L’efficacité diagnostique du plasma miR-362-3p combiné à l’échographie Doppler dans le diagnostic du cancer du sein

Résumé

Le taux de diagnostic de cancer du sein est relativement faible. La méthode du tableau quadruple a été utilisée pour analyser la valeur diagnostique de miR-362-3p combinée à l’échographie Doppler pour le cancer du sein. La combinaison de l’échographie Doppler et du miR-362-3p a efficacement amélioré l’efficacité diagnostique, offrant une méthode prometteuse pour le diagnostic du cancer du sein.

Résumé

Le cancer du sein est la deuxième tumeur maligne la plus courante au monde, menaçant sérieusement la vie des femmes et imposant un fardeau économique énorme. Cette étude vise à explorer la valeur du miR-362-3p combiné à l’échographie Doppler dans le diagnostic du cancer du sein. Un total de 182 patientes atteintes de cancer du sein et 147 patientes atteintes de maladie mammaire bénigne ont été incluses dans cette étude. Les niveaux plasmatiques de miR-362-3p des patients ont été mesurés à l’aide de la réaction en chaîne quantitative de polymérase à fluorescence en temps réel (RT-qPCR). Le test chi-carré a été utilisé pour analyser les différences dans les paramètres de l’échographie Doppler entre les deux groupes de patients. La courbe caractéristique de l’opérateur récepteur (ROC) a été utilisée pour évaluer l’efficacité diagnostique de miR-362-3p, de l’indice de résistance (RI) et de l’indice de pulsatilité (PI). L’efficacité diagnostique de l’échographie Doppler combinée au plasma miR-362-3p dans le cancer du sein a été analysée par la méthode du tableau quadruple. Les niveaux de miR-362-3p ont été nettement réduits chez les patientes atteintes de cancer du sein. Il y avait des différences significatives dans les paramètres d’échographie bidimensionnelle. miR-362-3p, RI et PI ont une valeur diagnostique pour le cancer du sein. La valeur diagnostique combinée des trois facteurs était plus élevée. L’échographie combinée à miR-362-3p a significativement amélioré la sensibilité, la précision et la valeur prédictive négative dans le diagnostic du cancer du sein. L’échographie Doppler combinée à miR-362-3p pourrait améliorer l’efficacité diagnostique du cancer du sein, ce qui pourrait fournir un outil diagnostique auxiliaire non invasif et potentiel pour le cancer du sein.

Introduction

Selon les statistiques de l’Agence internationale pour la recherche sur le cancer, le taux d’incidence du cancer du sein a dépassé celui du cancer du poumon en 2020^. Le cancer du sein est une tumeur maligne qui survient fréquemment et constitue une cause majeure de décès liés au cancer chez les femmes dans le^{monde 1}. Un diagnostic rapide du cancer du sein est bénéfique pour le pronostic des patientes. La biopsie tissulaire est la référence pour diagnostiquer le cancer du sein. Cependant, il s’agit d’un type de diagnostic invasif, et il ne s’applique pas aux patientes atteintes d’un cancer du sein à un stade^{précoce 2}.

L’échographie Doppler est une technique d’imagerie couramment utilisée pour le dépistage du cancer du sein et le diagnostic^{auxiliaire 3}. L’échographie Doppler peut évaluer avec précision la taille des nodules, les signaux de flux sanguin et l’état de la métastase^{ganglionnaire 4}. L’échographie Doppler mammaire, grâce à ses avantages tels que l’absence de radiations ionisantes, sa sécurité, sa non-invasivité et sa capacité à effectuer des examens répétables, est devenue l’une des techniques d’imagerie les plus largement utilisées dans le dépistage et le diagnostic du^{cancer du sein 5}. Cependant, l’échographie Doppler est susceptible d’être perturbée par le fond tissulaire lors de la détection de cancers du sein à faible densité ou faible volume, ce qui entraîne une baisse significative de la sensibilité diagnostique et rend difficile la satisfaction des besoins cliniques pour un diagnostic^{précoce 6}. Il est donc nécessaire de développer des biomarqueurs plasmatiques capables de surmonter les limites de la technologie d’échographie Doppler. Si la combinaison des deux méthodes peut accroître la sensibilité du diagnostic pour le cancer du sein, cela aura une valeur clinique significative et une importance pratique.

