité 12 000 × g) | Eppendorf | Eppendorf 5430 R | |
| Ultracentrifugeuse (capacité 120 000 × g) | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | |
| Logiciel R | The R Foundation | v4.2.1 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v10.0 | |
| Seurat (package R) | Satija Lab (open-source) | v4.0.4 | |
| Harmony (package R, correction de lot) | Open-source | v1.2.0 | |
| Scrublet (package Python, détection des doublets) | Open-source | v0.2.3 | |
| clustree (package R) | Open-source | v0.5.1 | |
| glmnet (package R, LASSO) | Open-source | v4.1.8 | |
| e1071 (package R, SVM-RFE) | Open-source | v1.7-14 | |
| xgboost (package R) | Open-source | v1.7.7.1 | |
| randomForest (package R, Boruta) | Open-source | v4.7-1.1 | |
| Base de données Gene Expression Omnibus (GEO) | NCBI | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | |
| Base de données STRING | string-db.org | https://www.string-db.org/ | |
| Metascape | metascape.org | https://metascape.org/ | |
| Logiciel Cytoscape | Cytoscape Consortium | v3.10.4 | |
| ggplot2 (package R) | Open-source | v3.5.1 | |
| limma (package R) | Open-source | v3.58.1 | |
| pheatmap (package R) | Open-source | v1.0.12 | |
| ClusterProfiler (package R) | Open-source | v4.8.3 | |
| DOSE (package R) | Open-source | v3.28.2 | |
| ggpubr (package R) | Open-source | v0.6.0 |
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