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Article de méthode

Un test in vitro pour la dégradation de LpxC par la protéase FtsH liée à la membrane et l’adaptateur LapB d’Escherichia coli

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DOI :

10.3791/71092

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22 juin 2026

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1Department of Pharmacology, Yale University School of Medicine, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Escherichia coli régule principalement la biosynthèse des lipopolysaccharides (LPS) en contrôlant la dégradation de LpxC, la déacétylase qui catalyse la première étape engagée de la synthèse du LPS. L’objectif de ce protocole est d’établir un test sensible et quantitatif de dégradation in vitro pour LpxC, en utilisant la protéase AAA+ reconstituée FtsH et l’adaptateur LapB dans les protéolisomes.

Résumé

Ce protocole présente un test sensible et quantitatif de dégradation in vitro de LpxC utilisant la protéase FtsH reconstituée AAA+ (ATPase associée à diverses activités cellulaires) et LapB adaptateur dans les protéoliposomes. Les protéases AAA+ sont des machines moléculaires dépendantes de l’ATP qui maintiennent l’homéostasie des protéines et régulent divers processus cellulaires dans le cytoplasme ou aux membranes cellulaires. Comparées à leurs homologues cytoplasmiques, les protéases AAA+ liées à la membrane restent peu caractérisées en raison de difficultés techniques dans la reconstitution et la mesure de leur activité in vitro. Ici, nous utilisons le système FtsH–LapB–LpxC comme modèle pour développer un test de dégradation par fluorescence dans les protéoliposomes. FtsH et LapB sont reconstitués en protéoliposomes pour imiter l’environnement membranaire natif, et LpxC est marqué de manière covalente avec le colorant fluorescent Atto488. La dégradation est initiée par la combinaison de protéoliposomes avec des LpxC et de l’ATP marqués et terminée par l’acide trichloroacétique (TCA). Un essai réussi est défini par une augmentation temporelle de la fluorescence dans la fraction surnageante soluble après la précipitation du TCA, correspondant à la libération de fragments peptidiques fluorescents générés par la protéolyse LpxC. Ce signal permet la quantification directe des taux de dégradation initiaux dans des conditions définies. Comparée aux tests traditionnels basés sur l’électrophorèse en gel de dodécyle de sodium et de polyacrylamide (SDS-PAGE), cette méthode offre une sensibilité nettement améliorée et permet une analyse cinétique quantitative. De plus, le système de protéoliposomes permet une étude systématique de la manière dont les composants protéiques, tels que les adaptateurs et anti-adaptateurs, ainsi que la composition lipidique, influencent la dégradation du LpxC. Bien que développé pour le système FtsH–LapB–LpxC, ce test est facilement adaptable à d’autres protéases AAA+ et substrats liés à la membrane, fournissant une base générale pour l’étude de la protéolyse membranaire in vitro.

Introduction

Les protéases AAA+ sont des machines moléculaires conservées dépendantes de l’ATP qui jouent un rôle central dans le contrôle de la qualité des protéines et la protéolyserégulatrice 1,2. Ces machines contiennent un anneau hexamérique du domaine AAA+ ATPases, qui hydrolyse l’ATP, reconnaît, déplie et transloce les substrats vers le domaine compartimental de la protéase pour ladégradation 1. Alors que les protéases AAA+ cytoplasmiques telles que ClpXP3 et Lon4 ont été largement caractérisées à l’aide de tests in vitro bien établis, les protéases AAA+ membranaires restent relativement peu comprises. Cet écart reflète en grande partie les défis techniques liés à la reconstitution des protéines membranaires en environnements lipidiques définis et à la mesure quantitative de leur activité protéolytique in vitro. L’objectif global de cette méthode est d’établir des tests sensibles et quantitatifs pour étudier l’activité protéolytique des protéases enfermées dans la membrane.

FtsH est la seule protéase AAA+ essentielle dans Escherichia coli et sert de protéase AAA+ membraneuseprototypique 5,6,7. Ancrée à la membrane interne par des hélices transmembranaires N-terminales, FtsH dégrade un ensemble diversifié de substrats cytoplasmiques et associés à la membrane, régulant ainsi le contrôle de la qualité des protéines membranaires, les réponses au stress et l’homéostasielipidique 8,9,10,11. L’un de ses substrats les mieux caractérisés est le LpxC, une déacétylase soluble qui catalyse la première étape engagée dans la biosynthèse des lipopolysaccharides (LPS) 12,13. La dégradation efficace de LpxC par FtsH nécessite la protéine membranaire LapB, qui agit comme un adaptateur pour reconnaître spécifiquement LpxC et la livrer à la protéase 14,15,16,17,18.