Les microARN (miARN) sont une classe de molécules d’ARN non codantes d’une longueur d’environ 20 à 24 nucléotides ^7,8. L’une des caractéristiques des miARN est un haut degré de conservation au cours du processus évolutif. Les miARN ont une large distribution tissulaire, qui est non seulement expressée spécifiquement dans diverses cellules de tissus humains, mais peut aussi exister de manière stable dans plusieurs fluides corporels tels que le sang et^{la salive 9}. Ces caractéristiques de distribution offrent des avantages pour le développement de marqueurs diagnostiques non invasifs. Sur le plan fonctionnel, les miARN dégradent l’ARNm en se liant complémentairement aux 3' Régions Non Traduites (UTR)^10,11, participant à une série de processus pathologiques et physiologiques clés tels que les réponses inflammatoires cellulaires, le stress oxydatif, l’apoptose, ainsi que la prolifération et la différenciation¹². Un grand nombre d’études ont confirmé que les changements anormaux dans les profils d’expression des miARN étaient étroitement liés à l’apparition et au développement du cancer du^{sein 13,14}. La dysrégulation de l’expression des miARN peut favoriser la transformation maligne des cellules épithéliales mammaires en régulant les réseaux d’expression des oncogènes ou des gènes suppresseurs tumoraux. miR-362-3p est un facteur typique qui inhibe la progression tumorale. Plusieurs rapports ont montré que miR-362-3p inhibait la progression du cancer du sein 15,16,17. Assiri et al. ont rapporté que la faible expression de miR-362-3p était étroitement associée à un mauvais pronostic et à une survie globale plus courte chez les patientes atteintes de cancer du^{sein 15}. Sur le plan mécanique, miR-362-3p a exercé un effet antitumoral dans le cancer du sein en ciblant l’hélicase DEAD-box 5 (DDX5) pour favoriser la prolifération, l’invasion et la migration des cellules^{cancéreuses 16}. De plus, l’équipe dirigée par Kang a également constaté que miR-362-3p était significativement sous-régulée dans les tissus atteints du cancer du sein, et que la régulation ciblée de l’expression de miR-362-3p pourrait constituer une nouvelle stratégie thérapeutique potentielle pour la prise en charge^{du cancer du sein 17}. Cependant, aucun rapport n’a été publié sur la possibilité que le miR-362-3p puisse servir de marqueur diagnostique précoce pour le cancer du sein.

Cette étude a mesuré le niveau d’expression de miR-362-3p dans le plasma et a simultanément analysé les paramètres clés de l’échographie Doppler chez des patientes atteintes de cancer du sein. L’étude a examiné en profondeur la valeur d’application combinée des niveaux d’expression plasmatiques de miR-362-3p et des paramètres d’image par échographie Doppler, et a clairement démontré l’efficacité de cette approche diagnostique combinée dans le dépistage du cancer du sein et dans le diagnostic différentiel entre maladies mammaires bénignes et malignes.

Protocole

Cette étude a été réalisée conformément aux principes de la Déclaration d’Helsinki. L’approbation a été accordée par le Comité d’éthique de l’hôpital affilié de la Seconde Université de Médecine du Shandong, École de médecine clinique, Université de Médecine Seconde du Shandong (numéro d’approbation : wyfy-2023-ky-124). Un consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets impliqués dans l’étude. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Sujets expérimentaux

Le calcul de la taille de l’échantillon a été effectué à l’aide du logiciel G*Power 3.1 basé sur un test t d’échantillon indépendant. Une taille d’effet moyenne (d de Cohen = 0,5, largement utilisée dans les études observationnelles cliniques), un test à deux bras, α = 0,05, et une puissance (1 − β) = 0,95 ont été fixées. Le calcul indiquait qu’au moins 105 participants étaient requis par groupe. Enfin, 182 patientes atteintes de cancer du sein et 147 patientes présentant des lésions mammaires bénignes ont été inscrites, et la taille réelle de l’échantillon des deux groupes a largement dépassé la taille minimale requise, assurant une puissance statistique suffisante pour étayer les conclusions de l’étude et contrôlant le risque d’erreur de type II dans une fourchette acceptable. Tous les participants ont été strictement et consécutivement inscrits selon des critères unifiés d’inclusion et d’exclusion.

De 2023 à 2024, tous les patients étaient inscrits à l’Hôpital affilié de la Seconde Université de Médecine du Shandong, École de médecine clinique, Université de Médecine Seconde du Shandong. Lésions bénignes : Les lésions non malignes ont été confirmées par la pathologie. Cancer du sein : les tumeurs malignes ont été confirmées par la pathologie. Des échantillons de sang veineux ont été prélevés sur tous les participants après un jeûne nocturne. Les échantillons de sang veineux ont été anticoagulés puis centrifugés pour séparer le plasma, conformément strictement aux procédures standard, puis transférés à −80 °C pour un stockage à long terme, qui a ensuite été utilisé pour l’extraction de miARN. Tous les échantillons de plasma étaient strictement limités à un maximum de deux cycles de congélation-dégel avant l’extraction de l’ARN afin d’éviter la dégradation des miARN. Tous les patients étaient pleinement informés du protocole de l’étude et ont volontairement fourni un consentement éclairé écrit avant l’inscription.

Critères d’inclusion pour les patientes atteintes de cancer du sein : (1) Patientes atteintes d’un cancer du sein primaire confirmé de manière pathologique. (2) Aucun traitement chirurgical avant l’inscription. (3) Ne pas avoir reçu de traitement de radiothérapie ou de chimiothérapie avant la collecte de l’échantillon.

Critères d’inclusion pour les patientes atteintes de maladie mammaire bénigne : (1) Lésions mammaires bénignes confirmées pathologiquement. (2) Sans autres tumeurs malignes systémiques ni lésions précancéreuses. (3) Non enceinte et non lactante. (4) Pas d’infection aiguë grave ni de maladie inflammatoire chronique.

Critères d’exclusion pour les patientes atteintes de cancer du sein et de lésions mammaires bénignes : (1) Infection mammaire grave ou maladie critique aiguë. (2) Dysfonction sévère du foie ou des reins, ou maladie auto-immune. (3) Patients ayant reçu une hormonothérapie dans les 6 mois.

2. Examen par échographie Doppler

Les seins bilatéraux de la patiente ont été examinés en profondeur sur quatre quadrants à l’aide d’une échographie Doppler. Une échographie bidimensionnelle a été utilisée pour enregistrer les caractéristiques de la lésion, notamment les limites, la forme, l’écho interne, les ondes d’écho postérieures et le rapport d’image de la lésion. L’imagerie Doppler couleur a été appliquée pour évaluer les paramètres du flux sanguin de la lésion, notamment l’indice de résistance (RI), l’indice de pulsatilité (PI) et la vitesse maximale du flux sanguin (V_max). Les signaux de flux sanguin ont été classés selon un système de classification précédemment^{signalé 18} : Grade 0 : Aucun signal de circulation sanguine ; Grade I : signal de circulation sanguine minimale ; Grade II : La longueur du signal de flux sanguin dépasse la moitié du diamètre de la lésion ; Grade III : Signal de circulation sanguine abondante.

3. Définition positive pour le diagnostic par échographie du cancer du sein

Cela comprenait (1) des frontières ambiguës ; (2) Forme irrégulière ; (3) Écho interne inégal ; (4) Écho arrière affaibli ; (5) Format d’aspect >1 ; (6) RI > 0,70 ; (7) PI > 1,50 ; (8) Débit sanguin maximal (Vmax)> 18,00 cm/s ; (9) Signal de circulation sanguine ≥ grade II. Toute lésion répondant à l’un des critères suspects ci-dessus est classée comme échographie positive, tandis que celles sans caractéristiques suspectes sont considérées comme échographies négatives.