Malgré son importance physiologique, l’analyse quantitative de la protéolyse médiée par FtsH in vitro a été limitée, en particulier pour les substrats cytoplasmiques tels que LpxC. Les tests traditionnels de dégradation in vitro utilisent FtsH purifié dans des micellesdétergentes 13,19, qui ne fournissent pas l’environnement membranaire pour la protéase ancrée dans la membrane. De plus, les tests de dégradation reposent souvent sur la détection de la disparition du substrat13 basée sur SDS–PAGE, qui peut être laborieux, à faible débit et insuffisamment sensible pour des analyses cinétiques. Plus récemment, FtsH reconstitué en bicelles a été utilisé pour étudier la dégradation des substrats membranaires, comme l’a initié le groupe20 de Heedeok Hong ; cependant, un système comparable pour analyser les substrats cytoplasmiques fait défaut. Ici, nous adaptons la reconstitution bicelle de Heedeok Hong à la reconstitution des protéolisomes pour imiter l’environnement membranaire. De plus, le substrat hydrosoluble LpxC est marqué par fluorescence, ce qui permet une mesure sensible et quantitative de la cinétique de la dégradation dépendante de FtsH/LapB de LpxC in vitro.

Cette méthode doit être utilisée lorsque les chercheurs doivent mesurer quantitativement la protéolyse médiée par FtsH des substrats solubles dans l’eau. Il présente plusieurs avantages par rapport aux approches existantes. Premièrement, la détection des produits protéolytiques par fluorescence, plutôt que la disparition du substrat, améliore substantiellement la sensibilité et la plage dynamique, facilitant ainsi des comparaisons quantitatives de l’activité protéolytique. Deuxièmement, l’utilisation des protéoliliposomes préserve le contexte membranaire nécessaire au fonctionnement de FtsH tout en permettant un contrôle précis de la composition des protéines et deslipides 18. Enfin, bien que développé avec le système FtsH–LapB–LpxC, ce protocole est facilement adaptable à d’autres protéases AAA+ liées à la membrane et à leurs substrats cytoplasmiques nécessitant une machinerie de dégradation associée à la membrane.

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Protocole

1. Étiquetage de LpxC avec Atto488

  1. Préparation du LpxC
    1. Exprimer et purifier la protéine LpxC comme indiqué précédemment18. Échanger le tampon de LpxC purifié de Tris vers un tampon phosphate de 50 mM, pH 7,6 (6 mMNaH 2PO4, 44 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl) par filtration sur gel à l’aide d’une colonne de filtration gel haute résolution (par exemple, colonne Superdex 200 Increase 10/300 GL).
    2. Concentrez le LpxC à l’aide d’une colonne d’ultrafiltration jusqu’à une concentration finale d’au moins 5 mg/mL à 4 °C.
  2. Étiquetage de LpxC avec Atto488
    1. Diluez 0,5 mg de LpxC dans un tampon phosphate de 50 mM, pH 7,6, pour un volume final de 225 μL. Ajoutez 25 μL de 1 M bicarbonate de sodium pour ajuster le pH à environ 8,3.
    2. Dissoudre 0,24 mg de colorant réactif Atto488 dans 20 μL de tampon au bicarbonate de sodium 0,1 M pour préparer une solution d’origine (0,012 mg/μL). Préparer une solution de travail en diluant 2 μL de la solution standard avec 18 μL de tampon de bicarbonate de sodium 0,1 M, pour obtenir une concentration finale de 0,0012 mg/μL.
    3. Ajoutez immédiatement 4 μL de la solution de travail Atto488 à la solution protéique (correspondant à un rapport molaire de LpxC : Atto488 de 3:1). Enroulez le tube dans du papier aluminium et faites couper à 4 °C pendant 2 heures avec une légère agitation (18 tr/min).
      REMARQUE : La crosse Atto488 et les solutions de travail peuvent être congelées instantanément dans de l’azote liquide et stockées à -80 °C.
  3. Séparation de LpxC–Atto488 du colorant libre
    1. Équilibrer une colonne de désalage-10 avec 10 mL d’eau ultrapure, suivie de 15 mL de tampon phosphate de 50 mM, pH 7,6.
    2. Appliquez le mélange de réaction d’étiquetage sur la colonne et laissez-le pénétrer complètement dans la résine.
    3. Élute avec 5 mL de tampon phosphate de 50 mM, pH 7,6. Deux bandes distinctes correspondant à LpxC–Atto488 (première bande) et à la teinture libre Atto488 (deuxième bande) devraient devenir visibles. Collectez les fractions de la première bande en ~0,5 mL d’aliquotes.
    4. Analysez les fractions élues par SDS-PAGE. Visualisez la fluorescence sous éclairage UV avant la coloration Coomassie Brilliant Blue (CBB).
    5. Concentrez les fractions contenant LpxC–Atto488 et concentrez la protéine marquée à environ 2 mg/mL.
    6. Estimez l’efficacité du marquage en mesurant la concentration de protéines et la concentration d’Atto488 à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume.
      REMARQUE : Un rapport de concentration d’Atto488 (en pmol/μL) à la concentration de LpxC (en mg/mL) dans la plage de 2 à 5 indique un niveau de marquage approprié. Cela correspond à un rapport molaire d’Atto488 à LpxC allant de 1:15 à 1:6 après marquage.
    7. LpxC–Atto488 en microcentrifuge de 1,5 mL, congélation instantanée dans de l’azote liquide, et stocké à -80 °C. À ce stade, le protocole peut être mis en pause jusqu’à 3 mois.
      ATTENTION : L’azote liquide est extrêmement froid ; manipulez-le avec un équipement de protection approprié (gants cryogéniques, protection oculaire).