4. Réaction en chaîne quantitative de polymérases à fluorescence en temps réel (RT-qPCR)

Les miARN plasmatiques ont été extraits à l’aide d’un kit spécialisé d’extraction de miARN. Les échantillons d’ARN extraits avec succès ont été utilisés pour synthétiser l’ADNc à l’aide de kits spécialisés de transcription inverse de miARN. Conditions de réaction de transcription inverse pour miR-362-3p : Le volume total de cette réaction était de 20 μL. La procédure de réaction PCR était la suivante : (1) Le mélange était incubé à 37 °C pendant 15 minutes, (2) La réaction de transcription inverse était réalisée pendant 50 minutes à 42 °C, (3) L’enzyme était inactivée pendant 5 minutes à 95 °C. Le produit était stocké à 4 °C. Les conditions de réaction qPCR : Le volume total du système de réaction était de 20 μL. Les conditions d’amplification ont été réalisées comme suit : (1) L’ADN a été pré-dénaturé, et la polymérase d’ADN a été activée à 95 °C pendant 2 minutes. (2) Les brins d’ADN recuit et s’étendent pendant 30 s à 60 °C. Les deux étapes ci-dessus ont été réalisées sur un total de 40 cycles. L’expression relative du gène a été calculée par la formule 2^-(ΔΔCt). L’expression relative du miR-362-3p a été calibrée par U6. Pour justifier l’utilisation de U6 comme contrôle endogène, la stabilité de U6 a été évaluée à l’aide de l’algorithme BestKeeper dans la cohorte plasmatique. Le coefficient de variation (CV) des valeurs de U6 Ct sur tous les échantillons était inférieur à 2 %, indiquant une forte stabilité d’expression. Par conséquent, U6 a été validé et sélectionné comme gène de référence pour la normalisation de l’expression de miR-362-3p dans la présente étude. La séquence aval des amorces a été fournie par le kit. Les séquences d’amorces étaient les suivantes :

miR-362-3p : GCCGAGAACACACCTATTCA.

U6 : CTCGCTTCGGCAGCACATATATACT.

5. Courbe de caractéristique de fonctionnement du récepteur (ROC)

L’indice de Youden a été utilisé pour déterminer la valeur de seuil optimale de miR-362-3p dans le diagnostic du cancer du sein en calculant les valeurs de sensibilité et de spécificité de la courbe ROC. Le modèle diagnostique combiné a été construit en utilisant la régression logistique binaire dans SPSS, avec miR-362-3p, RI et PI entrés comme variables indépendantes. Les variables ont été incluses par la méthode Enter pour générer la valeur de probabilité prédite du diagnostic combiné pour chaque sujet. La formule de la probabilité de prédiction (PRE) : . Les courbes ROC ont été tracées selon le PRE. Le test de Delong a été utilisé pour comparer les différences de valeurs de zone sous la courbe (AUC) entre différentes courbes ROC.

6. Définition des paramètres de résultat

Le critère principal de jugement était l’efficacité diagnostique globale du modèle combiné de miR-362-3p plasmalogique et d’échographie Doppler pour le cancer du sein, le diagnostic pathologique étant la référence d’excellence. Les paramètres secondaires de jugement comprenaient la performance diagnostique de l’échographie Doppler seule et du plasma miR-362-3p seul.

7. Statistiques de données

Les niveaux d’expression de miR-362-3p et des courbes ROC des deux groupes de patients ont été analysés à l’aide de logiciels statistiques et graphiques. Le test t a été utilisé pour comparer les différences de variables continues entre les deux groupes. Le test du chi-carré et la méthode de la table quadruple ont été analysés à l’aide de SPSS 26.0. Le test du chi carré a été utilisé pour évaluer les différences statistiques des variables catégorielles ; la combinaison à deux indices (miR-362-3p + échographie Doppler) était considérée comme l’analyse principale, représentant une conclusion qualitative diagnostique courante en pratique clinique ; s’il y avait des caractéristiques suspectes dérivées de la classification BI-RADS (Breast Imaging Reporting and Data System), la lésion était considérée comme positive ; la méthode du tableau quadruple a été utilisée pour calculer la spécificité, la valeur prédictive positive, la valeur prédictive négative et la précision du diagnostic combiné de l’échographie Doppler et du miR-362-3p. Les résultats diagnostiques entre l’échographie Doppler et miR-362-3p comprenaient un vrai positif (a), un faux positif (b), un faux négatif (c) et un vrai négatif (d). Formule de calcul : Sensibilité = a / (a + c) ; Spécificité = d / (d + b) ; Valeur prédictive positive = a / (a + b) ; Valeur prédictive négative = d / (d + c) ; Précision = (a + d) / (a + b + c + d). Les trois méthodes de diagnostic (miR-362-3p, échographie et diagnostic combiné) ont été réalisées à l’aide du test Pearson χ² pour les tableaux de contingence R×C. P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Résultats

Le taux de miR-362-3p a été significativement diminué chez les patientes atteintes de cancer du sein

Les informations de base clinique et les caractéristiques pathologiques cliniques de 182 patientes atteintes de cancer du sein et de 147 patientes présentant des lésions mammaires bénignes ont été comparées. Les données détaillées ont été résumées dans le tableau 1. La RT-qPCR a été utilisée pour mesurer les niveaux plasmatique...

Discussion

Le cancer du sein est l’un des types de tumeurs malignes les plus courants, devenant un problème majeur de santé publique menaçant la santé^{humaine 19,20}. Les taux élevés d’incidence et de mortalité causent non seulement de graves traumatismes psychologiques aux familles des patients, mais engendrent aussi un lourd fardeau sur la société et l’économie. La plupart des patientes atteintes d’un cancer du sein ont déjà subi une invasi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
BD Vacutainer K2EDTA Blood Collection Tube (purple cap)	USA	367861	Pour le prélèvement de sang veineux et la préparation du plasma pour l'analyse des miRNA.
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad Laboratories	1855195	Instrument de PCR quantitative à fluorescence 96 puits à 6 canaux, utilisant la conduction par fibre optique et l'imagerie CCD froide, avec collecte de fluorescence synchrone dans chaque puits sans délai.La plage dynamique atteint 10 ordres de grandeur, et il est compatible avec l'analyse qPCR conventionnelle et la courbe de fonte à haute résolution (HRM).Le logiciel prend en charge l'exportation au format RDML, est compatible avec les tests de recherche et cliniques, et est couramment utilisé dans des expériences telles que la quantification de l'expression génique, le typage SNP et l'analyse de la méthylation.
Kirgen 0.1 mL PCR Tubes (or 8-Strip PCR Tubes), Sterile	Shanghai, China	KG0811	Utilisés pour préparer et effectuer des réactions qPCR.
Kirgen 1.5 mL Microcentrifuge Tubes, Sterile	Kirgen Biotech Co., Ltd.	KG2911	Utilisés pour le stockage des échantillons, la préparation des réactifs et la centrifugation lors de l'extraction de miRNA et de la transcription inverse.
miRcute miRNA Isolation Kit (Spin Column)	Beijing, China	DP501	Pour l'isolement et la purification de l'ARN total, y compris le miRNA, à partir d'échantillons de plasma humain, utilisant une technologie basée sur une colonne de centrifugation.
miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit	Beijing, China	KR211	Pour la transcription inverse du miRNA purifié en cDNA de première chaîne par la méthode de queue poly(A).
miRcute Plus miRNA qPCR Kit (SYBR Green)	Beijing, China	FP411	Pour la détection quantitative en temps réel par PCR de miRNA utilisant une chimie basée sur le SYBR Green I.
Roche LightCycler 480 Multiwell Plate 96, White	Mannheim, Germany	4729692001	Utilisé pour les analyses de PCR quantitative en temps réel sur l'instrument Roche LightCycler 480.
Siemens Acuson 14L5 / 14L5 SP Linear Array Probe	Siemens Healthineers	10041226	Sonde de tableau linéaire à haute fréquence, avec une plage de fréquences de 5–14 MHz, spécialement conçue pour l'examen des organes superficiels tels que le sein et la thyroïde. Il offre une haute résolution et un excellent contraste tissulaire, et prend en charge l'élastographie et la numérisation automatique du volume du sein.
Siemens Acuson S2000/S3000/S1000 Ultrasound System	Siemens Healthineers	/	Le système d'échographie couleur Doppler prend en charge l'imagerie en temps réel 3D/4D et les fonctions d'imagerie élastique, et est largement utilisé dans plusieurs services tels que l'abdomen, la cardiologie, la gynécologie et l'obstétrique, et le sein.
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375786	Instrument de PCR gradient à 96 canaux, prend en charge l'optimisation de température par gradient; a une précision élevée de contrôle de la température; utilisé pour la synthèse d'ADNc et l'amplification PCR conventionnelle.