2. Reconstitution de FtsH/LapB en protéolisomes

  1. Préparation des liposomes
    1. Transférez 100 mg de 1-Palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (POPC) en chloroforme dans un tube à essai en verre. Évaporez le solvant sous un jet doux de N₂, puis séchez sous vide toute la nuit.
      REMARQUE : Le POPC a une température de transition de phase de ~-2 °C et est largement utilisé en biophysique membranaire, formulations de liposomes et systèmes modèles cellulaires.
      ATTENTION : Le chloroforme peut nuire aux yeux, à la peau, au foie, aux reins et au système nerveux. Un équipement de protection approprié (gants, protection oculaire, masque) est nécessaire lors de la manipulation. Manipulez-la dans une hotte avec une seringue en verre.
    2. Ajoutez 1 315 μL de tampon A (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl) au film POPC séché. Résuspendez les lipides en alternant 1 minute de sonication au bain-marie avec 1 minute de vortex à vitesse maximale pour un total de ~15 minutes, ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement dispersés. (concentration finale de lipides : 100 mM).
      REMARQUE : Pour améliorer la resuspension lipidique, ajustez la profondeur d’immersion du tube à essai en verre dans le sonicateur à bain-marie afin de maximiser l’agitation. Les lipides en suspension peuvent être stockés à -20 °C. À ce stade, le protocole peut être mis en pause jusqu’à 1 mois.
    3. Alyquote la suspension liposomeuse en portions de 200 μL et stockée à -20 °C.
  2. Extubation des liposomes
    1. Décongelez une aliquote liposome de 200 μL dans un bain-marie à température ambiante et diluez avec 800 μL de tampon A jusqu’à un volume final de 1 mL.
    2. Soumettez les liposomes à trois cycles de gel-dégel en alternant entre azote liquide et bain marie à température ambiante.
    3. Rincez les seringues, deux supports filtrants et une membrane en polycarbonate de 200 nm avec tampon A. Montez la mini-extrudeuse et extrudez les liposomes 20 fois.
      REMARQUE : La suspension liposomeuse doit paraître transparente après extrusion.
    4. Divisez la suspension de liposomes extrudés de 1 mL en trois tubes (330 μL par tube) et diluez chacun avec 600 μL de tampon A.
  3. Titration par gonflement du Triton X-100
    REMARQUE : Le Triton X-100 est un détergent à faible concentration critique de micelles (CMC), et il s’est avéré le plus efficace dans de nombreuxcas 21
    ATTENTION : Le Triton X-100 est un produit chimique dangereux, causant principalement de graves lésions oculaires, des irritations cutanées et des effets nocifs s’il est avalé. Un équipement de protection approprié (gants, protection oculaire) est nécessaire lors de la manipulation.
    1. Préparez le Triton X-100 à 10 % (v/v) en mélangeant 100 μL de Triton X-100 avec de l’eau ultrapure de 900 μL, puis en l’incubant dans un shaker pour dissoudre complètement le Triton X-100.
    2. Mesurez l’absorption des liposomes à 540 nm (A₅₄₀) à l’aide d’un spectrophotomètre.
    3. Ajouter 5 μL d’aliquotes de 10 % de Triton X-100 séquentiellement, en mélangeant doucement après chaque addition, et mesurer A₅₄₀. Continuez d’ajouter Triton X-100 jusqu’à ce que A₅₄₀ atteigne un maximum, puis ajoutez Triton X-100 4 à 5 fois supplémentaires jusqu’à ce que l’absorbance diminue à environ 60 % de la valeur de pic.
    4. Sur la base de la courbe de titration, on gonfle les liposomes en ajoutant 35 μL de 10 % de Triton X-100 et on incube à température ambiante pendant 1 h avec une légère agitation.
  4. Reconstitution de FtsH/LapB en liposomes
    1. Exprimer et purifier les protéines FtsH et LapB comme décrit précédemment18.
    2. Lavez ~2 g d’un adsorbant non polaire en polystyrène (par exemple, Bio-Beads SM-2) une fois avec 10 volumes de méthanol, une fois avec 10 volumes d’éthanol, et dix fois avec 10 volumes d’eau ultrapure. Conservez l’adsorbant lavé dans le tampon A à 4 °C.
    3. Pour chaque tube de liposomes gonflés du Triton X-100, ajoutez 3 μL de 500 mM de tris(2-carboxyétyl)phosphine (TCEP), 22,5 μg de FtsH, et 22,5 μg de LapB. Ajustez le volume total à 1 mL avec le tampon A et incubez en RT pendant 1 heure avec une légère agitation.
      REMARQUE : Des rapports protéine/lipides de 1:20 à 1:200 (poids/poids) étaient systématiquement utilisés lors de la reconstitution des protéolisomes21. Ici, un ratio de 1:100 est utilisé.
    4. Retirez la lessive par incubation séquentielle avec un adsorbent en polystyrène non polaire : 40 mg à la RT pendant 0,5 heure, suivis de 40 mg à la RT pendant 1 heure, puis 40 mg à 4 °C pendant la nuit, et enfin 40 mg à 4 °C pendant 1 heure.
    5. Centrifugez brièvement pour pelleter l’adsorbant polystyrène non polaire à 4 °C (400 × g pendant 3 s). Transférez le surnageant dans des tubes ultracentrifuge. Lavez l’adsorbant non polaire en polystyrène avec 1 mL de tampon A et combinez le lavage avec le surnageant. Ajoutez un tampon supplémentaire A à un volume final de ~6 mL.
      REMARQUE : Pour des raisons de sécurité, les tubes ultracentrifuges doivent contenir au moins 6 mL de liquide.
    6. Équilibrez les tubes et l’ultracentrifuge à 250 000 × g à 4 °C pendant 45 minutes dans un rotor à angle fixe (par exemple, MLA-80) pour pelleter des protéoliposomes.
    7. Éliminez le surnageant et remettez la pellete de protéolisosome en suspension dans 70 μL de tampon A complétés par 1 mM de TCEP.
      REMARQUE : Le volume final des protéolisomes est d’environ 100 μL.
    8. Congelez rapidement les protéoliposomes dans de l’azote liquide et conservez-les à -80 °C.
      REMARQUE : À ce stade, le protocole peut être mis en pause jusqu’à 1 mois.
  5. Analyse SDS-PAGE des protéoliposomes
    1. Mélangez soigneusement les protéolisomes et combinez 5 μL de l’échantillon avec 5 μL de tampon de charge SDS 2× (0,1 M Tris-HCl, pH 6,8, 5 % SDS, 20 % de glycérol, 0,01 % de bleu de bromophénol, 200 mM de DTT).
    2. Chargez des échantillons de protéolisomes avec 525 ng de FtsH (correspondant à 0,06 μM d’hexamère FtsH en 20 μL) sur un gel SDS-PAGE à 4–20 %.
    3. Teignez le gel avec du CBB.
    4. Scannez le gel et quantifiez l’intensité de la bande FtsH pour chaque échantillon. Calculer le volume de suspension de protéolisomes équivalent à 525 ng de FtsH.

3. Dégradation in vitro de LpxC–Atto488

  1. Effectuer des tests de dégradation in vitro dans une réaction de 20 μL contenant des protéoliposomes FtsH/LapB (correspondant à 0,06 μM FtsH) et 0,5, 1, 2, 2,5, 5, 10, 20, 40 μM LpxC-Atto488 dans un tampon de dégradation (50 mM Tris-acétate, pH 8,0, 10 mM Mg-acétate, 5 mM ATP, 25 μM Zn-acétate, 80 mM NaCl, 1,4 mM β-mercaptoéthanol).
  2. Pour la mesure de chaque concentration de substrat, préparez une réaction de 70 μL.
    1. Prenez une fraction de 20 μL et trempez-la en la mélangeant immédiatement avec 48 μL d’acide trichloroacétique (TCA) à 5 % dans des tubes microcentrifuges de 1,5 mL (0 min). Prenez la deuxième et la troisième fractions et trempez-les respectivement à 10 et 20 minutes.
    2. En parallèle, préparez les réactions de contrôle correspondantes dépourvues de protéoliposomes pour la soustraction de fond.
      REMARQUE : Trois mesures de réplication sont recommandées afin d’obtenir des résultats fiables.
      Minimisez l’exposition à la lumière lors de la manipulation de LpxC–Atto488.
      ATTENTION : Le TCA est un produit chimique hautement corrosif qui provoque de graves brûlures cutanées, des dommages oculaires permanents et une irritation respiratoire intense à l’inhalation. Manipulez-le avec un équipement de protection approprié (gants, protection oculaire, masque).
  3. Incuber des échantillons à 37 °C pendant 30 minutes pour précipiter les protéines, puis centrifuger à 18 800 × g à température ambiante pendant 20 minutes.
  4. Neutraliser les échantillons en transférant 50 μL de surnageant dans un tube contenant 60 μL de 500 mM Tris-HCl, pH 8,8. Mélangez bien et transférez 100 μL sur une plaque noire à 96 puits. Mesurez la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques avec excitation à 498 nm et émission à 520 nm.

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Résultats

Pour améliorer la sensibilité du test de dégradation in vitro , le substrat LpxC a été marqué avec le colorant fluorescent Atto488. Le groupe ester succinimidyle d’Atto488 réagit efficacement avec les groupes aminés primaires de LpxC dans des conditions légèrement alcalines. Comme le tampon Tris contient des amines primaires qui interfèrent avec cette réaction, le LpxC purifié dans le tampon Tris a été remplacé par tampon phosphate par filtration en gel avant l’étiquetage. Pour ...

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Discussion

La première étape critique de ce protocole est l’étiquetage Atto488 de LpxC. Un marquage modéré est essentiel pour mesurer avec précision l’activité de dégradation in vitro . D’après nos expériences d’optimisation, un ratio molaire de LpxC à Atto488 entre 9:1 et 3:1 est optimal. Un excès d’Atto488 entraîne un sur-étiquetage, ce qui perturbe probablement l’état natif de LpxC. Dans ces conditions, la différence de dégradation de LpxC–Atto488 par FtsH seul par rapport à FtsH/LapB e...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Toutes les recherches ont été menées à l’université de Yale. W.M. est soutenue par le National Institute of General Medical Sciences sous les numéros de prix R01GM137068 et RM1GM149406, ainsi que par la Richard and Susan Smith Family Foundation via le prix Odyssey.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1.5 mL microcentrifuge tubeUSA scientific1415-2500
200 nm polycarbonate membraneAvanti Polar Lipids610006
4-20% SDS-PAGEFabriqué maison
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrateSigmaA26209
Atto 488 Protein Labeling KitSigma38371
Bio-Beads SM-2 Bio-Rad152-8920Adsorbant en polystyrène non polaire 
Black 96-well plate Costar3915
Bromophenol blueSigma114391
Coomassie Brilliant Blue R250Sigma1.12553
DTTSigmaD9779
EthanolSigma459844
Filter supportAvanti Polar Lipids610014
Glass syringeAvanti Polar Lipids610017
Glass test tubeKIMBLE45066-16150
GlycerolAvantor2136-01
Magnesium acetate tetrahydrateSigma228648
MethanolSigma179337
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75-002-436
Mini-extruderAvanti Polar Lipids610000
MLA-80 rotor Beckman367096Rotor à angle fixe 
Plate readerTecanInfinite M1000 PRO
POPC Avanti Polar Lipids850457C
Refrigerated microcentrifugeThermo Fisher Scientific75002559
SDSAmerican BioAB01920-00500
Sodium bicarbonate SigmaS6014
Sodium chlorideSigmaS9888
Sodium dihydrogen phosphateSigma38400100
Sodium phosphate dibasicSigma567547
SonicatorFisherbrandFB-11201
SpectrophotometerSCILOGEXSCI-V1000
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva 28990944Colonne de filtration sur gel haute résolution 
Tabletop ultracentrifugeBeckmanOptima MAX-XP
TCEP HClGold BiotechnologyTCEP1
Trichloroacetic acid SigmaT6399
Tris BaseSigma252859
Triton X-100 SigmaT8787
Ultracentrifuge tubes Beckman355647
Ultrafiltration column MilliporeUFC8030
Vortex-Genie 2 MixerScientific IndustriesSI-0236 
Zinc acetate dihydrateSigma379786
β-mercaptoethanolSigma444203

Références

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